CN107305213A - 一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法及试剂盒 - Google Patents
一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法，该检测方法是通过双抗体夹心检测胆碱酯酶实现的。本发明还公开了一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的试剂盒。本发明通过检测胆碱酯酶的构象变化来判定被检样品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药的残留情况，其具有检测范围广、高灵敏、简便易行、费用低廉。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是涉及了一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法及试剂盒。
背景技术
有机磷类和氨基甲酸酯类农药由于其杀虫谱广，药效高，在我国的农业生产实践中得到了广泛的应用。由于其使用量大，应用面广，在食品安全和环境保护方面受到了普遍关注。尤其是一些剧毒、高毒的农药品种，如甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷等农药，由于其造成的急性毒性和残留毒性问题，已被禁止在蔬菜和水果上使用。但由于农民缺乏科学用药知识，常常出现高毒、剧毒农药的乱用和滥用问题。即使是那些毒性相对较低的农药，也存在农民加大用药剂量或采收前施药（不遵循安全间隔期）等问题，给消费者和环境安全造成了极大危害。因此开展农药残留的快速检测具有重要的现实意义。目前有机磷类农药残留检测常用的方法是酶抑制法和色谱分析法。色谱法的测定准确度和灵敏度都较高，但存在仪器化程度高、前处理操作复杂、耗时较长的问题。酶抑制法采用胆碱酯酶检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药，具有广谱性，且简便、快捷，但是其灵敏性较低（远达不到国家标准限量要求），而且需要复杂和昂贵的辅助设备，进一步限定其应用。
近年来，免疫测定技术在生物技术领域得到迅猛发展，它以特异性好、简单、快速、灵敏度高等优点，得到广泛的应用。随着免疫学技术的发展，其在农药残留中的检测应用也越来越深入，其中酶联免疫吸附测定(ELISA)技术在农药残留分析中表现最为活跃，已有大量文献报道了杀菌剂、杀虫剂、除草剂和一些植物（昆虫）生长调节剂的ELISA检测技术方法的建立，其检测水平可达到ng、甚至pg级。免疫层析法是另外一种广泛应用的检测方法，已经广泛应用于临床、兽药检测领域。目前，在农残检测领域也有免疫层析检测产品出现。但是不管是ELISA还是免疫层析试纸法都只能一次检测一两种（多的五六种）农药残留，根本无法满足目前在用农药达几百种的现实需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法，该方法具有广谱性，简便、快捷、低成本，且具有高灵敏性。本发明还提供了检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的试剂盒。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法，所述方法是通过双抗体夹心检测胆碱酯酶实现的。
所述方法可以是任何一种免疫学分析方法，如：免疫层析法（immunochromatography）、酶联免疫吸附实验（ELISA）、时间分辨免疫分析（time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA）、化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、液相芯片（liquid chip）、表面等离子共振免疫分析(Surface Plasmon Resonance，SPR)、蛋白质芯片（protein chip technology）、生物膜干涉分析（Bio-LayerInterferometry ，BLI）等。
在本发明中，所述胆碱酯酶是乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶。
在本发明中，所述双抗体包括第一抗体和第三抗体：所述第一抗体为与活性胆碱酯酶特异性结合但不与老化胆碱酯酶结合的抗体，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合；或者，
所述双抗体包括第二抗体和第三抗体：所述第二抗体与老化胆碱酯酶特异性结合但不与活性胆碱酯酶结合，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合。
在本发明中，所述第一抗体是用活性胆碱酯酶免疫动物获得或是用胆碱酯酶的多肽免疫动物获得；所述第二抗体是用老化胆碱酯酶免疫动物获得或是用胆碱酯酶的多肽免疫动物获得。所述抗体可以是单克隆抗体，也可以是单克隆抗体，本发明优选采用单克隆抗体。
一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫层析试剂盒，包括含有活性胆碱酯酶的第一容器、第一免疫层析试纸条；所述第一免疫层析试纸条的层析膜和结合垫分别包被有第三抗体和纳米颗粒标记的第二抗体，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合，所述第二抗体与老化胆碱酯酶特异性结合但不与活性胆碱酯酶结合。
