CN111944766B

CN111944766B - 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体t156及其应用

Info

Publication number: CN111944766B
Application number: CN202010712852.9A
Authority: CN
Inventors: 王小红; 丁一峰; 李亚萌; 黄晨曦; 王佳; 李俊杰; 张宇
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2040-07-22
Also published as: CN111944766A

Abstract

本发明公开了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156及其应用，该噬菌体为宽谱型且能够裂解沙门氏菌及其耐药菌株，经鉴定为有尾噬菌体目长尾噬菌体科，噬菌体T156在pH 3‑12，温度30‑50℃之间效价稳定。利用本发明提供的噬菌体可以有效控制食品样品中的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311，与抗生素和化学防腐剂相比较，具有特异性高、无残留和安全的特点。

Description

鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156及其应用

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156及其应用。

背景技术

食源性疾病是摄入由微生物、有毒化学物质或其他有害物质污染的食物而引起的疾病，近年来食源性疾病已经逐渐成为全球食品安全的首要问题，严重影响经济发展，并且危害公共健康。

沙门氏菌是全球范围内导致食源性疾病的最普遍的原因之一，位居食源性病原菌世界首位，在很多发达国家食品安全问题屡屡发生。沙门氏菌感染可分为4类：肠炎型、伤寒型、败血症型和局部化脓性感染，潜伏期为4-48h，人感染沙门氏菌后，前期会出现食欲不振、呕吐、腹泻、大便稀样等症状，严重时会导致菌血症和全身感染，乃至死亡。沙门氏菌血清型众多，迄今为止全世界已发现2600多种血清型。其中，临床中最常被分离的血清型为鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)。统计资料表明，美国每年有沙门氏菌感染者达120万例，其中有超过23000例住院治疗，由沙门氏菌造成的死亡人数达450例。

我国致力于改善和加强食品安全的监管，如针对终端产品的重点抽查，但对食源性疾病的基础设施和监管能力仍然有很大的上升空间，这些问题使得我们不得不寻找针对食源性致病菌更加安全高效且无污染的防控手段。最初人们使用抗生素治疗沙门氏菌引起的疾病感染，但随着抗生素的滥用、错用，导致沙门氏菌产生耐药和交叉耐药的现象。长期以来，抗生素预防疾病的治疗效果大大降低，危害到食品安全和人类健康。

噬菌体是一类细菌性病毒,其中裂解性噬菌体在感染宿主菌后能快速复制增殖，并最终破裂菌体细胞从而达到抗菌效果。与传统的抗生素相比，噬菌体治疗具有特异性强、自我复制增殖、安全无残留以及来源丰富等优势，因此被认为是一种理想的抗生素替代物。但噬菌体往往对不利的环境敏感，如酸性环境、加工条件、储存和配送过程中的温度变化。微囊化技术常用于活性物质包埋，是一种利用天然的、合成或半合成有机高分子材料，对分散的固体、液体或气体物质进行包裹，使其分散于载体基质中，形成微小粒子的过程。将噬菌体微囊化可以本阻止外界环境对噬菌体的影响，目前国内外已经出现一些微囊化的噬菌体产品，在食品领域中微胶囊技术主要应用于饮料生产、焙烤制品、肉制品以及乳制品等多个领域，而对于将微囊化噬菌体应用于食品中的研究较少。

发明内容

本发明第一目的是在于提供了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156，该噬菌体为宽谱型沙门氏菌噬菌体。它不仅可以裂解鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、ST-8、ATCC 13311、30、SJTUF 13336、SITUF 13350、SJTU 13277、STTUF 13337、SJTUF 13306、UK 1、114、172、206；肠炎沙门氏菌ATCC 13076、SJTUF 10978、SJTUF 10984、38、39、42、10960、11561、211、CMCC50093、4917、4693；都柏林沙门氏菌3710，3723；乙型副伤寒沙门氏菌CMCC 50094；印第安纳沙门氏菌13500、13520；阿哥拉沙门氏17、19、21；鸡白痢沙门氏菌CVCC 534、C79-3；猪霍乱沙门氏菌ATCC 10708，而且对大肠杆菌T10和李斯特菌ATCC 19115均有裂解效果。根据全基因测序结果可知，噬菌体T156基因组中无毒力因子和抗生素抗性基因。因此，该结果从遗传背景上证实了噬菌体T156应用于食品中病原菌及噬菌体治疗的安全性。

本发明的第二个目的是在于上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156在制备预防沙门氏菌的杀菌剂中的应用，以及微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156在食品抑制中的应用。鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156能够有效控制牛奶和生菜中的鼠伤寒沙门氏菌，与抗生素和化学防腐剂相比较，具有特异性高、无残留和安全的特点。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术措施：

本发明提供了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156，所述噬菌体鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156具有广谱性、能够裂解沙门氏菌耐药菌株，其命名为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156Salmonella typhimurium bacteriophage T156，于2020年7月6日将该噬菌体T156保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2020288。

