CN113133513A - 一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获‑分离剂及其制备方法和应用，该捕获‑分离剂包括，包括Fe3O4磁性核，Fe3O4磁性核的外部包裹有单宁酸，所述单宁酸呈颗粒状，使得整个分离剂为一种类似于病毒状结构的分离剂。该颗粒能够捕获分离果汁中的细菌。该纳米材料能够特异性识别革兰氏阳性菌，可以捕获分离果汁中的革兰氏阳性菌，该病毒状结构和单宁酸修饰显著提高纳米捕获分离剂的捕获效率，吸附分离革兰氏阳性菌具有高度特异性。
Description
技术领域
本发明属于纳米磁分离技术领域，具体涉及一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂及其制备方法和应用。
背景技术
病原微生物对食品的污染是全球范围内的一个重要问题，对人类健康构成了严重威胁。在全球范围内，由食物腐败微生物介导的食源性疾病受到人们的高度重视。食源性细菌暴发是全世界疾病和死亡的主要原因之一，对健康和安全造成极其严重的威胁，给医疗保健和社会经济造成沉重的经济负担。食源性致病菌是导致食品安全问题的重要来源，其作为引起食源性疾病的主要因素，尽管进行了质量控制、巴氏灭菌和超高温(UHT)处理，但仍报告了由于食用受污染变质的产品而引起的许多食品安全事件。
传统热杀菌方式如高温高压、超高温瞬时杀菌等过程产生的热效应会对果汁中的营养成分、理化特性、风味属性产生不利影响，并引起感官品质的下降。而超高压技术、高压脉冲电场技术、电子束辐射杀菌、高压CO2杀菌技术等非热杀菌技术设备复杂，微生物细胞破碎死亡后仍残留在果汁中。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂及其制备方法和应用，以解决现有技术中杀菌技术品质变化、设备复杂及细菌裂解残留的问题。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂，包括Fe3O4磁性核，Fe3O4磁性核的外部表面附着有单宁酸，所述单宁酸呈突刺状。
本发明的进一步的改进在于：
优选的，所述Fe3O4磁性核和单宁酸的质量比为2:1。
一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将六水合三氯化铁和无水醋酸钠在乙二醇中溶解，然后加入聚丙烯酸，磁力搅拌过程中充入氮气，获得反应溶液；反应溶液水热反应后获得黑色反应产物，使用无水乙醇清洗黑色反应产物，直至上清液清澈透明，将清洗后的反应产物真空干燥，获得Fe3O4磁性纳米材料；
步骤2，将Fe3O4磁性纳米材料在去离子水中超声分散，机械搅拌过程中加入草酸，获得过程产物，用去离子水洗涤过程产物，真空干燥过程产物，获得刻蚀后的Fe3O4磁性纳米材料；
步骤3，将刻蚀后的Fe3O4磁性纳米材料在去离子水中超声分散，获得过程溶液；将单宁酸溶解在去离子水中，获得单宁酸溶液；将单宁酸溶液与过程溶液混合后振荡反应，通过磁分离去除上清液，获得反应产物，将反应产物通过去离子水清洗后，获得Fe3O4@TA纳米捕获-分离剂，为革兰氏阳性菌捕获-分离剂。
4.根据权利要求3所述的一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法，其特征在于，步骤1中，六水合三氯化铁、无水醋酸钠和聚丙烯酸的质量比为2.72:7.2:0.25。
优选的，步骤1中，水热反应分为两个加热阶段，第一阶段的加热温度为110-130℃，加热时间为2h；第二阶段的加热温度为190-210℃，加热时间为10h；反应产物的真空干燥温度为60℃。
优选的，步骤2中，Fe3O4磁性纳米材料和去离子水的混合比例为1g:1mL；Fe3O4磁性纳米材料和草酸的质量比为1:1.26。
优选的，步骤2中，机械搅拌时间为20-25min。
优选的，步骤3中，Fe3O4磁性纳米材料和单宁酸的质量比为2:1。
优选的，步骤3中，振荡反应时间为2h，振荡反应温度为35-45℃。
