CN103755805B - HIV-1 Env特异性的全人单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

发明属于基因工程技术领域，具体涉及到抗HIV包膜蛋白（Env）特异性全人单克隆抗体。这些抗体分子对HIV-1具有中和活性和抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)。这些抗体单独或者联合应用，可以预防感染，在治疗中也有可能清除更多的病毒。此外，HIV-1单克隆抗体可进一步用于HIV-1感染的诊断和治疗。

Description

HIV-1 Env特异性的全人单克隆抗体

技术领域

本发明属于生物医药领域。本发明涉及多株HIV包膜蛋白(Env)特异性全人单克隆抗体，这些抗体分子对HIV-1具有中和活性和抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

背景技术

在病毒感染宿主的过程中，宿主体内产生大量的病毒特异性抗体，这些抗体主要通过中和作用和ADCC作用来清除病毒。病毒感染细胞可以概括为附着、融合和核衣壳进入三个主要步骤。中和抗体可以在附着、融合和核衣壳进入细胞的每一个环节发生作用，也可以阻止组装的核衣壳和病毒的释放。此外，抗体还可以通过与未结合到细胞上的病毒颗粒发生交联而形成大分子凝聚物被细胞吞噬作用清除，从而发挥其中和效应。

有研究显示，最早在HIV感染8周时即可测得病人体内存在中和抗体，并且发现病人血清中和抗体的滴度与病人的病毒载量之间呈负相关，提示中和抗体在早期病毒控制中可能起到重要作用[1]。研究发现，高度暴露却持续血清阴性者(即感染后能够在一定程度上控制或延迟HIV诱导的感染者)，其体液中存在中和抗体，存在于血液中的中和抗体还能抑制病毒的感染能力，降低病毒传播的风险。那些无需接受抗逆转录病毒治疗却能够长期将CD⁴⁺T细胞维持在正常水平并将病毒载量控制在检测水平以下的感染者，被称为长期不进展者(long term nonprogressor，LTNPs)，这些人只占所有HIV-1感染者的不到5％，研究发现LTNP的粘膜分泌物中含有CCR5特异性IgA和IgG抗体，该研究小组对这些人的追踪研究发现这些抗体的消失与AIDS的进展有关[2]。

在HIV-1感染者体内除了中和抗体以外，还有一些抗体虽然中和作用很弱或者没有中和作用，但仍然通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀伤HIV-1感染细胞。抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用是指表达IgG Fc受体的NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在病毒感染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀伤这些靶细胞的作用。最近泰国RV144疫苗试验的结果显示，疫苗对受试者有一定的保护作用，对其保护机理的研究表明，CD8细胞杀伤作用和中和抗体作用较弱，提示其他作用机理包括ADCC可能起到重要作用[3]。在对长期不进展者的研究中也发现，ADCC反应与HIV病毒的长期不进展相关联[4]。这些研究都显示ADCC在HIV疾病控制和疫苗研制中可能起重要作用。

近两年随着B细胞培养技术和单细胞RT-PCR的发展，大大提高了单克隆抗体的筛选速度。Laura M.Walker等从约1800名HIV-1感染者中逐层筛选，最后从一名非洲HIV-1 C 亚型感染者的记忆性B细胞中分离到了两株具有很强的广谱中和活性的抗体PG9和PG16，能中和高达70％以上的HIV-1流行毒株[5]。利用此类技术，其他研究者先后筛选到了VRC01以及PGT121～131等HIV-1广谱中和抗体，其中有些单抗能中和90％以上的HIV-1流行毒株[6，7]。但最近Zelda Euler等研究发现随着时间的推移，HIV-1在流行过程中不断发生变异，对中和抗体的抵抗能力也越来越强，该小组用新近分离的HIV-1毒株(2003～2006年)与早期(1985～1989年)分离到的B亚型毒株分别对已知的几种广谱中和抗体的中和活性进行综合比较后发现，新近分离到的毒株对VRC01和PG16抵抗力更强，但该研究也发现即使这些毒株对其中的一种抗体产生了抵抗，但仍然能被其他的抗体所中和[8]。这些研究均提示，如果我们找到更多的中和抗体，将他们联合应用，就有可能预防感染，在治疗中也有可能清除更多的病毒。此外，HIV-1单克隆抗体在HIV-1的诊断和科研领域也有着广泛的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供多种抗HIV全人单克隆抗体及其应用，这些单抗能特异性与HIV包膜蛋白Env抗原结合，并对HIV具有一定的中和活性和ADCC作用。