一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫层析试剂盒，包括含有活性胆碱酯酶的第一容器、第一免疫层析试纸条；所述第一免疫层析试纸条的层析膜和结合垫分别包被有第三抗体和纳米颗粒标记的第一抗体，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合，所述第一抗体与活性胆碱酯酶特异性结合但不与老化胆碱酯酶结合。
一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫层析试剂盒，包括含有活性胆碱酯酶的第一容器、含有纳米颗粒标记的第一抗体的第二容器、第二免疫层析试纸条；所述第二免疫层析试纸条的层析膜包被有第三抗体，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合，所述第一抗体与活性胆碱酯酶特异性结合但不与老化胆碱酯酶结合；
或者，
包括含有活性胆碱酯酶的第一容器、含有纳米颗粒标记的第二抗体的第二容器、第二免疫层析试纸条；所述第二免疫层析试纸条的层析膜包被有第三抗体，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合，所述第二抗体与老化胆碱酯酶特异性结合但不与活性胆碱酯酶结合。
一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的ELISA试剂盒，包括活性胆碱酯酶、包被有第一抗体或第二抗体的微孔板、酶标记的第三抗体；所述第一抗体与活性胆碱酯酶特异性结合但不与老化胆碱酯酶结合，所述第二抗体与老化胆碱酯酶特异性结合但不与活性胆碱酯酶结合，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合。
如上所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的ELSIA试剂盒，还包括显色液、终止液、洗涤液、阳性对照品、阴性对照品。
本发明具有如下有益效果：本发明公开的一种快速检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法，其原理是：有机磷类和氨基甲酸酯类农药会导致胆碱酯酶构象发生变化，采用免疫学方法测定胆碱酯酶的构象变化情况可知待检样品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药的残留情况。
本发明通过检测胆碱酯酶的构象变化来判定被检样品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药的残留情况，具有检测范围广（能够有效检测出绝大多数有机磷类和氨基甲酸酯类农药）、高灵敏（检测下限远优于现有的酶抑制法，达到或超过农药残留限量标准要求）、简便易行（整个检测过程不需要用到昂贵的仪器设备和专业人员，几乎任何场合均可开展检测）、费用低廉（试纸条和酶联免疫吸附试验是公认的低成本检测方法，而且本发明所公开的方法仅需一个检测反应就可知晓样本有机磷类和氨基甲酸酯类农药的残留情况，大大节省了检测成本）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
实施例1 待检样品处理方法
1.肉类：1）取0.5g肉置于10ml烧杯中，加入5ml丙酮浸泡5min，每隔1min涡旋混匀1次，再加0.2g碳酸钙；2）取0.5ml上述液体于5ml烧杯中，用氮气吹干丙酮；加入0.3ml 0.1MTris-HCl （pH8.0）缓冲液溶解；3）加入0.1ml 0.3%次氯酸钙，放置10min；4）再加入0.3ml10%亚硝酸钠，摇匀，备检。
2.乳：1）生鲜乳、巴氏灭菌乳不需处理。2）发酵乳：用两倍质量的0.1M Tris-HCl（pH8.0）调节pH至pH8.0，备检。3）乳粉：取1g乳粉，加入9ml去离子水，溶解，备检。
3.蜂蜜：用0.1M Tris-HCl（pH8.0）稀释10倍，备检。
4.尿液：用0.1M Tris-HCl（pH8.0）稀释2倍，备检。
5.果蔬：取1g菜叶，用5ml去离子水浸泡1min，取液体，备检。
6.水：1）自来水、河水、湖水等较洁净的水：直接加测。2）污水：用中速定性滤纸过滤，收集滤液，备检。
7.血液：分离血清或血浆，备检。
实施例2单克隆抗体的制备
1.第一单克隆抗体的制备
a、采用对有机磷类和氨基甲酸酯类农药高度敏感的活性胆碱酯酶（如来源于动物、植物、基因重组的乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶）免疫Balb/c小鼠，免疫剂量：100μg/只，每隔2周免疫一次，连续免疫四次；
b、免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，然后用相应的活性胆碱酯酶包被的微孔板筛选出单克隆抗体；
c、老化胆碱酯酶的制备：往活性胆碱酯酶中添加过量甲基对硫磷；置于37℃下1h；超滤去除小分子；用PBS重悬胆碱酯酶，即为老化胆碱酯酶。
d、第一单克隆抗体的筛选：用碳酸盐缓冲液将老化胆碱酯酶稀释到1~10μg/ml，4℃包被酶标微孔；用1%BSA于37℃封闭酶标微孔2h；检测步骤b筛选到的单克隆抗体，筛选出与老化胆碱酯酶不发生特异性结合的单克隆抗体，即为第一单克隆抗体。
e、在筛选过程中，既与活性胆碱酯酶结合又与老化胆碱酯酶结合的单克隆抗体即为第三单克隆抗体。
具体实现时，可增加通过其他有机磷类和氨基甲酸酯类农药老化的胆碱酯酶进行多次筛选的步骤，以获得只与活性胆碱酯酶发生特异性结合，而与绝大多数农药老化的老化胆碱酯酶不发生特异性结合的第一单克隆抗体，进一步提高检测的准确性。
