CN105067694A - 用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品安全快速检测技术领域，具体涉及用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法，包括：以玻碳电极为基础电极，以聚酰胺树枝状大分子材料结合还原性石墨烯纳米复合物为电活性修饰膜层，固定于玻碳电极表面，然后采用物理吸附法或采用牛血清白蛋白－戊二醛交联方法固定化辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体制备纳米免疫传感器；本发明将该纳米免疫传感器用于食品中的阪崎肠杆菌的检测，其结果与国标方法结果一致，但该方法具有灵敏度高、特异性好、精确度高，检测时间短，是一种简便快速、精度高的阪崎肠杆菌的检测方法，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于阪崎肠杆菌快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，以及利用该纳米免疫传感器检测奶粉中的阪崎肠杆菌的检测方法。
背景技术
阪崎肠杆菌是一种常见的寄生在人和动物肠道内的革兰氏阴性无芽孢杆菌，有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧，为肠道正常菌群之一。阪崎肠杆菌作为一种条件性致病菌，能导致严重的新生儿童脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症。并且可以导致神经系统后遗症甚至死亡，死亡率高达50％以上。婴幼儿奶粉作为携带阪崎肠杆菌的主要食品种类，近几年来连续引发了多起与食品安全相关的事件而备受国际相关组织，各国政府的高度重视和消费者的广泛关注。目前阪崎肠杆菌的分布及致病机制并不十分清楚，鉴于其潜在的危害，对于该菌的检测显得尤为重要。传统的阪崎肠杆菌检测方法，依赖于生化和形态学特征，国际上通常以美国食品药品监督管理局(FDA)和国际标准化组织(ISO)制定的检测方法为标准方法。2008年我国也制定了阪崎肠杆菌检验国家标准，并于2010年进行了修订，规范了阪崎肠杆菌检测。但传统的检测方法存在操作繁琐、耗时长、不易分辨结果等缺点。因此，目前许多工作研究者致力于开发更为快速、准确的阪崎肠杆菌的检测方法，以提高环境、食品阪崎肠杆菌的检测效率，同时要避免出现假阴性或假阳性的现象。
发明内容
本发明为解决上述技术的不足，提供一种用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，还提供一种利用该免疫传感器检测食品中阪崎肠杆菌的方法，本发明方法既具备了更加灵敏、快速、易微型化、便携的优势，同时也具备了免疫反应抗原-抗体结合的特异性，所以，在致病性微生物的快速检测中的应用日益受到各国学者的重视。
为解决以上问题，本发明采用以下技术方案：
本发明一种用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是，以玻碳电极为基础电极，以聚酰胺树枝状大分子材料结合还原性石墨烯纳米复合物为电活性修饰膜层，具体将该纳米复合修饰物固定于玻碳电极表面，然后采用物理吸附法或采用牛血清白蛋白－戊二醛交联方法固定化辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体制备而成纳米免疫传感器。
所述的用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，包括以下步骤:
a.电极预处理
将玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水清洗干净，再依次用二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水超声清洗3min～5min，用氮气吹干玻碳电极，然后,将pH值为7.0的磷酸盐缓冲液放入烧杯中,再加入铁氰化钾、氯化钾和过氧化氢,使其浓度分别为2mmol/L、0.1mol/L和0.5mmol/L，得到电解质溶液,然后将玻碳电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝(片)对电极插入上述电解质溶液中,连接PAR270电化学工作站；用PAR270电化学工作站进行循环伏安法扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，扫描电位范围在-0.2V～+0.6V之间，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出玻碳电极用二次蒸馏水清洗净，用氮气吹干备用；
b.石墨烯-聚酰胺-胺复合物的制备
将一定量的石墨烯粉末加入到二次蒸馏水中，使其浓度为0.5mg/ml，搅拌1min～2min，并超声处理15min～20min，得到均匀一致的黑色石墨烯悬浮液,备用；
将2.0代聚酰胺-胺溶于体积浓度为1％的乙酸溶液中，使聚酰胺-胺的浓度为1.0×10-3g/mL，室温的条件下，磁力搅拌55min～60min，得到聚酰胺-胺溶液，然后将聚酰胺-胺溶液和上述的石墨烯悬浮液按体积比1:1混合均匀，将混合溶液超声处理1.5h～2h，得到均匀稳定的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液；
c.免疫传感器的制备
准确量取3～8μL步骤b得到的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液滴涂到步骤a得到的玻碳电极表面，于室温下自然晾干或用便携式红外干燥器烘干，然后在玻碳电极表面滴涂与石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物同体积的辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体,并置于4℃冰箱内反应1.5h～2h，再滴涂同体积的1wt％牛血清白蛋白溶液于37℃温度下处理55min～60min封闭非特异性吸附位点，将修饰后的电极取出，用二次去离子水冲洗去除未结合的多余辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体，得到阪崎肠杆菌纳米免疫传感器，在4℃避光的条件下保存备用。
