CN108827875A - 一种快速测定液体中兽药残留及非法添加物的方法 - Google Patents

一种快速测定液体中兽药残留及非法添加物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用光纤生物传感器检测液体样本中兽药残留及非法添加物的方法。本发明从反应方式上着手，提供一种采用光纤生物传感器快速检测液体样本中兽药残留或非法添加物的方法，通过纳米金的信号放大作用将检测的灵敏性提高到一个比较高的水平。本发明方法灵敏性高，操作简单，时间短，且光纤传感器可再生使用，适合液体样本中小分子物质的快速检测。

Description

一种快速测定液体中兽药残留及非法添加物的方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用光纤生物传感器检测液体样本中兽药残留及非法添加物的方法。
背景技术
随着人民生活水平的日益提高，对食品特别是动物源性食品的需求也在不断上升。而在动物生产过程中，为了追求利益最大化，大量使用兽药以及其它非法添加物等物质,这使得水产及肉蛋奶中会含过量的化学物质残留,这些物质不断积聚往往对人体产生巨大的损害。因而，对动物源性食品中存在的化学药物残留进行快速检测对于保障人民生命健康、促进贸易的发展具有重要意义。
快速检测技术作为保障食品质量安全的重要技术支撑,在食品生产、流通全过程控制和监管以及进出口贸易中发挥着越来越重要的作用。现有的快速检测动物制品中兽药残留及非法添加物的方法主要是基于抗原-抗体反应的检测技术，主要有免疫层析法和酶联免疫吸附实验(ELISA)两种。
由于抗生素、激素类以及其它非法添加物等物质均为小分子，没有更多的抗原表位，所以对这类物质进行免疫学检测时均采用竞争法进行。目前几乎所有抗生素、激素以及其它非法添加物都已经建立了免疫测定法，如CN101198872公开了一种采用免疫层析技术检测β-内酰胺类抗生素、四环素、磺胺类抗生素的方法。免疫分析法普遍具有特异性好、灵敏度高、操作方便、检测时间短、不需要大型仪器设备等优势。
生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)是在光纤生物传感器(Biosensor)底部覆盖了生物分子相容层,可以用来固定相互作用分子中的一个,形成生物膜层,当具有一定带宽的可见光入射生物膜层时,根据薄膜干涉的简化模型和光线反射折射定律,入射光线在生物膜层表面被分成两部分,形成第一部分反射光,进入生物层的透射部分在生物层的第二个界面产生反射,形成第二部分反射光。光束垂直入射时,两部分反射光形成干涉波,被光谱仪所检测。相互作用发生时,生物层厚度增加,反射光干涉光谱曲线整体向波长增加方向移动，会导致干涉曲线的漂移,这种变化可以被实时监测。文献CN1875243公开了一种基于分子相互作用的光学元件，该元件可以用于生物分子生物相互作用检测。
发明内容
本发明旨在提供一种采用生物膜干涉技术检测液体样本中兽药残留及非法添加物的方法。
一种分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，包括：
a)孵育：用经纳米金颗粒标记的与兽药或非法添加物分子特异性结合的抗体或受体与待检液体混合，在便于抗体或受体与兽药或非法添加物分子反应的条件下，使抗体或受体与待检液体中的兽药或非法添加物分子充分反应形成复合物；
b)平衡：将底部带有与兽药或者非法添加物分子与载体蛋白形成的共价偶联物分子层的光纤生物生物传感器暴露于阴性样品或阴性样品与纳米金混合液，同时检测信号变化；
c)结合：将底部带有与兽药或者非法添加物分子与载体蛋白形成的共价偶联物分子层的光纤生物生物传感器暴露于孵育后的液体中，同时检测信号变化；
d)判断：根据信号变化情况，对液体中相应兽药残留或非法添加物含量进行判定。
如上所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征在于是光纤生物传感器是通过光纤耦合至光源及检测器的光学元件，该元件的远离光源的一端带有与兽药或非法添加物分子与载体蛋白形成的共价偶联物。
如上所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是孵育阶段的反应条件为：20℃-50℃反应1min-15min，优选37℃-45℃反应1-5min。
