CN116547535A - 鉴定冠状病毒的交叉反应性抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明用于鉴定冠状病毒的交叉反应性抗体的方法。此种抗体结合至少一常见人类冠状病毒的的S2胞外域的至少一部分，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV‑NL63、HCoV‑OC43、HCoV‑229E及HCoV‑HKU1，以及结合至少一高致病性人类冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS‑CoV‑1、MERS‑CoV及SARS‑CoV‑2。通过本文中所述的方法所鉴定的抗体特别适用于治疗或预防冠状病毒的感染，特别是对抗高致病性冠状病毒，例如SARS‑CoV‑1、MERS‑CoV及/或SARS‑CoV‑2以及典型的非人类冠状病毒的跨物种传播。
Description
技术领域
本发明涉及用于鱼类的早期性别决定的方法，特别是平头鲻鱼(flathead greymullet)以及生产此种鱼的偏好性别的单性群体的方法。
背景技术
冠状病毒是包膜RNA病毒，可感染哺乳动物及鸟类。α冠状病毒及β冠状病毒感染哺乳动物(例如，牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)；犬冠状病毒(caninecoronavirus，CCoV)，猫冠状病毒(feline coronavirus，FCoV)及人类冠状病毒(humancoronavirus，HCoV)，而γ冠状病毒及δ冠状病毒通常感染鸟类。大多数的冠状病毒仅感染一种宿主物种。然而，跨物种传播亦可能发生，且是人类疾病(即，人畜共患病)出现的重要原因。
冠状病毒编码许多病毒蛋白，包括刺突蛋白、膜蛋白、包膜蛋白及核衣壳蛋白。刺突蛋白(S蛋白)是一大的第I型跨膜、第I类融合蛋白。S蛋白的胞外域包含一个S1结构域及一个S2结构域。N端的S1结构域包括受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)，且负责受体结合。S1结构域，尤其是S1 RBD，已成为对抗特定的冠状病毒所开发的许多抗体及疫苗的目标位点。C端的S2胞外域负责融合，且包括一个UH(upstream helix)结构域(上游螺旋)、一个融合肽、两个七肽重复(heptad repeat)序列(HR1及HR2)、一个中央螺旋及一个β发夹。此等区域及此种区域的示例性序列是本领域已知的，且先前已经报道冠状病毒的序列比对(参见，例如，沃斯等人，Nature 2016 531:114-117，特别是延伸的数据图9)。
已知七种冠状病毒会感染人类。被四种人类冠状病毒感染，即，HCoVs-229E、OC43、NL63及HKU1感染，通常会导致轻度至重度的上呼吸道及下呼吸道疾病。此等病毒约占常见感冒的15％。被三种人类冠状病毒，即，中东呼吸综合征相关冠状病毒(Middle Eastrespiratory syndrome-related coronavirus，MERS-CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)及严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)；感染会导致严重的症状以及死亡。人类很可能从单峰骆驼感染MERS-CoV；从蝙蝠感染SARS-CoV；蝙蝠亦可能为SARS-CoV-2的储存宿主。
病毒受体结合及病毒融合对于病毒进入一宿主细胞是至关重要的。冠状病毒的刺突蛋白与不同的靶标结合，以介导传染性。SARS-CoV-2、SARS-CoV-1及NL63结合至ACE2、OC43及HKU1结合至9-O-乙酰化唾液酸、MERS-CoV结合至DPP4及唾液酸，以及229E结合至APN。在此等病毒之间的另一区别因子为是否存在人类弗林蛋白酶(furin)切割位点的病毒的刺突蛋白S。其存在于SARS-CoV-2、OC43、HKU1及MERS-CoV的S蛋白中，但不存在于NL43、229E及SARS-CoV的S蛋白中。
SARS-CoV-2亦称为COVID-19病毒(即，导致2019冠状病毒疾病的新型冠状病毒)。Covid-19大流行导致一场巨大的健康危机，为此迫切需要新的解决方案来预防、减轻或治愈此感染。本公开的一目的是提供一种用于增加对抗SARS-CoV-2以及其他的致病性冠状病毒的免疫力的方法及组合物。
在荷兰等国家，严重的COVID-19导致住院高峰的主要风险群体在介于70与80岁之间，而COVID-19死亡率高峰在介于80与90岁之间。此群体有越来越多的合并症，其中大多数是非传染性的。因此，COVID-19是一种衰老的急症，如肺炎球菌性肺炎、严重流感、带状疱疹及百日咳(圣坦斯马斯逸斯D等人，COVID-19是一种紧急的衰老的急症，MedRxiv 2020)。同一群体的免疫力下降，且针对此年龄群体的疫苗反应性不佳。这仍然是老年人疫苗效力的主要障碍。
发明内容
虽然不希望受理论的束缚，但本公开提出“常见”HCoV(例如，HCoVs-229E、OC43、NL63及HKU1)的感染，特别是同时感染或连续感染，会诱导对抗诸如致病性HCoV的异源病毒株的交叉反应性B细胞。本文中所公开的方法将此等交叉反应性B细胞与体内模型结合起来，以鉴定提供体内泛冠状交叉保护的抗体。此种方法不同于传统的研究，所述传统的研究根据例如体外中和活性研究或从恢复期的COVID-19患者中选择候选抗体。
从本文中所述的方法所鉴定出的抗体对于保护发生严重及可能危及生命的感染风险的受试者特别有用，包括严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)。此种抗体亦可用作预防冠状病毒的跨物种传播的第一道防线。
本发明提供以下较佳的实施例。然而，本发明不限于此等实施例。
在一方面，提供一种鉴定冠状病毒的交叉反应性抗体的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供来自一或多位人类受试者的血浆样本，优选地至少45岁或以上，所述样本在一时间点(X)独立地被收集，
(b)可选地且优选地，鉴定具有血浆样本的受试者，所述血浆样本具有结合至少两种，优选地至少四种人类冠状病毒(HCoV)的免疫球蛋白，其中所述HCoV是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1；
(c)提供来自所述经鉴定的受试者的PBMC样本，其中所述PBMC样本在时间点(X)或更晚被收集，且所述PBMC样本包括选自记忆B细胞、浆细胞及浆母细胞的B细胞；
(d)筛选由(c)的B细胞所编码的抗体或其抗原结合片段，以结合来自至少两种，优选地至少四种不同的冠状病毒的S(刺突)蛋白的S2胞外域的至少一部分；以及优选地筛选抗体或其抗原结合片段，以结合来自至少两种、优选地至少四种不同的冠状病毒的S蛋白的融合肽、HR1七肽重复序列或HR2七肽重复序列的至少一部分；
(e)选择抗体或其抗原结合片段，其结合至少一常见人类冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，以及结合至少一高致病性人类冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2；优选地，选择抗体或其抗原结合片段，其结合HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的S蛋白的S2结构域的至少一部分；优选地，选择抗体或其抗原结合片段，其结合SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的S蛋白的S2结构域的至少一部分；
(f)从(e)中选择抗体或其抗原结合片段，其抑制至少一常见人类冠状病毒的病毒融合、感染及/或复制，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，以及其抑制至少一高致病性人类冠状病毒的病毒融合、感染及/或复制，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2；
(g)确定来自(f)的经选择的抗体或其抗原结合片段在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的能力；优选地，确定所述经选择的抗体或其抗原结合片段在SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的能力；以及
(h)选择在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的抗体或其抗原结合片段；优选地，选择在SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的抗体或其抗原结合片段。
在一方面，提供一种用于鉴定冠状病毒的交叉反应性抗体的方法，所述方法包括步骤：
提供来自一或多位人类受试者的PBMC样本，其中所述PBMC样本包括选自记忆B细胞、浆细胞及浆母细胞的B细胞；
鉴定结合来自至少两种，优选地至少四种不同的冠状病毒中S(刺突)蛋白结合的至少一部分的B细胞；优选地，筛选抗体或其抗原结合片段，以结合来自至少两种、优选地至少四种不同冠状病毒的S蛋白的融合肽、HR1七肽重复序列或HR2七肽重复序列的至少一部分；
选择抗体或其抗原结合片段，其结合至少一常见人类冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，优选为HCoV-NL63，以及结合至少一高致病性人类冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2，优选为SARS-CoV-2；优选地，其中所述经选择的抗体或其抗原结合片段亦结合一动物冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分；优选地选择抗体或其抗原结合片段，其结合HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的S蛋白的S2结构域的至少一部分；优选地选择抗体或其抗原结合片段，其结合SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV2的S蛋白的S2结构域的至少一部分；
从上文中选择抗体或其抗原结合片段，其抑制至少一常见人类冠状病毒的病毒融合、感染及/或复制，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，以及其抑制至少一高致病性人类冠状病毒的病毒融合、感染及/或复制，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2；
确定所述经选择的抗体或其抗原结合片段在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的能力；优选地确定所述经选择的抗体或其抗原结合片段在SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的能力；以及
选择在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的抗体或其抗原结合片段；优选地选择在SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的抗体或其抗原结合片段。
优选地，所述方法包括步骤：提供来自多个受试者的额外的血浆样本，其中所述样本在一时间点(Y)被收集，其中时间点(Y)比时间点(X)早或晚至少3个月。
优选地，选择来自一受试者的血浆样本，相较于在较早或较晚的时间点所收集的受试者的血浆样本，其具有增加的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白结合至少两种HCoV。
优选地，所述血浆样本具有独立地结合至少两种HCoV的IgG、IgM及/或IgA免疫球蛋白。优选地，所述免疫球蛋白结合HCoV刺突蛋白的S2结构域。
优选地，所述方法包括步骤：
