CN107884569A - 一种快速检测氯霉素残留的方法 - Google Patents

一种快速检测氯霉素残留的方法 Download PDF

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Abstract

一种快速检测氯霉素残留的方法，属于检验技术领域。本发明采用活性酯法将含有羧基的半抗原琥珀氯霉素与载体蛋白质直接偶联制备免疫原和包被抗原，以经前述包被抗原表面修饰的多模光纤探头检测对实际样品进行检测，由于氯霉素抗体结合到传感器上的差异，导致可见光在传感器膜面上形成的干涉光谱位移差异，通过检测这种位移变化间接反映目标物氯霉素抗体的浓度，由此实现对氯霉素的检测。该检测方法较传统仪器分析方法更为简单快捷，且检测成本较低，有望进行大规模的推广应用。

Description

一种快速检测氯霉素残留的方法
技术领域
本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种快速检测氯霉素残留的方法，特别涉及一种基于光学传感器的氯霉素残留的快速检测方法。
背景技术
氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一种广谱抗生素，由于其低廉的价格和稳定的抗菌性，曾在一段时间内作为饲料添加剂和兽医临床常用药品。但氯霉素有严重的毒副作用，能引起再生障碍性贫血症和婴儿灰色综合症。氯霉素在动物性食品中的残留是通过水产品、肉制品、奶、蛋等作用于人类，因而美国和欧共体已禁止在动物中使用氯霉素，并规定在动物源食品中不得检出。
氯霉素在水产品、畜产品中残留的检测方法，国内外报道很多，包括微生物法、色谱法、免疫测定法等，微生物法易操作、费用低，但灵敏度低、特异性差。色谱法精确可靠、灵敏度高，检测极限可达到0.1μg/kg，但前处理步骤多，回收率偏低。免疫测定具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备和人员素质要求低以及样品前处理简单等优点，适于现场监控和大规模样品筛选。免疫学检测方法的灵敏度高及特异性较强，但相应抗体的研发时间长而成本高，且重复性及稳定性较差。
传感器方法是近些年发展起来的新型检测技术，基于生物学原理的传感器使以生物活性物质作为传感器的识别原件，与样品中的待测物质发生特异性反应，通过适当的换能器将这些反应（形成复合物、发色、发光等）转换成可以输出检测的信号（电压、频率等），通过分析信号对待测物进行定性和定量检测。随着光纤传感技术及各种生物固定技术的广泛研究，光纤生物传感器（fiber optic biosensor，FOBS）得到了迅速的发展，各类光纤生物传感器的研制开发成为生物传感器的发展热点。
光纤传感器是一类在物理或化学激励下产生光学特性变化，引起光纤中传播光束的特征参量，如强度、波长、相位、偏振态等的改变，并为与光纤相连接的各种检测器件所响应的装置。其中，生物膜干涉技术基于光吸收、荧光和光反射原理，通过蛋白分子结合到传感器上的差异，导致可见光在传感器膜面上形成的干涉光谱位移差异，通过检测这种位移变化间接反映蛋白分子的浓度。因此，开发基于生物膜干涉技术的氯霉素检测方法有助于快速检测动物源性食品中氯霉素残留。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速检测氯霉素残留的方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：制备氯霉素半琥珀酸酯
将氯霉素、琥珀酸酐、丙酮及吡啶混合，搅拌使可溶物溶解，回流反应后得到的反应液经浓缩，得淡黄色粘稠液体，用乙酸乙酯洗出，然后加1M的HCl分层，取有机相，再用质量分数为10%的 NaHCO3转溶后，用浓盐酸将pH值调至2，用乙酸乙酯萃取，取有机相，经浓缩后即得氯霉素半琥珀酸酯；
第二步：制备包被原
将氯霉素半琥珀酸酯溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃条件下预冷10min后加入三丁胺混匀，接着加入氯甲酸异丁酯，3~5℃条件下搅拌18~22min，然后加入到牛血清蛋白溶液中，3~5℃条件下搅拌反应3~5h，反应产物用0.05 M 的pH值为7.4的PBS缓冲液透析，获得氯霉素-BSA偶联物受体；所述牛血清蛋白溶液的制备方法为：将牛血清蛋白溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃条件下预冷，再将pH值调至8，即得牛血清蛋白溶液；以氯霉素计算，氯霉素与牛血清蛋白的摩尔比为45~55：1；
