CN105277710A

CN105277710A - 高灵敏度lspr生化感测套组及其应用方法

Info

Publication number: CN105277710A
Application number: CN201410338477.0A
Authority: CN
Inventors: 林宽锯; 张家瑜; 陈威宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2014-07-16
Publication date: 2016-01-27

Abstract

本发明涉及一种以简单、快速和低成本的方式来侦测低浓度待测物的局域表面等离子体共振(LSPR)生化感测套组及其应用方法。该套组包含：等离子体金属纳米结构基板，包括基材、包埋于其上的单层纳米金属粒子，以及修饰于其上的接收器；裸金粒子悬浮溶液。该套组用于侦测低浓度待测物的方法包含：在纳米等离子体晶片基材上利用加热法包埋单层纳米金属粒子；在晶片表面修饰一接收器；接着修饰待测物，并同时滴加裸金粒子，使裸金粒子修饰在待测物上；侦测该待测物的LSPR讯号。本发明的套组及方法利用简易的方式在待测物上修饰裸金属粒子来增强LSPR讯号，以达到能够侦测低浓度待测物的目的与功效，极具创新的产业应用价值。

Description

高灵敏度LSPR生化感测套组及其应用方法

技术领域

本发明涉及一种LSPR生化感测套组及其应用方法。更特别地，本发明涉及一种利用于进行LSPR分析时将裸金粒子修饰于待测物上，以增强LSPR讯号的方法。

背景技术

局域表面等离子体共振(Localizedsurfaceplasmonresonance，LSPR)的原理在于，当纳米金属粒子制作于透明基板上时，受到入射光的激发，将使得纳米金属粒子表面产生表面等离子体共振，由于此共振的频率与强度容易受到周遭环境的影响，而产生波长的位移或者讯号强度的改变等，故可利用局部介电常数的变化来进行分析物的侦测。因此只要有分析物键结在粒子附近，我们便可以通过光学仪器量到光学变化。可以想象，纳米粒子表面就像是微小型的探测器，在纳米尺度的范围之内都可以量测到很高的光学变化讯号。

先前的研究已发现，当成对的纳米粒子间距小于约2.5粒子半径时，会发生等离子体偶合作用(plasmoniccoupling)而产生明显的光谱位移(spectralshifts)，请参见Anker,J.N.等人,NatureMaterials7:442,2008。本身具有明确偶合特质的Au-LSPR晶片，已被应用于LSPR生化感测方法，其讯号产生基于吸光值与等离子体条带波长的结合。先前使用金纳米结构的LSPR技术，在进行感测时光谱位移量仅有3nm以下，以致在提升侦测灵敏度方面无法有效突破。先前虽曾有提出一种OpticalEnhancementSystem(OES)，在先前的量测抗原步骤，额外再进行抗原-抗体(此抗体表面有进行标定)的动作，通过标定物与金纳米结构进行较巨大的等离子体偶合效应，而使得位移量大大提升(Kim,H.M.等人,Sensors9:2334,2009)。然而，OES技术本身必须利用到加上标定的次级抗体，所以已经失去原先LSPR所具有的不须标定(label-free)的优势。

本发明为解决上述LSPR生化感测方法的限制问题，于是提出一种在侦测方法进行时通过添加裸金粒子，将其修饰于待测物上，以增强LSPR讯号的方法。本发明所研发的方法能以低成本、短时间的分析过程及简易制备的方式，来侦测低浓度的待测物，例如以侦测帕金森氏症的标记物抗-α-突触核蛋白抗体(anti-α-synucleinantibody)为例，其灵敏度可达到3.8ng/mL，且整体侦测过程仅需耗时约3小时。

发明内容

于是，本发明的一方面基于以上的目的，提供一种用于侦测低浓度待测物的高灵敏度局域表面等离子体共振(LSPR)生化感测套组，其包含一等离子体金属纳米结构基板，包含一基材、包埋于该基材上的单层纳米金属粒子，及一修饰于该基材表面或该纳米金属粒子上的接收器(receptor)；及一裸金粒子悬浮溶液，包含悬浮于一缓冲液中的裸金粒子，其中该裸金粒子的粒径介于5～100nm。