一种上述的纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的应用，其特征在于，将捕获-分离剂分散在水中，获得捕获-分离剂溶液，其中捕获-分离剂的浓度为5-25mg/mL，将捕获-分离剂溶液和革兰氏阳性菌混合后，将混合物振荡完成捕获，振荡温度为4-45℃，振荡时间为0.5min-10min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂，该捕获-分离剂包括Fe3O4磁性核，Fe3O4磁性核的外部包裹有单宁酸，单宁酸呈颗粒状，使得整个分离剂为一种类似于病毒状结构的分离剂。该颗粒能够捕获分离果汁中的细菌。该纳米材料能够特异性识别革兰氏阳性菌，可以捕获分离果汁中的革兰氏阳性菌，该病毒状结构和单宁酸修饰显著提高纳米捕获分离剂的捕获效率，吸附分离革兰氏阳性菌具有高度特异性。
本发明还公开了一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法，该制备方法首先制备出磁性纳米材料，然后通过草酸刻蚀合成具有病毒状结构的纳米材料，增加了活性位点；制备出来的磁性纳米材料具有特异性，能够特异性捕获革兰氏阳性菌；选用的单宁酸修饰的磁性纳米材料对于革兰氏阳性菌具有很高的选择性，本发明方法能够快速合成病毒状结构的磁性纳米材料，本发明的材料合成方法的成本低、易于实现。
本发明还公开了一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的应用，将制备好的纳米捕获-分离剂应用于果汁中，可以特异性吸附食品中的革兰氏阳性菌，并在外加磁场作用下，可以将微生物分离出来，同时还可以保持食品原有的色泽、香气和营养成分。该捕获分离方法适用范围广，可实现纳米捕获分离剂对于果汁体系中革兰氏阳性菌的分离，具有很好地应用性，同时拓宽了纳米材料在杀菌领域的应用；该捕获-分离剂捕获分离的果汁的最佳浓度为0.1mg/mL(终浓度)，对于细菌浓度更高的液体样品亦可通过增加材料浓度进行捕获分离；该去除细菌的方法具有操作简单、快速和选择性高等优点，可快速实现对果汁中革兰氏阳性菌的捕获分离。
附图说明
图1为本发明具有病毒状结构的磁性纳米材料的扫描电镜图；
其中，(a)图为实施例1步骤1制备的Fe3O4磁性纳米材料；(b)图为实施例1步骤2制备的被刻蚀后的vFe3O4磁性纳米材料；(c)图为实施例1步骤3制备的病毒状的vFe3O4-TA纳米捕获-分离剂；
图2为纳米捕获分离剂对不同的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的捕获效率柱状图；
图3为病毒状结构的仿生增强的捕获效率图；
图4为捕获分离剂应用于实际样品的捕获效率图；
图5为捕获分离剂应用于实际样品的平板对比图；
图6为本发明的制备方法流程图；
图7为实施例2制备出的vFe3O4形貌图；
图8为实施例3制备出的vFe3O4形貌图；
图9为实施例8-实施例11的捕获效率对比图；
图10为实施例12-实施例18的捕获效率对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细描述：
参见图6，一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法和应用，是按以下步骤完成的：
一、通过溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4 NPs)。将2.72g六水合三氯化铁和7.20g醋酸钠于80mL乙二醇中充分均匀溶解。加入0.25g聚丙烯酸，磁力搅拌下充入氮气2小时。将混合物转移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，将高压釜加热至110-130℃并保持2小时，然后加热至190-210℃反应10小时。待反应釜自然冷却至室温，所得黑色产品用无水乙醇洗涤至上清清澈透明，并在60℃下进行真空干燥，即可制得Fe3O4磁性纳米材料。
三、将200mg于200mL去离子水中超声5～30min以均匀分散，Fe3O4与去离子水的质量比为1:1；将分散液在机械搅拌下加入252mg草酸刻蚀20-25min，Fe3O4与草酸的质量比为1:1.26，用去离子水洗涤所得材料，真空干燥即可制得病毒状Fe3O4磁性纳米材料。
四、取100mg病毒状Fe3O4磁性纳米材料于20mL去离子水中超声5～30min以均匀分散，获得初始反应材料溶液；取50mg单宁酸于20mL去离子水中均匀溶解，获得单宁酸溶液，单宁酸的用量依据病毒状Fe3O4磁性纳米材料决定，Fe3O4磁性纳米材料和单宁酸的质量比为2:1；将单宁酸溶液与初始反应材料溶液均匀混合，在35-45℃，200rpm条件下振荡反应2小时，磁分离弃去上清，用去离子水洗涤几次，即可制得病毒状的Fe3O4@TA纳米捕获-分离剂。