第三步：制备免疫原
将卵清蛋白和氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05M的硼砂缓冲液中，4℃搅拌，将上述1.5 mLA溶液逐滴加入到该溶液中，避光反应1 h，得到氯霉素包被抗原溶液，用pH值为7.4的PBS缓冲液透析5d，每12 h更换一次透析液，将透析后的溶液离心300015 min，弃沉淀，冻干上清液，获得免疫原；
第四步：光纤传感器抗原包被修饰
将APS光纤传感器末端没入包被原溶液中，室温静置5 min；再将APS光纤生物传感器末端没入质量分数为15%的蔗糖水溶液中，室温静置1 min，然后室温晾干后置于2～8℃干燥条件下保存，备用；
第五步：金标氯霉素包被原制备
向1 ml胶体金中加入1μL0.5mg/ml的氯霉素-BSA偶联物受体，涡旋混匀，室温静置15min，加入100 μL 的质量分数为10%的牛血清蛋白溶液，室温封闭15 min，10000 rpm离心10min，弃掉上层清液，加入90 μL pH 7.4 的PB缓冲液，重悬颗粒，得到金标BSA。
第五步：检测
将氯霉素-BSA偶联物用pH值为7.4的PB缓冲液稀释20倍，取200μL于微孔板的第2列；用巴氏杀菌奶稀释氯霉素标准品到0.1、0.05、0.025和0.0125 ng/ml，分别取200 μL于微孔板的第4列，并加入5μL金标氯霉素抗体、50μL反应液，混匀；往微孔板第1列中加入200 μL水，往微孔板的第3列加入200μL巴氏杀菌奶、5μL金标BSA、50μL反应液，混匀；用APS光纤传感器进行检测：第一列60 s，第2列60 s；第3列60 s；第4列400 s。
优选的技术方案为：还包括APS光纤传感器的再生，包括：
平衡：将APS光纤传感器末端没入空白基质底液中120s，该空白基质底液含有200μL的底液、50 μL的反应液、5μL金标BSA；
检测：将APS光纤传感器末端没入氯霉素素检测阴性底液600s，该氯霉素素检测阴性底液含有200μL氯霉素素检测阴性样液、50μL反应液和5μL金标氯霉素素受体；
再生：将APS光纤生物传感器探头底部没入Gly/DMF30 s，该Gly/DMF由4倍体积的0.1 M甘氨酸溶液与1倍体积的二甲基甲酰胺混合混合后构成；
洗涤：用pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤APS光纤生物传感器探头底部一次。
优选的技术方案为：所述硼砂缓冲液的pH值为 8.5。
4、根据权利要求1或2所述的快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：所述反应液为pH 值为7.4的PBS缓冲液。
5. 根据权利要求1所述的快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：所述底液为奶粉溶于水后制得，其质量分数为10%。
附图说明
图1是金标记BLI检测牛奶中氯霉素残留。
图2是金标记BLI重复检测氯霉素加标样品。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
以氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS)为母体直接偶联所得亲和膜固定在光纤探头表面，再由光纤光谱分析装置检测和识别待测样品中是否存在目标物以及浓度信息，实现样品中氯霉素的定量检测。该方法大大缩短了检测成本和检测时间，具有良好重现性和自动化、高通量等优势，有望进一步改善生物传感器免疫分析技术，使其走向定量化、多元检测和广泛化应用。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
结合如下实施例对光学生物传感器测定动物源性食品的方法进行进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：一种快速检测氯霉素残留的方法
氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS)制备如下：
