CN203965377U - 一种苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器 - Google Patents
一种苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器 Download PDFInfo
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Abstract
本实用新型公开了一种电化学免疫传感器，其电极表面的中心有抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，所述抗体优选单克隆抗体，所述传感器优选含有双层纳米金膜，其电极优选玻碳电极，是以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)复合物固定于电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，构建双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器。该传感器可用于检测食品中沙门氏菌和/或志贺氏菌，其灵敏度高，特异性强，能够对沙门氏菌和/或志贺氏菌实现快速定量检测。
Description
技术领域
本实用新型涉及生物免疫检测技术领域，特别是涉及一种苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器。
背景技术
随着单克隆抗体杂交瘤技术日益广泛的应用，需要对获得的单克隆抗体(McAb)进行系统地分析鉴定，以确定其在各种免疫学试验中的价值。除了对McAb的免疫球蛋白链理化性质进行分析外，测定McAb结合抗原的特异性、解离平衡常数KD、结合亲和力Kon及解离速率常数Kdis对选择合适的McAb用于某一特定目的十分重要。生物分子相互作用仪采用生物薄膜干涉(Bio-Layer Interferometry，BLI)技术，无需标记，具有高灵敏度、高通量等特点，可以作为检测抗原抗体之间亲和力的工具。自2004年问世以来，在抗原与抗体互作、小分子与蛋白互作、蛋白分子与蛋白分子互作及药物筛选等方面发展迅速，受到越来越多的关注。
沙门氏菌(Salmonella)是一种可以引起沙门氏菌病的革兰氏阴性菌，是最常见的人畜共患型食源性致病菌之一。据统计，在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。志贺氏菌(Shigella)也是一类具有高度传染性的肠道致病菌。根据WHO统计有1.647亿人感染痢疾，1.1万人死亡，其中多数为5岁以下的儿童。在成年患者中，10～100cfu志贺氏菌就可通过感染肠道致病，引发炎症反应。目前，食品中沙门氏菌的检测方法仍采用传统的国标法GB4789.4-2010，食品中志贺氏菌的检测方法采用传统的国标法GB4789.5-2012，上述方法是目前世界各国普遍接受的标准方法，鉴定结果准确可靠。但是由于菌种有上千种血清型，生化特性各异，使 其检验程序十分复杂繁琐，由于检测时需要反复进行细菌培养，因此至少需要4～7d才可得到准确的检测结果。近年来，国内外对于沙门氏菌、志贺氏菌的检测有了一些新的进展，主要为基于光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术、生物薄膜干涉(BioLayer Interferometry，BLI)技术、PCR技术、荧光标记技术和酶联免疫技术(ELISA)等的快速检测方法。但PCR、SPR、BLI仪器设备要求精度高、价格昂贵，不能实现在线检测，且对试验操作人员要求严格；而荧光标记技术及ELISA只能进行定性或半定量，再加上数据处理和加样方式的限制，要实现即时、准确定量和在线检测几乎是不可能的。电化学分析具有不受样品的浊度、颜色的影响，所需设备仪器相对简单的特点以及酶促反应的高效性、免疫分析无需对样品进行纯化、富集等预处理的特点，可以较好成为沙门氏菌及志贺氏菌的检测平台。
苏氨酸磷酸裂合酶(phosphothreonine lyase)是以SpvC(Salmonella plasmid virulence C)为代表的(包括Outer shigella protein F，OspF)一类新的酶效应蛋白家族，由沙门氏菌及志贺氏菌通过Ⅲ型分泌系统特异性分泌，因此可以作为检测两种菌的标志物。当它注入到宿主细胞后，不可逆灭活宿主丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，破坏宿主的先天免疫防线，导致的急性炎症。研究发现在导致细菌性痢疾的菌种都能通过Ⅲ型分泌系统分泌SpvC。本实用新型拟以苏氨酸磷酸裂合酶为抗原制备抗-SpvC单克隆抗体，利用抗原抗体之间特异性结合作用检测苏氨酸磷酸裂合酶，从而间接达到检测沙门氏菌及志贺氏菌的目的；本实用新型拟通过BSI筛选出与抗原蛋白亲和力更强的抗-SpvC单克隆抗体株以用于苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备。
实用新型内容
本实用新型的目的是为解决现有技术中所存在的缺陷，发明的一种灵敏度高、特异性强、快速定量测定沙门氏菌及志贺氏菌的电化学免疫传感器。
为实现上述目的，本实用新型提供一种苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器，其特征在于，其电极表面是包住电极的壳聚糖凝胶层，壳聚糖凝胶层之上是纳米金溶胶层，纳米金溶胶层之上为抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层，抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层之上在电极中心位置为硫堇/壳聚糖聚合物膜，其上为纳米金/辣根过氧化物酶层，最上层为抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层。
所述抗体为多克隆抗体。
所述抗体为单克隆抗体。
所述电极为玻碳电极。
所述传感器以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体。