纳米捕获-分离剂由Fe3O4磁性纳米材料、草酸及单宁酸制备而成；Fe3O4磁性纳米材料为基底，草酸为刻蚀剂，单宁酸为表面修饰材料。磁性基底为Fe3O4纳米材料。
纳米复合材料具有病毒状结构。
所述的细菌为革兰氏阳性菌，纳米捕获-分离剂能够特异性捕获革兰氏阳性菌，纳米捕获-分离剂用于捕获-分离液态食品中的革兰氏阳性菌。对果汁中的阳性菌吸附纳米捕获-分离剂用量为0.1mg/mL(终浓度)，细菌污染量为103～104CFU/mL。
所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌时，捕获-分离剂的浓度为5-25mg/mL之间，对阳性菌的杀菌率为87％以上。
该纳米捕获-分离剂的具体应用过程为：
将vFe3O4-TA纳米捕获-分离剂超声均匀分散在于水中，制成浓度5-25mg/mL的材料溶液；将志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌制成菌悬液；然后分别添加100μL vFe3O4-TA溶液于2500μL不同的菌悬液中，将混合物在4～45℃振荡0.5～10分钟，完成捕获。
应用时的液体样品为苹果汁。
本发明的工作原理为：本发明采用溶剂热法合成磁性四氧化三铁基底材料，再进一步通过草酸刻蚀和单宁酸修饰合成病毒状的纳米捕获分离剂，该材料能够特异性识别革兰氏阳性菌，通过外部磁分离可以快速简便的捕获分离液体中的革兰氏阳性菌，将其应用于苹果汁中的革兰氏阳性菌的捕获分离，表现出较高的捕获效率，且对苹果汁品质影响不大。因此，提供一种有效的果汁中革兰氏阳性菌的捕获分离方法。
下面结合具体的实施例进一步的说明：
对比例
步骤1，通过溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4 NPs)。将2.72g六水合三氯化铁和7.20g醋酸钠于80mL乙二醇中充分均匀溶解。加入0.25g聚丙烯酸，磁力搅拌下充入氮气2小时。将混合物转移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，将高压釜加热至120℃并保持2小时，然后加热至200℃反应10小时。待反应釜自然冷却至室温，所得黑色产品用无水乙醇洗涤至上清清澈透明，并在60℃条件下真空干燥，即可制得Fe3O4磁性纳米材料。
步骤3，取100mg Fe3O4磁性纳米材料于20mL去离子水中超声15min以均匀分散，50mg单宁酸于20mL去离子水中均匀溶解，将单宁酸溶液与材料溶液均匀混合，在40℃200rpm条件下振荡反应2小时，磁分离弃去上清，用去离子水洗涤几次，即可制得Fe3O4-TA纳米捕获-分离剂。
实施例1
步骤1，通过溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4 NPs)。将2.72g六水合三氯化铁和7.20g醋酸钠于80mL乙二醇中充分均匀溶解。加入0.25g聚丙烯酸，磁力搅拌下充入氮气2小时。将混合物转移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，将高压釜加热至120℃并保持2小时，然后加热至200℃反应10小时。待反应釜自然冷却至室温，所得黑色产品用无水乙醇洗涤至上清清澈透明，并在60℃条件下真空干燥，即可制得Fe3O4磁性纳米材料。
步骤2，将200mg Fe3O4于200mL去离子水中超声15min以均匀分散，机械搅拌下加入252mg草酸刻蚀23min，用去离子水洗涤所得材料，真空干燥即可制得病毒状vFe3O4磁性纳米材料。
步骤3，取100mg病毒状Fe3O4磁性纳米材料于20mL去离子水中超声15min以均匀分散，50mg单宁酸于20mL去离子水中均匀溶解，将单宁酸溶液与材料溶液均匀混合，在40℃200rpm条件下振荡反应2小时，磁分离弃去上清，用去离子水洗涤几次，即可制得病毒状的vFe3O4-TA纳米捕获-分离剂。
图1为本实施例中步骤1、步骤2和步骤3的Fe3O4(a图)、vFe3O4(b图)、vFe3O4-TA(c图)的扫描电镜图。从图1的(a)图中可以看出Fe3O4本身表面为粗糙的结构，参见(b)图可以看出球形的Fe3O4在草酸刻蚀后表面呈刺突状，参见(c)图可以看出，单宁酸在刻蚀后的Fe3O4表面分布良好，形成了病毒状结构。