选择抗原结合片段，其结合至少一常见人类冠状病毒的S2结构域的至少一部分，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，以及结合至少一高致病性人类冠状病毒的S蛋白的S2结构域的至少一部分，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2；优选地，其中所述经选择的抗体或其抗原结合片段亦结合一动物冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分；
制备包含所述经选择的抗原结合片段的IgM、IgA或IgG抗体，
确定IgM、IgA或IgG抗体在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的能力；以及
选择IgM、IgA或IgG抗体，以预防或降低在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中的感染。
在一方面，提供一种治疗或预防被冠状病毒感染，特别是被SARS-CoV-1、MERS-CoV或SARS-CoV-2感染的方法，包括步骤：向有需要的受试者局部地、优选地鼻内施用如本文中所公开的抗体或其抗原结合片段。
附图说明
图1：NL63-S特异性记忆B细胞在FACS中的分选策略的实例。
图2：293T上清液的ELISA结果。F分选的NL63 S记忆B细胞衍生的抗体(在小规模HEK293T培养物中表达)与NL63 S、SARS-COV-2S及SARS-COV-2S2三聚体结合的ELISA结果。
图3：NL63 S记忆B细胞衍生的及经纯化的单克隆抗体(在更大规模的HEK293F培养物中表达)的FACS及ELISA结果。图(3A)：B/E分选及F分选的NL63衍生的与常见hCoV NL63、hCoV OC43 S及229E(仅B/E分选)及致病性hCoV SARS-CoV-2的S蛋白结合的FACS结果。图(3B)与致病性hCoV SARS-CoV-2S2三聚体结合的ELISA结果。
具体实施方式
为了应对SARS-CoV-2的大流行，人们已做出各种努力来开发SARS-CoV-2特异性疫苗，以预防感染。典型的疫苗开发依赖于使用致病性病毒并将病毒减毒，以用作“减毒活疫苗”或灭活病毒。亚单位疫苗亦可基于病毒的片段，例如表面蛋白而被开发。疫苗开发，尤其是与新病毒相关的疫苗开发，是一个漫长且艰难的过程。疫苗对于诸如老年人的高危人群亦可能效果较差。
人们亦努力从COVID-19患者中鉴定针对SARS-CoV-2的抗体。参见，例如，克雷尔C等人(从COVID-19患者中纵向的分离有效的近种系SARS-CoV-2中和抗体，MedRxiv 2020)，其描述鉴定来自COVID-19患者的中和抗体。
相反的，本文中所述方法所提供的解决方案并不依赖于来自COVID-19患者的SARS-CoV-2中和抗体。虽然不希望受理论的束缚，但本文提出，虽然从COVID-19患者中分离出的此种抗体可能特异性靶向感染一特定患者的SARS-CoV-2病毒株，但此种抗体在靶向进化中的SARS-CoV-2病毒株、其他致病性冠状病毒或易发生跨物种传播的动物冠状病毒方面的效果较差。如同MERS-CoV、SARS-CoV-1及SARS-CoV-2的爆发所证明的，冠状病毒的跨物种传播会导致疾病的出现。针对特定的HCoV病毒株具有高度特异性的抗体不太可能提供对抗此种新出现的HCoV(倘若存在)的显着性保护。
在一些方面，本公开提供一种用于鉴定冠状病毒的交叉反应性抗体的方法。在一步骤中，所述方法包括提供来自一或多个(例如，多个)人类受试者的血浆样本。在时间点(X)收集样本。各个受试者的采集时间点皆是独立的。
人类受试者最好从未感染过MERS-CoV、SARS-CoV-1或SARS-CoV-2。由于被MERS-CoV及SARS-CoV-1感染的数量相对较少，因此，于2019年底之前在未受MERS-CoV及SARS-CoV-1影响的地区所收集的所有样本很可能来自从未感染过MERS-CoV、SARS-CoV-1或SARS-CoV-2的受试者。
在一些实施例中，受试者至少40岁，更优选地至少45岁或以上。老年人感染多种HCoV的可能性更大。在一些实施例中，受试者为75岁或更年轻，更优选地65岁或更年轻。优选地，受试者年龄是介于45与65岁之间。
如下文更详细所描述，血浆样本可用于例如确定一受试者是否被感染或已被感染一或多种HCoV。在一些实施例中，所述方法进一步包括步骤：选择从被感染或已经被感染HCoV(优选地至少两种常见HCoV)的受试者所收集的血浆样本。因此，所述方法优选地包括步骤：选择具有结合人类冠状病毒(human coronavirus，HCoV)、优选地至少两种人类冠状病毒的免疫球蛋白的血浆样本，其中所述HCoV是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1。另有说明，可选择对于HCoV具有免疫反应性的血浆样本。优选地，所述血浆样本对于选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的至少三种及至少四种的HCoV具有免疫反应性。优选地，所述血浆样本对于HCoV NL63具有免疫反应性。优选地，血浆样本对于HCoV NL63及HKU1具有免疫反应性。
免疫反应性及免疫球蛋白结合是指在血浆样本中的免疫球蛋白将HCoV识别为抗原的能力。在本文中，所述免疫球蛋白不需要产生可检测的免疫作用。与两种病毒，例如，HCoV-NL63及HCoV-HKU1结合的增加的免疫球蛋白可指增加与HCoV-NL63及HCoV-HKU1结合的免疫球蛋白，但预计此种增加将是由于增加特别是与HCoV-NL63结合的免疫球蛋白以及与HCoV-HKU1结合的特定免疫球蛋白。
“常见”HCoV的序列以及由所述病毒所编码的病毒蛋白的序列在本领域中是已知的。冠状病毒的来源可为临床的分离株，例如，从人类患者的鼻腔或咽喉拭子中获得。所述病毒可在细胞系上繁殖，例如哺乳动物细胞系，例如，非洲绿猴肾细胞(vero cell)、犬肾(MadinDarby，MDCK)细胞及PERC6细胞。示例性的HCoV-NL63序列描述于WO2005017133中。一些临床分离株的基因组序列亦是公开的；例如，人类冠状病毒NL63分离株Amsterdam496的基因组序列，其具有登录号DQ445912(VRL 21-NOV-2006)是描述匹克等人(J.Mol.Biol.364(5)，964-973(2006)中；人类冠状病毒NL63分离株Amsterdam 057的基因组序列，其具有登录号DQ445911(VRL21-NOV-2006)是描述于匹克等人(J.Mol.Biol.364(5)，964-973(2006)中；人类冠状病毒NL63分离株ChinaGD01的基因组序列，其具有登录号MK334046(28-FEB-2020)是描述于张等人(Microbiol Resour Announc 9(8)，e01597-19(2020))中；人类冠状病毒NL63分离株ChinaGD05的基因组序列，其具有登录号MK334045(VRL 28-FEB-2020)是描述于张等人(Microbiol Resour Announc 9(8)，e01597-19(2020))；人类冠状病毒NL63分离株NL63/人类/美国/891-4/1989的基因组序列具有登录号KF530114(VRL26-SEP-2014)；以及人类冠状病毒NL63分离株NL63/人类/美国/838-9/1983的基因组序列具有登录号KF530110(VRL 26-SEP-2014)。对于以上所列出的六个分离株的BLAST分析表明其共享大于98％的序列同一性。
数种HCoV-229E临床分离株的基因组序列已被公开；例如，人类冠状病毒229E分离株0349的基因组序列其具有登录号JX503060(VRL04-APR-2013)是描述于法萨尼等人(Virus Genes 45(3)，433-439(2012))中。；人类冠状病毒229E分离株J0304的基因组序列，其具有登录号JX503061(VRL 04-APR-2013)是描述于法萨尼等人(Virus Genes 45(3)，433-439(2012))中；人类冠状病毒229E/西雅图/美国/SC9724/2018的基因组序列具有登录号MN369046(VRL 21-FEB-2020)；人类冠状病毒229E/人类/美国/933-40/1993的基因组序列具有登录号KF514433(VRL 26-SEP-2014)；人类冠状病毒229E/BN1/GER/2015的基因组序列具有登录号KU291448VRL(04-SEP-2016)；以及人类冠状病毒229E/西雅图/美国/SC1212/2016的基因组序列具有登录号KY369911(VRL 21-FEB-2020)。对于以上所列出的六个分离株的BLAST分析表明其具有大于99％的序列同一性。此外，所述病毒亦可如人类冠状病毒229E从ATCC公开获得(ATCC VR-740；哈姆雷D、普罗克诺JJ.一种从人类呼吸道所分离的新病毒，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.121：190-193，1966)。
数种HCoV-HKU1临床分离株的基因组序列已被公开；例如，人类冠状病毒HKU1分离株Caen1的基因组序列具有登录号HM034837(VRL08-OCT-2010)；人类冠状病毒HKU1分离基因型A的基因组序列具有登录号AY597011(VRL 27-JAN-2006)；人类冠状病毒HKU1/人类/美国/HKU1-15/2009的基因组序列，其具有登录号KF686344(VRL 26-SEP-2014)是描述于多明格斯等人(J.Gen.Virol.95(PT 4)，836-848(2014))中；人类冠状病毒HKU1/人类/美国/HKU1-5/2009的基因组序列具有登录号KF686340(VRL 26-SEP-2014)；人类冠状病毒HKU1/人类/美国/HKU1-11/2009的基因组序列具有登录号KF430201(VRL 26-SEP-2014)。对于以上所列出的六个分离株的BLAST分析表明其具有大于99％的序列同一性。
数种HCoV-OC43临床分离株的基因组序列已被公开；例如，人类冠状病毒OC43分离株MDS16的基因组序列具有登录号MK303625(VRL30-MAR-2019)；人类冠状病毒OC43分离株MDS12的基因组序列具有登录号MK303623(VRL 30-MAR-2019)；人类冠状病毒OC43/西雅图/美国/SC9428/2018的基因组序列具有登录MN310476(VRL 21-FEB-2020)；人类冠状病毒OC43/西雅图/美国/SC9430/2018的基因组序列具有登录号MN306053(VRL 21-FEB-2020)；人类冠状病毒OC43/人类/美国/9211-43/1992的基因组序列具有登录号KF530097(VRL 26-SEP-2014)；人类冠状病毒OC43/人类/美国/873-6/1987的基因组序列具有登录号KF530087(VRL26-SEP-2014)。对于以上所列出的六个分离株的BLAST分析表明其具有大于98％的序列同一性。
分析针对HCoV的免疫反应性的方法是本领域已知的。参见，例如陈KH等人，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒感染的患者的血清学反应以及与人类冠状病毒229E、OC43及NL63的交叉反应，Clin Diagn Lab Immunol，2005年11月；12(11):1317-21；12(11)：1317-21；克莱默AR等人，选自免疫库的狂犬病病毒糖蛋白特异性人类抗体库，Eur J Immunol，2005年7月；35(7)：2131-45；以及波尔-科佩1995Journal of Virological Methods 55：175-183.此种方法包括，例如，使用病毒蛋白或其片段，以便使用例如蛋白质印迹分析、ELISA的或任何其他已知的免疫分析来检测在血浆样本中所存在的免疫球蛋白。优选地，所述方法包括确定(定性或定量)结合HCoV的免疫球蛋白的存在。优选地，所述方法包括步骤：确定血浆样本对于一种或多种HCoV的免疫反应性。
如对于本领域技术人员显而易见的，与HCoV的免疫反应性或抗体结合包括与由所述病毒所编码的蛋白质的免疫反应性或抗体结合。优选地，所述方法选择具有增加结合HCoV S蛋白的S2结构域的免疫球蛋白的血浆样本。