在本发明的一些具体实施例，所述的缓冲液可包括PBS缓冲液或MES缓冲液等。在本发明的一具体实施例，所述的缓冲液为0.1mMPBS缓冲液。

在本发明的一些具体实施例，所述的基材为一光学玻璃(opticalglass)或高光穿透性塑胶(hightransparencyplastic)。

在本发明的一些具体实施例，所述的纳米金属粒子选自金、银、铜、铂及其合金纳米粒子。在本发明的一具体实施态，所述的纳米金属粒子为金纳米粒子。

在本发明的具体实施例，所述的裸金粒子指其表面上未经任何化学分子修饰或官能化的金粒子。所述的裸金粒子粒径较佳为5～50nm，且最佳为10nm。

在本发明的一些具体实施例，所述的接收器(receptor)为一与该待测物相对应的抗体或抗原。在本发明的一项具体实施例，所述的待测物为帕金森氏症的生物标记物，可为α-突触核蛋白(α-synuclein)或抗-α-突触核蛋白抗体(anti-α-synucleinantibody)。

本发明的另一方面，关于一种用于侦测低浓度待测物的局域表面等离子体共振(LSPR)生化感测方法，包含：提供一纳米等离子体晶片，其利用加热法在基材上包埋单层纳米金属粒子；在该纳米等离子体晶片表面上修饰一接收器(receptor)，该接收器为一与待测物相对应的抗体或抗原；将待测物加入与该接收器进行结合，并同时滴加裸金粒子，使裸金粒子修饰于待测物上；在400～800nm波长下侦测该待测物的LSPR讯号消光强度改变量。

在本发明的一项具体实施例，所述的待测物为帕金森氏症的生物标记物。在本发明的一项具体实施例，所述的待测物为α-突触核蛋白(α-synuclein)。在本发明的一项具体实施例，所述的待测物为抗-α-突触核蛋白抗体(anti-α-synucleinantibody)。

所述纳米金属粒子选自金、银、铜、铂及其合金纳米粒子。

所述裸金粒子的粒径介于5～50nm。

所述裸金粒子的粒径为10nm。

本发明的有益效果为：所提供的高灵敏度LSPR生化感测套组及其生化感测方法，不需另外添加标记药剂或是二次抗体，就能成功侦测低浓度或小分子待测物，可有效降低高成本的花费；且侦测时间仅需3小时左右，相较于其他侦测方式可大幅地缩短侦测时间。

附图说明

图1为纳米金簇在金纳米等离子体晶片上形成的示意图。图1A中金纳米等离子体晶片上所包埋的固态金纳米粒子(AuNP)直接和待测物相对应的抗原or抗原(A)产生键结，并于修饰分析物(D)时，同时滴加裸金粒子(Au-NPs)溶液，使其和待测物产生键结；图1B中修饰于待测物上的裸金粒子通过聚集作用(aggregation)而在等离子体晶片上形成纳米金簇(gold-nanoparticle-basedclusters)，藉以增强LSPR讯号。

图2为显示以FE-SEM观察形成在金纳米等离子体晶片上的纳米金簇(圆圈处)SEM图。

图3为侦测1μg/mLIgG抗原的UV-Vis光谱图。

图4为侦测抗-α-突触核蛋白抗体的UV-Vis消光光谱图，显示使用本发明的LSPR生化感测方法侦测不同浓度抗-α-突触核蛋白抗体(1ppm、0.1ppm及0.0038ppm)的消光强度改变量。

图5为以本发明的LSPR生化感测方法侦测PBS缓冲液、人类抗-IgG(1ug/ml)及抗-α-突触核蛋白抗体(3.8ng/mL)的吸光值强度变化量。误差值(Errorbars)表示进行三重复实验产生的标准偏差。

具体实施方式

本发明的其他特色及优点将于下列实施例中被进一步举例与说明，而该实施例仅作为辅助说明，并非用于限制本发明的范围。

纳米等离子体晶片基板的制备

纳米等离子体晶片基板可利用已知的方法制备得，包括(例如)激光、微波、微波等离子体等加热法。可用于制备本发明纳米等离子体晶片基板的金属膜包括金、银、铜、铂及其合金等。在本发明的一实施例，是利用微波等离子体当作加热源，进行材料表面的处理，而得到具有特殊金属纳米结构的等离子体晶片。其原理为金属膜因受热形成纳米结构，且由于受到微波与微波等离子体两种作用下，使得进一步金属纳米结构与玻璃基板介面间产生瞬间的高温，因此在所制得的金属纳米结构基板中，形成的金属纳米颗粒的底部包覆一层玻璃结构。

