CN104459125A

CN104459125A - 一种快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法

Info

Publication number: CN104459125A
Application number: CN201410750804.3A
Authority: CN
Inventors: 田晶晶; 李勇; 王红梅; 蒙青林; 丁少华; 段生宝; 陈晔洲; 魏双施
Original assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明公开了一种快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法，包括步骤为：将纳米磁珠与脂磷壁酸抗体或核酸适配体偶联，封闭未偶联位点，得到阳性菌富集磁珠；将纳米磁珠与脂多糖抗体或核酸适配体偶联，封闭未偶联位点，得到阴性菌富集磁珠；将所述阳性菌富集磁珠或阴性菌富集磁珠与检测样本分别混匀后孵育并洗涤，再加入荧光标记二抗或酶标记二抗孵育并洗涤后测定结果。通过上述方式，本发明快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法能对低浓度细菌污染样本进行检测，节约操作时间，易于自动化，操作简化并保证检测精度，可实现定量检测，可广泛应用于医疗卫生、食品药品等领域的细菌污染筛查，解决细菌有无、细菌含量等问题，满足快速、准确、可靠的检测要求。

Description

一种快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种快速定量鉴定流体样本中革兰氏阴性阳性菌的检测方法。

背景技术

细菌存在于各种环境中，包括水、食品、甚至人体内，与人的生活密切相关。细菌对环境、人类和动物既有用处又有危害。生物有害菌的快速检测有助于疾病的预防和治疗，对此方面的研究也是方兴未艾。医疗、检疫、环境、农业、制药和食品加工等领域均需要进行大量的细菌检测工作。目前通用的细菌检测方法有十种以上，对细菌直接进行检测的方法都需要对样品进行细菌培养或DNA扩增。

以血液制品为例，临床输血目前为成分输血，即血液采集后分离有效成分分别输注，包括红细胞成分制品、血小板成分制品、血浆成分制品等。临床输血必需保证血液制品无菌，尽管目前采用多种方法防止血液制品输注前污染，但是依然不可避免，这严重危害患者的健康，其中血小板制品污染问题尤其突出。

血小板制品必须在(22±2)℃条件下振荡保存，这种环境极易于细菌繁殖，有效保存期很短。发生细菌污染的血小板制品如果输注到病人体内，几乎无例外都要引起轻重程度不等的输血反应，甚至是致命的菌血症和败血症。血小板制品细菌污染的概率要高于其他血液成分细菌污染或病毒感染的概率，输注血小板引起输血相关败血症的概率约为1/25000，而输注红细胞引起输血相关败血症的概率为1/250000。输注血小板引起细菌性败血症的风险远大于各种病毒引起的输血相关败血症。

在血小板制品细菌检测技术的研究方面，国外已经发展了基于细菌生长繁殖的间接指标，如pH值变化、葡萄糖浓度异常等、细菌消耗O₂和释放CO₂原理、抗原抗体免疫学原理、分子生物学核酸检测等领域的检测技术。其中通过FDA认证的有Bact/ALERT细菌培养监测系统、PalleBDS细菌检测系统、Scansystem 系统和血小板PGD检测系统，并运用于血小板制品细菌污染的检测中，但国内尚未开发相关的检测试剂及仪器。

血小板细菌污染在世界范围内都是颇为棘手的问题。在血小板捐献后进行血样培养，过24小时甚至48小时才能得出检测结果，然后抛弃有污染的部分。然而，血小板制品中细菌数量在培养前可能比较低，以至于不能检出；同时我国临床用血量巨大，培养时间过长不能有效的保证我国临床安全用血；且医院在临床输血前不能快速对血源细菌进行检测，增大患者的输血风险。目前主要检测方法有三个问题：耗时长，操作繁琐、敏感度低。