虽然不希望受理论的束缚，但对于HCoV的免疫反应性被认为是被HCoV感染或既往感染的指标。优选地，所述方法检测IgM、IgA或IgG。更优选地，检测IgM及IgA，因为此等免疫球蛋白是早期感染的指标。本领域技术人员能够容易地确定结合HCoV的免疫球蛋白水平是否指示感染或是否在背景水平内。例如，倘若可以在至少8倍稀释的血浆中检测到抗体，则表明存在免疫反应性。
在所述方法的一些实施例中，可随时间从同一受试者收集更多的血浆样本。例如，可以每3、6、9或12个月或其任何组合收集一次样本。在一些实施例中，所述方法包括步骤：提供在一时间点(Y)所收集的血浆样本，其中所述时间点(Y)比时间点(X)早或晚至少3个月。
在不同的时间点从同一个受试者所采集的样本具有以下的优点，即可通过比较在样本之间的HCoV特异性免疫球蛋白水平，以确定一受试者在一特定时间点的病毒感染的情况。例如，相较于在先前的时间点所收集的样本，血浆中的HCoV-NL63特异性免疫球蛋白水平的增加表明受试者在收集所述样本时感染(或最近感染)HCoV-NL63。
本领域技术人员可容易地确定免疫球蛋白水平的差异是否“显着”。例如，虽然IgM水平增加10％可被认为是显着的，然而，IgM及IgA水平较小的增加(例如，5％)可被认为是显着的。
在时间点(X)的血浆样本对于至少两种HCoV具有免疫反应性的受试者很可能在时间点(X)或之前感染至少两种HCoV。虽然不希望受理论的束缚，但本公开提供来自一些此等受试者的B细胞可编码交叉反应性泛冠状抗体。因此，所述方法进一步公开提供来自所述受试者的PBMC样本。所述PBMC样本在时间点(X)或之后被收集。本领域技术人员将认识到“在时间点(X)”亦包括时间点X之前的数天。
如本领域技术人员将理解，血浆样本是指包含血浆的样本，以及PBMC样本是指包含PBMC的样本。虽然血浆样本及PBMC样本可为相同的样本，例如血液样本(例如，在时间点(X)收集)，但为了长期储存，此等两种成分通常是分开的。在一实施例中，可在时间点X从一受试者获得血液样本。倘若需要，可进一步处理血液样本，以制备可单独长期储存的血浆样本及PBMC样本，。处理血浆及PBMC以供储存的方法是本领域众所周知的。
在一些实施例中，如本文所述，所述方法包括步骤：提供来自一受试者的血浆样本，以及检测免疫反应性。之后可从对至少两种HCoV显示出免疫反应性的血浆样本的受试者获得PBMC样本。在一些实施例中，所述方法包括步骤：提供来自多个人类受试者的样本，其中针对各个受试者，所述样本包括一对样本，所述一对样本包括在一时间点(X)所收集的血浆样本及外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)样本。在一些实施例中，所述方法包括步骤：提供来自一受试者的至少第二对样本，其包括在一时间点(Y)所收集的血浆样本及外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)样本，其中时间点(Y)至少比时间点(X)早或晚3个月。
所述方法包括步骤：提供含有记忆B细胞的PBMC样本。如本文中所使用，“记忆B细胞”是指CD27+/IgA+；CD27+/IgG+；CD27+/IgM+及CD27+/IgM+/IgD+记忆B细胞，其亦可为CD19+、CD22+及/或CD24+。
在一些实施例中，记忆B细胞可从其他的PBMC中分离或富集。记忆B细胞的特征以及分离或富集此种细胞的方法是本领域已知的。例如，记忆B细胞可通过使用抗CD27微珠进行阳性细胞分选而被富集。
所述方法进一步包括步骤：筛选由记忆B细胞所编码的抗体，以结合来自不同的冠状病毒的S2胞外域的至少一部分。虽然在某些情况下可筛选来自所有的记忆B细胞的抗体，但本公开涵盖仅使用部分的B细胞。在一些实施例中，来自数种不同的冠状病毒的完整S蛋白或S2胞外域是被用于筛选抗体。在一些实施例中，对应于选自UH、FP、HR1、中心螺旋、β-发夹及HR2结构域的结构域的肽是用于筛选抗体的结合。在一些实施例中，肽对应于选自FP、HR1或HR2结构域的结构域。肽不需要对应于如上所述的整个结构域，但亦包括含有所述结构域的至少一部分的肽。在一些实施例中，肽具有10个至200个氨基酸，优选地12个至50个氨基酸。在一些实施例中，筛选结合S2胞外域的至少一部分的抗体或其抗原结合片段的步骤是指进行结合分析，以鉴定结合所述S2胞外域的至少一部分的抗体。
在一些实施例中，筛选以及优选地选择结合至少一常见人类冠状病毒以及至少一高致病性人类冠状病毒的抗体，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，以及所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2。在一些实施例中，筛选以及优选地选择结合HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的抗体。在一些实施例中，筛选以及优选地选择结合SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的抗体。在一些实施例中，筛选以及优选地选择结合非人类冠状病毒的抗体，所述非人类冠状病毒例如猪、牛、马、骆驼、猫、狗、啮齿动物、鸟类、蝙蝠、兔、雪貂或水貂冠状病毒。优选地，筛选结合5种或更多种或甚至10种或更多种不同的冠状病毒的抗体。
在一优选的实施例中，筛选结合来自至少一高致病性HCoV、至少一常见HCoV及至少一动物CoV的S2胞外域的抗体。在一些实施例中，选择结合选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的至少一常见人类冠状病毒的抗体；选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的至少一高致病性人类冠状病毒的抗体；选自猪、牛、马、骆驼、猫、狗、啮齿动物、鸟类、蝙蝠、兔、雪貂或水貂冠状病毒的至少一动物冠状病毒的抗体。参见，例如，兽医病毒学(Fenner’s Veterinary Virology)，第24章-冠状病毒科2017，第435-461页，以及CoVDB的序列(位于covdb.popgenetics.net/v1/的冠状病毒数据库)。
在本公开的示例性实施例中，筛选抗体以确定与HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV-1、MERS-CoV、SARS-CoV-2，以及至少一动物冠状病毒的S2胞外域的结合。优选的抗体表现出与所有测试的S2胞外域的结合。然而，本领域技术人员能理解，仅结合一子集的抗体亦可用作交叉反应性抗体。
如本领域技术人员所清楚的，相应的抗原结合片段亦可用于筛选步骤。抗体的抗原结合片段包括Fab、F(ab’)2及Fv片段。优选地，抗原结合片段包括重链的CDR1至CDR3及轻链的CDR1至CDR3。更优选地，抗原结合片段包括轻链及重链可变区。
例如，在一些实施例中，可使用由记忆B细胞所编码的抗体序列(即，可变链结构域)构建一单链可变片段(single chain variable fragment，ScFv)噬菌体展示抗体库。参见，例如，克莱默AR等人。选自免疫库的狂犬病病毒糖蛋白特异性的人类抗体库，Eur JImmunol，2005年7月；35(7):2131-45.)。之后通过(生物)淘选来筛选与抗原(对应于S蛋白的S2结构域)结合的噬菌体的噬菌体展示库。
在一些实施例中，可进行单细胞筛选，以鉴定结合一特定靶标的B细胞。其可用作例如产生噬菌体展示库之前的初始步骤。在一些实施例中，筛选B细胞结合来自一组冠状病毒的S2胞外域的能力。之后将阳性B细胞用作产生噬菌体展示库的来源，以鉴定与多种冠状病毒发生交叉反应的抗原结合片段。
在其他的实施例中，可筛选由所述B细胞所产生的抗体。例如，在一些实施例中，B细胞被永生化，以及针对所述组筛选经分泌的抗体。B细胞可通过例如利用爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr，EBV)感染的B细胞而被永生化，以及可培养单个克隆。EBV永生化细胞的永生化及克隆效率亦可通过使用在记忆B细胞上表达的模式识别受体(PatternRecognition Receptor)的激动剂，例如TLR-7、TLR-9或TLR-10激动剂(参见，例如，US9290786B2)
筛选免疫球蛋白以确定抗原结合的方法是本领域已知的。可使用西方印迹分析、ELISA或任何其他已知的免疫分析。例如，肽可连接至固体表面，例如肽微阵列(即，肽芯片)。在一些实施例中，可进行Pepscan分析，例如，其中针对免疫球蛋白结合来筛选跨越S2结构域的重叠15个聚体线性肽(参见，例如，克莱默等人，选自免疫库的狂犬病病毒糖蛋白特异性人类抗体库，Eur J Immunol，2005年7月；35(7)：2131-45)。S2结构域或其部分亦可在细胞表面上表达，以及用于筛选免疫球蛋白的结合。
被鉴定为编码或表达结合S2结构域的抗体的B细胞可用作用于克隆抗体基因的核酸的来源。
所述方法进一步包括步骤：选择抗体或其抗原结合片段，其结合至少一常见人类冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，以及结合至少一高致病性人类冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2。在优选的实施例中，选择抗体或其抗原结合片段，其结合HCoV-NL63的HR1结构域、HCoV-OC43的HR1结构域、HCoV-229E的HR1结构域及HCoV-HKU1 HR1结构域，及/或结合SARS-CoV-1的HR1结构域、MERS-CoV的HR1结构域及SARS-CoV-2的HR1结构域。
所述方法进一步包括步骤：选择抗体或其抗原结合片段，其抑制至少一常见人类冠状病毒的病毒融合、感染及/或复制，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，以及其抑制至少一高致病性人类冠状病毒的病毒融合及/或抑制细胞感染性，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2。病毒融合分析、感染分析及复制分析是本领域技术人员众所周知的，以及用于执行此种方法的示例性方法描述于本文的实例中。例如，已经开发由各种HCoV的S蛋白所介导的多种细胞-细胞融合分析(夏S、严L、徐W等人，一种针对人类冠状病毒刺突的HR1结构域的泛冠状病毒融合抑制剂，Sci Adv，2019；5(4))。假型病毒感染分析，如刘等人所述(Nat.Commun.5，3067(2014)，亦可被使用。亦描述检测HCoV复制的分析法(参见实例)。本领域技术人员清楚，无需完全抑制，以及本领域技术人员能够鉴定显着抑制病毒融合、感染或复制的抗体。优选地，抗体导致抑制至少50％。
在一些实施例中，所述方法包括步骤：检测抗体或抗原结合片段对于病毒融合、感染及/或复制的影响。在本公开的示例性实施例中，筛选抗体以确定对于HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV-1、MERS-CoV、SARS-CoV-2，以及至少一动物冠状病毒的融合、感染或复制的影响。优选的抗体抑制HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV-1、MERS-CoV、SARS-CoV-2及至少一动物冠状病毒的融合、感染及/或复制。然而，本领域技术人员将理解仅抑制与冠状病毒的亚群的融合、感染及/或复制的抗体亦可用作交叉反应性抗体。
所述方法进一步包括步骤：确定所述经选择的抗体或其抗原结合片段在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的能力。抗原结合片段，例如，scFv，可用于体内模型。优选地，使用IgG、IgM或IgA形式的全长抗体。将可变区克隆成全长形式或不同的全长形式的方法是本领域已知的。参见，例如，伯尔E等人，从噬菌体展示库衍生的单链Fv抗体片段所构建的所有同型的功能性人单克隆抗体，JImmunol Methods，2000年5月26日；239(1-2)：153-66。在一些实施例中，可以数种形式，例如以IgG、IgM及IgA形式，测试来自一特定抗体的抗原结合片段，以确定抗体形式是否会影响功能。
SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2感染的体内模型是已知的。SARS-CoV-2感染的合适的体内模型是描述于例如，西亚，S.F.、严，L.、静，A.W.H.等人，SARS-CoV-2在金仓鼠中的发病机制及传播，Nature(2020)中。合适的MERS-CoV感染的体内模型描述于例如，金J等人，中东呼吸综合征冠状病毒感染已建立的hDPP4转基因小鼠可通过激活促炎反应及肺纤维化而加速肺损伤，J Microbiol Biotechnol，2020年3月28日；30(3)：427-438中。SARS-CoV-1感染的合适的体内模型描述于例如，罗伯茨等人，Virus Research，2008 133:20-32中。
体内感染的预防或降低包括增加对感染的抵抗力或改善抵抗感染的能力(例如，可在症状出现之前清除感染，或经历的症状较轻微)。死亡率、体重减轻及肺部病理学可用作预防或降低体内感染的能力的指标。
一方面，本公开提供一种冠状病毒交叉反应性抗体。所述抗体结合至少一种，优选地至少两种选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV。所述抗体亦结合至少一种、至少两种、至少三种或至少四种选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的HCoV。优选地，所述抗体亦结合至少一种或多种动物冠状病毒，例如猪、牛、马、骆驼、猫、狗、啮齿动物、鸟类、蝙蝠、兔、雪貂或水貂冠状病毒。优选地，所述抗体结合S蛋白的S2结构域。优选地，所述抗体结合S蛋白的融合肽、HR1或HR2。在一些实施例中，根据本文中所公开的方法鉴定所述抗体。
本文中所鉴定的抗体可用于提高个体对抗冠状病毒的免疫力。术语“提高免疫力”是指提高个体对抗一特定抗原(例如，冠状病毒)的免疫反应。提高免疫力可导致增强对感染的抵抗力或可改善一个体抵抗感染的能力(例如，感染可在症状出现之前被清除，或症状较轻微)。提高免疫力不要求完整的免疫力，亦包括部分的免疫力。本领域技术人员将清楚，本文中所公开的方法及组合物可用于预防或降低冠状病毒感染及/或降低冠状病毒感染的严重程度。所述方法及组合物亦可用于预防或降低与冠状病毒感染相关的症状的严重程度。特别地，提高的免疫力是指被动免疫，例如通过施用抗体。
在一些实施例中，增加的免疫力是指提供消除性免疫。与允许感染但有效的清除感染的免疫力相反，消除性免疫可防止有效的病毒感染。在一些实施例中，本文中所公开的组合物提供消除性免疫。在一些实施例中，包含本文中所公开的抗体的组合物提供至少一天，优选地至少一周的消除性免疫。在一些实施例中，包含本文中所公开的抗体的组合物提供持续1周至2周的消除性免疫。
本公开提供一种用于增加对抗冠状病毒的免疫力的方法及组合物。优选地，所述个体是人类，以及所述冠状病毒是人类冠状病毒，即，能够感染人类的病毒。优选地，冠状病毒是一高致病性病毒，或者更确切地说是一种可导致被感染的患者出现严重症状的病毒。在一些实施例中，本文中所使用的高致病性病毒是指具有1％以上的致死率的病毒。示例性高致病性冠状病毒包括MERS-CoV(病死率约为34％)、SARS-CoV-1(病死率约为9.5％)及SARS-CoV-2(病死率约为2％)(彼得罗西洛等人，Clinical Microbiology and Infection，第26卷，第6期，2020年6月，第729-734页)。致病力亦可根据症状的严重程度来定义。例如，在一些实施例中，本文中所使用的高致病性冠状病毒是指在至少10％的被感染的个体中引起急性呼吸窘迫综合征的病毒，所述病毒包括SARS-CoV-1、SARS-CoV-2及MERS-CoV(彼得罗西洛等人，2020年)。在优选的实施例中，所述冠状病毒是α-冠状病毒或β-冠状病毒。
在一些实施例中，本公开提供一种编码本文中所公开的抗体的核酸分子。本公开的另一方面提供一种包含本文中所公开的核酸分子的载体及表达载体。可用于本公开的表达载体包括痘苗病毒、逆转录病毒及杆状病毒。所述表达载体可包括本文中所公开的核酸序列或其片段，其是在诸如启动子的调控元件下所控制，或可操作地连接至诸如启动子的调控元件。称为启动子的DNA片段负责调控DNA转录为mRNA。所述表达载体可包括适合基因在例如植物细胞、真菌细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或其他的真核细胞中表达的一或多种启动子。
包含本文中所述的抗体的组合物可与药学上可接受的载体、稀释剂及/或佐剂一起配制。药学上可接受的载体或稀释剂的实例包括软化水或蒸馏水；生理盐水；植物油、纤维素衍生物、聚乙二醇等。
优选地，本文中所公开的抗体是局部给药，或者更确切地说非为全身给药。局部给药包括对皮肤、眼睛及粘膜的给药。在优选的实施例中，将所述组合物施用至粘膜，例如支气管、食道、鼻及口腔粘膜以及舌头。优选地，所述组合物通过鼻吸入而提供。所述组合物亦可作为乳霜或乳液提供至鼻。所述组合物亦可通过口腔吸入或施用至口腔粘膜，例如作为漱口水。在一些实施例中，所述组合物不经肠胃外给药(例如，不通过静脉内(intravenous，IV)、肌肉内(intramuscular，IM)、皮下(subcutaneous，SC)或皮内(intradermal，ID)给药)。
在可能遇到一高致病性冠状病毒之前，可预防性或“根据需要”施用所述组合物。例如，所述组合物可每天给药一次。在个体留在家中且无暴露风险的日子里，可跳过所述组合物的给药。
如本文中所使用，“包括”及其变形是以其非限制性意义使用，意指包括所述词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，动词“由…组成”可替换为“基本上由…组成”，意为如本文中所所定义的化合物或辅助化合物可包括除了具体确定的彼等之外的额外组分，所述额外组分不改变本发明的独特性。
冠词“一(a)”及“一(an)”在本文中是用于指代冠词的一个或多个(即，至少一个)语法对象。例如，“一元素”是指一个元素或一个以上的元素。
当与数值(大约10，约10)结合使用时，词语“大约”或“约”优选地表示所述值可为给定值的10或多于或少于所述值的1％。
如本文中所使用，如本文所述，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”及“治疗(treating)”指逆转、减轻、延迟一疾病或病症的发作或抑制其进展。在一些实施例中，可在一或多种症状出现后进行治疗。在其他的实施例中，可在无症状的情况下进行治疗。例如，可在症状发作之前，对易感个体进行治疗。在所述症状消失之后，亦可继续治疗，例如预防或延缓其复发。如本文中所使用，术语“预防”无需绝对性预防例如感染，但可降低感染的风险或可能性。
本说明书中所引用的所有专利及文献参考皆通过引用整体并入本文中。
实例：
在以下的实例中进一步解释本发明。此等实例不限制本发明的范围，而仅用于阐明实施本发明的一种可能方式。本领域技术人员将认可可使用其他的方法。
实例1：
如下所示，血浆及PBMC样本是从数个人类受试者中所获得的。
从每位供体中，将10毫升血液收集在补充有肝素钠作为抗凝剂的Vacutainer管(10毫升)中。在收集血浆及外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)之后的八小时内，根据制造商的说明使用，Ficoll-Paque(GE Healthcare Bio SciencesAB，乌普萨拉，瑞典)密度梯度离心法以分离血浆及外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)。收集血浆，并将其转移至一毫升的Nalgene冷冻管(Nalgene)中。
收集含有PBMNC的血沉棕黄层，并在冷的(+4℃)磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffered saline，PBS)中清洗三至五次，以去除存在于血沉棕黄层中的血小板。在最后的洗涤步骤之后，含有PBMNC的细胞沉淀是利用含有10％二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、40％热灭活胎牛血清(fetal calf serum，FCS)及50％ RPMI 1640培养基的冷的冷冻培养基进行稀释，其浓度为5x 106个细胞/毫升。在连续的混合下，将冷冻培养基滴加至细胞悬液中。将细胞悬浮液转移至一毫升的Nalgene冷冻管中。
将含有血浆或PBMNC细胞悬液的冷冻管置入Mr.Frosty冷冻容器(Nalgene)中，并在-80℃下过夜，之后转移至液氮中，以进行长期储存。
实例2：
使用以下的一或多种方法测试血浆样本对于HCoV的免疫反应性。
1.ELISA测试：
HCoV-OC43、HCoV-229、HCoV-NL63及HCoV-HKU1的N(NCt)蛋白的S、N及/或c端的抗体水平是通过ELISA测定。至此，HCoV-OC43、HCoV-229、HCoV-NL63及HCoV-HKU1的S、N及NCt序列的克隆、表达及纯化是如前所述(迪克曼R、杰宾克MF、El伊德里西NB、匹克K、穆勒MA、葵柏TW等人，儿童冠状病毒NL63及229E血清转化，J Clin Microbiol2008；46(7月(7))：2368-73；迪克曼R、杰宾克MF、冈特E等人，婴儿冠状病毒OC43及NL63感染的优势，J Clin Virol，2012；53(2)；135-139)。如前所述进行ELISA(埃德里奇等人，冠状病毒保护性免疫是短暂的，medRxiv 2020.05.11.20086439)。简言之，96个半面积微孔板(Greiner Bio-one)在4℃下利用在0.1M碳酸盐缓冲液pH 9.6中所稀释的3μg/mL蛋白质涂覆过夜。非特异性结合位点是利用添加5％脱脂牛奶(Fluka)的磷酸盐缓冲盐水-0.1％ Tween 20(phosphate-buffered saline-Tween 20，PBST)进行封闭，在室温下轻轻摇动1小时。血清样本在含有1％脱脂牛奶的PBST中，以1：200进行稀释，并在盘中进行培养，在室温下轻轻摇动2小时。洗涤之后，加入在1％脱脂牛奶-PBST中所稀释(1：1500)的碱性磷酸酶缀合的抗人免疫球蛋白G Fcγ-尾抗体(杰克逊免疫研究所)。在室温下温和地摇动1小时培养后，洗涤所述盘，并利用Lumi-Phos Plus(Lumigen)显影信号，在室温下且在黑暗中温和地摇动1小时。使用Glomax 96盘光度计(Promega)进行检测。所有的血清双重复或三重复进行测试，并归一化，以校正发光时间的差异。针对各个标准化观察，计算在技术性重复之间的标准偏差(对同一血清样本的新稀释液进行双重复或三重复的ELISA)。
2.Pepscan分析：
通过Fmoc偶联在Pepscan水凝胶的固体支持物上合成来自HCoV-OC43、HCoV-229、HCoV-NL63及HCoV-HKU1的S蛋白序列的14个残基重迭的15个聚体肽(朗格代克JPM、泽克维尔德MJ、瑞特M、科尔蒂D、贝克JW，用于先导识别及相互作用位点映射的螺旋肽阵列，Anal.Biochem，2011；417：149-155，[PubMed：21708118])。肽库是利用1：1000稀释的热灭活人血清进行探测。充分洗涤之后，加入山羊抗人HRP偶联二抗，之后使用2,2’-偶氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)进行显色。电荷耦合装置相机是用于量化于405nm处的吸光度。针对各个单独的Pepscan数据集，数据皆被归一化为从整体分析中得出的平均信号强度。
3.使用HCoV测试AB滴度：
针对HCoV-OC43、HCoV-229、HCoV-NL63及HCoV-HKU1的抗体滴度是通过免疫荧光测试而确定的，如前所述，并进行一些修改(陈KH等人，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒感染的患者的血清学反应以及与人类冠状病毒229E、OC43及NL63的交叉反应，Clin DiagnLab Immunol，2005Nov；12(11)：1317-21)。