将氯霉素(CAP)、琥珀酸酐(HS)、丙酮及吡啶混合，搅拌溶解，60℃回流反应2h，于旋转蒸发器中浓缩，得淡黄色粘稠液体。用乙酸乙酯洗出，加1M HCl分层，取有机相，再用10%的NaHCO3转溶后，用浓盐酸调至pH2，用酸乙酯萃取，取有机相旋转蒸发器浓缩，得淡黄色粘稠固体，备用。
氯霉素包被原(CAP-BSA)制备如下：
称取CAP-HS 21.7 mg溶于DMF3ml中，4℃预冷10 min，加入三丁胺，混匀；并加入氯甲酸异丁酯，4℃搅拌20min。以CAP:BSA为50:1的摩尔比称取BSA，溶于50%的DMF10ml中，4℃预冷。用1 MNaOH调BSA至pH 8。将上CA-HS液迅速加入BSA中，4℃搅拌反应4h。所得产物以0.05M pH7.4的PBS透析3d，获得包被原。
氯霉素包被抗原(CAP-OVA)制备如下：
称取48 mg OVA和10 mg氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05M硼砂缓冲液(pH 8.5，含0.15 MNaCl)中，4℃搅拌，将上述1.5 mL A溶液逐滴加入到该溶液中，避光反应1 h，得到氯霉素包被抗原溶液，用PBS(pH 7.4)4℃透析5d(每12 h更换一次透析液)，将透析后的溶液高速离心(3000 g)15 min，弃沉淀，冻干上清液，获得包被抗原。
APS光纤传感器抗原包被修饰 将APS光纤传感器末端没入不同浓度的包被原溶液中，室温静置5 min。再将APS光纤生物传感器没入质量分数为15%的蔗糖溶液中，室温静置1min。室温晾干，置于5℃干燥保存，使用之前才将APS光纤传感器与ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪连接。
金标氯霉素包被原(CAP-BSA)制备如下：
向1 ml胶体金中加入1μL0.5mg/ml的氯霉素-BSA偶联物受体，涡旋混匀，室温静置15min，加入100 μL 10% BSA，室温封闭颗粒15 min，10000 rpm离心10 min，弃掉上层清液，加入90 μL PB(pH 7.4)，重悬颗粒，备用。
实际样品检测
将氯霉素-BSA偶联物(6 mg/ml)用1×PB(pH 7.4)稀释20倍，取200μL于微孔板中(第2列)；用巴氏杀菌奶稀释氯霉素标准品到0.1、0.05、0.025和0.0125 ng/ml，分别取200 μL于微孔板中(第4列)并加入5μL金标氯霉素抗体、50μL反应液，混匀；往微孔板第1列中加入200μL水，往第3列加入200μL巴氏杀菌奶、5μL金标BSA、50μL反应液；用APS探头进行检测(各列用时依次为60s、60s、60s、400s)。
所述反应液为pH 值为7.4的PBS缓冲液。
APS光学生物传感器再生：
平衡：将APS光纤传感器末端没入空白基质底液中120s，该空白基质底液含有200μL的底液（200μL10%奶粉水溶液）、50 μL的反应液、5μL金标BSA；
检测：将APS光纤传感器末端没入氯霉素素检测阴性底液600s，该氯霉素素检测阴性底液含有200μL氯霉素检测阴性样液、50μL反应液和5μL金标氯霉素素受体；氯霉素检测阴性样液与氯霉素素检测样液组成成分相同，但是不含有氯霉素。在本实施例中即为经检测不含有氯霉素的巴氏杀菌奶。
再生：将APS光纤生物传感器探头底部没入Gly/DMF30 s，该Gly/DMF由4倍体积的0.1 M甘氨酸溶液与1倍体积的二甲基甲酰胺混合混合后构成；
洗涤：用pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤APS光纤生物传感器探头底部一次。
所述反应液为pH 值为7.4的PBS缓冲液。
用金标记检测加有不同浓度的标准氯霉素的巴氏杀菌奶，计算结果，结果如图1所示。
灵敏性检测 重复检测6次氯霉素含量为0.1ng/ml的牛奶样本检测结果，图2显示该方法具有良好的灵敏性。该方法最低灵敏度达到0.0125 ng/ml，可满足牛奶氯霉素残留的快速定量检测。
特异性实验 用所建立的方法检测加标浓度为1000ng/ml的三聚氰胺、头孢哌酮、恩诺沙星、青霉素G、安苄青霉素、头孢哌酮、氟苯尼考和甲砜霉素，检测结果均为阴性。
实施例二：一种快速检测氯霉素残留的方法