本发明包括：①具有所述单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有所述单克隆抗体可变区链的单克隆抗体。②具有含所述的互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何抗体。抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明的主要优点：提供了多种全新的结合分子，其是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性)抗HIV的分子相比，免疫原性大大减少，且亲和性良好，如果用于临床将大大降低副作用。且本文中多种抗体联合应用具有协同抗病毒作用，进一步提高抗病毒效果。由于本发明中的抗体分子可以和HIV Env抗原特异性结合，在HIV的诊断和检测中也有很好的应用前景。

附图说明

图1.单抗对不同形式的HIV-1包膜糖蛋白(Env)的结合活性。

图2.单抗B358.I1在不同浓度下的ADCC活性。

具体实施方式

本发明的全人单克隆抗体制备以及抗体特性分析过程分为两部分：利用B细胞培养和 RT-PCR法获得抗体基因以及抗体表达；以及抗体特性分析。

1  抗体基因的筛选及抗体表达纯化

1.1记忆性B细胞的分离纯化

经过对HIV-1感染者血浆中和活性的检测，筛选出血浆中和活性较好的感染者，在获得感染者知情同意的情况下，采取20ml EDTA抗凝全血样本。将20ml新鲜抗凝全血按照5ml/管加入人淋巴细胞分离管(购自深圳达科为公司)中，2200r/min离心15min，吸取中间白色淋巴细胞层，即为人外周血单个核细胞(periphery blood mononuclear cell，PBMC)。然后用人记忆性B细胞磁珠分选试剂盒(购自德国美天旎公司)分选出记忆性B细胞，简述为：首先，在PBMCs中加入生物素标记的CD2、CD14、CD16、CD36、CD43和CD235a抗体，4℃放置10min，加入抗生物素的磁珠，4℃放置15min，洗涤细胞，将细胞悬液加到放置于磁力分选器上的分选柱，磁珠标记的非B细胞将留在分选柱上，收集流出的未标记细胞即为B细胞；然后用磁珠标记的CD27抗体与B细胞在4℃作用15min，洗涤细胞，将细胞悬液通过细胞分选柱，留在分选柱的细胞即为CD19+CD27+的记忆性B细胞。具体操作参照试剂盒说明书。

1.2记忆性B细胞的活化培养

将分选所得的CD¹⁹⁺CD²⁷⁺细胞按照200细胞/孔的密度接种U型底96孔培养板，培养液中含CpG 2006(购自荷兰Hycult Biotech公司)2.5μg/ml，重组人IL-2和IL-10(均购自美国Peprotech公司)10ng/mL，25％的B958细胞培养上清和照射灭活的同种异源的单个核细胞50000/孔作为饲养细胞，在37℃，5％CO₂条件下培养10～14d，让记忆性B细胞活化为抗体分泌细胞，收集上清用于下一步检测。

1.3 ELISA法检测HIV-1 Env特异性抗体

本检测方法中用以下四种重组蛋白检测Env特异性抗体的存在情况：①gp120：HIV包膜表面蛋白，与宿主细胞表面受体CD4结合；②FLSC(全长单链)，人CD4的D1D2结构域和gp120组成的一种融合蛋白[9]。FLSC的gp120和CD4半部相互结合，形成稳定的分子复合物，其组成性地暴露自然感染条件下由HIV-1与靶细胞结合诱导产生的抗体所识别的CD4诱导(CD4i)表位。③gp140：稳定的寡聚蛋白，对应于包膜蛋白的膜外区。④gp41(ΔTM)：gp41为跨膜蛋白，参与病毒与宿主细胞膜融合，本方法中使用的gp41(ΔTM)为gp41蛋白的膜外区。应用这些抗原可对特异性结合CD4结合位点表位(CD4bs)、CD4诱导(CD4i)表位和“其他”表位的抗体进行快速鉴定，后者包括由所有形式的包膜蛋白或仅由低聚物形式的包膜蛋白所表达的表位。