如上所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是阴性样本与纳米金混合液中的纳米金表面被不与兽药残留或非法添加物分子发生结合反应的分子所覆盖，如：BSA、OVA等。
如上所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是兽药或非法添加物与载体蛋白形成的共价偶联物分子通过疏水作用力、共价键或者分子间作用力固定于光纤生物传感器底部，优选疏水作用力。
如上所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是若偶联物分子以疏水作用力固定于光纤生物传感器的底部，则偶联物的包被浓度优选50μg/ml-5mg/ml。
如上所述分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是结合阶段的反应条件为：20℃-50℃反应1min-15min，优选37℃-45℃反应5min。
如上所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征在于，将偶联物分子固定于光纤生物传感器底部之后，应再将光纤生物传感器底部暴露于1％-5％的鱼明胶、5％-20％的海藻糖或者5％-10％的蔗糖中，暴露时间为0.5min-10min，优选用1％-5％的鱼明胶暴露1min-3min。
如上所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是所述纳米金颗粒的粒径为20nm-60nm。
如上所述分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是纳米金通过直接或者间接标记方式与抗体或受体结合在一起形成复合物。
如上所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征在于，纳米金标记与兽药或非法添加物分子特异性结合的抗体或受体的条件为1毫升纳米金与0.2μg-20μg的抗体或受体反应，优选1毫升纳米金与15μg-20μg的抗体或受体反应。
如上所述分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是非法添加物是指三聚氰胺、罗丹明B、苏丹红、孔雀石绿等在动物生产加工领域中禁用的化学物质。
有益效果：本发明从反应方式上着手，提供一种采用光纤生物传感器快速检测液体样本中兽药残留或非法添加物的方法，通过纳米金的信号放大作用将检测的灵敏性提高到一个比较高的水平。本发明方法灵敏性高，操作简单，时间短，且光纤传感器可再生使用，适合液体样本中小分子物质的快速检测。
附图说明
图1：美国Fortebio公司生产的光纤生物传感器示意图；
图2：附图1中A部分(即光纤生物传感器下部)放大示意图；
图3：光纤生物传感器检测液体样本中的兽药或非法添加物；
图4：采用纳米金信号放大的光纤生物传感器检测牛奶中氨苄青霉素灵敏性实验结果。
1：兽药或非法添加物分子与载体蛋白形成的偶联物；3：兽药残留或非法添加物分子；4：与兽药或非法添加物分子特异性结合的受体或者抗体；5：纳米金颗粒；6：液体样本与缓冲液、纳米金标记的抗体/受体组成的混合溶液；7：反应容器。
具体实施方式
实施例1检测牛奶中β-内酰胺类抗生素
1.光纤生物传感器的制备
1)将APS光纤生物传感器底部插入超纯水中，静置1min以上；
2)取出，将APS光纤生物传感器底部插入安苄青霉素-BSA偶联物溶液(1μg/ml-1mg/ml，50mMPB(pH7.4)，0.2％蔗糖)，室温反应5min；
3)用1×PBS(pH7.4)洗涤光纤传感器底部一次；
4)用将光纤生物传感器底部浸入15％蔗糖中1min；
5)取出，室温晾干；
6)将制备好的光纤生物传感器置于4℃密封干燥保存。
2.金标抗体的制备：采用40nm纳米金(参照Frens，1973合成)标记抗β-内酰胺类抗生素受体的抗体，具体标记方法如下：往1ml纳米金溶液中加入1.5μL，3mg/ml的抗β-内酰胺类抗生素受体的单克隆抗体，涡旋混匀，室温静置15min；加入10％BSA 100μL封闭颗粒15min；离心，弃上清；加入50mM PB(pH7.4)100μL重悬颗粒，4℃保存，备用。