所述的用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，所述步骤c中量取的步骤b得到的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液为5μL。
上述的纳米免疫传感器检测阪崎肠杆菌的方法，包括以下具体步骤；
取分离纯化的阪崎肠杆菌加入到8.5g/L的生理盐水中，在37℃摇床中过夜培养，使得阪崎肠杆菌均匀分散在生理盐水中，然后依次将其阪崎肠杆菌用浓度为8.5g/L的生理盐水稀释至阪崎肠杆菌菌悬液的浓度为108cu/mL、106cu/mL、104cu/mL、和102cu/mL，以及8.5g/L的生理盐水，备用；在所述纳米免疫传感器上滴涂与辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体同体积的各个梯度的上述阪崎肠杆菌菌悬液，室温下孵育20min～25min。以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝(片)为对电极，阪崎肠杆菌免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在与所述步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行电化学测试，用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2V～+0.6V，以电流响应值为纵坐标，阪崎肠杆菌的浓度对数为横坐标，得到阪崎肠杆菌的免疫响应电流值与其浓度之间的线性曲线，即标准曲线及线性回归方程式，实验在25℃±0.5℃下进行；
然后将检测食品样品奶粉加入到45℃±1℃的缓冲蛋白胨水中，所述奶粉与缓冲蛋白胨水的比例为1g：9ml，摇动或搅拌至样品充分溶解，于36℃±1℃培养18h～22h,得到培养液一，移取培养液一转接种于改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤中，培养液一与改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤的体积比为1:10，36℃±1℃培养18h～22h,得到培养液二，备用；所述的纳米免疫传感器上滴涂与辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体同体积的上述备用的培养液二，室温下孵育20min～25min。以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝(片)为对电极，阪崎肠杆菌免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在与所述步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行电化学测试，用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2V～+0.6V，可以根据响应电流值相比于免疫传感器的响应电流值大幅下降，来判断样品中有阪崎肠杆菌，并且将样品进行三次测量，并求其平均值，按线性回归方程式计算样品中阪崎肠杆菌的浓度，此过程在25℃±0.5℃下进行。
本发明与现有技术相比具有以下显著的优点：
①本发明的免疫传感器用于检测奶粉中的阪崎肠杆菌法与国标法和实时荧光PCR法相比，在检验时间上大大缩短了，提高检测效率。
②制备简单、成本较低等优点，降低了检验成本，也就是减少了生产成本。
附图说明
图1为不同修饰情况的传感器的循环伏安表征图。
图2为基于石墨烯-聚酰胺-胺复合物的电化学免疫传感器用于奶粉样品I中阪崎肠杆菌检测的响应电流图。
图3为奶粉样品II中阪崎肠杆菌检测的差分脉冲伏安图
图4为奶粉样品III中阪崎肠杆菌检测的差分脉冲伏安图
具体实施方式
下面参照附图对本发明具体实施方式进行详细说明。
参见图1、图2、图3、图4。
实施例1
用免疫传感检测奶粉样品I中阪崎肠杆菌
1.免疫传感器的制备
a.电极预处理
将玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水洗干净，再依次用二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水中超声清洗3min～5min，用氮气吹干玻碳电极。然后,将pH值为7.0的磷酸盐缓冲液放入烧杯中,再加入铁氰化钾、氯化钾和过氧化氢,使其分别为2mmol/L、0.1mol/L和0.5mmol/L，得到电解质溶液,然后将参比电极、对电极和玻碳电极插入到电解质溶液的电解池中,连接PAR270电化学工作站；用PAR270电化学工作站进行循环伏安法扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2～+0.6V，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出玻碳电极用二次蒸馏水洗净，用氮气吹干备用。
b.石墨烯-聚酰胺-胺复合物的制备
将一定量的石墨烯粉末加入到二次蒸馏水中，使其浓度为0.5mg/ml，搅拌1min～2min,并超声处理15min～20min，直到得到均匀一致的黑色石墨烯悬浮液,备用。
将10mg2.0代聚酰胺-胺溶于10ml体积浓度为1％的乙酸溶液中，室温的条件下磁力搅拌55min～60min，得到聚酰胺-胺溶液，然后将10ml聚酰胺-胺溶液和上述的10ml的石墨烯悬浮液混合均匀。将混合溶液超声处理1.5h～2h，得到稳定的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液。
c.免疫传感器的制备