上述噬菌体T156在pH 3-12，温度30-50℃之间效价稳定；噬菌体T156可裂解的菌株包括鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、ST-8、ATCC 13311、30、SJTUF 13336、SITUF 13350、SJTU 13277、STTUF 13337、SJTUF 13306、UK 1、114、172、206；肠炎沙门氏菌ATCC 13076、SJTUF 10978、SJTUF 10984、38、39、42、10960、11561、211、CMCC 50093、4917、4693；都柏林沙门氏菌3710、3723；乙型副伤寒沙门氏菌CMCC 50094；印第安纳沙门氏菌13500、13520；阿哥拉沙门氏17、19、21；猪霍乱沙门氏菌ATCC 10708，而且对大肠杆菌T10和李斯特菌ATCC19115均有裂解效果。

本发明还提供了一种上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156在制备预防沙门氏菌的杀菌剂中的应用。所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311。

本发明还提供了一种上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156微囊化的方法，包括以下步骤：

1)将新鲜宿主菌ATCC 13311和鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156混合，恒温培养，得到悬浊裂解液，离心收集过滤，得到鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156悬液；

2)将Tris-HCI溶液加入灭菌的海藻酸钠中，然后加入鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156悬液，搅拌；得到噬菌体T156-海藻酸钠的混合液；

3)向噬菌体T156-海藻酸钠的混合液中逐滴滴入20mL、质量分数为2.5％的CaCI₂溶液中形成海藻酸钙微囊，边滴加边摇晃，静置硬化；

4)过滤收集微囊，用去离子水洗涤，再投入壳聚糖溶液中成膜反应，再次过滤微囊并用去离子水洗涤，除去未反应的壳聚糖；得到微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156。

作为优选方案，所述方法的具体方法如下：

1)取1mL新鲜宿主菌ATCC 13311，100μL效价约为10⁹PFU/mL噬菌体T156，按最佳MOI＝0.1进行混合，置于37℃恒温培养箱孵育15-20min，将此细菌-噬菌体混合液转移至25mL含10mM MgSO₄的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养18h，得到悬浊裂解液，于4℃、8000r/min离心10min，收集上清液；上清液再经0.22μm一次性过滤装置过滤除菌，得到噬菌体T156悬液；

2)称取0.22g海藻酸钠置于生物安全柜中，紫外杀毒30min；再将1moL/L Tris-HCI稀释为50mmoL/L，并用0.22μm一次性过滤装置过滤除菌，吸取10mL倒入紫外照射后的海藻酸钠，加入搅拌子在磁力搅拌器上，30℃、300r/min搅拌混匀，然后加入噬菌体T156悬液，30℃、250r/min继续搅拌；

3)再将上述噬菌体T156-海藻酸钠的混合液，用1mL无菌注射器逐滴滴入20mL、质量分数为2.5％CaCI₂溶液中形成海藻酸钙凝胶，边滴加边摇晃，且控制滴加的力度和速度，使微囊形态一致，20±2℃静置硬化30min；

4)过滤收集微囊，用去离子水洗涤，再投入质量分数为0.4％壳聚糖溶液中成膜反应30min；再次过滤微囊并用去离子水洗涤，除去未反应的壳聚糖；得到微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156。

本发明还提供了一种上述得到的微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156在食品抑菌中的应用。

作为优选方案，所述应用的方法：向食品中添加微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156培养液，其中，微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的添加量为10³～10⁴PFU/mL。

作为优选方案，所述食品为牛奶或生菜。

上述微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156在牛奶样品中抑菌效果的实验，其步骤是：

(1)牛奶样品的准备：称取脱脂奶粉10g溶于100mL蒸馏水中，用玻璃棒搅拌至完全溶解，115℃高温高压灭菌15min，放于4℃冰箱备用；

(2)微囊化噬菌体T156的制备：取1mL新鲜宿主菌ATCC13311，100μL效价约为10⁹PFU/mL噬菌体T156，按最佳MOI＝0.1进行混合，置于37℃恒温培养箱孵育15-20min，将此细菌-噬菌体混合液转移至25mL含10mM MgSO₄的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养18h，得到悬浊裂解液，于4℃、8000r/min离心10min，收集上清液；上清液再经0.22μm一次性过滤装置过滤除菌，得到噬菌体悬液；

(3)称取0.22g海藻酸钠置于生物安全柜中，紫外杀毒30min。将1moL/L Tris-HCI稀释为50mmoL/L，并用0.22μm一次性过滤装置过滤除菌，吸取10mL倒入紫外照射后的海藻酸钠，加入搅拌子在磁力搅拌器上，30℃、300r/min搅拌混匀，然后加入噬菌体T156悬液，30℃、250r/min继续搅拌；

(4)将上述噬菌体-海藻酸钠的混合液，用1mL无菌注射器逐滴滴入20mL、质量分数为2.5％CaCI₂溶液中形成海藻酸钙微囊，边滴加边摇晃，且控制滴加的力度和速度，尽量使微囊形态一致，(20±2)℃静置硬化30min；