2.第二单克隆抗体的制备
a、老化胆碱酯酶的制备：往活性胆碱酯酶（如来源于动物、植物、基因重组的乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶）中添加过量甲基对硫磷；置于37℃下1h；超滤去除小分子；用PBS重悬胆碱酯酶，即为老化胆碱酯酶。
b、采用上述步骤a制得的老化胆碱酯酶免疫Balb/c小鼠，免疫剂量：80μg/只，每隔2周免疫一次，连续免疫四次；
c、免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，然后用步骤a制得的老化胆碱酯酶包被的微孔板筛选出单克隆抗体；
d、第二单克隆抗体的筛选：用碳酸盐缓冲液将活性胆碱酯酶稀释到1~10μg/ml，4℃包被酶标微孔；用1%BSA于37℃封闭酶标微孔2h；检测步骤c筛选到的单克隆抗体；筛选出与活性胆碱酯酶不发生特异性结合的单克隆抗体，即第二单克隆抗体。
e、在筛选过程中，既与活性胆碱酯酶结合又与老化胆碱酯酶结合的单克隆抗体即为第三单克隆抗体。
具体实现时，用其他有机磷类和氨基甲酸酯类农药老化的胆碱酯酶包被微孔板，检测步骤c筛选到的单克隆抗体，筛选出与之发生特异性结合的单克隆抗体，以获得只与老化胆碱酯酶发生特异性结合，而与活性胆碱酯酶不发生特异性结合的第二单克隆抗体，进一步提高检测的准确性。
实施例3 检测活性胆碱酯酶的免疫层析方法
1.金标第一单克隆抗体的制备：取10ml粒径40nm的纳米金颗粒，加入40μg第一单克隆抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1%(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往密理博公司的135硝酸纤维素膜上按照1.0μl/cm的量依次喷涂浓度为2mg/ml的第三单克隆抗体（检测区）、0.02mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3.样品垫的制备：用20mM Tris-HCl (pH8.0)、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡奥斯龙8964玻璃纤维 10min；置于37℃干燥，备用。
4.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次为胆碱酯酶检测区、质控区。
5.检测样品：1）往微孔中加入0.5U丁酰胆碱酯酶，加入200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将上述步骤1）微孔中的液体转至含有10μl金标第一单克隆抗体的微孔中，吹打混匀，置于40℃3min；3）将试纸条的样品垫一端插入微孔中，3min后观察结果，不同待检样品通过不同检测方法的检测结果如表1~2所示。
表1检测果蔬中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
表2本法检测尿液中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
实施例4 检测活性胆碱酯酶的免疫层析法
1.荧光纳米颗粒标记第一单克隆抗体的制备：取1ml粒径120nm的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，用50mM MES（pH6.0）洗涤两次；1ml 50mM MES（pH6.0）重选颗粒；加入EDC，使其终浓度为5mg/ml；室温避光反应30min；13000rpm 10min，弃掉上清；用50mM MES（pH6.0）洗涤1次；加入200μg第一单克隆抗体；室温反应60min；加入BSA至终浓度1%(W/V)，继续室温反应60min；13000rpm 10min，弃掉上清；50mM MES（pH6.0）洗涤两次；离心，用1ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往赛多利斯CN95硝酸纤维素膜上按照0.8μl/cm的量依次喷涂浓度为2mg/ml的第三单克隆抗体（检测区）、0.02mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3.样品垫的制备：用20mM Tris-HCl (pH8.0)、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡奥斯龙8964玻璃纤维 10min；置于37℃干燥，备用。
4.结合垫的制备：将制备好的荧光纳米颗粒标记第一单克隆抗体按照1μl/cm喷涂奥斯龙8964玻璃纤维，置于37℃干燥，备用。
5.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次为胆碱酯酶检测区、质控区。
6.检测样品：1）往微孔中加入0.5U丁酰胆碱酯酶，加入200μl待检样品（乳汁、蜂蜜、洗涤果蔬所得液体、水、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将试纸条的样品垫一端插入微孔中，3min后于紫外光下观察结果，不同待检样品通过不同检测方法的检测结果如表3~6所示。
表3检测果蔬中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
表4本法检测牛乳中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