简而言之，使用经HCoV-OC43及HCoV-HKU1感染的HCT-8、经HCoV-229感染的MRC-5细胞及经HCoV-NL63感染的LLCMK2细胞涂片进行研究。当60％至70％的细胞存在病毒抗原表达的证据时，将细胞在20℃的冷冻丙酮中固定10分钟，并在80℃下储存，直至被使用为止。如上文所述，使用间接免疫荧光进行抗体检测。选择对至少两种HCoV具有免疫反应性的血浆样本。
从血浆样本中选择对至少两种HCoV的S蛋白、S2结构域或N蛋白结构域具有免疫反应性的供体。
实例3：
来自供体的PMBC样本，其血浆样本显示对如实例2中所确定的来自至少两种HCoV的S或N蛋白的免疫反应性，所述PMBC样本是用作记忆B细胞的来源，如下所述，使用标准噬菌体展示、B细胞永生化或单B细胞分选方法来分离抗体。
记忆B细胞的选择：
B细胞是从PBMC样本中富集。如前所述，记忆B细胞是利用特异性荧光偶联抗体进行标记，及利用流式细胞仪进行分选(思比M等人，从人类IgM+记忆B细胞中所回收的H5N1及H1N1交叉保护的异亚型中和单克隆抗体，PLoS One，2008年；3(12):e3942、埃勒贝迪AH等人，在人类的病毒感染及接种疫苗之后，确定血液中的抗原特异性浆母细胞及记忆B细胞亚群，Nat Immunol.2016；17(10)：226-1234、拉默特J等人，在人类的急性登革热病毒感染期间，快速及大量的病毒特异性浆母细胞反应，J Virol.2012年3月；86(6)：2911-8、帕斯夸尔G等人，无症状个体对于过度磷酸化Tau的免疫记忆，Acta Neuropathol 2017年5月；133(5)：767-783)分选的细胞被收集为细胞部分或单细胞)。
实例3A：
在一些实验中，如下所示，B细胞是用于构建噬菌体展示抗体库。单链可变片段(single chain variable fragment，ScFv)噬菌体展示库的构建是如前所述(克莱默AR等人，从免疫库中选择的狂犬病病毒糖蛋白特异性人类抗体库，Eur J Immunol.2005年7月；35(7)：2131-45)。简而言之，使用从记忆B细胞所分离的抗体基因构建噬菌体库。通过使用菌落PCR分析随机挑选的克隆，以验证所述库的质量。
S2结构域特异性scFv噬菌体的噬菌体展示选择基本上是如前所述来进行(克莱默AR等人，从免疫库中选择的狂犬病病毒糖蛋白特异性人类抗体库，Eur J Immunol.2005年7月；35(7)：2131-45)但使用跨越HCoV-OC43、HCoV-229、HCoV-NL63、HCoV-HKU1以及来自SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2的S2结构域(特别是UH、FP、HR1、中央螺旋、β-发夹及HR2区域)的重叠肽的组。或者，可使用来自HCoV-OC43、HCoV-229、HCoV-NL63、HCoV-HKU1以及来自SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2的细胞表面表达或纯化的刺突蛋白。
证明与选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的至少一常见人类冠状病毒及选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2至少一高致病性人类冠状病毒的肽(或表面表达或纯化的S蛋白)结合的克隆。
实例3B：
在一些实验中，B细胞是用于B细胞永生化，以产生单克隆抗体。如前所述，生成产生永生化B细胞克隆的单克隆抗体(兰扎韦基亚A等人，通过记忆B细胞的永生化来产生人单克隆抗体，Curr Opin Biotechnol.2007；18(6)：523-528。)
使用记忆B细胞时，必须首先诱导细胞，以产生浆细胞。如前所述，浆细胞是从记忆B细胞体外产生的(马伊加RI等人，人类CD38hiCD138+浆细胞可在体外从CD40-激活的转换记忆B淋巴细胞中产生，J Immunol Res.2014；2014：635108)。简而言之，将分选的记忆B细胞扩增，并随后在CD154+及CD70+贴壁细胞上培养，从而产生CD38hiCD138+浆细胞。
测试培养物上清液与如上所述的来自多种冠状病毒的跨越S2结构域的肽及/或表面表达或纯化的S蛋白的结合。选择产生抗体的B细胞，所述抗体可结合选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的至少一普通人类冠状病毒及选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的至少一高致病性人类冠状病毒的肽或S蛋白。
实例3C：
在一些实验中，选择在体外与S2结构域结合的记忆B细胞。基本上如前所述，选择与病毒肽结合的记忆B细胞(帕斯夸尔G等人，Acta Neuropathol，2017；133(5)：767-783。无症状的个体对于过度磷酸化tau的免疫记忆)。
简而言之，制备来自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2的刺突蛋白的HR1、HR2及/或FP结构域肽序列，及进行生物素化，并与荧光染料结合。CD22+PBMNC细胞是利用荧光偶联抗体IgG-FITC、CD19-PerCPCy5.5进行标记，并与生物素化荧光病毒肽一起培养。具有结合荧光病毒肽的记忆B细胞表型的细胞是利用流式细胞仪分选为单细胞。
如实例4所述，经选择的抗体是用于产生全长抗体。之后可进一步测试此种抗体与来自数种冠状病毒的S2胞外域的结合。
选择结合选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的至少一常见人类冠状病毒及选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的至少一高致病性人类冠状病毒的肽的细胞。
实例4：
产生来自所选择的噬菌体(实例3A)或记忆B细胞(实例3B及实例3C)的IgG、IgA及/或IgM抗体。
如前所述，从经选择的噬菌体中生产人类IgG、IgM或IgA单克隆抗体(伯尔E等人，从噬菌体展示库衍生的单链Fv抗体片段所构建的所有同型的功能性人单克隆抗体，JImmunol Methods，2000年5月26日；239(1-2)：153-66)。
简而言之，构建用于生产人类IgG1-4、IgA1-2及/或IgM单克隆抗体的载体。将经选择的噬菌体的编码scFv片段的VH3H链及Vλ3L链基因克隆至不同的表达载体中，以产生不同的Ig亚类的单克隆抗体。通过在fur-BHK21细胞中共转染H及L链构建体，以建立稳定转染的细胞系。收集培养物上清液，并使用蛋白质A柱纯化所有的亚类。
如前所述，IgG1-4、IgA1-2、IgM及IgE抗体基本上是从经选择的记忆B细胞中所产生的(阿佩特里A等人，一种由具有独特功能的天然人类V H5-51/V L 4-1抗Tau抗体识别的常见抗原基序，Acta Neuropathol Commun.2018年5月31日；6(1)：43)。
简而言之，重链及轻链(heavy chain/light chain)(HC/LC)抗体可变区使用前导特异性及框架特异性引物池，从单细胞分选的记忆B细胞中通过两步骤PCR方法回收。重链及轻链PCR片段(380至400kb)经由重叠延伸PCR而连接，随后克隆至基于双CMV的人类IgG1-4、IgA1-2、IgM或IgE哺乳动物表达载体中。经克隆的抗刺突蛋白人单克隆抗体被短暂地转染至人胚肾293衍生的Expi293细胞(赛默飞世尔)中，且在转染后72小时，收集细胞培养基，并以1200RPM离心7分钟。通过标准蛋白质A亲和层析方法，从培养基中纯化免疫球蛋白。
可测试单克隆抗体与来自多种冠状病毒的S蛋白、S2胞外域或特定肽的结合，所述多种冠状病毒例如HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2。
实例5：
可使用以下的一或多种方法来评估单克隆抗体的体外功能。
1.细胞融合抑制：
已开发由各种HCoV的S蛋白所介导的多种细胞-细胞融合分析法(夏S、严L、徐W，一种针对人类冠状病毒刺突的HR1结构域的泛冠状病毒融合抑制剂，Sci Adv，2019；5(4))。具体而言：(1)经MERS-CoV S介导的细胞融合；(2)经229E S介导的细胞融合；(3)经SARS-CoV及SL-CoV S介导的细胞-细胞融合；以及(4)经OC43或NL63 S介导的细胞-细胞融合。为了评估单克隆抗体对抗不同的S蛋白所介导的融合的抑制效力，将效应细(293T/S/GFP)及靶细胞(Huh-7细胞)于指定的融合浓度下，且在存在或不存测试mAb的情况下进行共培养。在计数融合细胞及未融合的细胞之后，计算细胞-细胞融合的百分比。在此，随机选择在各个孔中的五个视野，以计算融合细胞及未融合的细胞。所述融合细胞至少是未融合的细胞的两倍大，且由于增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein，EGFP)从一效应细胞扩散至靶细胞，融合细胞中的荧光强度变弱。之后计算细胞-细胞融合的百分比[(融合细胞的数量/融合细胞及未融合的细胞的数量)×100％]。使用以下的公式来计算细胞-细胞融合的抑制百分比：[1-(E-N)/(P-N)]×100％。其中“E”表示在实验组中的细胞-细胞融合的百分比。“P”表示在阳性对照组中的细胞-细胞融合的百分比，其中293个T/HCoV S/EGFP细胞是作为效应细胞，其仅加入PBS。“N”为在阴性对照组中的细胞-细胞融合的百分比，其中293个T/EGFP细胞是作为效应细胞。
2.假型病毒感染分析：
如前所述，携带CoV的S蛋白或VSV-G蛋白及缺陷型HIV-1基因组的假病毒在293T细胞中产生((L.吕、Q.刘、Y.朱、K.-H.陈、L.秦、Y.李、Q王、J.F.-W.陈、L.杜、F.余、C.马、S.叶、K.-Y.元、R.张、S.姜，基于结构的中东呼吸综合征冠状病毒融合抑制剂的发现，Nat.Commun.5，3067(2014)，以及其滴度是通过HIV-1p24 ELISA进行定量，之后在存在或不存在连续稀释的测试mAb下，使用假病毒来感染靶标Huh-7细胞(或假型SARS-CoV的ACE2/293T细胞)(96孔盘中的各个孔含有104个细胞)。感染后12小时，更新培养基，且之后再培养48小时，之后使用PBS洗涤细胞，使用裂解试剂(Promega)裂解细胞，以及将细胞裂解物转移至96孔Costar平底光度计盘(Corning Costar)中，使用萤火虫荧光素酶分析试剂盒(Promega)及Ultra384光度计检测相对光单位。
3.抑制活的HCoV的复制：
如别处所述，评估mAb在HCT-8细胞中对抗OC43复制的抑制活性(E.布里森、H.雅科米、M.德福热、P.J.塔尔博特，具有对抗神经侵袭性人类呼吸道病毒的神经保护及抗病毒特性的新治疗，J.Virol.88，1548-1563(2014)。简而言之，将100TCID50的OC43与连续稀释的抗体混合，并在37℃下培养30分钟。之后将混合物三重复的施用于在96孔微量滴定盘中生长的单层HCT-8细胞上。于感染后第5天，检测在培养基中的病毒滴度，及根据细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)计算TCID50(J.切伊卡、K.沃尔斯基、M.诺瓦科夫斯卡、K.匹克、K.什楚比亚乌卡，用于选择性及可逆吸附冠状病毒的生物聚合物纳米/微球，Mater.Sci.Eng.C Mater.Biol.Appl.76，735-742(2017))。如上所述，以相似的方式评估经测试的抗体对抗在A549细胞中的229E复制及对抗在LLC-MK2细胞中的NL63复制的抑制活性。
如前所述，使用经改良的标准微中和分析法，在Calu-3细胞中测试抗体对抗MERS-CoV的复制的抑制活性(X.涛，F.梅，A.阿格拉瓦尔，C.J.彼得斯，T.G.克西亚泽克，X.程，C.-T.K.曾，阻断由cAMP直接激活的交换蛋白质，导致降低中东呼吸综合征冠状病毒的复制，J.Virol.88，3902-3910(2014))。简而言之，于室温下，将60μl的连续两倍稀释的mAb与60μl(120TCID50)的MERS-CoV在补充有2％ FBS(M-2培养基)的MEM培养基中进行培养约60分钟，其在96孔盘的双孔中进行。之后将100微升的mAb/MERS-CoV混合物转移至在96孔盘中生长的汇合的Calu-3细胞中。含有及不含病毒的M-2培养基所培养的Calu-3细胞的孔包含在此等分析中，以分别作为阳性对照及阴性对照。在72小时收集上清液，并通过基于标准VeroE6的感染性分析法来量化感染性病毒滴度，并将滴度表示为log10TCID50/ml。