(5)过滤收集微囊，用一定体积去离子水洗涤，再投入0.4％壳聚糖溶液中成膜反应30min，再次过滤微囊并用去离子水洗涤，除去未反应的壳聚糖；

(6)称取200mg制好的微囊溶于900μL微球破解液中，60min后吸取100μL进行梯度稀释，备用；

(7)将鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311培养至对数生长期，用LB液体培养基以10倍比梯度稀释菌液，使稀释后的菌量在10³CFU/mL～10⁴CFU/mL左右。试验组中加入800μL牛奶、100μL宿主菌液，再按照MOI＝1000和MOI＝10000加入破解后的噬菌体T156，对照组中加入800μL牛奶、100μL宿主菌液，100μLPBS缓冲液。将试验样品分别置于4℃和25℃条件下进行培养，于0h、1h、3h、6h、9h、12h取出，吸取100μL试验样品，用PBS以10倍比梯度稀释，采用平板计数法，将原液和稀释液分别在已备好的LB琼脂平板上涂布，自然晾干后，放于37℃培养箱倒置培养过夜，从菌落数量可得出噬菌体的杀菌效果。实验重复2次，每次设2个平行。

上述微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156在生菜样品中抑菌效果的实验，其步骤是：

(1)生菜样品的准备：新鲜生菜购买于生鲜菜市场，用蒸馏水冲洗干净生菜的污渍，使用无菌钻孔器在生菜鲜嫩部位，钻取特定尺寸(面积1cm²)大小并置于乙醇消毒液中浸泡1min，取出后用无菌水冲洗干净置于无菌培养皿，这种预处理的目的是减少自然污染产生表面的细菌数量，这些细菌的存在可能会使我们的结果的解释变得复杂；最后，放入生物安全柜紫外照射生菜样品正反面各半小时，备用；

(2)微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的制备：取1mL新鲜宿主菌ATCC 13311，100μL效价约为10⁹PFU/mL鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156混合，置于37℃恒温培养箱孵育15-20min，将此细菌-噬菌体混合液转移至25mL含10mM MgSO₄的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养18h，得到悬浊裂解液，于4℃、8000r/min离心10min，收集上清液；上清液再经0.22μm一次性过滤装置过滤除菌，得到噬菌体悬液；

(3)称取0.22g海藻酸钠置于生物安全柜中，紫外杀毒30min。将1moL/L Tris-HCI稀释为50mmoL/L，并用0.22μm一次性过滤装置过滤除菌，吸取10mL倒入紫外照射后的海藻酸钠，加入搅拌子在磁力搅拌器上，30℃、300r/min搅拌混匀，然后加入鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156悬液，30℃、250r/min继续搅拌；

(5)过滤收集微囊，用一定体积去离子水洗涤，再投入0.4％壳聚糖溶液中成膜反应30min。再次过滤微囊并用去离子水洗涤，除去未反应的壳聚糖；

(6)称取200mg制好的微囊溶于900μL微球破解液中，60min后吸取100μL进行梯度稀释，备用。

(7)在生菜片上接种100μL鼠伤寒沙门氏菌13311(最终菌量为10³CFU/mL～10⁴CFU/mL左右)，将样品置于安全柜中干燥15～20min，试验组中按照MOI＝1000和MOI＝10000加入100μL破解后的噬菌体T156，尽量覆盖住滴加宿主菌的位置，对照组中加入100μLPBS缓冲液，将试验样品分别置于4℃和25℃条件下进行培养，于0h、1h、3h、6h、9h、12h取出，每次取一片不同条件下的生菜样品，置于1.5mL的无菌EP管中，将样品在无菌环境中用研磨棒充分研磨，加入900μLPBS缓冲液，涡旋30s后用PBS缓冲液以10倍比梯度稀释。采用平板计数法，将原液和稀释液分别在已备好的LB琼脂平板上涂布，自然晾干后，放于37℃培养箱倒置培养过夜，从菌落数量可得出噬菌体的杀菌效果。实验重复2次，每次设2个平行。

本发明的有益效果：

1.鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156(简称噬菌体T156)为广谱型噬菌体，对35株沙门氏菌具有较强的杀菌效果，克服了噬菌体具有种型特异性的缺点，其灭菌应用范围更大。

2.噬菌体T156具有良好的温度耐受性和pH耐受性，在实际生产中用时具有较宽的适用范围。

3.噬菌体T156对21株耐药性沙门氏菌具有很好的裂解效果，随着抗生素的滥用导致超级细菌的出现，其可作为一种杀菌/抑菌的生物制剂来控制耐药性食源性病原菌对食品的污染。

4.经固体富集后的噬菌体原液效价高，在本发明中，噬菌体T156的效价≧10¹⁰PFU/mL。

5.噬菌体T156作为抑菌物质应用在食品中，既不会影响食品的质量和风味，又能快速高效地防控由沙门氏菌引起的食品污染。

6.将噬菌体T156微囊化后作为抑菌物质用于牛奶和生菜的抑菌。可以有效由沙门氏菌造成的食品污染。

附图说明

图1为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的双层平板噬菌斑图；

图2为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的电镜观察图；

图3为鼠伤寒沙门氏菌体T156的BLAST颜色比例尺；

图4为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的结构蛋白的分析的SDS-PAGE图谱；

图中，1：噬菌体T156结构蛋白；2：中分子量蛋白标准；

图5为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的核酸的提取及鉴定的电泳图；

图中，M：15000bp DNA marker；1：噬菌体T156基因组经Hind III酶切；2：噬菌体D1-2基因组经EcoRⅤ酶切；3：噬菌体T156基因组；