表5检测蜂蜜中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
表6检测水中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
实施例5 检测老化胆碱酯酶的免疫层析方法
1.金标第二单克隆抗体的制备：取10ml粒径40nm的纳米金颗粒，加入25μg第二单克隆抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1%(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往密理博公司的135硝酸纤维素膜上按照1.0μl/cm的量依次喷涂浓度为2mg/ml的第三单克隆抗体（检测区）、0.02mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3.样品垫的制备：用20mM Tris-HCl (pH8.0)、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡无纺布10min；置于37℃干燥，备用。
4.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次为胆碱酯酶检测区、质控区。
5.检测样品：1）往微孔中加入0.5U乙酰胆碱酯酶，加入200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将上述步骤1）微孔中的液体转至含有5μl金标第二单克隆抗体的微孔中，吹打混匀，置于40℃3min；3）将试纸条的样品垫一端插入微孔中，3min后观察结果，不同待检样品通过不同检测方法的检测结果如表7~8所示。
表7检测果蔬中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
表8本法检测尿液中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
实施例6 检测老化胆碱酯酶的免疫层析法
1.金标第二单克隆抗体的制备：取10ml粒径40nm的纳米金颗粒，加入25μg第一单克隆抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1%(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往赛多利斯CN90硝酸纤维素膜上按照0.8μl/cm的量依次喷涂浓度为2.5mg/ml的第三单克隆抗体（检测区）、0.02mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3.样品垫的制备：用20mM Tris-HCl (pH8.0)、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡聚酯膜10min；置于37℃干燥，备用。
4.结合垫的制备：将制备好的金标第二单克隆抗体按照2μl/cm喷涂奥斯龙8964玻璃纤维，置于37℃干燥，备用。
5.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次为胆碱酯酶检测区、质控区。
6. 检测样品：1）往微孔中加入0.5U丁酰胆碱酯酶，加入200μl待检样品（乳汁、蜂蜜、洗涤果蔬所得液体、水、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将试纸条的样品垫一端插入微孔中，3min后观察结果，不同待检样品通过不同检测方法的检测结果如表9~12所示。
表9检测果蔬中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
表10本法检测牛乳中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
表11检测蜂蜜中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
表12检测水中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
实施例7 检测活性胆碱酯酶的ELISA检测方法
1.用碳酸盐缓冲液（pH9.6）将第一单克隆抗体稀释成2000ng/ml，按照100μl/孔分装至酶标微孔中，4℃孵育18h；
2.用PBST（吐温-20含量0.05%）洗涤酶标微孔5次；
3.用1% BSA封闭酶标微孔：150μl/孔，37℃ 2h；
4.弃掉BSA，备用；
5.按照200μl/孔将待检样品（或者处理后所得液体）分装至干净的微孔中，并往微孔中加入5U/孔乙酰胆碱酯酶，混匀，置于37℃孵育15min；
6.按照100μl/孔将步骤5制得的液体转至步骤4的酶标微孔中；于37℃孵育45min；
7.PBST洗涤5次；
8.按照100μl/孔加入辣根过氧化物酶标记的第三单克隆抗体，混匀，置于37℃孵育30min；
9.用PBST（吐温-20含量0.05%）洗涤酶标微孔6次；
10.按照100μl/孔加入底物显色；
11.按照50μl/孔加入2M硫酸终止反应，于450nm检测结果，果蔬通过本检测方法的检测结果如表13所示。
表13检测果蔬中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
实施例8 检测老化胆碱酯酶的ELISA检测方法
1.用碳酸盐缓冲液（pH9.6）将第二单克隆抗体稀释成3000ng/ml，按照100μl/孔分装至酶标微孔中，4℃孵育18h；