下面对实施例1制备出的病毒状的vFe3O4-TA纳米捕获-分离剂进行效果验证。
(1)吸附特异性效果验证
①、细菌培养：
在本发明中，革兰氏阳性细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)被选作模型细菌，以评估材料的吸附性能。首先，采用平板划线技术将细菌在LB琼脂平板上划线，放入37℃的培养箱过夜培养，然后在培养好的平板上挑出单个菌落，然后接种在30mL LB肉汤中，并于37℃振荡温育12小时。
②、菌悬液的制备：从上一步培养好的细菌的肉汤中移取8mL至无菌离心管中，在6000rpm、4℃条件下离心5min，弃去上清的肉汤，加入相同体积的PBS缓冲液(1×，pH 7.4)后重悬，再次离心，重复洗涤3次，最后用PBS缓冲液稀释已经洗涤的菌悬液，使得其在OD600nm处的吸光值为0.5，制备好的菌悬液存放至4℃环境，备用。
③、根据步骤一制备得到的材料，将其超声均匀分散在于水中，制成浓度2.0mg/mL的材料溶液；将志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌按实施例二制成菌悬液；然后分别添加100μL v Fe3O4-TA溶液于2500μL不同的菌悬液中。将混合物在37℃振荡10分钟，磁分离后分别记录上清的吸光度，计算捕获效率，结果见图2；
图2为在纳米捕获分离剂对不同的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴形细菌的捕获效率。从图2中可以看出，纳米捕获分离剂对革兰氏阴性菌：大肠杆菌、沙门氏菌及志贺氏菌的捕获效率远小于革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌。结果表明，该纳米捕获分离剂对革兰氏阳性菌具有特异性吸附。
(2)病毒状结构的仿生增强：
将纯Fe3O4纳米材料、病毒状v Fe3O4材料(实施例1的步骤2获得的材料)、Fe3O4-TA(对比例获得的材料)及vFe3O4-TA材料分别制成浓度20mg/mL的溶液，然后分别添加100μL各材料溶液于2500μL不同的菌悬液中。将混合物在37度振荡10分钟，磁分离后分别记录上清的吸光度，计算捕获效率，结果见图3；
从图3中可以看出在四种材料的吸附能力有显著性差异，刻蚀成病毒状的vFe3O4材料比纯Fe3O4材料捕获效率要好，刻蚀后修饰单宁酸的v Fe3O4-TA材料比单纯修饰单宁酸的Fe3O4-TA捕获效率更好，表明刻蚀过的材料会显著增加活性位点；Fe3O4-TA比Fe3O4捕获效率更好，v Fe3O4-TA比v Fe3O4捕获效率更好，表明单宁酸的修饰能显著提高材料的吸附能力。
(3)病毒状结构的仿生增强的v Fe3O4-TA用于捕获分离苹果汁中的革兰氏阳性菌
实际样品为100％苹果汁，以金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌作为果汁中的革兰氏阳性目标菌。添加103～104CFU/mL于无菌苹果汁中以制备被污染的果汁，将v Fe3O4-TA材料溶液添加至果汁中(终浓度分别为0.1mg/mL和0.3mg/mL)，结果如图4所示。同时对加入材料前后的果汁品质进行了评估，包括总酸、可溶性固形物、透光率以及色差变化，结果如表1、表2所示。
从图4中可以看出在两个浓度条件下金黄色葡萄球菌全部被吸附分离，吸附效率达100％；而李斯特菌的吸附效率也达到95％以上。从图5中可以看出原菌液在用捕获分离剂磁分离后上清液菌数显著减少，进一步佐证了图4的结果。
从表1中可以看出，加入材料前后果汁的可溶性固形物和总酸没有显著变化，透光率有显著变化，但在可以接受的范围内。从表2中可以看出，加入材料前后果汁色差的ΔE<2，在大多数应用中可以接受。
表1捕获分离剂处理前后果汁的可溶性固形物、总酸和透光率变化
表2捕获分离剂处理前后果汁色差变化
这些结果进一步表明，本发明方法对于果汁中的革兰氏阳性菌具有较高的捕获效率，且对果汁品质变化影响不大，说明本发明能够用于液体体系中革兰氏阳性菌的捕获分离。
实施例2
一、通过溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4 NPs)。将2.72g六水合三氯化铁和7.20g醋酸钠于80mL乙二醇中充分均匀溶解。加入0.25g聚丙烯酸，磁力搅拌下充入氮气2小时。将混合物转移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，将高压釜加热至120℃并保持2小时，然后加热至200℃反应10小时。待反应釜自然冷却至室温，所得黑色产品用无水乙醇洗涤至上清清澈透明，并在60℃条件下真空干燥，即可制得Fe3O4磁性纳米材料。