图6为沙门氏菌噬菌体T156的进化树图；

图7为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的吸附速率结果图；

图8为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的一步生长曲线图；

图9为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的热稳定性结果图；

图10为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的pH稳定性结果图；

图11为微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的光学显微镜图；

图12为微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156在低温4℃及室温25℃对牛奶中鼠伤寒沙门氏菌13311的控制效果图；

图中，*显著；**极其显著，P-value＜0.05；

图13为微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156在低温4℃及室温25℃对生菜中鼠伤寒沙门氏菌13311的控制效果图；

图中，*显著；**极其显著，P-value＜0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1

鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156(以下简称：噬菌体T156)的分离筛选方法，其步骤是：

(1)样品采集

污水样品分别来自湖北省武汉市某小区地下污水通道。

(2)沙门氏菌噬菌体的筛选

a.将采集的污水用滤纸进行粗过滤，除去大的杂质颗粒。过滤后的滤液置于50mL的离心管中，4℃、11000r/min离心15min，收集上清液并用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤，过滤液即为所需样品，置于4℃备用；

b.将沙门氏菌菌株ATCC 13311接种到TSB培养基，37℃振荡培养至对数生长期，取2.5mL对数期菌液、5mL过滤液与10mLTSB液体培养基混匀，置于37℃恒温摇床振荡培养16h，扩增污水样品中的特异性噬菌体。将混合培养物于4℃、11000r/min离心15min。收集上清液并用直径为0.22μm的微孔滤膜过滤，将滤液按照上述步骤再富集一次，以便更易检测到噬菌体，从而得到噬菌体原液；

c.采用点样法步验证：有明显空斑样品进一步采用双层平板法，经梯度稀释，观察噬菌斑形态。

(3)噬菌体的扩增培养和纯化

采用固体增殖法：在双层平板上观察噬菌斑的大小形态，挑选噬菌斑形态一致，大小均匀的单个噬菌斑，加到含有100μL宿主菌的2×YT培养基，37℃、180r/min振荡培养16h左右，经4℃、11000r/min离心15min，弃沉淀，上清液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌得到纯化一次的噬菌体悬液。用SM缓冲液将噬菌体悬液以10倍比梯度稀释，重复以上步骤，连续纯化6次以上，待平板上出现大小形态透明度一致的噬菌斑即可。并利用双层平板法测定所分离噬菌体的效价。

(4)菌株鉴定

经纯化后鼠伤寒沙门氏菌噬菌体命名为：鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156Salmonella typhimurium bacteriophage T156，其形态特征为：头部长度57.4±1.0nm，具有长度为151.6±3.0nm的细长尾巴，属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科。

(5)噬菌体的保藏

短期保存可将过滤得到的噬菌体悬液存放于4℃冰箱中；若长期保存将过滤得到的噬菌体悬液，加入灭菌甘油(终浓度为20％)，存放于-80℃冰箱。

于2020年7月6日将该鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020288。

该噬菌体T156属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科，头部呈二十面体，噬菌斑透亮清晰且无浑浊的晕环，裂解斑特征明显，纯化的噬菌体颗粒4℃保藏于TSB培养基中效价稳定。其温度和pH耐受性均较高，能有效裂解沙门氏菌和耐药性沙门氏菌，并且在食品中的抑菌应用实验中也表明，其可作为一种生物制剂有效抑制裂解沙门氏菌。

实施例2：噬菌体T156宿主谱的测定

选择鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、ST-8、ATCC 13311、30、36、SJTUF 13336、SITUF13350、SJTU 13277、STTUF 13337、SJTUF 13306、10855、UK 1、114、172、206；肠炎沙门氏菌ATCC 13076、SJTUF 10978、SJTUF 10984、38、39、42、10960、11561、201、211、CMCC 50093、4917、4693；鸡白痢沙门氏菌CVCC 534、C79-3；都柏林沙门氏菌3710，3723；乙型副伤寒沙门氏菌CMCC 50094；印第安纳沙门氏菌13500、13520；阿哥拉沙门氏17、19、21；猪霍乱沙门氏菌ATCC 10708；鸭沙门氏菌CMCC 9270；大肠杆菌DH 5α、BL 21、T 10；金黄色葡萄球菌ATCC29213、6538；李斯特菌ATCC 19115共46株菌做宿主谱分析。

分别培养上述菌株(40株沙门氏菌和6株其他菌株)至对数期，待上层琼脂(0.7％TSA)温度降至45℃时，取3.8mL上层琼脂与100μL对数期上述菌液混匀，倒入15mL下层琼脂培养基(TSA)上。静置晾干约10min，待上层培养基凝固后，滴加5μL T156噬菌体液(T156噬菌体液的制备方法：取鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311菌落接种于含有5mLTSB液体培养基的细菌瓶中，37℃培养8h，取100μL上述菌液于10mL新鲜TSB液体培养基中，再加入100μL于4℃保存的噬菌体T156，混匀后37℃振荡培养箱中培养12-18h使噬菌体增殖；将增殖液于离心管中，11000×g离心10min去除细菌碎片，上清液用0.22μm滤膜过滤得噬菌体原液，效价约为10⁹PFU/mL)，隔夜观察。