2.用PBST（吐温-20含量0.05%）洗涤酶标微孔5次；
3.用1% BSA封闭酶标微孔：150μl/孔，37℃ 2h；
4.弃掉BSA，备用；
5.按照200μl/孔将待检样品（或者处理后所得液体）分装至干净的微孔中，并往微孔中加入5U/孔乙酰胆碱酯酶，混匀，置于37℃孵育15min；
6.按照100μl/孔将步骤5制得的液体转至步骤4的酶标微孔中；于37℃孵育45min；
7.PBST洗涤5次；
8.按照100μl/孔加入辣根过氧化物酶标记的第三单克隆抗体，混匀，置于37℃孵育30min；
9.用PBST（吐温-20含量0.05%）洗涤酶标微孔6次；
10.按照100μl/孔加入底物显色；
11.按照50μl/孔加入2M硫酸终止反应，于450nm检测结果，果蔬通过本检测方法的检测结果如表14所示。
表14检测果蔬中部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药的检出限（单位：mg/kg）
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法，其特征在于，所述方法是通过双抗体夹心检测胆碱酯酶实现的。
2.根据权利要求1所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法，其特征在于，所述方法是任何一种免疫学分析方法。
3.根据权利要求2所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法，其特征在于，所述免疫学分析方法包括免疫层析法、ELISA、时间分辨免疫分析、化学发光免疫分析、液相芯片、表面等离子共振免疫分析、蛋白质芯片分析、生物膜干涉分析。
4.根据权利要求1所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法，其特征在于，所述胆碱酯酶是乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶。
5.根据权利要求1所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法，其特征在于：
所述双抗体包括第一抗体和第三抗体：所述第一抗体为与活性胆碱酯酶特异性结合但不与老化胆碱酯酶结合的抗体，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合；或者，
所述双抗体包括第二抗体和第三抗体：所述第二抗体与老化胆碱酯酶特异性结合但不与活性胆碱酯酶结合，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合。
6.根据权利要求4所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的方法，其特征在于，所述第一抗体是用活性胆碱酯酶免疫动物获得或是用胆碱酯酶的多肽免疫动物获得；所述第二抗体是用老化胆碱酯酶免疫动物获得或是用胆碱酯酶的多肽免疫动物获得。
7.一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫层析试剂盒，其特征在于，包括含有活性胆碱酯酶的第一容器、第一免疫层析试纸条；所述第一免疫层析试纸条的层析膜和结合垫分别包被有第三抗体和纳米颗粒标记的第二抗体，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合，所述第二抗体与老化胆碱酯酶特异性结合但不与活性胆碱酯酶结合。
8.一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫层析试剂盒，其特征在于，包括含有活性胆碱酯酶的第一容器、第一免疫层析试纸条；所述第一免疫层析试纸条的层析膜和结合垫分别包被有第三抗体和纳米颗粒标记的第一抗体，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合，所述第一抗体与活性胆碱酯酶特异性结合但不与老化胆碱酯酶结合。
9.一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫层析试剂盒，其特征在于，包括含有活性胆碱酯酶的第一容器、含有纳米颗粒标记的第一抗体的第二容器、第二免疫层析试纸条；所述第二免疫层析试纸条的层析膜包被有第三抗体，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合，所述第一抗体与活性胆碱酯酶特异性结合但不与老化胆碱酯酶结合；
或者，
包括含有活性胆碱酯酶的第一容器、含有纳米颗粒标记的第二抗体的第二容器、第二免疫层析试纸条；所述第二免疫层析试纸条的层析膜包被有第三抗体，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合，所述第二抗体与老化胆碱酯酶特异性结合但不与活性胆碱酯酶结合。
10.一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的ELISA试剂盒，其特征在于，包括活性胆碱酯酶、包被有第一抗体或第二抗体的微孔板、酶标记的第三抗体；所述第一抗体与活性胆碱酯酶特异性结合但不与老化胆碱酯酶结合，所述第二抗体与老化胆碱酯酶特异性结合但不与活性胆碱酯酶结合，所述第三抗体与活性胆碱酯酶和老化胆碱酯酶均发生结合。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171031 |
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