用微量移液枪准确量取5μL步骤b得到的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液滴涂到步骤a得到的玻碳电极表面，于室温下自然晾干或红外干燥器烘干，然后在玻碳电极表面滴涂与石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物同体积的辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体,并置于4℃冰箱内反应1.5h～2h，再滴涂同体积的1wt％牛血清白蛋白溶液于37℃温箱内处理55min～60min封闭非特异性吸附位点，将修饰后的电极取出，用二次去离子水冲洗去除未结合的多余辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体，晾干后得到免疫传感器，在4℃避光的条件下保存备用。
图1为不同修饰阶段的电极之循环伏安图，a为玻碳电极，b为石墨烯-聚酰胺-胺修饰后的电极，c为在b电极的基础上滴加辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体并有牛血清白蛋白封闭的电极，d为在c电极的基础上滴加阪崎肠杆菌菌悬液的电极。由图可知，a电极(玻碳电极)在电解质溶液中出现一对可逆的氧化还原峰，当电极修饰后，氧化还原峰电流值增大，这是因为修饰物具有快速的电子传递能力。而加入抗体后氧化还原峰电流值降低，则说明酶标抗体已成功地包埋在修饰物复合膜中；免疫反应后，氧化还原峰电流值大幅降低，表面抗原-抗体免疫反应后生成的免疫复合物在部分空间上阻碍了媒介体和底物的扩散，电子传递受到了阻碍所致。
2.上述纳米免疫传感器用于奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测
取编号为3305373纯化的阪崎肠杆菌加入到8.5g/L的生理盐水中，使其浓度在108cfu/mL。在37℃摇床中过夜培养，使得阪崎肠杆菌均匀分散在生理盐水中。然后依次将其阪崎肠杆菌用浓度为8.5g/L的生理盐水稀释至浓度分别为106cfu/mL、104cfu/mL、102cfu/mL以及8.5g/L的生理盐水备用。在所述的免疫传感器上滴涂与辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体同体积的各个梯度的上述阪崎肠杆菌菌悬液，室温下孵育20min～25min。以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝(片)为对电极，有阪崎肠杆菌菌悬液的免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在与步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行电化学测试。用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2～+0.6V。以电流响应值为纵坐标，阪崎肠杆菌的浓度对数为横坐标，得到测试系统的电流响应值与阪崎肠杆菌浓度对数之间的线性曲线，即标准曲线及线性回归方程式，ΔIpc(uA)＝-1.1817lg[C/(cfu/ml)]+13.723，相关系数R2＝0.9989。其中ΔIpc(uA)为阪崎肠杆菌的电流响应值，μA，C为阪崎肠杆菌的浓度，cfu/mL。
然后取100g检测奶粉样品I加入到已预热至45℃±1℃装有900mL灭菌水的锥形瓶中，用手缓缓的摇动至样品充分溶解，36℃±1℃培养18h～22h。移取1mL转种于10mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤中，36℃±1℃培养18h～22。取1mL培养液备用。在所述的纳米免疫传感器上滴涂上述备用的培养液，室温下孵育20min～25min。以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝(片)为对电极，阪崎肠杆菌免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在与步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行电化学测试。用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2V～+0.6V。分别进行三次测量，并求其平均值。按线性回归方程式计算其阪崎肠杆菌的浓度。该奶粉样品中含有阪崎肠杆菌，其阪崎肠杆菌的浓度为1.2×103cfu/mL。
实施例2
用免疫传感检测奶粉样品II中阪崎肠杆菌
1.免疫传感器的制备
a.电极预处理
同实施例1
b.石墨烯-聚酰胺-胺复合物的制备
同实施例1
c.免疫传感器的制备
用微量移液枪准确量取4μL步骤b得到的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物滴涂到步骤a得到的玻碳电极表面，于室温下自然晾干或红外干燥器烘干，然后在玻碳电极表面滴涂与石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物同体积的辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体,并置于4℃冰箱内反应1.5h～2h，再滴涂同体积的1wt％牛血清白蛋白溶液于37℃温箱内处理55min～60min封闭非特异性吸附位点，将修饰后的电极取出，用二次去离子水冲洗去除未结合的多余辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体，晾干后得到免疫传感器，在4℃避光的条件下保存备用。
2.上述纳米免疫传感器用于奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测