作为本发明一具体实例的金纳米等离子体晶片基板的制备方法简述如下。首先，在玻璃基板上溅镀一层金薄膜，之后再放入微波等离子体内处理，处理时间仅仅只需30秒，之后便可以在该基板上形成金纳米颗粒。本发明的金纳米等离子体晶片基板上所形成的金纳米粒子大小约为9±3nm。

在纳米等离子体晶片基板表面修饰接收器(receptor)

本发明所述的“接收器”意指与待测物相对应的抗原或抗体。在上述制得的金纳米等离子体晶片基板上，滴加40μL与待测物相对应的抗原或抗体溶液，并于室温下静置1小时后，以1XPBS缓冲液、超纯水冲洗数次，再用氮气吹干。封阻(blocking)步骤：将晶片滴加40μL的5％的BSA溶液，并于室温下静置30分钟后，以1XPBS缓冲液、超纯水冲洗数次，再用氮气吹干。

修饰待测物

本发明方法的特征在于，在修饰待测物的同时滴加裸金粒子缓冲溶液，使其和待测物产生键结，而使纳米金簇修饰于待测物上，以增强LSPR讯号。将晶片滴加40μL的待测物溶液，并于37℃下静置1小时后，继续滴加40μL的10nm裸金粒子缓冲溶液(悬浮于0.1mMPBS缓冲液)，在静置于室温下20分钟后，以1XPBS缓冲液、超纯水冲洗数次，再用氮气吹干。图2显示纳米金簇在金纳米等离子体晶片上形成的SEM图。

以在感测晶片表面修饰一人类IgG抗体做为接收器(receptor)为例，我们先在等离子体晶片上修饰抗-IgG抗体(anti-IgGantibody)后，再对不同浓度的IgG抗原(IgG)进行侦测。图3为侦测1μg/mLIgG的UV吸收度强度变化量图。以人类IgG抗体做为接收器(receptor)，所得到的感测晶片其吸收高峰将落在540±2nm。使用此感测晶片来侦测人类IgG时，由于抗原接上去后会使所引起的光学变化量落在540nm左右。

以本发明的高灵敏度LSPR生化感测方法侦测帕金森氏症的标记物(anti-α-Syn抗体)

帕金森氏症的标记物α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)本来就存在于我们的脑中，但是当出现过量的α-突触核蛋白时，便会使α-突触核蛋白开始产生聚集，最后变成Lewybody(路易士体)，且对神经细胞有害。此时，脑神经细胞便开始产生对抗α-突触核蛋白的抗-α-突触核蛋白抗体(anti-α-Synantibody)并扩散至血液中。在实务上，欲侦测帕金森氏症的标记物，不仅可以侦测脑脊髓液中的α-突触核蛋白(α-Syn)，也可以侦测血液(血浆LSPR生化感测血清)中的抗-α-突触核蛋白抗体，或是血液(血浆或血清)中呈寡聚体(oligomer)或纤维(fibril)形态的α-突触核蛋白。然而，综观现有技术，皆未能以低成本、短时间的分析过程及简易制备的方式，来侦测帕金森氏症的标记物(α-突触核蛋白或其抗体)。于是，本发明进一步提供利用本发明方法及套组侦测低浓度帕金森氏症的标记物(α-synuclein)的抗体的实例，以证明本发明方法相较于已知侦测方法的进步性。

依前述的方法，先于金纳米等离子体晶片上修饰α-突触核蛋白(α-Syn，购自ENZOLIFESCIENCES)，再针对抗-α-Syn抗体(anti-α-Syn，购自SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC)进行侦测。由图4的结果显示，吸光值变化量随着待测物抗-α-突触核蛋白抗体的浓度增加而增大。