3.检检测液体的处理：取200μL牛奶于微孔板中，加入50μL 1×PBST(1％Tween20，pH7.4)，10μL 0.5μg/mlβ-内酰胺类抗生素受体、5μL纳米金标记的抗β-内酰胺类抗生素受体的抗体，吹打混匀，40℃反应3min。
4.用生物分子相互作用仪进行检测
1)平衡：将包被有氨苄青霉素-BSA的光纤生物传感器的底部没入β-内酰胺类抗生素阴性牛奶中，平衡2min(1000rpm，37℃)；
2)反应：将平衡过的光纤生物传感器底部没入准备好的待检液体(步骤3)中，反应5min(1000rpm，37℃)。
5.检测灵敏性如下表所示：
当往体系中添加5μL纳米金标记的抗β-内酰胺类抗生素受体的抗体，检测灵敏性显著提高，检测氨苄青霉素的灵敏性达到1-2ppb，如图4所示。
6.与添加有500ppb的三聚氰胺、恩诺沙星、环丙沙星、氯霉素的牛奶均无反应。
实施例2检测生奶中喹诺酮类抗生素
1.光纤生物传感器的制备
1)将APS光纤传感器底部插入超纯水中，静置1min以上；
2)将APS光纤传感器底部插入环丙沙星-BSA偶联物溶液(1μg/ml-1mg/ml，50mM Tris(pH8.5))，室温反应5min；
3)用1×PBST(0.5％Tween 20，pH7.4)洗涤传感器底部一次；
4)用将光纤传感器底部浸入15％蔗糖中1min；
5)取出，室温晾干；
6)将光纤生物传感器置于4℃密封干燥保存。
2.金标抗体的制备：采用40nm纳米金(参照Frens,1973合成)标记喹诺酮类抗生素单克隆抗体，具体标记方法如下：往1ml纳米金溶液中加入2.5μL，2mg/ml的喹诺酮类抗生素单克隆抗体，涡旋混匀，室温静置15min；加入10％BSA 100μL封闭颗粒15min；离心，弃上清；加入100μL 50mM PB(pH7.4)重悬颗粒，4℃保存，备用。
3.待检测液体的处理：取200μL牛奶于微孔板中，加入50μL 1×PBST(1％Tween-20，pH7.4)，5μL纳米金标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体，吹打混匀，20℃反应15min；
4.用生物分子相互作用仪进行检测
1)平衡：将传感器底部没入喹诺酮类抗生素检测呈阴性的牛奶中，平衡2min(1000rpm，37℃)；2)反应：将传感器底部没入准备好的待检液体(步骤3)中，反应5min(1000rpm，37℃)；5.检测结果
本方法检测牛奶中喹诺酮类抗生素的灵敏性如下：
实施例3检测牛奶中三聚氰胺
1.光纤生物传感器的制备
1)将APS光纤传感器底部插入1×PBS(pH7.4)中，静置1min以上；
2)将APS光纤传感器底部插入三聚氰胺-OVA偶联物溶液(1μg/ml-1mg/ml，50mM Tris(pH8.5))，室温反应5min；
3)用1×PBST(0.5％Tween 20，pH7.4)洗涤传感器底部一次；
4)用将光纤传感器底部浸入15％蔗糖中1min；
5)取出，室温晾干；
6)将光纤生物传感器置于4℃密封干燥保存。
2.金标抗体的制备：采用40nm纳米金(参照Frens,1973合成)标记三聚氰胺单克隆抗体，具体标记方法如下：往1ml纳米金溶液中加入2μL 1mg/ml的喹诺酮类抗生素单克隆抗体，涡旋混匀，室温静置15min；加入10％BSA 100μL封闭颗粒15min；离心，弃上清；加入100μL 50mM PB(pH7.4)重悬颗粒，4℃保存，备用。
3.待检测液体的处理：取200μL牛奶于微孔板中，加入50μL 1×PBST(1％Tween-20，pH7.4)，6μL纳米金标记的三聚氰胺单克隆抗体，吹打混匀，40℃反应3min；
4.用生物分子相互作用仪进行检测
1)平衡：将传感器底部没入三聚氰胺检测呈阴性的牛奶中，平衡2min(1000rpm，37℃)；2)反应：将传感器底部没入准备好的待检液体(步骤3)中，反应5min(1000rpm，37℃)。
5.检测结果
本方法检测牛奶中三聚氰胺的灵敏性为15ppb-25ppb。
实施例4检测猪尿液中的盐酸克伦特罗
1.盐酸克伦特罗光纤生物传感器的制备
1)用50mM MES(pH6.0)将盐酸克伦特罗-BSA偶联物稀释至50μg/ml，加入EDC至20mg/mL，混匀，立即将氨基修饰的光纤生物传感器底部插入上述溶液，室温偶联30min，加入BSA，使其终浓度为1％，室温封闭2h，用1×PBST(0.5％Tween，pH7.4)洗涤光纤生物传感器底部；