结果如表1所示，噬菌体T156具有较广的宿主范围，能够裂解鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、ST-8、ATCC 13311、30、SJTUF 13336、SITUF 13350、SJTU 13277、STTUF 13337、SJTUF13306、UK 1、114、172、206；肠炎沙门氏菌ATCC 13076、SJTUF 10978、SJTUF 10984、38、39、42、10960、11561、211、CMCC 50093、4917、4693；都柏林沙门氏菌3710，3723；乙型副伤寒沙门氏菌CMCC 50094；印第安纳沙门氏菌13500、13520；阿哥拉沙门氏17、19、21；猪霍乱沙门氏菌ATCC10708，而且对大肠杆菌T10和李斯特菌ATCC 19115均有裂解效果。

由噬菌体的宿主谱实验可以看出，该噬菌体为广谱性噬菌体，不仅扩宽了宿主谱，且克服了噬菌体特异性的缺点，使其灭菌应用范围更大，可用于治疗多细菌的混合感染。

表1噬菌体T156的宿主谱

注：“+”表示噬菌体T156对宿主菌的裂解程度，“+”越多，表示裂解程度越高。

实施例3噬菌体T156的电镜观察

将纯化浓缩的噬菌体悬液，设置4℃、40000r/min超速离心1h，离心结束后噬菌体会沉淀在离心管底部，再用0.1mol/L乙酸铵进行重悬，吸取20μL重悬液于封口膜上，轻取铜网置于噬菌体重悬液中，浸泡10min之后用滤纸吸去多余液体，再将铜网置于体积分数2％、pH＝7的磷钨酸染料中染色10min后，用滤纸从铜网边缘缓慢吸去多余液体，自然晾干至完全干燥，制备好的铜网在透射电子显微镜下观察噬菌体形态，并用软件DigitalMicrograph Demo 3.9.1测量其大小，拍照记录。

结果如图2所示，噬菌体T156头部长度57.4±1.0nm，具有长度为151.6±3.0nm的细长尾巴，属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科。

实施例4：噬菌体T156基因组的提取与全基因组denovo测序

采用ZnCl₂沉淀法提取噬菌体T156基因组，具体步骤如下：

(1)将活化后的噬菌体悬液进行超速离心，40000r/min，4℃下离心1h。取1mL乙酸铵溶液诱导得到的噬菌体T156悬液，加入20μL脱氧核糖核酸酶DNaseⅠ(1mg/mL)，20μL核糖核酸酶RNaseA(10mg/mL)，用小型涡旋仪涡旋2min，37℃温育40min；

(2)为提出噬菌体粒子沉淀，加入20μL 2M ZnCl₂，37℃温育7min；

(3)离心：10000r/min，1min，弃上清，下层即为噬菌体粒子沉淀。加入500μL TESbuffer，吹吸至澄清透明状态，无白色颗粒物，于65℃水浴15min；

(4)加入10μL蛋白酶k(20mg/mL)，用枪头轻轻吹吸，上下颠倒，50℃温育1h，每隔10min上下颠倒一下；

(5)温育后冷却，加入60μL提前放4℃冰箱预冷的3M CH3COOK(用醋酸调pH至5.2)，冰浴15min；

(6)于4℃、12000r/min离心10min，加入等量的苯酚/氯仿/异丙醇(25:24:1)，上下轻柔反复颠倒200次，进行萃取，上层水相下层有机相；

(7)于常温12000r/min离心10min，取上层液体(宁少勿多)转移至新的离心管中，加入1倍体积的异丙醇，上下颠倒后，有絮状物产生即为DNA，-20℃放置过夜；

(8)于4℃、12000r/min离心10min，弃上清，加入1mL 70％乙醇，充分并轻柔地吹吸，迎光看去有片状物存在即为DNA，吹吸让片状物浮起来即可。在4℃、12000r/min离心10min，弃上清，再离心1min，用白枪头小心吸取剩余乙醇，放在37℃培养箱风干至少40min；

(9)加20μL TE缓冲液在常温下溶解DNA，获得基因组DNA样品，-20℃保存备用。测序工作交于测序公司完成；

(10)由噬菌体T156的全基因测序结果可知，噬菌体T156基因组为双链DNA，全长为123849bp；

在NCBI中通过BLAST进行全数据库比对，如图3所示：发现与大肠杆菌噬菌体EPS7序列相似度最高，序列覆盖度为92％，一致度为97.55％，判断属于同一种。利用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度。