实例6：
来自实例5的抗体对选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的至少一常见人类冠状病毒及选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的至少一高致病性人类冠状病毒具有免疫反应性被选择以用于体内功效研究。如下进行体内病毒攻击研究。
SARS-CoV-2及SARS-CoV：
将单克隆抗体(0.1至2mg/kg)鼻内给药于金色叙利亚仓鼠。如前所述，2小时之后，金色叙利亚仓鼠受到SARS-CoV-2或SARS-CoV的攻击(谢，S.F.、严，L.、静，A.W.H.等人，SARS-CoV-2在金仓鼠中的发病机制及传播，Nature(2020)，Nature(2020)。从感染前至感染后的14天检测经SARS-CoV-2感染的动物的体重。相较于未治疗的动物，在体内提供保护作用的抗体将防止或降低体重减轻。
为了确定单克隆抗体对于感染SARS-CoV的金色叙利亚仓鼠的影响，在感染八天后，对肺部病理学进行评分。相较于未治疗的动物，在体内提供保护作用的抗体将预防或降低肺部病理。
MERS-CoV：
向hDPP4转基因小鼠鼻内施用单克隆抗体(0.1至2mg/kg)。如前所述，2小时之后，hDPP4转基因小鼠受到MERS-CoV的攻击(金J等人，中东呼吸综合征冠状病毒感染已建立的hDPP4转基因小鼠通过激活促炎反应及肺纤维化而加速肺损伤，J MicrobiolBiotechnol.2020年3月28日；30(3)：427-438)。从感染前至感染后14天检测经MERS-CoV感染的小鼠的体重。相较于未处理的动物，在体内提供保护作用的抗体将防止或降低体重减轻。
实例7：
静脉血液样本是采集自居住在荷兰莱顿的成年志愿者(年龄介于40岁与62岁之间)。分离PBMC并冷冻保存，用于之后的分析。所有的参与者皆回答在采血前10天内并未接触过(可能)感染冠状病毒的人，以及之前并无人检测出SARS-CoV-2呈阳性。收集鼻拭子，并在多重呼吸道病毒PCR中进行测试，所述呼吸道病毒包括其他人类冠状病毒NL63、OC43、HKU1、229E及SARS-CoV-2：所有的志愿者的所有病毒检测皆为阴性。在多重的Luminex分析中，将血清样本稀释1：4,000，以评估对抗hCoV NL63、OC43、HKU1及229E刺突蛋白的IgG抗体滴度，并以1：200稀释，以评估对抗致病性hCoV SARS-COV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的刺突蛋白的IgG抗体滴度。根据之前的发现(格罗本等人，2021年)，倘若回到对抗NL63、OC43、HKU1及229E的IgG≥125MFI的结果，以及对抗SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的IgG≥2,500MFI的结果，则认为一供体对于先前的感染是呈阳性。基于此等截止值，各个志愿者皆被认为在过去已感染所有四种hCoV NL63、OC43、HKU1及229E(供体ID号：1001至1020；表1)；所有先前感染MERS-CoV及SARS-CoV-1的检测结果皆为阴性，以及除了2例之外的其他志愿者先前的SARS-CoV-2感染检测结果皆为阴性(供体ID号：1007及1017的检测结果为阳性，且未包含在表1中)。
外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是从人类供体的静脉血液样本中所获得，且富含B细胞。如图1所示，富含B细胞的PBMC基于记忆B细胞标记物及与常见hCOV NL63刺突(S)蛋白的结合在FACS中进行单细胞分选。mRNA是获自NL63 S特异性单分选B-细胞，并转录成cDNA，及通过PCR扩增由B细胞表达的抗体的V(D)J可变区。表1显示一实例，可进行单细胞分选的NL63 S特异性B细胞的数量，以及来自不同的供体的成功VHVL对的数量。此表格亦显示在FACS分析预分选中经分选的NL63-S特异性记忆B细胞及由此衍生的VH VL对与SARS-CoV-2S结合，以及表达的抗体的同型的数量。针对分选为B、E及F类的NL63 S记忆B细胞单细胞，重组抗体的重链及轻链的可变V(D)J区随后利用GibsonAssembly而被克隆至含有人类IgG1重链或轻链的恒定区的表达载体中。贴壁HEK293T细胞是用于小规模的转染，转染后48小时收集上清液。使用不同的方法分析上清液，所述方法包括用于评估与常见hCoV NL63及致病性hCoV SAR-CoV-2(武汉)的刺突蛋白结合的抗体的Luminex或ELISA分析，以及用于评估与常见hCoV NL63及OC43以及致病性hCoV SARS-CoV-2的两种变体(巴西及南非变体)的刺突蛋白结合的抗体的FACS分析(由于可用于分析的体积有限，分析来自不同种类的上清液，测试了不同的方法)。结果如图2及表2及表3所示：鉴定多个克隆，此等克隆产生与至少一常见hCoV的S蛋白及致病性hCoV SARS-CoV-2的S蛋白结合的抗体，一些克隆亦显示结合稳定的SARS-CoV-2S2三聚体。此等克隆随后被选择，以在悬浮HEK293F细胞中进行转染及大规模表达mAb。经纯化的抗体在FACS分析中测试与常见hCoVNL6及病原体hCoV SARS-CoV-2的刺突蛋白的结合，以及在ELISA分析中测试与SARS-CoV-2的S2亚基的稳定的三聚体的结合。结果如图3A及图3B以及表4所示。
表1：
HEK293T培养：
HEK293T培养上清液B/E分选：
将源自“B分选及E分选”的克隆转染至293T细胞中，并对上清液进行以下的测试：1.在Luminex分析中测试与常见hCoV NL63及致病性hCoV SAR-CoV-2(武汉)的刺突蛋白的结合，以及2.在FACS分析中测试与常见hCoV NL63及OC43以及致病性hCoV SARS-CoV-2的两种变体(巴西及南非变体)的刺突蛋白结合。表2显示产生与至少一常见hCoV及至少一致病性SARS-CoV-2变体的S结合的抗体的克隆的数据：此等克隆随后被选择用于293F细胞的转染。
三个克隆(B1C1、B1E3及E1B2)产生与至少一常见hCoV(NL63)及至少一致病性hCoV(B1C1及B1E3：SARS-CoV-2武汉及巴西变体；E1B2：SARS-CoV-2武汉及南非变种)的刺突蛋白结合的抗体。
两个克隆(B1B2及B1E8)产生与至少二种常见hCoV(NL63及OC43)及至少一致病性hCoV(SARS-CoV-2巴西变体)的刺突蛋白结合的抗体。
表2
| LUMINEX | E1B2 | B1B2 | B1C1 | B1E3 | B1E8 |
| NL63 S | + | - | ++ | + | + |
| SARS-CoV-2S | - | - | ++ | - | - |
| FACS | E1B2 | B1B2 | B1C1 | B1E3 | B1E8 |
| NL63S | - | + | ++ | ++ | + |
| OC43S | - | + | - | - | + |
| SARS-COV-2(巴西)S | - | + | ++ | + | ++ |
| SARS-COV-2(南非)S | + | - | - | - | - |
HEK293T培养上清液F分选：
来自“F分选”的克隆被转染至293T细胞中，在ELISA分析中测试上清液与普通hCoVNL63及致病性hCoV SAR-CoV-2(武汉)的刺突蛋白，以及与SAR-CoV-2的S2亚基的稳定三聚体(武汉)的结合。显示产生与NL63S及SARS-CoV-2S结合的抗体的克隆的数据，随后选择此等克隆以转染293F细胞(图2及表3)。
四个克隆(F6B2、F6G1、F6F6及F6A10)产生与常见hCoV NL63(仅测试常见hCoV S)及致病性hCoV SARS-CoV-2(仅测试致病性hCoV S)的S蛋白结合的抗体。此外，克隆F6B2及F6F6亦显示与SARS-CoV-2S2三聚体的结合。
表3
| ELISA | F6B2 | F6G1 | F6F6 | F6A10 |
| NL63 S | + | + | + | + |
| SARS-CoV-2S | + | + | + | + |
| SARS-CoV-2S2-三聚体 | + | - | + | - |
HEK293F培养：
293F培养纯化抗体B/E及F分选：
将被选择用于产生与至少一常见hCoV及致病性SARS-CoV-2的S结合的抗体的克隆转染至293F细胞中，并从培养物中纯化抗体，以及进行以下的测试：1.在FACS分析中测试与常见hCoV NL63，及hCoV OC43及229E(仅来自B/E分选的克隆)及病原体hCoV SARS-CoV-2(武汉)的刺突蛋白的结合，以及2.在ELISA分析中测试与SARS-CoV-2的S2亚基的稳定三聚体的结合。
来自6个克隆(B1B2、B1C1、B1E3、B1E8、F6B2及F6F6)的纯化抗体显示与常见hCoVNL63的刺突蛋白结合(针对F分选衍生的克隆，唯一测试的常见hCoV)，包括与第二种常见hCoV(229E)的刺突蛋白结合的来自B/E分选的2个克隆，以及与3种测试的常见hCoV(NL63、229E及OC43)的刺突蛋白结合的来自此分选(B1E8)的1个克隆，其中所有6个克隆在FACS中亦与致病性hCoV SARS-CoV-2(仅测试武汉)结合。尽管母体记忆B细胞已根据其与NL63 S的结合进行分类，且在293T培养物中所产生的抗体显示与NL63 S的良好结合，然而克隆E1B2、F6A10及F6G1所产生的抗体在FACS实验中显示出与SARS-CoV-2S的良好结合，但与NL63 S的结合低/无结合。参见表4及图3A。
293F培养纯化的克隆F6G1抗体在ELISA中显示与SARS-CoV-2的S2亚基的稳定三聚体结合，同时一些证据表明克隆B1C1所产生的抗体在较高浓度下与S2结合。参见图3B及表4。
表4A
| FACS | B1B2 | B1C1 | B1E3 | B1E8 | E1B2 |
| NL63 S | + | ++ | + | + | -/+ |
| OC43S | - | - | - | + | - |
| 229E S | ++ | - | ++ | ++ | - |
| SARS-CoV-2S | ++ | + | + | + | + |
| ELISA | |||||
| SARS-CoV-2S2-三聚体 | - | -/+ | - | - | - |
表4B
| FACS | F6B2 | F6G1 | F6F6 | F6A10 |
| NL63 S | + | -/+ | + | - |
| OC43S | ND | ND | ND | ND |
| 229E S | ND | ND | ND | ND |
| SARS-CoV-2S | + | ++ | + | + |
| ELISA | ||||
| SARS-CoV-2S2-三聚体 | - | + | - | - |
材料及方法：
冠状病毒的S蛋白的设计：
具有T4三聚化结构域及六组氨酸(hexahistidine，His)标签的SARS-CoV-2的融合前S蛋白胞外域，以及SARS-CoV-2的RBD结构域的设计及克隆是如前所述(布劳威尔等人，2020年)，以及制备具有T4三聚化结构域及StrepII标签的SARS-CoV-2S2胞外域。其他的人类冠状病毒的融合前S蛋白胞外域是使用此序列作为模板而设计的，且订购于Genscript。通过比对不同的蛋白质序列，以选择截断位点。倘若存在，则在SARS-CoV-2的S蛋白参考序列中对应于682至685的氨基酸处，利用“GGGG”来取代弗林蛋白酶(furin)切割位点，以及在对应于SARS-CoV-2参考序列中的986及987氨基酸处插入脯氨酸取代。基因库(Genbank)IDMN908947.3(SARS-CoV-2)ABD72984.1(SARS-CoV)、AHI48550.1(MERS-CoV)、AAT84362.1(OC43-CoV)、Q0ZME7(HKU1-CoV)、NP_073551.1(229E-CoV)及AKT07952.1(NL63-CoV)作为蛋白质设计的模板。在流式细胞术中所使用的蛋白质的三聚化结构域及his标签之间添加Avi标签。