所述传感器以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)复合物固定于电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，构建双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器。
一方面，本实用新型还提供所述的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体的制备；
2)玻碳电极的预处理；
3)纳米金溶胶的制备；
4)硫堇/壳聚糖(Thi/Chit)共聚物的制备；
5)纳米金吸附辣根过氧化物酶的制备；
6)苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备。
所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：
本实用新型以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体；以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)复合物固定于上述电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体(所述抗体优选单克隆抗体)，构建了双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器，于此形成的良好的信号放大系统使其灵敏度高，特异性强，能够对沙门氏菌和/或志贺氏菌实现快速定量检测。
附图说明
图1为本实用新型的苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本实用新型，但不用来限制本实用新型的范围。
实施例1传感器的制备
1、抗苏氨酸磷酸裂合酶单克隆抗体株的筛选
首先，采用常规单克隆抗体制备方法，将来源于沙门氏菌的SpvC蛋白抗原注射Balb/C小鼠，得到单克隆抗体株，再腹腔注射Balb/C小鼠，纯化腹水即得抗苏氨酸磷酸裂合酶单克隆抗体。
然后，进行抗苏氨酸磷酸裂合酶单克隆抗体株的筛选：采用美国ForteBio公司生产的生物分子相互作用仪Octet Red96进行本实验：取五只Protein A传感器A3、B3、C3、D3、E3，五个浓度梯度苏氨酸磷酸裂合酶蛋白抗原与之一一对应，浓度分别是：4μM，1.33μM，0.44μM，0.1481μM，0μM。所用五株SpvC单克隆抗体分别为：A2-E2(1.129μM)；A3-E3(0.91μM)；A4-E4(0.91μM)；A5-E5(1.755μM)；A6-E6(1μM)结果如下表。
表1 不同抗体株的解离平衡常数、结合常数和解离常数
由上表可知A2-E2株抗-SpvC单克隆抗体与SpvC的解离平衡常数KD(KD＝kdis/kon)，最小为3.85E-10M，即亲和力最强，该株单抗可以用于以下免疫传感器的制备。而五株单抗结合常数kon值均为2.50E+03 1/Ms，表明抗原蛋白与五株单抗结合能力相等，在0.91μM～1.755μM浓度范围内抗原与单抗结合能力与浓度无关，其亲和力大小取决于解离常数kdis。
本领域技术人员可以理解的是，抗-SpvC的多克隆抗体也可以用于本实用新型的电化学免疫传感器的制备。
2、玻碳电极的预处理：
将玻碳电极依次分别用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒径的α-Al2O3浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用HNO3与H2O按照体积比为1∶1配置的混合液、无水乙醇、超纯水清洗。在1mol/L H2SO4溶液中用扫描范围为1.0～－1.0V，扫描速度为100mV/s的循环伏安法活化电极，重复扫描直至出现稳定的循环伏安曲线。上述的稳定的循环伏安曲线满足下述要求：在实验室条件下预处理后的电极的循环伏安曲线的峰电位差应在80mV以下，并尽可能的接近64mV，电极方能使用，最后置于氮气环境中干燥待用。
3、纳米金(Nano-Au)溶胶的制备:
根据Frens法取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入1g/100mL的柠檬酸钠溶液4mL混匀，置于微波炉中低火保持8-10min，待其自 然冷却后用超纯水补充至104mL即得纳米金溶胶，置于4℃避光保存备用。利用分光光度计对所制备的纳米金溶胶在可见光范围内(400-700nm)进行扫描，光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，且光吸收峰的波长λmax在518nm，可粗略确定纳米金平均粒径为15nm。用透射电镜对所制纳米金溶胶颗粒的大小、形状及分散情况进行进一步精确的表征，所合成的纳米金形状规则，粒度均匀，平均粒径约为15nm，且没有聚集现象。
4、硫堇/壳聚糖(Thi/Chit)共聚物的制备：
(1)将2g壳聚糖(Chit)溶于100mL体积百分比为2％的醋酸溶液中搅拌3h得到2％的壳聚糖溶液。
(2)将上述2.5mL质量体积百分比为2％的壳聚糖溶液加到320μL体积百分比为10％的戊二醛溶液中，混匀后加入0.01M硫堇(Thi)溶液200μL，最后加入体积百分比为2％的醋酸溶液至总体积为6mL，混匀后即可用于滴涂电极，且该共聚物溶液需现用现配。
5、纳米金吸附辣根过氧化物酶的制备：
(1)将0.02g辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.01M pH值为7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，配置2.0g/L辣根过氧化物酶溶液。
(2)用0.1M K2CO3调节步骤2制备的纳米金溶胶的pH值至7.0后，取1mL上述pH值为7.0的纳米金溶胶与1mL上述2.0g/L辣根过氧化物酶溶液搅拌2h混匀，4℃静置过夜，并利用分光光度计对此混合液在350～700nm范围内进行扫描，获得HRP/Nano-Au聚合物的吸收光谱，通过最大吸收波长对Nano-Au与HRP相互作用后所发生的变化情况进行表征。
6、苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备:
(1)将0.5g壳聚糖溶于100mL体积分数为1％的醋酸溶液，得到质量体积百分比为0.5％壳聚糖溶液。
(2)取5μL上述质量体积百分比为0.5％的壳聚糖溶液滴于步骤 1预处理后的玻碳电极表面，置于50℃烘箱中干燥20min，使所述壳聚糖溶液形成包住玻碳电极的凝胶，取出待其自然冷却至室温后浸于1mol/L NaOH溶液中5min，用超纯水清洗后并浸于超纯水中30min，使NaOH全部进入水中。
(3)取出，在25℃干燥箱干燥10min；然后置于纳米金溶胶中至少24h，得到纳米金电极。然后将该电极置于纯化的抗苏氨酸磷酸裂合酶单克隆抗体中4℃自组装至少24h，即得单层纳米金修饰的电极。
(4)再取5μL步骤4中所制备的硫堇/壳聚糖(Thi/Chit)共聚物溶液滴加于单层纳米金修饰的电极表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超纯水反复清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；然后置于步骤5所制备的纳米金/辣根过氧化物酶溶液中4℃自组装至少24h，超纯水冲洗后再置于步骤3所纯化的苏氨酸磷酸裂合酶单克隆抗体中4℃自组装至少24h，最后置于1g/100mL的牛血清白蛋白溶液(BSA)溶液中于37℃温育至少1h，以封闭非特异性位点，以含体积百分比为0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液清洗未结合的牛血清白蛋白，自然晾干即得双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器。该传感器可保存于4℃PBS缓冲液中待用。
本实用新型的苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备及检测原理见图2。可利用循环伏安法、交流阻抗法、原子力显微镜等表征电极组装的各个阶段。
实施例2传感器检测沙门氏菌和/或志贺氏菌
1、制备标准曲线：
将制备好的苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器分别在0.01 M pH7.4 PBS缓冲液梯度稀释的沙门氏菌悬液中37℃孵育15min(从低浓度到高浓度)后进行电流-时间扫描(扫描电位－ 0.38V)，经比较选择稳态电流值(一般为第50s)为标准，以电流在检测前后的变化量△I与沙门氏菌落数(按照GB4789.2《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》来测定菌浓度)作图，得到△I与沙门氏菌浓度之间的线性关系。
2、样品制备：
选择浓度约为1×108cfu/mL沙门氏菌悬液(按照GB4789.2检测得到)，从中吸取1mL加入到9mLPBS缓冲液中，吹打摇匀，记为1，此时菌浓度约为1×107cfu/mL；再从1中吸取1mL溶液滴加到9mLPBS缓冲液中，吹打摇匀，记为2，此时菌浓度约为1×107cfu/mL；依次类推，直至稀释成1cfu/mL菌溶液。志贺氏菌也做相应的处理，同时制备混合菌液的梯度稀释。以PBS缓冲液作为空白对照，并从低浓度向高浓度依次检测。
3、检测结果：
利用电流时间曲线法分别测定PBS稀释的沙门氏菌和志贺氏菌悬液，结果表明响应电流与两种菌在10～1.0×104 cfu/mL范围内线性相关，最低检测限为5cfu/mL。再利用时间电流曲线法测定PBS稀释的两种菌混合液，响应电流与混合菌在10～1.0×104 cfu/mL范围内亦呈线性相关，表明该传感器可以检测这两种混合菌液中菌总浓度。
实施例3传感器稳定性和重现性检测
将组装好的苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器分别在1×102cfu/mL沙门氏菌及1×102cfu/mL志贺氏菌的PBS稀释液中连续测定12次，结果相对标准偏差R.S.D分别为3.23％、4.11％；将该传感器于0.01mol/L pH7.4 PBS溶液上方4℃保存，每隔3天检测一次沙门氏菌悬液(1×102cfu/mL)，第13天电流响应信号为初始电流的86.45％，表明该传感器具有较好的稳定性。
取不同批次制备的免疫传感器5支，在相同条件下对同一浓度沙门氏菌悬液(1×102cfu/mL)、志贺氏菌悬液(1×102cfu/mL)及两种混 合菌液(1×102cfu/mL)进行测定，结果响应电流的相对标准偏差R.S.D.分别为4.12％、4.66％、4.82％，说明该传感器重现性良好。
实施例4传感器干扰试验
分别用1×107cfu/mL的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌进行了干扰试验，结果显示对该传感器定量测定沙门氏菌及志贺氏菌(1×107cfu/mL)均无明显干扰。
以上实施例表明，本实用新型的传感器结合电化学分析可不受样品浊度、颜色的影响，所需设备仪器相对简单，无需对样品进行纯化、富集等预处理，可应用于分别或同时对沙门氏菌及志贺氏菌的快速检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本实用新型作了详尽的描述，但在本实用新型基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本实用新型精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本实用新型要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器，其特征在于，其电极表面是包住电极的壳聚糖凝胶层，壳聚糖凝胶层之上是纳米金溶胶层，纳米金溶胶层之上为抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层，抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层之上在电极中心位置为硫堇/壳聚糖聚合物膜，硫堇/壳聚糖聚合物膜上为纳米金/辣根过氧化物酶层，最上层为抗苏氨酸磷酸裂合酶抗体层。
2.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述电极为玻碳电极。
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