二、将200mg于200mL去离子水中超声15min以均匀分散，Fe3O4与去离子水的质量比为1:1；将分散液在机械搅拌下加入252mg草酸刻蚀25min，Fe3O4与草酸的质量比为1:1.26，用去离子水洗涤所得材料，真空干燥即可制得病毒状Fe3O4磁性纳米材料。该病毒的Fe3O4纳米捕获-分离剂的形貌结构图如图7所示。
三、取100mg病毒状Fe3O4磁性纳米材料于20mL去离子水中超声15min以均匀分散，获得初始反应材料溶液；取50mg单宁酸于20mL去离子水中均匀溶解，获得单宁酸溶液，单宁酸的用量依据病毒状Fe3O4磁性纳米材料决定，Fe3O4磁性纳米材料和单宁酸的质量比为2:1；将单宁酸溶液与初始反应材料溶液均匀混合，在40℃，200rpm条件下振荡反应2小时，磁分离弃去上清，用去离子水洗涤几次，即可制得病毒状的Fe3O4@TA纳米捕获-分离剂，实施例3
一、通过溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4 NPs)。将2.72g六水合三氯化铁和7.20g醋酸钠于80mL乙二醇中充分均匀溶解。加入0.25g聚丙烯酸，磁力搅拌下充入氮气2小时。将混合物转移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，将高压釜加热至110℃并保持2小时，然后加热至190℃反应10小时。待反应釜自然冷却至室温，所得黑色产品用无水乙醇洗涤至上清清澈透明，并在60℃条件下真空干燥，即可制得Fe3O4磁性纳米材料。
二、将200mg于200mL去离子水中超声15min以均匀分散，Fe3O4与去离子水的质量比为1:1；将分散液在机械搅拌下加入252mg草酸刻蚀22min，Fe3O4与草酸的质量比为1:1.26，用去离子水洗涤所得材料，真空干燥即可制得病毒状Fe3O4磁性纳米材料。该病毒状的Fe3O4纳米捕获-分离剂的形貌图如图8所示。
三、取100mg病毒状Fe3O4磁性纳米材料于20mL去离子水中超声15min以均匀分散，获得初始反应材料溶液；取50mg单宁酸于20mL去离子水中均匀溶解，获得单宁酸溶液，单宁酸的用量依据病毒状Fe3O4磁性纳米材料决定，Fe3O4磁性纳米材料和单宁酸的质量比为2:1；将单宁酸溶液与初始反应材料溶液均匀混合，在45℃，200rpm条件下振荡反应2小时，磁分离弃去上清，用去离子水洗涤几次，即可制得病毒状的Fe3O4@TA纳米捕获-分离剂。
对比图7和图8可以发现，步骤2中，刻蚀时间越长，刻蚀出的突刺数量越多。
实施例4
一、通过溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4 NPs)。将2.72g六水合三氯化铁和7.20g醋酸钠于80mL乙二醇中充分均匀溶解。加入0.25g聚丙烯酸，磁力搅拌下充入氮气2小时。将混合物转移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，将高压釜加热至130℃并保持2小时，然后加热至210℃反应10小时。待反应釜自然冷却至室温，所得黑色产品用无水乙醇洗涤至上清清澈透明，并在60℃条件下真空干燥，即可制得Fe3O4磁性纳米材料。
二、将200mg于200mL去离子水中超声15min以均匀分散，Fe3O4与去离子水的质量比为1:1；将分散液在机械搅拌下加入252mg草酸刻蚀20min，Fe3O4与草酸的质量比为1:1.26，用去离子水洗涤所得材料，真空干燥即可制得病毒状Fe3O4磁性纳米材料。
三、取100mg病毒状Fe3O4磁性纳米材料于20mL去离子水中超声15min以均匀分散，获得初始反应材料溶液；取50mg单宁酸于20mL去离子水中均匀溶解，获得单宁酸溶液，单宁酸的用量依据病毒状Fe3O4磁性纳米材料决定，Fe3O4磁性纳米材料和单宁酸的质量比为2:1；将单宁酸溶液与初始反应材料溶液均匀混合，在35℃，200rpm条件下振荡反应2小时，磁分离弃去上清，用去离子水洗涤几次，即可制得病毒状的Fe3O4@TA纳米捕获-分离剂。
实施例5