2)将光纤传感器插入15％蔗糖溶液中1min；
3)取出，室温晾干；
4)置于4℃干燥保存。
2.金标盐酸克伦特罗抗体的制备
采用30nm纳米金(参照Frens，1973合成)标记盐酸克伦特罗抗体，具体标记方法如下：往1ml纳米金溶液中加入3.5μL，1mg/ml的盐酸克伦特罗单克隆抗体，涡旋混匀，室温静置15min；加入10％BSA 100μL封闭颗粒15min；离心，弃上清；加入50mM PB(pH7.4)100μL重悬颗粒，4℃保存，备用。
3.待检测液体的处理：取200μL猪尿液于微孔板中，加入50μL 1×PBST(1％Tween-20，pH7.4)，5μL纳米金标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体，吹打混匀，40℃反应5min；4.用生物分子相互作用仪进行检测
1)平衡：将传感器底部没入盐酸克伦特罗检测呈阴性的猪尿液中，平衡2min(1000rpm，37℃)；2)反应：将传感器底部没入准备好的待检液体(步骤3)中，反应5min(1000rpm，37℃)。
5.检测结果
本方法检测猪尿液中盐酸克伦特罗的灵敏性为2ppb。
实施例5检测蜂蜜中氯霉素
1.氯霉素光纤生物传感器的制备
1)将APS光纤传感器底部插入1×PBS(pH7.4)中，静置1min以上；
2)将APS光纤传感器底部插入氯霉素-BSA偶联物溶液(1μg/ml-1mg/ml，50mM PB(pH7.4))，室温反应5min；
3)用1×PBST(0.5％Tween 20，pH7.4)洗涤光纤生物传感器底部一次；
4)用将光纤传感器底部浸入15％蔗糖中1min；
5)取出，室温晾干；
6)将光纤生物传感器置于4℃密封干燥保存。
2.纳米金标记氯霉素单克隆抗体的制备
采用40nm纳米金(参照Frens，1973合成)标记氯霉素单克隆抗体，具体标记方法如下：往1ml纳米金溶液中加入1μL，1mg/ml的氯霉素单克隆抗体，涡旋混匀，室温静置15min；加入10％BSA 100μL封闭颗粒15min；离心，弃上清；加入50mM PB(pH7.4)100μL重悬颗粒，4℃保存，备用。
3.蜂蜜样品处理
1)取3g样品与3ml蒸馏水充分混合；
2)加入6ml乙酸乙酯充分震荡混合10min；
3)2000g离心10min；
4)转移4ml上层乙酸乙酯到干净离心管中，50℃温和氮气吹干；
5)加入300μL1×PBS(pH7.4)溶解产物；
6)取200μL猪尿液于微孔板中，加入50μL 1×PBST(1％Tween-20，pH7.4)，5μL纳米金标记的氯霉素单克隆抗体，吹打混匀，40℃反应5min；
4.检测
1)平衡：将传感器底部没入1×PBS-BSA(0.5％BSA，pH7.4)中，平衡2min(1000rpm，37℃)；2)反应：将传感器底部没入准备好的待检液体(步骤3)中，反应5min(1000rpm，37℃)。
5.检测结果
本方法检测蜂蜜中氯霉素的灵敏性为0.1ppb。
实施例6检测水产品中孔雀石绿
1.孔雀石绿光纤生物传感器的制备
2.纳米金标记孔雀石绿多克隆抗体的制备
3.样品处理
1)将鱼虾去皮取肉，用匀质器匀质样品至糊状；
2)称取5g左右均质好的样品，放入50mL离心管中；
3)加入2ml提取试剂A和10ml提取乙腈-盐酸混合液高速震荡3-4min；
4)加入4g中性氧化铝粉末，拧紧盖子并上下充分摇晃20-30s，然后4000rpm离心5min；
5)转移4.5ml上清溶液到新的15ml离心管中，并加入50μL氧化剂混匀，
6)室温下静置3min；
7)加入等体积的正己烷，拧紧盖子上下充分颠倒混匀5-6次，室温下静置3min，然后小心吸弃上层后，并将约3.5ml下层倒入5ml离心管中，60℃氮吹仪将其吹干；
8)加入200ul样品复溶液，震荡15-20s备用；
9)取180μL溶解后的产物于微孔板中，加入50μL 1×PBST(1％Tween-20，pH7.4)，5μL纳米金标记的孔雀石绿多克隆抗体，吹打混匀，50℃反应1min。
4.检测
1)平衡：将传感器底部没入1×PBS-BSA(0.5％BSA，pH7.4)中，平衡2min(1000rpm，37℃)；2)反应：将传感器底部没入准备好的待检液体(步骤3)中，反应5min(1000rpm，37℃)。
5.检测结果
本方法检测组织中氯霉素的灵敏性为0.5ppb-1ppb。