参见图5的结果，经由比较空白组(PBS缓冲液)、控制组(抗-IgG)和实验组(抗-α-Syn)的数据可以发现，待测物3.8ng/mL抗-α-Syn抗体的吸收强度变化量大于PBS缓冲液和1μg/mL抗-IgG的吸收度强度变化量，且3.8ng/mL抗-α-Syn抗体的吸收强度变化量也大于PBS缓冲液的三倍标准偏差(参照图5的右表)，因此以本发明的侦测方法已成功定性侦测3.8ng/mL的抗-α-Syn抗体，且有机会侦测到更低浓度的抗-α-Syn抗体。

因此将本发明方法与已知相关技术比较的侦测极限及侦测过程总耗时整理于下表1。

表1

[1]Bryan,T.等人.ChemicalScience2012,3,3468.

[2]Shi,M.等人.NeuroscienceLetters2010,480,78.

[3]谢世良,流式细胞技术.249.

[4]An,Y.等人.Biosensors&Bioelectronics2012,32,224.

[5]WienekeJ.A.vanGeel等人.NeuroscienceMethods2008,168,182.

经由以上的比较结果显示，本发明的高灵敏度LSPR生化感测方法，不需另外添加标记药剂或是二次抗体，就能成功侦测低浓度或小分子待测物，可有效降低高成本的花费；且侦测时间仅需3小时左右，相较于其他侦测方式可大幅地缩短侦测时间。

Claims

1.一种用于侦测低浓度待测物的高灵敏度局域表面等离子体共振生化感测套组，其特征在于，包含：

一等离子体金属纳米结构基板，包含一基材、包埋于该基材上的单层纳米金属粒子，及一修饰于该基材表面或该纳米金属粒子上的接收器；及

一裸金粒子悬浮溶液，其中该裸金粒子悬浮于缓冲液中且具有的粒径介于5～100nm。

2.如权利要求1所述的局域表面等离子体共振生化感测套组，其特征在于，所述基材为光学玻璃或高光穿透性塑胶。

3.如权利要求1所述的局域表面等离子体共振生化感测套组，其特征在于，所述纳米金属粒子选自金、银、铜、铂及其合金纳米粒子。

4.如权利要求1所述的局域表面等离子体共振生化感测套组，其特征在于，所述接收器为一与所述待测物相对应的抗体或抗原。

5.如权利要求1所述的局域表面等离子体共振生化感测套组，其特征在于，所述待测物为帕金森氏症的生物标记物。

6.如权利要求5所述的局域表面等离子体共振生化感测套组，其特征在于，所述待测物为α-突触核蛋白或抗-α-突触核蛋白抗体。

7.如权利要求1所述的局域表面等离子体共振生化感测套组，其特征在于，所述裸金粒子悬浮溶液包含PBS缓冲液或MES缓冲液。

8.如权利要求1所述的局域表面等离子体共振生化感测套组，其特征在于，所述裸金粒子的粒径介于5～50nm。

9.如权利要求1或8所述的局域表面等离子体共振生化感测套组，其特征在于，所述裸金粒子的粒径为10nm。

10.一种用于侦测低浓度待测物的局域表面等离子体共振生化感测方法，其特征在于，包含：

提供一纳米等离子体晶片，其利用加热法在基材上包埋单层纳米金属粒子；

在该纳米等离子体晶片表面上修饰一接收器，该接收器为一与待测物相对应的抗体或抗原；

将待测物加入与该接收器进行结合，并同时滴加裸金粒子，使裸金粒子修饰在待测物上；及

在400～800nm波长下侦测该待测物的局域表面等离子体共振讯号消光强度改变量。

11.如权利要求10所述的局域表面等离子体共振生化感测方法，其特征在于，所述纳米金属粒子选自金、银、铜、铂及其合金纳米粒子。

12.如权利要求10所述的局域表面等离子体共振生化感测方法，其特征在于，所述裸金粒子的粒径介于5～50nm。

13.如权利要求12所述的局域表面等离子体共振生化感测方法，其特征在于，所述裸金粒子的粒径为10nm。

14.如权利要求10所述的局域表面等离子体共振生化感测方法，其特征在于，所述待测物为帕金森氏症的生物标记物。

15.如权利要求14所述的局域表面等离子体共振生化感测方法，其特征在于，所述待测物为α-突触核蛋白或抗-α-突触核蛋白抗体。