一、通过溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4 NPs)。将2.72g六水合三氯化铁和7.20g醋酸钠于80mL乙二醇中充分均匀溶解。加入0.25g聚丙烯酸，磁力搅拌下充入氮气2小时。将混合物转移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，将高压釜加热至115℃并保持2小时，然后加热至205℃反应10小时。待反应釜自然冷却至室温，所得黑色产品用无水乙醇洗涤至上清清澈透明，并在60℃条件下真空干燥，即可制得Fe3O4磁性纳米材料。
二、将200mg于200mL去离子水中超声15min以均匀分散，Fe3O4与去离子水的质量比为1:1；将分散液在机械搅拌下加入252mg草酸刻蚀24min，Fe3O4与草酸的质量比为1:1.26，用去离子水洗涤所得材料，真空干燥即可制得病毒状Fe3O4磁性纳米材料。
三、取100mg病毒状Fe3O4磁性纳米材料于20mL去离子水中超声15min以均匀分散，获得初始反应材料溶液；取50mg单宁酸于20mL去离子水中均匀溶解，获得单宁酸溶液，单宁酸的用量依据病毒状Fe3O4磁性纳米材料决定，Fe3O4磁性纳米材料和单宁酸的质量比为2:1；将单宁酸溶液与初始反应材料溶液均匀混合，在42℃，200rpm条件下振荡反应2小时，磁分离弃去上清，用去离子水洗涤几次，即可制得病毒状的Fe3O4@TA纳米捕获-分离剂。
实施例6
一、通过溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4 NPs)。将2.72g六水合三氯化铁和7.20g醋酸钠于80mL乙二醇中充分均匀溶解。加入0.25g聚丙烯酸，磁力搅拌下充入氮气2小时。将混合物转移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，将高压釜加热至115℃并保持2小时，然后加热至195℃反应10小时。待反应釜自然冷却至室温，所得黑色产品用无水乙醇洗涤至上清清澈透明，并在60℃条件下真空干燥，即可制得Fe3O4磁性纳米材料。
二、将200mg于200mL去离子水中超声15min以均匀分散，Fe3O4与去离子水的质量比为1:1；将分散液在机械搅拌下加入252mg草酸刻蚀23min，Fe3O4与草酸的质量比为1:1.26，用去离子水洗涤所得材料，真空干燥即可制得病毒状Fe3O4磁性纳米材料。
三、取100mg病毒状Fe3O4磁性纳米材料于20mL去离子水中超声15min以均匀分散，获得初始反应材料溶液；取50mg单宁酸于20mL去离子水中均匀溶解，获得单宁酸溶液，单宁酸的用量依据病毒状Fe3O4磁性纳米材料决定，Fe3O4磁性纳米材料和单宁酸的质量比为2:1；将单宁酸溶液与初始反应材料溶液均匀混合，在38℃，200rpm条件下振荡反应2小时，磁分离弃去上清，用去离子水洗涤几次，即可制得病毒状的Fe3O4@TA纳米捕获-分离剂。
实施例7
一、通过溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4 NPs)。将2.72g六水合三氯化铁和7.20g醋酸钠于80mL乙二醇中充分均匀溶解。加入0.25g聚丙烯酸，磁力搅拌下充入氮气2小时。将混合物转移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，将高压釜加热至120℃并保持2小时，然后加热至210℃反应10小时。待反应釜自然冷却至室温，所得黑色产品用无水乙醇洗涤至上清清澈透明，并在60℃条件下真空干燥，即可制得Fe3O4磁性纳米材料。
二、将200mg于200mL去离子水中超声15min以均匀分散，Fe3O4与去离子水的质量比为1:1；将分散液在机械搅拌下加入252mg草酸刻蚀24min，Fe3O4与草酸的质量比为1:1.26，用去离子水洗涤所得材料，真空干燥即可制得病毒状Fe3O4磁性纳米材料。
三、取100mg病毒状Fe3O4磁性纳米材料于20mL去离子水中超声15min以均匀分散，获得初始反应材料溶液；取50mg单宁酸于20mL去离子水中均匀溶解，获得单宁酸溶液，单宁酸的用量依据病毒状Fe3O4磁性纳米材料决定，Fe3O4磁性纳米材料和单宁酸的质量比为2:1；将单宁酸溶液与初始反应材料溶液均匀混合，在35℃，200rpm条件下振荡反应2小时，磁分离弃去上清，用去离子水洗涤几次，即可制得病毒状的Fe3O4@TA纳米捕获-分离剂。
实施例8-实施例11