实施例5噬菌体T156的结构蛋白分析

(1)噬菌体颗粒固体增殖

a.活化鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311，用无菌白枪头挑取单菌落，加到5mL LB液体培养基中，置于37℃培养箱振荡培养6-8h；

b.将LB固体培养基灭菌并倒平板(现制现用)，用LB液体培养基连续十倍梯度稀释，将噬菌体原液稀释到10^-3或10^-4(噬菌斑长满整个平板)，吸取100μL宿主菌、100μL已稀释噬菌体，3.8mL加热至完全融化并保温至45℃左右的半固体培养基，混匀后倾倒于LA平板上制成双层平板，每株噬菌体倒三个板子，自然晾干后，立即将其倒置于37℃恒温培养箱中培养5h；

c.将已长满噬菌斑的板子，用灭菌的棉签轻轻将其上层培养基刮到50mL离心管中，加20mL LB液体培养基、100μL对数生长期的宿主菌，放于37℃恒温培养箱振荡培养3.5h。经4℃、10000r/min离心10min，弃沉淀，取上清液并用0.22μm孔径的无菌滤膜过滤除菌，滤液放置4℃备用。

(2)噬菌体结构蛋白的SDS-PAGE电泳：

a.安装好制胶玻璃板，检查是否漏水。

b.在干净的小烧杯中制备12％分离胶，配方如下

混匀，加入玻璃板中，并加入异丙醇压平液面，静置30min以上待其凝固后弃掉异丙醇。

c.在干净的小烧杯中制备5％浓缩胶，配方如下

混匀，加入到分离胶上层，插入梳子，静置20min以上待其凝固；

d.蛋白样品准备：先将噬菌体固体增殖提高其效价，将增殖浓缩后的噬菌体经4℃、40000r/min超速离心1h，吸取新鲜配制的1倍上样缓冲液，将超速离心后沉淀下来的噬菌体颗粒进行重悬，并沸水浴5min，冷却至室温；

e.上样：在电泳槽中将凝胶板安装到位，缓慢加入电泳缓冲液，将梳子轻轻拔出，用移液器点5μL中分子量蛋白marker，15μL蛋白样品；

f.电泳：接通电源，电压设定80V，待样品电泳至分离胶界面时，调电压至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂达凝胶下缘，停止电泳；

g.染色：小心取出凝胶夹板，用润湿的切胶刀取下凝胶，将凝胶置入盛有考马斯亮蓝染色液的玻璃平皿中，于圆周震荡摇床上室温染色3h左右；

h.脱色：弃掉染色液，加入脱色液至浸没凝胶，脱色液每隔半小时进行更换，直至凝胶背景变成白色，用凝胶扫描仪摄取图像。

结果如图4所示：在中分子蛋白质标准范围内，其中显现出明显的至少8条蛋白条带，含量最大的条带经Quantity One软件分析分子量大小约为33kDa，说明33kDa左右所对应的蛋白在噬菌体T156颗粒中所占的拷贝数最大，为最主要的结构蛋白即最可能为噬菌体T156的衣壳蛋白，但最终确定每一个结构蛋白还需经过质谱鉴定或经过完整的基因组注释。

实验例6噬菌体T156最佳感染复数的测定

感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)是指初始感染时噬菌体的数量与宿主菌数量的比值，也称感染倍数。最佳感染复数的测定可以得到噬菌体的最大收获量。活化宿主菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311，按感染复数为0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000，吸取菌液和噬菌体悬液各500μL混合均匀，放于37℃培养箱振荡培养3.5h。经4℃、8000r/min离心10min，收集上清液，用PBS缓冲液连续十倍梯度稀释，采用双层平板法测不同MOI值样品中噬菌体的效价。效价最高的感染复数即该噬菌体的最佳感染复数(MOI)。

结果如表2，噬菌体T156在感染复数为0.1时，噬菌体效价达到最高，即噬菌体T156的最佳感染复数为0.1，表明在噬菌体效价与宿主菌菌量以0.1感染时，可增殖更多的噬菌体。为实现最大的收益，后续的实验均用最佳MOI扩增噬菌体。

表2噬菌体T156的最佳MOI的测定

实验例7噬菌体T156吸附速率的测定

按最适MOI将新鲜噬菌体悬液与其宿主菌液各5mL混合于无菌离心管中，37℃、180r/min振荡培养，从0min开始，每隔数分钟吸取300μL混合液，立即冰浴30s，在4℃、8000r/min离心30s，用PBS缓冲液将上清液中未吸附的噬菌体以10倍比梯度稀释，采用双层平板法测定其效价。试验重复3次，每次设2个平行。

吸附速率(％)＝(初始噬菌体效价-噬菌体效价)/初始噬菌体效价；

结果如图7所示：噬菌体T156的最佳吸附速率为92.57％，达到最佳吸附速率的时间为25min，此时噬菌体大量吸附于宿主菌上。

实验例8噬菌体T156一步生长曲线的测定

(1)按最适MOI将新鲜噬菌体悬液与其宿主菌液各500μL混合于无菌离心管中，37℃温育数分钟(最佳吸附速率的时间)左右，便于噬菌体吸附到细菌上，4℃、8000r/min离心2min，弃上清，将沉淀用1mL TSB培养基重悬，重复2次，以除去游离的噬菌体；

(2)上述1mL重悬液加入到9mL TSB液体培养基中，每隔10min吸取300μL混合液，4℃、8000r/min离心2min，用PBS缓冲液将上清液中未吸附的噬菌体以10倍比梯度稀释，采用双层平板法测定其效价，并测定初始时菌量。试验重复3次，每次设2个平行；