实施例7检测组织中氯霉素
1.氯霉素光纤生物传感器的制备
1)将APS光纤传感器底部插入1×PBS(pH7.4)中，静置1min以上；
2)将APS光纤传感器底部插入氯霉素-BSA偶联物溶液(1μg/ml-1mg/ml，50mM PB(pH7.4))，室温反应5min；
3)用1×PBST(0.5％Tween 20，pH7.4)洗涤光纤生物传感器底部一次；
4)用将光纤传感器底部浸入15％蔗糖中1min；
5)取出，室温晾干；
6)将光纤生物传感器置于4℃密封干燥保存。
2.纳米金标记氯霉素多克隆抗体
采用40nm纳米金(参照Frens，1973合成)标记氯霉素多克隆抗体，具体标记方法如下：往1ml纳米金溶液中加入2μL，1mg/ml的氯霉素多克隆抗体，涡旋混匀，室温静置15min；加入10％BSA 100μL封闭颗粒15min；离心，弃上清；加入50mM PB(pH7.4)100μL重悬颗粒，4℃保存，备用。
3.样品处理
1)鱼虾、畜禽肉等去皮，避免脂肪和结缔组织，均质，称取3g均质物于15ml离心管中，加入3ml乙酸乙酯，剧烈振荡2min。
2)室温(20-25℃)4000r/min，离心5min，移取全部上层上清溶液到另一个锥底离心管，吹干；
3)用200μL超纯水溶解微孔内试剂；
4)取180μL溶解后的产物于微孔板中，加入50μL 1×PBST(1％Tween-20，pH7.4)，5μL纳米金标记的氯霉素多克隆抗体，吹打混匀，40℃反应5min。
4.检测
3)平衡：将传感器底部没入1×PBS-BSA(0.5％BSA，pH7.4)中，平衡2min(1000rpm，37℃)；
4)反应：将传感器底部没入准备好的待检液体(步骤3)中，反应5min(1000rpm，37℃)。
5.检测结果
本方法检测组织中氯霉素的灵敏性为0.1ppb。
实施例8检测组织中磺胺类抗生素
1.磺胺类抗生素光纤生物传感器的制备
7)将APS光纤传感器底部插入1×PBS(pH7.4)中，静置1min以上；
8)将APS光纤传感器底部插入磺胺二甲嘧啶-BSA偶联物溶液(1μg/ml-1mg/ml，50mM PB(pH7.4))，室温反应5min；
9)用1×PBST(0.5％Tween 20，pH7.4)洗涤光纤生物传感器底部一次；
10)用将光纤传感器底部浸入15％蔗糖中1min；
11)取出，室温晾干；
12)将光纤生物传感器置于4℃密封干燥保存。
2.纳米金标记磺胺类抗生素单克隆抗体的制备
采用40nm纳米金(参照Frens，1973合成)标记磺胺类抗生素单克隆抗体，具体标记方法如下：往1ml纳米金溶液中加入1μL，1mg/ml的磺胺类抗生素单克隆抗体，涡旋混匀，室温静置15min；加入10％BSA 100μL封闭颗粒15min；离心，弃上清；加入50mM PB(pH7.4)100μL重悬颗粒，4℃保存，备用。
3.样品处理
1)将待测组织去皮取肉，用匀质器匀质样品至糊状；
2)称取1g左右均质好的样品，放入15mL离心管中；
3)加入2ml提取液，高速震荡3-4min；
4)4000rpm离心5min，取上清150μL于白色微孔中，再加入50μL中和液，混合均匀；
5)取180μL产物于微孔板中，加入50μL 1×PBST(1％Tween-20，pH7.4)，5μL纳米金标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体，吹打混匀，40℃反应5min。
4.检测
1)平衡：将传感器底部没入1×PBS-BSA(0.5％BSA，pH7.4)中，平衡2min(1000rpm，37℃)；2)反应：将传感器底部没入准备好的待检液体(步骤3)中，反应5min(1000rpm，37℃)。
5.检测结果
本方法检测组织中磺胺类抗生素的灵敏性为10ppb(磺胺总量)。
实施例9检测组织中呋喃唑酮代谢物
1.呋喃唑酮代谢物光纤生物传感器的制备
1)将APS光纤传感器底部插入1×PBS(pH7.4)中，静置1min以上；
2)将APS光纤传感器底部插入磺胺二甲嘧啶-BSA偶联物溶液(1μg/ml-1mg/ml，50mM PB(pH7.4))，室温反应5min；
3)用1×PBST(0.5％Tween 20，pH7.4)洗涤光纤生物传感器底部一次；
4)用将光纤传感器底部浸入15％蔗糖中1min；
5)取出，室温晾干；