纳米磁珠由于比表面积大，磁珠对配体的载量相对其它介质高，同时它还具备可以进行磁分离的特性，这些优势赋予它无可比拟的优势。在免疫检测、细胞分选、生物大分子分离纯化及靶向给药等生物医学领域得到广泛的应用。磁珠介导的免疫检测有效率高，分离快速，重复性好及可自动化操作等优点。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法，该方法检测快速、准确、可靠。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法，包括步骤为：（1）将纳米磁珠与脂磷壁酸抗体或脂磷壁酸核酸适配体偶联，封闭未偶联位点，得到阳性菌富集磁珠；（2）将纳米磁珠与脂多糖抗体或脂多糖核酸适配体偶联，封闭未偶联位点，得到阴性菌富集磁珠；（3）将所述阳性菌富集磁珠或阴性菌富集磁珠与检测样本分别混匀后孵育并洗涤，再加入荧光标记二抗或酶标记二抗孵育并洗涤后测定结果。

在本发明一个较佳实施例中，所述纳米磁珠是具有磁性的四氧化三铁磁珠、具有磁性的三氧化二铁磁珠或聚合物包裹的磁性聚合物，所述纳米磁珠的表面富含有多种活性基团，所述纳米磁珠大小在20纳米-1微米之间。

在本发明一个较佳实施例中，所述磁性聚合物为二氧化硅磁性微球、聚苯乙烯磁性微球或金纳米磁性微球，所述活性基团为氨基、羧基、巯基、羟基或环氧基。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）或（2）中所述阴性菌或阳性菌富集磁珠制备过程为将所述纳米磁珠稀释至体积分数为5-50%，与1-5 mg/mL抗体或核酸适配体混合均匀，反应30min-2h，磁力吸附洗涤去上清，磁珠用0.1-1%的牛血清白蛋白或脱脂乳封闭12h-24h，得到阴性菌或阳性菌富集磁珠。

在本发明一个较佳实施例中，所述脂磷壁酸抗体或脂多糖抗体为鼠源单克隆抗体，所述脂磷壁酸核酸适配体或脂多糖核酸适配体为利用富集的配基系统进化技术即SELEX技术筛选的与脂磷壁酸或脂多糖特异结合的寡核苷酸链。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）或（2）中所述偶联过程为共价偶联，偶联剂为双功能交联剂或硅烷偶联剂，所述偶联过程中采用的磷酸盐缓冲液的浓度为0.5M。

在本发明一个较佳实施例中，所述双功能交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)、N-[p-马来酰亚胺苯]异氰酸酯（PMPI）。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）或（2）中所述偶联过程是利用生物素和亲和素连接的，在所述纳米磁珠上偶联亲和素，在抗体或核酸适配体上偶联生物素，通过生物素与亲和素结合的特点将所述纳米磁珠与抗体或核酸适配体偶联。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述检测样本为流体样本或固体样本溶于溶液后的样本，所述流体样本为血液样本、尿液样本、组织液样本或水样本，所述溶液为水。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述荧光标记二抗中用于标记的荧光素为花青素Cy系列荧光素或Alexa Fluor系列荧光素或异硫氰酸荧光素，所述酶标记二抗中用于标记的酶为碱性磷酸酶或过氧化物酶。

本发明的有益效果是：本发明的快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法，该方法仅需两种类型的细菌富集磁珠就能完成对流体样本中细菌的富集，克服传统的细菌检测前细菌需培养扩增的环节，可对低浓度细菌污染样本进行检测；同时利用磁性分离代替离心分离，节约操作时间，易于自动化；相对于染色法、PCR法，磁珠表面偶联细菌特异性配体，利用免疫学方法，更简化操作难度并保证检测精度，可实现定量检测。可广泛应用于医疗卫生、食品药品检测等领域的细菌污染筛查，可解决流体样本细菌污染中细菌有无、细菌含量等问题，满足快速、准确、可靠的检测要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明的快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法的原理过程图；

图2 是本发明的快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法中纳米磁珠的电镜图；

图3是本发明的快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法中纳米磁珠偶联抗体的最优缓冲液选择图；

图4是本发明的革兰氏阳性菌的检测结果图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

提供一种快速定量鉴定流体样本中革兰氏阴性及阳性菌含量的检测方法，包括步骤为：

纳米磁珠的合成方法：

（1）催化剂制备：将1g 尿素与20ml 溶剂乙二醇在氮气保护下搅拌加热到150℃，使尿素溶解，1h后冷却到100℃待用。

（2）反应体系制备：称取0.8g聚丙烯酸、0.35g FeCl₃，与50ml 溶剂乙二醇混合，在氮气保护下搅拌1h后加热至230℃，所有物质溶解后，反应体系制备完成。