一种快速检测氯霉素的免疫分析方法，所述方法包括氯霉素特异性抗体、包被的氯霉素与载体蛋白的偶联物制备及以下步骤：
步骤⑴ 制备氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS)，将CAP、琥珀酸酐、丙酮及吡啶混合，搅拌溶解，60℃回流反应2h，于旋转蒸发器中浓缩，得淡黄色粘稠液体。用乙酸乙酯洗出，加1M HCl分层，取有机相，再用10%的 NaHCO3转溶后，用浓盐酸调至pH2，用酸乙酯萃取，取有机相旋转蒸发器浓缩，得淡黄色粘稠固体，备用；
步骤⑵ 制备包被原 称取CAP-HS 21.7 mg溶于DMF3ml中，4℃预冷10 min，加入三丁胺，混匀；并加入氯甲酸异丁酯，4℃搅拌20min。以CAP:BSA为50:1的摩尔比称取BSA，溶于50%的DMF10ml中，4℃预冷。用1 MNaOH调BSA至pH 8。将上CA-HS液迅速加入BSA中，4℃搅拌反应4h。所得产物以0.05 M pH7.4的PBS透析3d，获得包被原；
步骤⑶ 制备免疫原 称取48 mg OVA和10 mg氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05M硼砂缓冲液(pH 8.5，含0.15 M NaCl)中，4℃搅拌，将上述1.5 mL A溶液逐滴加入到该溶液中，避光反应1 h，得到氯霉素包被抗原溶液，用PBS(pH 7.4)4℃透析5d(每12 h更换一次透析液)，将透析后的溶液高速离心(3000 g)15 min，弃沉淀，冻干上清液，到免疫原；
APS光纤传感器抗原包被修饰 将APS光纤传感器末端没入不同浓度的包被原溶液中，室温静置5 min。再将APS光纤生物传感器没入质量分数为15%的蔗糖溶液中，室温静置1min。室温晾干，置于5℃干燥保存，使用之前才将APS光纤传感器与ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪连接。
金标氯霉素包被原(CAP-BSA)制备如下：
向1 ml胶体金中加入1μL0.5mg/ml的氯霉素-BSA偶联物受体，涡旋混匀，室温静置15min，加入100 μL 10% BSA，室温封闭颗粒15 min，10000 rpm离心10 min，弃掉上层清液，加入90 μL PB(pH 7.4)，重悬颗粒，备用。
实际样品检测
将氯霉素-BSA偶联物(6 mg/ml)用1×PB(pH 7.4)稀释20倍，取200μL于微孔板中(第2列)；用巴氏杀菌奶稀释氯霉素标准品到0.1、0.05、0.025和0.0125 ng/ml，分别取200 μL于微孔板中(第4列)并加入5μL金标氯霉素抗体、50μL反应液，混匀；往微孔板第1列中加入200μL水，往第3列加入200μL巴氏杀菌奶、5μL金标BSA、50μL反应液；用APS探头进行检测(各列用时依次为60s、60s、60s、400s)。
所述反应液为pH 值为7.4的PBS缓冲液。经检测，巴氏杀菌奶中含有0.74 ng/ml的氯霉素。
APS光学生物传感器再生：
平衡：将APS光纤传感器末端没入空白基质底液中120s，该空白基质底液含有200μL的底液（200μL10%奶粉水溶液）、50 μL的反应液、5μL金标BSA；
检测：将APS光纤传感器末端没入氯霉素素检测阴性底液600s，该氯霉素素检测阴性底液含有200μL氯霉素检测阴性样液、50μL反应液和5μL金标氯霉素素受体；氯霉素检测阴性样液与氯霉素素检测样液组成成分相同，但是不含有氯霉素。在本实施例中即为经检测不含有氯霉素的巴氏杀菌奶。
再生：将APS光纤生物传感器探头底部没入Gly/DMF30 s，该Gly/DMF由4倍体积的0.1 M甘氨酸溶液与1倍体积的二甲基甲酰胺混合混合后构成；
洗涤：用pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤APS光纤生物传感器探头底部一次。
所述反应液为pH 值为7.4的PBS缓冲液。
本发明提供的一种利用光学生物传感器测定动物源性食品中氯霉素含量，所述检测的目标物为氯霉素，所述的检测仪器为光纤光谱分析装置，通过在光线传感器探头表面修饰固定一层氯霉素特异性抗体，建立了检测样品中目标物的金标测试方法，使用曲线拟合技术获得定量曲线，实现目标物的定量。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.一种快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：制备氯霉素半琥珀酸酯