6)将光纤生物传感器置于4℃密封干燥保存。
2.纳米金标记呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备
采用40nm纳米金(参照Frens，1973合成)标记呋喃唑酮代谢物单克隆抗体，具体标记方法如下：往1ml纳米金溶液中加入1μL，1mg/ml的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体，涡旋混匀，室温静置15min；加入10％BSA 100μL封闭颗粒15min；离心，弃上清；加入50mM PB(pH7.4)100μL重悬颗粒，4℃保存，备用。
3.样品处理
1)鱼虾、畜禽肉等去皮，避免脂肪和结缔组织，均质，称取6g均质物于15ml离心管中。
2)加入8ml蒸馏水，1ml试剂A和400μl衍生化试剂，剧烈振荡5min，充分混匀，在65℃水浴中孵育30min。
3)分别加入2ml试剂B，0.8ml试剂C和8ml的乙酸乙酯，剧烈振荡3min；
4)室温(20-25℃)4000r/min，离心5min，取出上层4ml的乙酸乙酯，吹干；
5)用1ml正已烷溶解干燥物，充分振荡混合1min，加入0.6ml试剂D充分振荡混合1min。
6)在室温下(20-25℃)静置5分钟，取下层溶液用于检测。
7)将装有反应微孔的铝箔袋恢复至室温，取出所需数量的反应微孔及相应试纸条，将多余的微孔和试纸条放入铝箔袋中，并密封好。
8)移取200μl下层样品溶液于反应微孔中，抽吸5-10次，混合均匀，室温下静置5min(准确计时)。
9)取180μL产物于微孔板中，加入50μL 1×PBST(1％Tween-20，pH7.4)，5μL纳米金标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体，吹打混匀，40℃反应5min。
4.检测
1)平衡：将传感器底部没入1×PBS-BSA(0.5％BSA，pH7.4)中，平衡2min(1000rpm，37℃)；
2)反应：将传感器底部没入准备好的待检液体(步骤3)中，反应5min(1000rpm，37℃)。
5.检测结果
本方法检测组织中呋喃唑酮代谢物的灵敏性为0.5ppb。

Claims (10)

1.一种分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，包括：
a)孵育：用经纳米金颗粒标记的与兽药或非法添加物分子特异性结合的抗体或受体与待检液体混合，在便于抗体或受体与兽药或非法添加物分子反应的条件下，使抗体或受体与待检液体中的兽药或非法添加物分子充分反应形成复合物；
b)平衡：将底部带有与兽药或者非法添加物分子与载体蛋白形成的共价偶联物分子层的光纤生物生物传感器暴露于阴性样品或阴性样品与纳米金混合液，同时检测信号变化；
c)结合：将底部带有与兽药或者非法添加物分子与载体蛋白形成的共价偶联物分子层的光纤生物生物传感器暴露于孵育后的液体中，同时检测信号变化；
d)判断：根据信号变化情况，对液体中相应兽药残留或非法添加物含量进行判定。
2.如权利要求1所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征在于是光纤生物传感器是通过光纤耦合至光源及检测器的光学元件，该元件的远离光源的一端带有与兽药或非法添加物分子与载体蛋白形成的共价偶联物。
3.如权利要求1所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是孵育阶段的反应条件为：20℃-50℃反应1min-15min，优选37℃-45℃反应1-5min。
4.如权利要求1所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是阴性样本与纳米金混合液中的纳米金表面被不与兽药残留或非法添加物分子发生结合反应的分子所覆盖，如：BSA、OVA等。
5.如权利要求1所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是兽药或非法添加物与载体蛋白形成的共价偶联物分子通过疏水作用力、共价键或者分子间作用力固定于光纤生物传感器底部，优选疏水作用力。
6.如权利要求1所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是若偶联物分子以疏水作用力固定于光纤生物传感器的底部，则偶联物的包被浓度优选50μg/ml-5mg/ml。