冠状病毒的S蛋白的表达与纯化：
SARS-CoV-1、MERS-CoV、SARS-CoV-2、NL63-CoV、OC43-CoV、HKU1-CoV及229E-CoV的刺突蛋白是在HEK293F细胞(Invitrogen)中所产生的，所述HEK293F细胞保持在Freestyle培养基(莱富生命科技公司)中。使用1mg/L的聚乙烯亚胺盐酸盐(PolyethylenimineHydrochloride，PEI)MAX(Polysciences)及312.5μg/L的表达质粒，以3：1的比例在每升含有50mL OptiMEM(Gibco)中进行转染。转染后7天，通过以4000rpm离心30分钟，之后使用0.22μM Steritop过滤装置(Merck Millipore)来过滤上清液，并收集上清液。使用镍-次氮基三乙酸(Nickel-Nitrilotriacetic Acid，Ni-NTA)琼脂糖珠(Qiagen)，通过亲和层析，从澄清的上清液中纯化经His标记的蛋白质。使用100kDa截留分子量(molecular weightcut-off，MWCO)Vivaspin离心浓缩仪来浓缩洗脱液，并将缓冲液更换为PBS。使用PBS作为缓冲液，在Superose 6增加10/300GL柱(GE Healthcare)上使用尺寸排阻色谱法进一步纯化，以去除聚集的及单体的蛋白质级分。三聚体S蛋白以大约13mL的体积进行洗脱。使用100kDaMWCO Vivaspin离心浓缩器来汇集并浓缩含有三聚体蛋白的级分。使用Nanodrop 2000分光光度计检测所得到的蛋白质浓度。蛋白质储存在-80℃，直至需要为止。
根据制造商的步骤准则，对所有的蛋白质使用相同的条件，使用BirA试剂盒(Avidity)对带有avi标签的蛋白质进行生物素化。随后，使用SuperDex200 10/300GL增加柱，通过尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)以进一步纯化蛋白质。汇集对应于S三聚体蛋白的峰级分，再次浓缩，并在-80℃下储存于PBS中。
Luminex分析评估抗体与冠状病毒的S蛋白的结合：
使用两步碳二亚胺反应，将蛋白质共价偶联至Luminex Magplex珠上。SARS-CoV-2的S蛋白以75μg蛋白质与1250万个珠子的比例进行偶联。其他的蛋白质与等摩尔的SARS-CoV-2的S蛋白进行偶联。SARS-CoV-2S1及S2蛋白是来自Abclonal。Luminex Magplex珠(Luminex)是利用100mM磷酸二氢钠pH 6.2进行洗涤，并通过添加磺基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Thermo Fisher Scientific)及1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(ThermoFisher Scientific)进行激活，并在室温下，于旋转器上培养30分钟。经活化的珠子利用50mM MES pH 5.0洗涤3次。蛋白质在50mM MES pH 5.0中进行稀释，并添加至珠子中。在室温下，珠子及蛋白质于旋转器上培养3小时。接下来，利用PBS洗涤经蛋白质缀合的珠子，并在室温下，利用含有2％ BSA、3％胎牛血清(fetal calf serum，FCS)及0.02％ Tween-20的pH 7.0的PBS，于旋转器上封闭30分钟。清洗经蛋白质缀合的珠子，并于4℃下储存在含有0.05％叠氮化钠的PBS中，并在6个月内使用。检测各个经S蛋白偶联的珠上的His标签，以确认珠上的蛋白质的量。
将50μl操作的珠混合物与50μl经稀释的血清一起培养过夜，其中每μl的各种蛋白质-珠缀合物含有20个珠子。将盘进行密封，并在盘振荡器上于4℃下培养过夜。第二天，使用手持磁选机，利用含有0.05％ Tween-20(TBST)的TBS来洗涤所述盘。将经蛋白质缀合的珠子重新悬浮于50μl山羊抗人类IgG-PE(Southern Biotech)中，并在室温下，于盘振荡器上培养2小时。接下来，利用TBST洗涤珠子，并重新悬浮于70μl Magpix驱动液(Luminex)中，并在室温下，于平板振荡器上放置数分钟。之后在Magpix(Luminex)上进行读数。中值荧光强度(median fluorescence intensity，MFI)值被评估为每孔约50个珠子的中值，并通过从仅有缓冲液及珠子的孔中减去MFI值，以进行校正。
单细胞记忆-B细胞分选：
为了在流式细胞术中鉴定与冠状病毒蛋白结合的B细胞，如布劳威尔等人所述(Science，2020)，将生物素化重组CoV(NL63)及SARS-CoV-2刺突(spike，S)蛋白与链霉亲和素荧光团结合，以产生荧光标记探针。简而言之，重组的NL63S蛋白以2：1的摩尔比与链霉亲和素缀合物AF647(0.5mg/mL，BioLegend)与BV421(0.1mg/mL BioLegend)进行缀合。重组的SARS-CoV-2S蛋白利用链霉亲和素BB515(0.1mg/mL BD Biosciences)进行标记。偶联培养是在4℃下进行至少1小时。通过与10mM游离生物素(Genecopoeia)培养15分钟，以终止探针偶联。
根据制造商的说明，首先使用人类B细胞富集试剂盒(Stemcell)对外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)进行B细胞富集。之后将富含B细胞的PBMC在4℃下与荧光标记的冠状病毒的刺突蛋白(NL63S-AF647；NL63S-BV421；SARS-CoV-2S-BB515；活细胞/死细胞标记物(活力-eF780，eBiosciences)；表面标记CD20-PE-CF594(2H7，BD Biosciences)、CD27-PE(L128，BD Biosciences)、IgG AF700(G18-145，BDBiosciences)、IgM-BV605(MHM-88，BioLegend)、IgD-PE-Cy7(IA6-2，Biolegend)；以及具有相同荧光团APC-eF780的各种表面标记物进行培养30分钟)，以消除所有的非B细胞，包括T细胞标记物CD3(UCHT1，eBiosciences)及CD4(OKT4，eBiosciences)、单核细胞及巨噬细胞标记物CD14(C1D3，eBiosciences)，以及NK细胞标记物CD16(CB16，eBiosciences)。在PBS(Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，eBiosciences)中洗涤3次之后，补充1mM EDTA及2％胎儿小牛血清，在4-激光FACS ARIA(BD Biosciences)上进行流式细胞术。使用FlowJo(版本10.6.2)分析活体记忆B细胞与NL63S(AF647及BV421)、SARS-CoV-2S，及同型表达的结合。对NL63 S(AF647及BV421)双阳性的活体记忆B细胞(参见实例的图1)，使用产量纯度以将单细胞分选至空的96孔盘中，并在裂解前，立即于-80℃下冷冻至少1小时，并进行逆转录酶(reverse transcriptase，RT)-PCR，以将mRNA转录成cDNA。
从记忆B细胞中提取抗体cDNA：
冷冻的单细胞分选的记忆B细胞在裂解缓冲液(室温下)中进行重组，由总体积为20μl的20U核糖核酸酶(Ribonuclease，RNAse)抑制剂(Invitrogen)、第一链SuperScriptIII缓冲液(Invitrogen)及1.25μl 0.1M二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)(Invitrogen)组成。通过RT-PCR，将经裂解的NL63S蛋白特异性单个B细胞的mRNA转化为cDNA。简而言之，将总体积为6μl的50U SuperScript III RTase(Invitrogen)、2μl 6mM dNTP(Invitrogen)及200ng随机六聚体引物(Thermo Scientific)添加至包含单个裂解细胞的各孔中。使用以下的RT程序：42℃，10分钟、25℃，10分钟、50℃，60分钟、95℃，5分钟，无限4℃。将cDNA储存于-20℃，直至进一步分析为止。
由NL63 S特异性单细胞分选的B细胞所表达的抗体的V(D)J可变区是如泰勒等人，J Immunol Methods 2008所述进行扩增。简而言之，对于κ及λ链，PCR 1是使用总体积为20μl的0.5U MyTaq聚合酶(BioLine)、0.1μM正向及逆向多重引物、MyTaq PCR反应缓冲液(BioLine)及2μl cDNA，进行95℃，1分钟、95℃，15秒，50个循环、58℃，15秒、72℃，45秒，之后72℃，10分钟。巢式PCR是使用总体积为14.5μl的0.375U HotStarTaq Plus聚合酶(Qiagen)、0.2mM dNTP、0.034μM正向及逆向多重引物、HotstarTaq Plus PCR缓冲液(Qiagen)及2μl的PCR 1产物，进行95℃，5分钟、94℃，30秒，50个循环、60℃，30秒、72℃，1分钟，之后72℃，10分钟。对于重链，进行初级及两个巢式PCR反应。简而言之，使用总体积为14.5μl的0.375U HotStarTaq Plus聚合酶(Qiagen)、0.2mM dNTP、0.069μM正向及逆向多重引物、HotstarTaq Plus PCR缓冲液(Qiagen)及2μl cDNA进行初级PCR：95℃，5分钟、94℃，30秒，50个循环，52℃，30秒，72℃，1分钟，之后72℃，10分钟。第一次巢式PCR使用总体积为20μl的0.5U MyTaq聚合酶(Bioline)、0.05μM正向及逆向多重引物(39)、MyTaq PCR反应缓冲液(BioLine)及2μl的PCR 1产物，进行95℃，1分钟、95℃，15秒，30个循环、58℃，15秒、72℃，45秒，之后72℃，10分钟。最终PCR是使用总体积为14.5μL的0.375U HotStarTaq Plus聚合酶(Qiagen)、0.2mM dNTP、具有载体悬垂的0.034μM正向及逆向多重引物、HotstarTaqPlus PCR缓冲液(Qiagen)及2μl PCR 2产物，进行95℃，5分钟，94℃，30秒，50个循环、60℃，30秒、72℃，1分钟，之后72℃，10分钟。
抗体克隆及小规模表达：
如索克等人(PNAS 2014)及范吉尔斯等人(2016)先前所述，所有的重组抗体皆在哺乳动物细胞表达系统中表达。简而言之，使用吉布森组装(Gibson Assembly)(吉布森等人，Nat Methods 2009)，将抗体的重链及轻链的可变V(D)J区克隆至含有人类IgG1重链或轻链的恒定区的相应表达载体中。吉布森组装是利用自制的吉布森混合物进行的，所述吉布森混合物是由2x吉布森混合物(0.2U T5核酸外切酶(Epibio)、12.5U Phusion聚合酶(New England Biolabs)、Gibson反应缓冲液(0.5g PEG-8000(Sigma Life Sciences)、1MTris/HCl pH 7.5、1M MgCl2、1M DTT、100mM dNTPs、50mM NAD(New England Biolabs)，MQ))，于50℃下进行60分钟。通过桑格(Sanger)测序来验证质粒的序列完整性。对于小规模的转染，将贴壁HEK293T细胞(ATCC，CRL-11268)维持在补充有10％胎牛血清(fetal calfserum，FCS)、青霉素(100U/mL)及链霉素(100μg/mL)的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)中，并按照范吉尔斯等人(Nat Microbiol2016)先前的描述进行转染。HEK293T细胞在转染前24小时接种在24孔盘或48孔盘中，如上所述，在完全培养基中，其密度分别为每孔2.75x10^5或1.5x10^5个细胞。转染混合物由1：1(w：w)HC/LC比率所组成，其利用1：2.5的比率与lipofectamin 200(Invitrogen)分别在200μL或100μL Opti-MEM中。在室温下培养15分钟后，将转染混合物添加至细胞中。转染后48小时收集上清液，澄清并在4℃下储存，直至进一步分析为止。