检测针对gp120和FLSC的抗体使用的是捕获ELISA方法，简述如下：用100ng/孔的羊抗人HIV-1 gp120抗体D7324(购自爱尔兰Aalto Bio Reagent公司)包被酶标板，洗板 机洗板5遍，洗液为含0.05％Tween的PBS。用5％脱脂奶37℃封闭2h，洗板5遍。加入适当稀释的含gp120或FLSC的细胞上清，50μl/孔，37℃放置1h。洗板5遍，加入1∶4稀释的待测细胞上清或适当稀释的单克隆抗体，37℃放置1h，洗板5遍。加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgG，50μl/孔，37℃放置45min，洗板5遍。加入TMB显色液，室温避光显色20min，加入2M硫酸终止显色反应，检测OD450nm，参考波长为630nm。OD₄₅₀＞0.1且实验孔OD₄₅₀＞2倍阴性对照孔OD₄₅₀即判定阳性。检测针对gp140或gp41(ΔTM)的抗体时使用间接ELISA方法，即使用100ng/孔的纯化gp140或gp41(ΔTM)直接包被酶标板，样品的稀释以及后续操作同捕获ELISA方法。

Elisa结果为阳性的孔，分别收集细胞沉淀和上清。细胞沉淀冻存于-80℃冰箱，用于后续RNA的提取和抗体基因的扩增。

1.4抗体基因的扩增和筛选

提取阳性细胞的RNA，用一步法RT-PCR方法扩增抗体重链可变区VH和轻链基因可变区Vκ或Vλ。将扩增出的重链和轻链可变区基因分别克隆至含有重链基因恒定区的载体pIgH(GenBank：FJ475055)和轻链基因恒定区载体pIgκ或pIgλ(GenBank：FJ475056和FJ517647)上，构建每个阳性孔细胞的抗体基因重链和轻链可变区的迷你文库mVH和mVL，将mVH和mVL共转染293T细胞，若转染上清中的Env特异性抗体为阳性，则用重链单个基因VHn和轻链基因的文库mVL共转染293T细胞筛选单个的阳性抗体重链基因，并用轻链单个基因VLn和重链基因的文库mVH共转染293T细胞筛选单个的阳性抗体轻链基因。最后将阳性VHn和VLn共转染293T细胞，获得大量单克隆抗体，进行抗体特性的鉴定。具体操作在本发明人之一的管永军博士之前发表的专利“源自记忆B细胞的人单克隆抗体的快速表达克隆(申请号：2009 80154443.3，申请公布号：CN 102272158A)”中有详细描述。

1.5抗体基因的序列分析

将阳性质粒克隆送北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序引物为5′GCTTCGTTAGAACGCGGCTAC 3′。用AlignX软件对序列进行比对，并上传到http：//www.imgt.org网站进行IgG可变区氨基酸序列比对。

通过以上方法，从5例HIV-1感染者体内分离到8株与Env抗原特异性结合的单抗，其重链和轻链可变区核苷酸序列如下，其中下划线标注序列为内切酶位点：

＞B801.I1重链

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＞B801.I1轻链(κ链)

Accggtgtccactgtgaaatagtgatgatgcagtctccagccaccctgtcgttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtggatctgggacaaattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtcaacagtatgataatctccccctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaacgtacg(SEQ ID NO.2) 

＞B801.I2重链

accggtgtacattcccagatgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaggatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcagctgggtgcgccagatgcctgggaaaggcctggagtggatggggaggattgaccctactgcctcttataccaactaccgcccgtccttcgagggccacgtcaccatttcagttgacaagtccatcagcactgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagacatcaatcccagagttcctatgatagtagtgaaatgtttgactactggggccagggagccctggtcaccgtctcctcagcgtcgac(SEQ ID NO.3)

＞B801.I2轻链(λ链)

Accggtgtcctctcctcctatgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggaagcaggtccaatgtcggaagtaattatgtttcctggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatttataataataatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacgtcagcctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgagactgattattattgtgcagcatgggatgacaactttgaggaagtggcattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccaccctcgag(SEQ ID NO.4)

＞B801.I3重链

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＞B801.I3轻链(κ链)

accggtgtccactgtgatgttgtgatgacacagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggccagtcagagtattgatagccgattggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaacctcctgatctatgaggcatctactttagaaagtggggtcccctcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttggaacttattactgccaacactttaatacttactctctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaacgtacg(SEQ ID NO.6)

＞B358.I1重链

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＞B358.I1轻链(κ链)

accggtgtccactgtgatgttgtgatgacacagtctccaggcaccctgtctttgtctccgggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctttggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcaggagactggagcctgaagatttggcagtgtattattgtcagcagtatggtacctcaccatggacgttcggccaagggaccaagctggagatcaaacgtacg(SEQ ID NO.8)

＞D07.O1重链

accggtgtacattccgaggtacagctcgtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagcaataaatactacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggggccggagtggtctcgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcag cgtcgac(SEQ ID NO.9)

＞D07.O1轻链(κ链)

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＞D07.G1重链

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＞D07.G1轻链(κ链)

Accggtgtccactgtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcactcctggagaaccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctccatagtaatggaaacaactatttcgattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagttgctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggatcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgtatgcaagctctacaaactcctcgcacttttggccaggggaccaaagtggatatcaaacgtacg(SEQ ID NO.12)

＞L04.I1重链

Accggtgtacattcccaggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggcaccttcagcgatttttttatcagctgggtgcgacaggcccctggagaaggtcttgagtggatgggagggatcatccctccctttggta caacagattacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacgaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgacctccatgactggtaccgaggactattatgagaatggtggtcattacggaggtttctactttgactactggggccagggaaccacggtcaccgtctcctcagcgtcgac(SEQ ID NO.13)

＞L04.I1轻链(κ链)

Accggtgtccactgtgaaattgtgatgatgcagtctccagccaccctgtcgttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtggatctgggacaaattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtcaacagtatgataatctccccctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaacgtacg(SEQ ID NO.14)

＞L09.O1重链

Accggtgtacattcccaggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataatgattatgcagtatctgtgaaaagtcgaataaccatcaacccagacacatccaagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtgtgaaagatgagggggattactatggttcggggagttattataatccctactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcagcgtcgac(SEQ ID NO.15)

＞L09.O1轻链

Accggtgtccactgtgaagttgtgctgacatggtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaacgtacg(SEQ ID NO.16)

可变区氨基酸序列如下，其中标注下划线部分依次分别为重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3：

＞B801.I1重链

QMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASISWVRQAPGEGLEWMGG DYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.17)

＞B801.I1轻链(κ链)

EIVMMQSPATLSLSPGERATLSCRASLAWYQQKPGQAPRLLIY NRATGIPARFSGSGSGTNFTFTISSLQPEDIATYYCFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.18)

＞B801.I2重链

QMQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSISWVRQMPGKGLEWMGRNYRPSFEGHVTISVDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCWGQGALVTVSS(SEQ ID NO.19)

＞B801.I2轻链(λ链)

SYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSVSWYQQLPGTAPKLLIYQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDETDYYCFGGGTKLTVL(SEQ ID  NO.20)

＞B801.I3重链

QMQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKTSINWVRQAPGQGLEWMGG TYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.21)

＞B801.I3轻链(κ链)

DVVMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASLAWYQQKPGKAPNLLIYTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFGTYYCFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.22)

＞B358.I1重链

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASISWVRQAPGEGLEWMGGDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.23)

＞B358.I1轻链(κ链)

DVVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASLAWYQQKPGQAPRLLIFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIRRLEPEDLAVYYCFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.24)

＞D07.O1重链

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASMHWVRQAPGKGLEWVAVYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO.25)

＞D07.O1轻链(κ链)