利用软件GraphPad Prism 6作图得到一步生长曲线图，根据生长曲线确定噬菌体的潜伏期、暴发期和裂解量；

裂解量＝暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度；

结果如图8所示：噬菌体T156潜伏期10min、裂解期70min、裂解量56.94PFU/cell。

实验例9噬菌体T156温度稳定性的测定

用PBS缓冲液将噬菌体原液稀释至10⁶PFU/mL，分装1mL于无菌离心管中，置于恒温水浴锅中，分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃保温，于0min、30min和60min取样100μL，立即冰浴30s，然后采用双层平板法测定噬菌体的效价。每个温度设3个重复，每次设2个平行。

结果如图9所示：噬菌体T156在30-50℃时，活性基本保持不变，当温度达到60℃时，噬菌体活性降低，70℃时已完全失活。

实验例10噬菌体T156 pH稳定性的测定

用HCl和NaOH调节TSB培养基的pH值，吸取100μL已知效价的噬菌体悬液(10⁷PFU/mL)分别加入到900μL不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)TSB培养基，放于37℃恒温水浴锅中2h。待作用时间结束，根据预实验结果将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。

结果如图10，噬菌体T156在pH＝3-12能保持较高活性，当所处环境出于碱性状态时，T156活性逐渐降低，在pH＝13时完全失活。

实验例11微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的制备

(1)取1mL新鲜宿主菌ATCC 13311，100μL效价约为10⁹PFU/mL噬菌体T156，按照最佳MOI＝0.1进行混合，置于37℃恒温培养箱孵育15-20min，将此细菌-噬菌体混合液转移至25mL含10mM MgSO₄的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养18h，得到悬浊裂解液，于4℃、8000r/min离心10min，收集上清液；上清液再经0.22μm一次性过滤装置过滤除菌，得到噬菌体T156悬液；

(2)称取0.22g海藻酸钠置于生物安全柜中，紫外杀毒30min。将1moL/L Tris-HCI稀释为50mmoL/L，并用0.22μm一次性过滤装置过滤除菌，吸取10mL倒入紫外照射后的海藻酸钠，加入搅拌子在磁力搅拌器上，30℃、300r/min搅拌混匀，然后加入噬菌体T156悬液，30℃、250r/min继续搅拌，得到噬菌体T156-海藻酸钠的混合液；

(3)将上述噬菌体T156-海藻酸钠的混合液，用1mL无菌注射器逐滴滴入20mL、质量分数为2.5％CaCI₂溶液中形成海藻酸钙微囊，边滴加边摇晃，且控制滴加的力度和速度，尽量使微囊形态一致，(20±2)℃静置硬化30min；

(4)过滤收集微囊，用去离子水洗涤，再投入0.4％壳聚糖溶液中成膜反应30min；再次过滤微囊并用去离子水洗涤，除去未反应的壳聚糖；得到微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156(以下简称微囊化噬菌体T156)。

结果如图11所示，微囊成型速度快、表面光滑，包埋效果较好，粒径平均大小在500μm，粒径范围为450μm-600μm之间。

实施例12在4℃和常温25℃条件下，微囊化噬菌体T156对牛奶中的沙门氏菌的抑菌实验

(1)称取脱脂奶粉10g溶于100mL蒸馏水中，用玻璃棒搅拌至完全溶解，115℃高温高压灭菌15min，放于4℃冰箱备用。称取200mg微球溶于900μL微球破解液(柠檬酸钠14.7g，碳酸氢钠16.8g，溶于1L的SM缓冲液中，0.22μm滤膜过滤除菌，常温保存备用)中，60min后吸取100μL进行梯度稀释，备用。

(2)将鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311培养至对数生长期，用LB液体培养基以10倍比梯度稀释菌液，使稀释后的菌量在10³～10⁴CFU/mL左右。试验组中加入800μL牛奶、100μL的宿主菌液，再分别按照MOI＝1000和MOI＝10000加入100μL破解后的噬菌体T156，对照组中加入800μL牛奶、100μL的宿主菌液，100μLPBS缓冲液。将试验样品分别置于4℃和25℃条件下进行培养，于0h、1h、3h、6h、9h、12h取出，吸取100μL试验样品，用PBS以10倍比梯度稀释，采用平板计数法，将原液和稀释液分别在已备好的LB琼脂平板上涂布，自然晾干后，放于37℃培养箱倒置培养过夜，从菌落数量可得出噬菌体的杀菌效果。实验重复2次，每次设2个平行。

数据统计与分析：运用Graphpad prism软件进行绘图和分析，实验数据采用ANOVA进行邓肯氏差异分析方法分析(取P-value<0.05)。

噬菌体的杀菌效率＝(对照组鼠伤寒沙门氏菌数量-实验组鼠伤寒沙门氏菌数量)÷对照组鼠伤寒沙门氏菌数量×100％；

结果如图12所示：4℃下，微囊化噬菌体T156在MOI＝10000作用12h时对牛奶中的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311的杀菌效率最高，达到21.80％。而MOI＝1000时作用12h时的杀菌效率最高，达到15.93％。25℃下，微囊化噬菌体T156在MOI＝10000作用12h时对牛奶中的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311的杀菌效率最高，高达57.93％。而MOI＝1000时作用12h时的杀菌效率最高，达到50.86％。