（3）纳米磁珠合成：把4ml 催化剂注入到反应体系中，约3min后溶液变浑浊，呈黑色。继续加热1h后，关闭温度，冷却至常温，磁性分离去上清，用无水乙醇清洗2次，再用去离子水清洗3次，最后用去离子水将所得的产物重新分散，得到表面含羧基修饰基团的纳米磁珠。如图2所示，合成的纳米磁珠直径约100nm。

基于上述得到的纳米磁珠偶联抗体最优缓冲液选择的方法：

要增加偶联效率，降低磁珠与蛋白质的非特异性吸附，使更多的蛋白质与磁珠发生共价偶联反应，需要选择合适的偶联反应缓冲液以提供适宜的离子强度和pH值，改变磁珠表面的微环境。

（1）偶联缓冲液配制分别配制pH=7.4的0.5M、0.1M、0.01M磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液），以及0.01M pH=5的乙酸-乙酸盐缓冲液。

（2）缓冲液选择步骤：

1）将纳米磁珠稀释至体积分数为10%；

2）取离心管5只，各管加入500μL合成的纳米磁珠；

3）将纳米磁珠溶液分别置换成0.5M、0.1M和0.01M（pH=7.4）磷酸盐缓冲液、去离子水、或0.01M乙酸-乙酸盐缓冲液（pH=5.0）；

4）分别向每管中加入50μL脂多糖抗体溶液（10mg/mL），以150rpm、室温条件在恒温振荡器上反应3h，反应后分离上清，测上清OD280吸收值。

（3）缓冲液测试结果

实验结果显示相对于对照组，当缓冲液为乙酸-乙酸钠溶液时，上清的OD280值为零，抗体几乎全部吸附；当缓冲液为超纯水时，大部分抗体被吸附；当缓冲液为PBS缓冲液时，尽管缓冲液的浓度不同，非特异性吸附都很低。其中PBS缓冲液为0.5M时，抗体和磁粒非特异性吸附最少，结果见图3。

检测革兰氏阳性菌的方法

（1）纳米磁珠制备：

1）催化剂制备：将1g 尿素与20ml 溶剂乙二醇在氮气保护下搅拌加热到150℃，使尿素溶解，1h后冷却到100℃待用。

2）反应体系制备：称取0.8g聚丙烯酸、0.35g FeCl₃，与50ml 溶剂乙二醇混合，在氮气保护下搅拌1h后加热至230℃，所有物质溶解后，反应体系制备完成。

3）纳米磁珠合成：把4ml 催化剂注入到反应体系中，约3min后溶液变浑浊，呈黑色。继续加热1h后，关闭温度，冷却至常温，磁性分离去上清，用无水乙醇清洗2次，再用去离子水清洗3次，最后用去离子水将所得的产物重新分散，得到表面含羧基修饰基团的纳米磁珠。

（2）阳性菌富集磁珠制备：

1）用0.5M磷酸盐缓冲液（pH=7.2）将纳米磁珠稀释至体积分数为5%，加入等体积的浓度为5mg/ml的脂磷壁酸抗体溶液，轻轻混匀后，立即加入20mg碳酰二亚胺盐，置于混匀仪室温反应6h。

2）反应完成后，磁性分离去上清，用磷酸盐缓冲液磁性洗涤3次，稀释到体积分数为10%待用。

（3）流体样本选择待检样本：含有一定量金黄色葡萄球菌的水溶液。阴性对照：无菌水。空白对照：未偶联抗体的纳米磁珠加入待检样本中。

（4）革兰氏阳性菌富集及检测：

取200μL未偶联抗体的纳米磁珠置于1.5ml离心管中，加入200μL待检样本；再分别取200 μL所述阳性菌富集磁珠悬液置于2只 1.5ml离心管中，分别加入200 μL待检样本、200 μL无菌水，混和均匀。将离心管置于37℃水浴下孵育10 min，再分别用500ul磷酸盐缓冲液磁性分离洗涤3次。加入用生理盐水稀释5000倍的50 μL FITC标记二抗，在37℃下孵育30 min得到混合液。分别用500ul磷酸盐缓冲液磁性分离洗涤3次，最后将磁珠混悬于200 μL磷酸盐缓冲液。用流式细胞仪进行检测。结果如图4。通过磁珠富集及信号放大作用，待检样本与阴性对照荧光值有100倍差异。利用此检测系统可有效筛检鉴别革兰氏阳性菌及阴性菌，为临床提供一种快速有效的检测手段。