EVVLTWSPLSLPVTLGQPASISCRSSLHWFHQRPGQSPRRLIYKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPEDVGVYYCFGQGTKVDIK(SEQ ID NO.26)

＞D07.G1重链

QMQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASMTWVRQAPGKGLEWVGR DYAAPVEGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKNEDTAVYYCWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.27)

＞D07.G1轻链(κ链)

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSFDWYLQKPGQSPQLLIYNR ASGVPDRISGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFGQGTKVDIK(SEQ ID NO.28)

＞L04.I1重链

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASISWVRQAPGEGLEWMGGDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.29)

＞L04.I1轻链(κ链)

EIVMMQSPATLSLSPGERATLSCRASLAWYQQKPGQAPRLLIYNRATGIPARFSGSGSGTNFTFTISSLQPEDIATYYCFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.30)

＞L09.O1重链

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISWNWIRQSPSRGLEWLGR DYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYC WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.31)

＞L09.O1轻链(κ链)

EVVLTWSPATLSLSPGERATLSCRASLAWYQQKPGQAPRLLIYNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.32)

1.6单克隆抗体的制备和纯化

消化293T细胞：从培养箱中取出293T细胞培养碟，倒去细胞培养上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一遍，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动使其铺匀至细胞培养碟，倒掉胰酶，然后放入孵箱内1min左右，取出用含10％FBS的DMEM培养基吹下细胞并计数，向T75细胞培养瓶加入293T细胞6×10⁶个，将培养瓶置于37℃，5％CO₂条件下培养过夜。将9μg的重链基因和9μg轻链基因质粒混合，加入到500μl无抗生素无血清的DMEM培养基中，室温放置5min，加入转染试剂Fugene HD 72μl，室温放置20min。然后将混合液加入到提前一天铺好细胞的T75细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂条件下培养。在转染后48～72h在转染细胞瓶中补加含10％FBS的DMEM培养液至50ml，继续培养，至转染后1周收集细胞上清。

将上一步中收集的转染后细胞培养上清1500r/min离心4min去沉淀，然后用0.45μm滤器过滤，收集滤液并以1～2滴/秒的速度流过蛋白A纯化柱，使IgG结合至蛋白A上。用PBS以5000g离心1min洗涤纯化柱2～3次，弃液，加入400ul IgG洗脱液轻轻混合，将柱子放进已加入40μl PH7.5～9的Tris-盐酸中和液的1.5ml离心管中，5000g离心1min，所得液体即为纯化的单克隆抗体，可反复洗涤2～3次，分别收集洗脱液。

用ELISA IgG定量试剂盒对纯化的抗体进行定量，具体操作为：包被Affinity purified  Human IgG 100ng/孔，室温温育1h，用含0.05％Tween的PBS洗板5次。用postcoat buffer200ul/孔室温封闭30min，洗板5次。在同一酶标板中加入加标准品和待测样品，标准品从第一孔以0.1μg/ml开始连续8个稀释度进行倍比稀释，做两个复孔；待测样品以一定稀释度连续8个稀释孔进行倍比稀释，做两个复孔，37℃孵育1小时，洗板5遍。每孔加入新鲜配制的TMB显色液100μl，室温避光反应20min。加入2mol/L硫酸50μl/孔终止反应。用酶标仪在450nm测定吸收值。以标准品及对应的OD值做散点图，据校准曲线计算出待测样品的IgG含量。

2抗体特性分析 

2.1 ELISA法测定抗体结合活性

将IgG定量后的纯化抗体从5μg/ml起做3倍系列稀释，每个稀释度做2个复孔。用不同的HIV-1Env抗原(gp120、FLSC、gp140和gp41)检测其结合活性，具体操作同1.3。

结果见图1，其中单抗B801.I1、B801.I2和L04.I1只与FLSC有结合活性，与其他几种抗原无结合活性；单抗B801.I3和B358.I1与FLSC结合活性最强，同时与gp120也有较弱的结合活性；单抗L09.O1和D07.O1与gp120和FLSC均有很强的结合活性，且与两者的结合活性无明显差异，同时与gp140也有较弱的结合活性；单抗D07.G1则只与gp41有很好的结合活性，与其他几种抗原均无结合活性。