实施例13在4℃和常温25℃条件下，微囊化噬菌体T156对生菜中的沙门氏菌的抑菌实验

(1)新鲜生菜购买于生鲜菜市场，用蒸馏水冲洗干净生菜的污渍，使用无菌钻孔器在生菜鲜嫩部位，钻取特定尺寸(面积1cm²)大小并置于乙醇消毒液中浸泡1min，取出后用无菌水冲洗干净置于无菌培养皿，放入生物安全柜紫外照射生菜样品正反面各半小时，备用。

(2)在生菜片上接种100μL鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311(最终菌量为10³～10⁴CFU/mL左右)，将样品置于安全柜中干燥15～20min。试验组中按照MOI＝1000和MOI＝10000加入100μL破解后的噬菌体T156，尽量覆盖住滴加宿主菌的位置，对照组中加入100μLPBS缓冲液，将试验样品分别置于4℃和25℃条件下进行培养，于0h、1h、3h、6h、9h、12h取出，每次取一片不同条件下的生菜样品，置于1.5mL的无菌EP管中，将样品在无菌环境中用研磨棒充分研磨，加入900μLPBS缓冲液，涡旋30s后用PBS缓冲液以10倍比梯度稀释。采用平板计数法，将原液和稀释液分别在已备好的LB琼脂平板上涂布，自然晾干后，放于37℃培养箱倒置培养过夜，从菌落数量可得出噬菌体的杀菌效果。实验重复2次，每次设2个平行。数据统计与分析：运用Graphpad prism软件进行绘图和分析，实验数据采用ANOVA进行邓肯氏差异分析方法分析(取P-value<0.05)。

结果如图13所示，4℃下，微囊化噬菌体T156在MOI＝10000作用12h时对生菜中的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311的杀菌效率最高，达到26.60％。而MOI＝1000时作用12h时的杀菌效率最高，达到37.19％。25℃下，微囊化噬菌体T156在MOI＝10000作用12h时对生菜中的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311的杀菌效率最高，高达52.06％。而MOI＝1000时作用12h时的杀菌效率最高，达到63.65％。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156，其特征在于：所述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156具有广谱性、能够裂解沙门氏菌耐药菌株，其命名为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体（Salmonella typhimurium bacteriophage）T156，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2020288。

2.一种权利要求1所述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156在制备预防沙门氏菌的杀菌剂中的应用，其特征在于：所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 13311。

3.一种权利要求1所述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156微囊化的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将新鲜宿主菌ATCC 13311和鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156混合，恒温培养，得到悬浊裂解液，离心收集过滤，得到鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156悬液；

2）将Tris-HCI溶液加入灭菌的海藻酸钠中，然后加入鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156悬液，搅拌；得到噬菌体T156-海藻酸钠的混合液；

3）向噬菌体T156-海藻酸钠的混合液中逐滴滴入20 mL、质量分数为2.5% 的CaCI₂溶液中形成海藻酸钙微囊，边滴加边摇晃，静置硬化；

4）过滤收集微囊，用去离子水洗涤，再投入壳聚糖溶液中成膜反应，再次过滤微囊并用去离子水洗涤，除去未反应的壳聚糖；得到微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156。

4.根据权利要求3所述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156微囊化的方法，其特征在于：所述方法的具体方法如下：

1）取1 mL新鲜宿主菌ATCC 13311，100 µL效价为10⁹PFU/mL噬菌体T156混合，置于37℃恒温培养箱孵育15-20 min，将此细菌-噬菌体混合液转移至25 mL含10 mM MgSO₄的LB液体培养基中，37℃，180 r/min振荡培养18 h，得到悬浊裂解液，于4℃、8000 r/min离心10min，收集上清液；上清液再经0.22 µm一次性过滤装置过滤除菌，得到噬菌体T156悬液；

2）称取0.22 g海藻酸钠置于生物安全柜中，紫外杀毒30 min；再将1 moL/L Tris-HCI稀释为50 mmoL/L，并用0.22 µm一次性过滤装置过滤除菌，吸取10 mL倒入紫外照射后的海藻酸钠，加入搅拌子在磁力搅拌器上，30℃、300 r/min搅拌混匀，然后加入噬菌体T156悬液，30℃、250 r/min继续搅拌；

3）再将上述噬菌体T156-海藻酸钠的混合液，用1 mL无菌注射器逐滴滴入20 mL、质量分数为2.5% CaCI₂溶液中形成海藻酸钙凝胶，边滴加边摇晃，且控制滴加的力度和速度，尽量使微囊形态一致，20±2℃静置硬化30 min；

4）过滤收集微囊，用去离子水洗涤，再投入质量分数为0.4% 壳聚糖溶液中成膜反应30min；再次过滤微囊并用去离子水洗涤，除去未反应的壳聚糖；得到微囊化鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156。