取100g检测奶粉样品II加入到已预热至45℃±1℃装有900mL灭菌水的锥形瓶中，用手缓缓的摇动至样品充分溶解，36℃±1℃培养18h～22h。移取1mL转种于10mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤中，36℃±1℃培养18h～22。取1mL培养液备用。
将上述的免疫传感器在与步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行电化学测试。用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2V～+0.6V。得到差分脉冲伏安图a。然后取出免疫传感器，用二次去离子水冲洗去除电极表面的电解质，备用。
在上述的纳米免疫传感器上涂上4μL上述备用的培养液，室温下孵育20min。以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝(片)为对电极，阪崎肠杆菌免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在与步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行电化学测试。用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2V～+0.6V。得到差分脉冲伏安图b。将图a与图b重叠后得到图3。由图3得到，b图的响应电流值与a图相比，响应电流值大幅变小，说明抗原与抗体产生了结合，也就是说，奶粉中有阪崎肠杆菌被检测出来。
实施例3
用免疫传感检测奶粉样品III中阪崎肠杆菌
1.免疫传感器的制备
a.电极预处理
同实施例1
b.石墨烯-聚酰胺-胺复合物的制备
同实施例1
c.免疫传感器的制备
用微量移液枪准确量取7μL步骤b得到的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物滴涂到步骤a得到的玻碳电极表面，于室温下自然晾干或红外干燥器烘干，然后在玻碳电极表面滴涂与石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物同体积的辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体,并置于4℃冰箱内反应1.5h～2h，再滴涂同体积的1wt％牛血清白蛋白溶液于37℃温箱内处理55min～60min封闭非特异性吸附位点，将修饰后的电极取出，用二次去离子水冲洗去除未结合的多余辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体，晾干后得到免疫传感器，在4℃避光的条件下保存备用。
2.上述纳米免疫传感器用于奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测
取100g检测奶粉样品III加入到已预热至45℃±1℃装有900mL灭菌水的锥形瓶中，用手缓缓的摇动至样品充分溶解，36℃±1℃培养18h～22h。移取1mL转种于10mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤中，36℃±1℃培养18h～22h。取1mL培养液备用。
以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝(片)为对电极，上述免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在与步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行电化学测试。用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2V～+0.6V。得到差分脉冲伏安图a。然后取出免疫传感器，用二次去离子水冲洗去除电极表面的电解质，备用。
在上述的纳米免疫传感器上涂上7μL上述备用的培养液，室温下孵育20min～25min。以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝(片)为对电极，阪崎肠杆菌免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在与步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行电化学测试。用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2V～+0.6V。得到差分脉冲伏安图b。将图a与图b重叠后得到图4。由图4得到，b图的响应电流值与a图相比，响应电流值明显变小，说明抗原与抗体产生了结合，也就是说，奶粉中有阪崎肠杆菌被检测出来。
为了验证该方法的有效性，同时利用实时荧光PCR法和国标方法测定奶粉中的阪崎肠杆菌。
表1国标法、实时荧光PCR法和免疫电极法对奶粉样品的检测结果
| 样品 | 国标 | 实时荧光PCR | 免疫电极 | 符合率 |
| 阳性 | 2 | 2 | 2 | 100％ |
| 阴性 | 28 | 28 | 28 | 100％ |
| 合计 | 30 | 30 | 30 | 100％ |
该方法测得的阪崎肠杆菌的准确率达到100％，说明此方法在快速检验阪崎肠杆菌是可行的、有效的。
Claims (4)
1.一种用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是，以玻碳电极为基础电极，以聚酰胺树枝状大分子材料结合还原性石墨烯纳米复合物为电活性修饰膜层，具体将该纳米复合修饰物固定于玻碳电极表面，然后采用物理吸附法或采用牛血清白蛋白－戊二醛交联方法固定化辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体制备而成纳米免疫传感器。
2.如权利要求1所述的用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤:
a.电极预处理
将玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水清洗干净，再依次用二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水超声清洗3min～5min，用氮气吹干玻碳电极，然后,将pH值为7.0的磷酸盐缓冲液放入烧杯中,再加入铁氰化钾、氯化钾和过氧化氢,使其浓度分别为2mmol/L、0.1mol/L和0.5mmol/L，得到电解质溶液,然后将玻碳电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝(片)对电极插入上述电解质溶液中,连接PAR270电化学工作站；用PAR270电化学工作站进行循环伏安法扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，扫描电位范围在-0.2V～+0.6V之间，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出玻碳电极用二次蒸馏水清洗净，用氮气吹干备用；
b.石墨烯-聚酰胺-胺复合物的制备
将一定量的石墨烯粉末加入到二次蒸馏水中，使其浓度为0.5mg/ml，搅拌1min～2min，并超声处理15min～20min，得到均匀一致的黑色石墨烯悬浮液,备用；
将2.0代聚酰胺-胺溶于体积浓度为1％的乙酸溶液中，使聚酰胺-胺的浓度为1.0×10-3g/mL，室温的条件下，磁力搅拌55min～60min，得到聚酰胺-胺溶液，然后将聚酰胺-胺溶液和上述的石墨烯悬浮液按体积比1:1混合均匀，将混合溶液超声处理1.5h～2h，得到均匀稳定的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液；
c.免疫传感器的制备
准确量取3～8μL步骤b得到的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液滴涂到步骤a得到的玻碳电极表面，于室温下自然晾干或用便携式红外干燥器烘干，然后在玻碳电极表面滴涂与石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物同体积的辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体,并置于4℃冰箱内反应1.5h～2h，再滴涂同体积的1wt％牛血清白蛋白溶液于37℃温度下处理55min～60min封闭非特异性吸附位点，将修饰后的电极取出，用二次去离子水冲洗去除未结合的多余辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体，得到阪崎肠杆菌纳米免疫传感器，在4℃避光的条件下保存备用。
3.如权利要求2所述的用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是，所述步骤c中量取的步骤b得到的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液为5μL。
4.使用权利要求1或2择一所述的纳米免疫传感器检测阪崎肠杆菌的方法，其特征是包括以下具体步骤；
取分离纯化的阪崎肠杆菌加入到8.5g/L的生理盐水中，在37℃摇床中过夜培养，使得阪崎肠杆菌均匀分散在生理盐水中，然后依次将其阪崎肠杆菌用浓度为8.5g/L的生理盐水稀释至阪崎肠杆菌菌悬液的浓度为108cu/mL、106cu/mL、104cu/mL、和102cu/mL，以及8.5g/L的生理盐水，备用；在所述纳米免疫传感器上滴涂与辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体同体积的各个梯度的上述阪崎肠杆菌菌悬液，室温下孵育20min～25min。以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极，阪崎肠杆菌免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在与所述步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行电化学测试，用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2V～+0.6V，以电流响应值为纵坐标，阪崎肠杆菌的浓度对数为横坐标，得到阪崎肠杆菌的免疫响应电流值与其浓度之间的线性曲线，即标准曲线及线性回归方程式，实验在25℃±0.5℃下进行；
然后将检测食品样品奶粉加入到45℃±1℃的缓冲蛋白胨水中，所述奶粉与缓冲蛋白胨水的比例为1g：9ml，摇动或搅拌至样品充分溶解，于36℃±1℃培养18h～22h,得到培养液一，移取培养液一转接种于改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤中，培养液一与改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤的体积比为1:10，36℃±1℃培养18h～22h,得到培养液二，备用；所述的纳米免疫传感器上滴涂与辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体同体积的上述备用的培养液二，室温下孵育20min～25min。以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极，阪崎肠杆菌免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在与所述步骤a中的电解质溶液相同的溶液中进行电化学测试，用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度为50mV·s-1，电压范围为-0.2V～+0.6V，可以根据响应电流值相比于免疫传感器的响应电流值大幅下降，来判断样品中有阪崎肠杆菌，并且将样品进行三次测量，并求其平均值，按线性回归方程式计算样品中阪崎肠杆菌的浓度，此过程在25℃±0.5℃下进行。
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