2.2假病毒法测定中和抗体

将纯化的单克隆抗体做适当稀释，每个稀释度做2个复孔。将待中和的假病毒用含10％胎牛血清的DMEM做适当稀释，使病毒对照孔的检测荧光素酶活性(Relative Luminescence Units，RLU)为细胞对照孔的10～20倍。将单抗从100μg/ml起始做3倍比稀释，将25μl的抗体稀释液与等体积的病毒稀释液混合，37℃放置1h，每孔加入50μl浓度为2×10⁵/mL的TZM-BL细胞，并加入终浓度为15μg/mL的DEAE-Dextran。同时设只含病毒的病毒对照孔和只含细胞的对照孔。将96孔板置于37℃，5％CO2的培养箱内继续孵育48h。培养结束后，裂解细胞，检测RLU。样品孔、细胞对照孔以及病毒对照孔的RLU平均值分别为S、C和V，中和百分数＝[1-(S-C)/(V-C)]×100％。根据抗体浓度和中和百分数作图并计算半数抑制浓度(IC₅₀)值。

结果见表1，通过对5种HIV-1假病毒和一种对照假病毒MLV的中和活性检测，本文中获得的单抗中有3株对假病毒SF162有中和活性，有一株对Bal.01假病毒有中和活性。对其余几种假病毒均未检测到中和活性。

表1单抗对不同假病毒的中和活性(IC₅₀，μg/ml)

3  抗体ADCC活性检测

使用羧基二乙酸荧光素(5-(and 6-)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)和PKH26对靶细胞进行双色荧光标记，采用流式细胞计数的方法进行单克隆抗体的活性检测。简述如下：首先用来源于HIVBal的gp120蛋白包被靶细胞CEM-NKr，同时用未加gp120蛋白包被的CEM-NKr细胞作为对照，用CFSE和PKH26对靶细胞和对照细胞进行染色，然后将靶细胞浓度调整至1×10⁵细胞/mL，按照50μl/孔加入96孔细胞培养板中。按照100μl/孔加入不同浓度的抗体稀释液(从10μg/mL开始做倍比稀释，每个浓度做3个复孔)，抗体和靶细胞在室温作用15min后，按照效应细胞与靶细胞的比率为50∶1加入效应细胞(正常人PBMC)，400g离心3min，将培养板放于37℃作用4h，用PBS洗细胞1次，用4％的多聚甲醛固定细胞，用流式细胞仪检测CFSE和PKH26标记的细胞。使用b12作为阴性对照，其浓度为10μg/mL。杀伤率(％killing)＝PKH26阳性CFSE阴性细胞/PKH26阳性细胞×100％。

结果见图2，单抗B358.I1检测到很好的ADCC活性，在效靶比为50∶1，抗体浓度为0.15μg/ml时对靶细胞的杀伤率仍能达到40.9％。

4  单抗与可溶性CD4(sCD4)联合应用对HIV-1中和活性的影响

由于本发明中筛选到的多株抗体经与四种抗原的结合活性检测结果可见其中有6株单抗均为针对CD4i表位的抗体，这些抗体结合的表位在HIV-1与CD4分子结合以后才能暴露出来，因此，本文检测了在sCD4存在的情况下，抗体中和活性的变化。具体操作为：将抗体从100μg/ml起始用含0.5μg/mlsCD4(此浓度下的sCD4单独作用观察不到中和活性)的稀释液做3倍比系列稀释。将待中和的假病毒做适当稀释，将25μl的抗体稀释液与等体积的病毒稀释液混合，37℃放置1h，每孔加入50μl浓度为2×10⁵/mL的TZM-BL细胞，并加入终浓度为15μg/mL的DEAE-Dextran。同时设只含病毒的病毒对照孔和只含细胞的对照孔。将96孔板置于37℃，5％CO₂的培养箱内继续孵育48h。培养结束后，裂解细胞，检测RLU。样品孔、细胞对照孔以及病毒对照孔的RLU平均值分别为S、C和V，中和百分数＝[1-(S-C)/(V-C)]×100％。