本发明的有益效果是：

本发明利用纳米磁珠对流体样本中的细菌进行富集，磁珠上分别偶联有针对革兰氏阳性菌脂磷壁酸（LTA）和革兰阴性菌脂多糖（LPS）的抗体或核酸适配体，将富集后细菌洗涤，再加入荧光标记二抗或酶标记的二抗孵育并洗涤后测定结果。

本发明的检测方法克服传统的细菌培养扩增、染色计数等耗时耗力的方法，利用纳米磁珠快速磁分离代替离心操作，操作更简便，易于自动化；同时利用磁珠富集菌株，省略了细菌培养过程，可实现微量细菌的检测；采用特异针对革兰氏阳性菌及阴性菌的抗体或核酸适配体，提高检测精度，结合检测仪器可实现定量检测。可广泛适用于应用于医疗卫生，食品药品检测等领域细菌污染筛查，可解决流体样本细菌污染中细菌有无、细菌含量等问题，满足快速、准确、可靠的检测要求。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种快速检测革兰氏阴性阳性菌的方法，其特征在于，包括步骤为：（1）将纳米磁珠与脂磷壁酸抗体或脂磷壁酸核酸适配体偶联，封闭未偶联位点，得到阳性菌富集磁珠；（2）将纳米磁珠与脂多糖抗体或脂多糖核酸适配体偶联，封闭未偶联位点，得到阴性菌富集磁珠；（3）将所述阳性菌富集磁珠或阴性菌富集磁珠与检测样本分别混匀后孵育并洗涤，再加入荧光标记二抗或酶标记二抗孵育并洗涤后测定结果。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述纳米磁珠是具有磁性的四氧化三铁磁珠、具有磁性的三氧化二铁磁珠或聚合物包裹的磁性聚合物，所述纳米磁珠的表面富含有多种活性基团，所述纳米磁珠大小在20纳米-1微米之间。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述磁性聚合物为二氧化硅磁性微球、聚苯乙烯磁性微球或金纳米磁性微球，所述活性基团为氨基、羧基、巯基、羟基或环氧基。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）或（2）中所述阴性菌或阳性菌富集磁珠制备过程为将所述纳米磁珠稀释至体积分数为5-50%，与1-5 mg/mL抗体或核酸适配体混合均匀，反应30min-2h，磁力吸附洗涤去上清，磁珠用0.1-1%的牛血清白蛋白或脱脂乳封闭12h-24h，得到阴性菌或阳性菌富集磁珠。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述脂磷壁酸抗体或脂多糖抗体为鼠源单克隆抗体，所述脂磷壁酸核酸适配体或脂多糖核酸适配体为利用富集的配基系统进化技术即SELEX技术筛选的与脂磷壁酸或脂多糖特异结合的寡核苷酸链。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）或（2）中所述偶联过程为共价偶联，偶联剂为双功能交联剂或硅烷偶联剂，所述偶联过程中采用的磷酸盐缓冲液的浓度为0.5M。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述双功能交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)、N-[p-马来酰亚胺苯]异氰酸酯（PMPI）。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）或（2）中所述偶联过程是利用生物素和亲和素连接的，在所述纳米磁珠上偶联亲和素，在抗体或核酸适配体上偶联生物素，通过生物素与亲和素结合的特点将所述纳米磁珠与抗体或核酸适配体偶联。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述检测样本为流体样本或固体样本溶于溶液后的样本，所述流体样本为血液样本、尿液样本、组织液样本或水样本，所述溶液为水。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述荧光标记二抗中用于标记的荧光素为花青素Cy系列荧光素或Alexa Fluor系列荧光素或异硫氰酸荧光素，所述酶标记二抗中用于标记的酶为碱性磷酸酶或过氧化物酶。