7.如权利要求1所述分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是结合阶段的反应条件为：20℃-50℃反应1min-15min，优选37℃-45℃反应5min。
8.如权利要求1所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征在于，将偶联物分子固定于光纤生物传感器底部之后，应再将光纤生物传感器底部暴露于1％-5％的鱼明胶、5％-20％的海藻糖或者5％-10％的蔗糖中，暴露时间为0.5min-10min，优选用1％-5％的鱼明胶暴露1min-3min。
9.如权利要求1所述的分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是所述纳米金颗粒的粒径为20nm-60nm。
10.如权利要求1所述分析样品中兽药残留或非法添加物含量的方法，其特征是纳米金通过直接或者间接标记方式与抗体或受体结合在一起形成复合物；纳米金标记与兽药或非法添加物分子特异性结合的抗体或受体的条件为1毫升纳米金与0.2μg-20μg的抗体或受体反应，优选1毫升纳米金与15μg-20μg的抗体或受体反应；非法添加物是指三聚氰胺、罗丹明B、苏丹红、孔雀石绿等在动物生产加工领域中禁用的化学物质。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114594264A (zh) * 2020-12-03 2022-06-07 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于生物膜干涉的多糖与蛋白相互作用亲和力的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104198734A (zh) * 2014-09-01 2014-12-10 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 一种金黄色葡萄球菌的检测方法
CN107305213A (zh) * 2016-04-25 2017-10-31 赵芳 一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法及试剂盒
CN107389938A (zh) * 2017-07-05 2017-11-24 浙江警察学院 一种基于生物膜干涉技术的摇头丸检测方法
CN107422135A (zh) * 2017-07-05 2017-12-01 浙江警察学院 一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104198734A (zh) * 2014-09-01 2014-12-10 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 一种金黄色葡萄球菌的检测方法
CN107305213A (zh) * 2016-04-25 2017-10-31 赵芳 一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法及试剂盒
CN107389938A (zh) * 2017-07-05 2017-11-24 浙江警察学院 一种基于生物膜干涉技术的摇头丸检测方法
CN107422135A (zh) * 2017-07-05 2017-12-01 浙江警察学院 一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘小军等: ""用生物膜干涉技术快速检测牛乳中β-内酰胺类抗生素残留"", 《安徽农业科学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114594264A (zh) * 2020-12-03 2022-06-07 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于生物膜干涉的多糖与蛋白相互作用亲和力的方法

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