将氯霉素、琥珀酸酐、丙酮及吡啶混合，搅拌使可溶物溶解，回流反应后得到的反应液经浓缩，得淡黄色粘稠液体，用乙酸乙酯洗出，然后加1M的HCl分层，取有机相，再用质量分数为10%的 NaHCO3转溶后，用浓盐酸将pH值调至2，用乙酸乙酯萃取，取有机相，经浓缩后即得氯霉素半琥珀酸酯；
第二步：制备包被原
将氯霉素半琥珀酸酯溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃条件下预冷10min后加入三丁胺混匀，接着加入氯甲酸异丁酯，3~5℃条件下搅拌18~22min，然后加入到牛血清蛋白溶液中，3~5℃条件下搅拌反应3~5h，反应产物用0.05 M 的pH值为7.4的PBS缓冲液透析，获得氯霉素-BSA偶联物受体；所述牛血清蛋白溶液的制备方法为：将牛血清蛋白溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃条件下预冷，再将pH值调至8，即得牛血清蛋白溶液；以氯霉素计算，氯霉素与牛血清蛋白的摩尔比为45~55：1；
第三步：制备免疫原
将卵清蛋白和氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05M的硼砂缓冲液中，4℃搅拌，将上述1.5 mLA溶液逐滴加入到该溶液中，避光反应1 h，得到氯霉素包被抗原溶液，用pH值为7.4的PBS缓冲液透析5d，每12 h更换一次透析液，将透析后的溶液离心300015 min，弃沉淀，冻干上清液，获得免疫原；
第四步：光纤传感器抗原包被修饰
将APS光纤传感器末端没入包被原溶液中，室温静置5 min；再将APS光纤生物传感器末端没入质量分数为15%的蔗糖水溶液中，室温静置1 min，然后室温晾干后置于2～8℃干燥条件下保存，备用；
第五步：金标氯霉素包被原制备
向1 ml胶体金中加入1μL的0.5mg/ml的氯霉素-BSA偶联物受体，涡旋混匀，室温静置15min，加入100 μL 的质量分数为10%的牛血清白蛋白溶液，室温封闭15 min，10000 rpm离心10 min，弃掉上层清液，加入90 μL pH值为 7.4 的PB缓冲液，重悬颗粒，得到金标BSA；
第五步：检测
将氯霉素-BSA偶联物用pH值为7.4的PB缓冲液稀释20倍，取200μL于微孔板的第2列；用巴氏杀菌奶稀释氯霉素标准品到0.1、0.05、0.025和0.0125 ng/ml，分别取200 μL于微孔板的第4列，并加入5μL金标氯霉素抗体、50μL反应液，混匀；往微孔板第1列中加入200 μL水，往微孔板的第3列加入200μL巴氏杀菌奶、5μL金标BSA、50μL反应液，混匀；用APS光纤传感器进行检测：第一列60 s，第2列60 s；第3列60 s；第4列400 s。
2.根据权利要求1所述的快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：还包括APS光纤传感器的再生，包括：
平衡：将APS光纤传感器末端没入空白基质底液中120s，该空白基质底液含有200μL的底液、50 μL的反应液、5μL金标BSA；
检测：将APS光纤传感器末端没入氯霉素素检测阴性底液600s，该氯霉素素检测阴性底液含有200μL氯霉素素检测阴性样液、50μL反应液和5μL金标氯霉素素受体；
再生：将APS光纤生物传感器探头底部没入Gly/DMF30 s，该Gly/DMF由4倍体积的0.1 M甘氨酸溶液与1倍体积的二甲基甲酰胺混合混合后构成；
洗涤：用pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤APS光纤生物传感器探头底部一次。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：所述反应液为pH 值为7.4的PBS缓冲液。
4.根据权利要求1所述的快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：所述底液为奶粉溶于水后制得，其质量分数为10%。
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