实施例8-实施例11中在进行吸附特异性效果验证时，材料溶液的浓度分别为5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL和25mg/mL，其余步骤均与实施例1相同，对比实施例8-实施例11以及实施例1的捕获效率，结果如下表以及图9所示。从下表和图9可以看出，随着制备出材料溶液浓度的增加，捕获效率在不断增加。
实施例12-18
实施例12-实施例18中在进行吸附特异性效果验证时，将混合物在37℃振荡分别振荡0.5、1、1.5、2、2.5、3、5min时磁分离记录上清的吸光度，计算捕获效率。结果如图10所示，可见，随着振荡时间的延长，捕获效率越高，当振荡时间为2min以上时，捕获效率稳定。
图10中，振荡时间为0的点为对比例，该对比例所有步骤同实施例1，只是在磁分离前未振荡。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂，其特征在于，包括Fe3O4磁性核，Fe3O4磁性核的外部表面附着有单宁酸，所述单宁酸呈突刺状。
2.根据权利要求1所述的一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂，其特征在于，所述Fe3O4磁性核和单宁酸的质量比为2:1。
3.一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将六水合三氯化铁和无水醋酸钠在乙二醇中溶解，然后加入聚丙烯酸，磁力搅拌过程中充入氮气，获得反应溶液；反应溶液水热反应后获得黑色反应产物，使用无水乙醇清洗黑色反应产物，直至上清液清澈透明，将清洗后的反应产物真空干燥，获得Fe3O4磁性纳米材料；
步骤2，将Fe3O4磁性纳米材料在去离子水中超声分散，机械搅拌过程中加入草酸，获得过程产物，用去离子水洗涤过程产物，真空干燥过程产物，获得刻蚀后的Fe3O4磁性纳米材料；
步骤3，将刻蚀后的Fe3O4磁性纳米材料在去离子水中超声分散，获得过程溶液；将单宁酸溶解在去离子水中，获得单宁酸溶液；将单宁酸溶液与过程溶液混合后振荡反应，通过磁分离去除上清液，获得反应产物，将反应产物通过去离子水清洗后，获得Fe3O4@TA纳米捕获-分离剂，为革兰氏阳性菌捕获-分离剂。
4.根据权利要求3所述的一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法，其特征在于，步骤1中，六水合三氯化铁、无水醋酸钠和聚丙烯酸的质量比为2.72:7.2:0.25。
5.根据权利要求3所述的一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法，其特征在于，步骤1中，水热反应分为两个加热阶段，第一阶段的加热温度为110-130℃，加热时间为2h；第二阶段的加热温度为190-210℃，加热时间为10h；反应产物的真空干燥温度为60℃。
6.根据权利要求3所述的一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法，其特征在于，步骤2中，Fe3O4磁性纳米材料和去离子水的混合比例为1g:1mL；Fe3O4磁性纳米材料和草酸的质量比为1:1.26。
7.根据权利要求3所述的一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法，其特征在于，步骤2中，机械搅拌时间为20-25min。
8.根据权利要求3所述的一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法，其特征在于，步骤3中，Fe3O4磁性纳米材料和单宁酸的质量比为2:1。
9.根据权利要求3所述的一种纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的制备方法，其特征在于，步骤3中，振荡反应时间为2h，振荡反应温度为35-45℃。
10.一种权利要求1所述的纳米仿生增强的革兰氏阳性菌捕获-分离剂的应用，其特征在于，将捕获-分离剂分散在水中，获得捕获-分离剂溶液，其中捕获-分离剂的浓度为5-25mg/mL，将捕获-分离剂溶液和革兰氏阳性菌混合后，将混合物振荡完成捕获，振荡温度为4-45℃，振荡时间为0.5min-10min。
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