结果见表2，可见有4株单抗在sCD4存在的情况下中和活性有所提高，在亚中和剂量的sCD4存在的情况下单抗B801.I3的IC₅₀的值从2.36μg/ml到了0.23μg/ml，降低了 10倍；单抗B358.I1的IC₅₀的值从1.58μg/ml到了0.07μg/ml，降低了22倍。这与这些抗体的特性有密切的关系，这些抗体均为CD4i表位抗体，其结合的表位只有在HIV-1与靶细胞表面的CD4分子结合以后才暴露出来，因此使用亚中和剂量的sCD4能明显提高其中和活性。同时也提示这些单抗如果能与诱导HIV-1表面的Env发生构象改变的CD4bs抗体如VRC01类的抗体联用，有可能提高彼此的中和活性。

表2.单抗与sCD4联合应用后中和活性的变化

参考文献： 

1.Ruppach，H.，et al.，Human immunodeficiency virus (HIV)-positive sera obtained shortly after seroconversion neutralize autologous HIV type 1isolates on primary macrophages but not on lymphocytes.J Virol，2000.74(12)：p.5403-11.

2.Kozbor，D.，A.E.Lagarde，and J.C.Roder，Human hybridomas constructed with antigen-specific Epstein-Barr virus-transformed cell lines.Proc Natl Acad Sci U S A，1982.79(21)：p.6651-5.

3.Karnasuta，C.，et al.，Antibody-dependent cell-mediated cytotoxic responses in participants enrolled in a phase I/II ALVAC-HIV/AIDSVAX B/E prime-boost HIV-1 vaccine trial in Thailand.Vaccine，2005.23(19)：p.2522-9.

4.Lambotte，O.，et al.，Heterogeneous neutralizing antibody and antibody-dependent cell cytotoxicity responses in HIV-1elite controllers. Aids，2009.23(8)：p.897-906.

5.Walker，L.M.，et al.，Broad and potent neutralizing antibodies from an African donor reveal a new HIV-1vaccine target.Science，2009.326(5950)：p.285-9.

6.Wu，X.，et al.，Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.Science，2010.329(5993)：p.856-61.

7.Walker，L.M.，et al.，Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature，2011.477(7365)：p.466-70.

8.Euler，Z.，et al.，Activity of broadly neutralizing antibodies，including PG9，PG16，and VRC01，against recently transmitted subtype B HIV-1variants from early and late in the epidemic.J Virol，2011.85(14)：p.7236-45.

9.Vu，J.R.，et al.，An immunoglobulin fusion protein based on the gp120-CD4receptor complex potently inhibits human immunodeficiency virus type 1in vitro.AIDS Res Hum Retroviruses，2006.22(6)：p.477-90.

Claims (8)

1.一种针对人类免疫缺陷病毒HIV包膜蛋白(Env)特异性抗体，所述抗体为全人源化抗体，能特异性与HIV包膜蛋白Env抗原结合，并对HIV具有中和活性和ADCC作用；所述抗体包含至少一个抗体重链可变段和一个抗体轻链可变段，所述抗体重链可变段和轻链可变段选自SEQ ID NO：23和24的组合。

2.一种编码权利要求1中任一项所述的抗体的核酸序列。

3.根据权利要求2所述的核酸序列，其中编码抗体重链段的核酸分别为SEQ ID NO：7，相对应的编码抗体轻链段的核酸分别为SEQ ID NO：8。

4.一种包含根据权利要求2或权利要求3所述的核酸序列的重组表达载体。

5.一种用权利要求4所述的重组表达载体转化的宿主细胞。

6.权利要求1所述的抗体，权利要求2或3所述的核酸序列，权利要求4所述的表达载体，权利要求5所述的重组细胞在制备治疗与人类免疫缺陷病毒(HIV)相关的疾病的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中与人类免疫缺陷病毒相关的疾病选自由获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、痴呆和淋巴瘤组成的组。

8.一种用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)相关的疾病的药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1所述的抗体，和/或权利要求2或3所述的核酸序列，和/或权利要求4所述的表达载体，与一种或多种药学上可接受的赋形剂结合。