大规模的抗体表达及纯化：
对于所选择的mAb的大规模表达，悬浮HEK293F细胞(Invitrogen，批号R79007)在FreeStyle培养基(Gibco)中进行培养，并与表达相应的重链及轻链的两个IgG质粒以1：1的比例进行共转染，其是利用1：3的比例的密度为0.8至120万个细胞/mL及1mg/L PEImax(Polysciences)。如前所述(索克等人，PNAS 2014)，在培养五天后，从细胞上清液中分离出重组IgG抗体。简而言之，将细胞悬浮液以4000rpm离心25分钟，并使用0.22μm孔径的SteriTop过滤器(Millipore)过滤上清液。经过滤的上清液通过10mL蛋白质A/G柱(Pierce)，之后利用两个柱体积的PBS进行洗涤。利用0.1M甘氨酸pH 2.5，以1：9的比例将抗体洗脱至中和缓冲液1M TRIS pH 8.7中。使用100kDa VivaSpin20柱(Sartorius)，将纯化的抗体缓冲液交换为PBS。IgG浓度在NanoDrop 2000上进行检测，且抗体储存于4℃，直至进一步分析为止。
Ni2+-次氮基三乙酸(Ni2+-nitrilotriacetic acid，Ni-NTA)-捕获ELISA：
将SARS-CoV-2的经His标记的刺突蛋白及经StrepII标记的S2蛋白加载至96孔Ni-NTA盘(Qiagen)上的酪蛋白(Thermo Scientific)中，并于室温下放置2小时。在利用Tris缓冲盐水(Tris Buffered Saline，TBS)清洗盘之后，加入在酪蛋白中的三倍连续稀释的mAb，从10μg/mL浓度开始，或加入HEK 293T抗体转染的上清液。利用TBS洗涤3次之后，加入1：3000稀释的经HRP标记的山羊抗人类IgG(Jackson Immunoresearch)酪蛋白溶液，于室温下放置1小时。最后，利用TBS/0.05％ Tween-20洗涤盘五次之后，加入显影液(1％3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(Sigma-Aldrich)、0.01％过氧化氢、100mM乙酸钠及100mM柠檬酸)。比色终点的显影进行4分钟后，通过加入0.8M硫酸终止显影，并于450nm处测定光密度(opticaldensity，OD值)。
在FACS中的全长SARS-CoV-2及CoV的刺突表达及结合：
通过将8μg SARS-CoV-2全长质粒DNA及在400μl Optimem中的25μl PEImax转染至培养皿中的12mL至15mL HEK293T细胞(接种前一天3.0x10^6)。48小时后收获细胞并冷冻。解冻后，将表达感兴趣的刺突蛋白的293T细胞以每孔20,000个至30,000个细胞接种于96孔盘中的PBS/0.5％FCS(FACS缓冲液)中，并与来自293T细胞的未纯化培养液，或在293F细胞中纯化及生产后，与稀释的mAb，于4℃下，以1：1的比例进行培养1小时。随后利用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并在50μl FACS缓冲液中于4℃且在黑暗中染色30分钟，所述FACS缓冲液含有1：1000稀释的PE偶联的山羊F(ab)’2抗人类IgG(Southern Biotech 2042 -09)。利用FACS缓冲液再次洗涤细胞，并在FACS canto II分析仪(BD)上进行分析。通过FlowJo软件分析样本，并绘制显示结合的细胞百分比。
在以下参考文献中进一步描述方法。
泰勒，T、梅弗雷，E、尤拉索夫，S、苏纪，M、努森维格，MC、沃德曼，H，通过单细胞RT-PCR及表达载体克隆从单个人类B细胞中高效产生单克隆抗体，J Immunol Methods，2008；329：112-124。
吉布森，DG、杨，L、庄，R-Y、凡特，JC、哈奇森，CA、史密斯，HO，高达数百个碱基的DNA分子的酶促组装，Nat Meth，2009；6：343-345。
索克，D、范吉尔斯，MJ、保特纳，M、于连，J-P、萨耶-弗朗西斯科，KL、薛，J、布里尼，B等人，重组HIV包膜三聚体选择针对三聚体顶点的四元依赖性抗体，Proc Natl Acad SciUSA 2014；111：17624-17629。
范吉尔斯，MJ、范登克霍夫，TLGM、奥佐罗夫斯基，G、科特雷尔，CA、索克，D、保特纳，M、帕勒森，J等人，来自上等中和剂的HIV-1抗体表明融合肽是一易受攻击的位点，NatureMicrobiology，2016；2：16199。
布劳威尔，PJM、坎尼尔，TG、范德斯特拉滕，K、斯尼策拉尔，JL、阿尔东，Y、班加鲁，S、托雷斯，JL等人，来自COVID-19患者的强效中和抗体定义多个易受攻击的标的，Science2020；38：eabc5902。
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范哈伦，MM、麦考伊，LE、托雷斯，JL、李，W、科特雷尔，CA、科普斯，JL、范德乌德，P等人，来自利用HIV-1进化枝B SOSIP三聚体免疫的兔子的抗体可通过破坏包膜糖蛋白的稳定性来中和多种进化枝B病毒，J Virol 2021；JVI0009421。
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Claims (15)
1.一种用于鉴定冠状病毒的交叉反应性抗体的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：
(a)提供来自一或多位人类受试者的血浆样本，优选地至少45岁或以上，所述样本在一时间点(X)独立地被收集，
(b)鉴定具有血浆样本的受试者，所述血浆样本具有结合至少两种，优选地至少四种人类冠状病毒(HCoV)的免疫球蛋白，其中所述HCoV是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1；
(c)提供来自所述经鉴定的受试者的PBMC样本，其中所述PBMC样本在时间点(X)或更晚被收集，且所述PBMC样本包括选自记忆B细胞、浆细胞及浆母细胞的B细胞；
(d)筛选由(c)的B细胞所编码的抗体或其抗原结合片段，以结合来自至少两种，优选地至少四种不同的冠状病毒的S(刺突)蛋白的S2胞外域的至少一部分；
(e)选择抗体或其抗原结合片段，其结合至少一常见人类冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，以及结合至少一高致病性人类冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2；优选地，其中所述经选择的抗体或其抗原结合片段亦结合一动物冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分；
(f)从(e)中选择抗体或其抗原结合片段，其抑制至少一常见人类冠状病毒的病毒融合、感染及/或复制，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，以及其抑制至少一高致病性人类冠状病毒的病毒融合、感染及/或复制，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2；
(g)确定来自(f)的经选择的抗体或其抗原结合片段在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的能力；以及
(h)选择在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的抗体或其抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括步骤：提供来自多个受试者的额外的血浆样本，其中所述样本在一时间点(Y)被收集，其中时间点(Y)比时间点(X)早或晚至少3个月。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：选择来自一受试者的血浆样本，相较于在较早或较晚的时间点所收集的受试者的血浆样本，其具有增加的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白结合至少两种HCoV。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：所述血浆样本具有独立地结合至少两种HCoV的IgG、IgM及/或IgA免疫球蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述免疫球蛋白结合HCoV刺突蛋白的S2结构域。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(d)包括筛选抗体或其抗原结合片段，以结合来自至少两种、优选地至少四种不同的冠状病毒的S蛋白的融合肽、HR1七肽重复序列或HR2七肽重复序列的至少一部分。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(e)包括选择抗体或其抗原结合片段，其结合HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1的S蛋白的S2结构域的至少一部分。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(e)包括选择抗体或其抗原结合片段，其结合SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的S蛋白的S2结构域的至少一部分。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(g)包括确定所述经选择的抗体或其抗原结合片段在SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的能力。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(h)包括选择在SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的抗体或其抗原结合片段。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：
选择抗原结合片段，其结合至少一常见人类冠状病毒的S2结构域的至少一部分，所述常见人类冠状病毒是选自HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E及HCoV-HKU1，以及结合至少一高致病性人类冠状病毒的S蛋白的S2结构域的至少一部分，所述高致病性人类冠状病毒是选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2；优选地，其中所述经选择的抗体或其抗原结合片段亦结合一动物冠状病毒的S蛋白的S2胞外域的至少一部分；
制备包含所述经选择的抗原结合片段的IgM、IgA或IgG抗体，确定IgM、IgA或IgG抗体在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中预防或降低感染的能力；以及
选择IgM、IgA或IgG抗体，以预防或降低在选自SARS-CoV-1、MERS-CoV及SARS-CoV-2的HCoV感染的体内模型中的感染。
12.一种根据权利要求1至11中任一项所述的方法所鉴定的抗体或其抗原结合片段。
13.根据权利要求12所述的抗体，其特征在于：所述抗体是IgG、IgM或IgA抗体。
14.一种治疗或预防被冠状病毒感染的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：向有需要的受试者局部地、优选地鼻内施用根据权利要求12或13所述的抗体。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述冠状病毒是SARS-CoV-1、MERS-CoV或SARS-CoV-2。
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