CN113637645B - 噬菌体VB_VpP_BT-1011、筛选方法和应用 - Google Patents

噬菌体VB_VpP_BT-1011、筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种噬菌体VB_VpP_BT‑1011及其筛选方法，噬菌体VB_VpP_BT‑1011保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年06月08日，保藏编号为CGMCCNo.22379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该噬菌体对耐药副溶血弧菌具有很好的防治效果。

Description

噬菌体VB_VpP_BT-1011、筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体的说是涉及一种噬菌体VB_VpP_BT-1011及其筛选方法和应用。
背景技术
噬菌体是一类感染细菌的病毒，它常分离于污水或海水等自然环境样本中，并且它具有严格的宿主特异性，只侵袭一种或几种细菌，所以噬菌体对人类或动植物没有感染性，也不会污染环境，安全性较高。噬菌体可以分为温和噬菌体与烈性噬菌体两大类，其中烈性噬菌体可以在短时间内造成敏感细菌裂解。在杀菌效果方面，烈性噬菌体能裂解细菌并具有指数增殖特征，能作为一种具有抗菌作用的生物消毒剂。由于噬菌体能够在各种环境中识别和感染宿主细菌细胞，与此同时具有很高的特异性并且只在活菌中增殖。
副溶血弧菌存在广泛，开放性伤口与该环境中的副溶血弧菌接触可能导致伤口感染和危及生命的败血病，同时该菌也常见于鱼，虾和贝类等海鲜产品中，摄入被副溶血弧菌污染的海鲜食物会导致胃肠道疾病，包括水样腹泻，腹部绞痛，恶心，呕吐，发烧，头痛或血性腹泻等症状；临床现治疗相关疾病的方法是抗生素杀菌。但是，抗生素增加了抗生素耐药性菌株(AMR)和耐药基因的产生和传播，进一步危及公众的健康。所以，筛选出一株可以对抗耐药性的副溶血弧菌的噬菌体是非常必要的。
因此，如何提供一种噬菌体VB_VpP_BT-1011，并将其应用于对抗耐药性的副溶血弧菌的噬菌体中是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种噬菌体VB_VpP_BT-1011及其在对抗副溶血弧菌中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种噬菌体VB_VpP_BT-1011，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年06月08日，保藏编号为CGMCC No.22379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种噬菌体VB_VpP_BT-1011的筛选方法，以副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)BTXS2对其进行筛选；所述副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)BTXS2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年06月08日，保藏编号为CGMCC No.22677，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
作为本发明优选的技术方案，以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)BTXS2对噬菌体VB_VpP_BT-1011进行筛选的具体过程包括：
1)取水样，过滤、离心，截留滤液，得截留物；
2)以SM buffer洗脱截留物，并将洗脱液涂布至上层为副溶血弧菌BTXS2的3％Nacl LB双层平板上，培养24h；
3)选取噬菌斑并转移到SM buffer离心管中，离心，0.22μm滤膜过滤，得滤液；
4)将滤液梯度稀释后与副溶血弧菌BTXS2混合，并倾注到3％Nacl LB双层平板上，培养24h，选取噬菌斑；
5)重复步骤3)-4)，至获得单一噬菌斑形态的纯净噬菌体。
作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，所述过滤为以0.22μm滤膜过滤；所述离心为利用超滤离心管在4000rpm下离心10min；所述截留为以截留分子量为30KDa的生物膜截留。
作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述离心为30000rpm下离心30min。
噬菌体VB_VpP_BT-1011在对抗副溶血弧菌BTXS2中的应用
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的技术效果是：
(1)本发明分离得到一株具有广泛致病基因和多种耐药基因的副溶血弧菌BTXS2。
(2)本发明中分离得到的副溶血弧菌噬菌体VB_VpP_BT-1011，能有效抑制副溶血弧菌BTXS2的生长，并将其杀灭。
(3)本发明涉及透射电镜(TEM)观察副溶血弧菌噬菌体VB_VpP_BT-1011前的富集方法；
(4)本发明提供了抗生素之外的干预细菌感染的方法，尤其是针对副溶血弧菌的致病性和抗生素耐药性；
(5)本发明所提供的烈性副溶血弧菌噬菌体VB_VpP_BT-1011在治疗副溶血弧菌感染性疾病中具有很多优势，首先其可对耐药菌也具有很好的防治效果；其次，由于噬菌体的杀菌谱较窄，在复杂细菌的环境中，例如动物肠道，发生杀菌作用时，不会对益生菌造成伤害；第三，其效价较高，防治效果好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为副溶血弧菌在弧菌选择培养基、光学显微镜和扫描电镜(SEM)下的形态图；其中，A为菌株BTXS2菌液在弧菌选择培养基上的菌落图；B为菌株BTXS2菌液在显色培养基上光学显微镜下的图；C和D为菌株BTXS2菌液在扫描电镜(SEM)下的形态图；
图2为该副溶血弧菌的抗生素抗性基因PCR验证研究图；M为marker，A为alas基因；B为carb-18基因；C为mfd基因；D为mexl基因；
图3为噬菌斑形态、噬菌体在透射电镜(TEM)下的形态图；A为噬菌斑形态图；B为噬菌体在透射电镜(TEM)下的形态图；
图4为VB_VpP_BT-1011噬菌体的一步生长曲线图；
图5为VB_VpP_BT-1011噬菌体环境耐受结果图；A为pH值对噬菌体耐受的影响；B为盐度对噬菌体耐受的影响；C为温度对噬菌体耐受的影响；D为噬菌体的衰减曲线；
图6为VB_VpP_BT-1011噬菌体对宿主菌的抑菌效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中用到的噬菌体VB_VpP_BT-1011，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年06月08日，保藏编号为CGMCC No.22379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)BTXS2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年06月08日，保藏编号为CGMCC No.22677，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1的筛选、纯化及耐受性鉴定，结果见图1；
(1)将天津渤海河口的水样经过0.22μm滤膜过滤、截留细菌，利用PBS缓冲液重悬、浓缩细菌，并涂布在弧菌显色培养基上，37℃恒温培养24h后，挑选代表性的菌落放入高压灭菌的3％Nacl LB中培养过夜。再次利用弧菌显色培养基平板划线挑选代表性菌落，重复上述筛选纯化操作直至获得纯净的单克隆BTXS2。
(2)副溶血弧菌保存液的制备
将处于指数生长期的副溶血弧菌增殖液离心、弃掉上清，加入新鲜的3％NaCl LB重悬并浓缩副溶血弧菌，将浓缩菌液与40％甘油以1：1的比例混合，即得到副溶血弧菌保存液，副溶血弧菌保存液-80℃保存。
(3)副溶血弧菌形态的观察，见图1；
a.菌株BTXS2接种于LB培养基(含3％NaCl)中并置于30℃培养箱中培养16h后，取少许菌液在显色培养基上划线培养后观察单克隆的形态；另取菌液经过负染后使用光学显微镜和扫描电镜(SEM)观察细菌形态；(图1B和图1C和图1D)
b.该细菌在弧菌选择培养基上呈现典型的绿色单克隆，且菌落较大，表面较光滑，边缘平整；图1A；
c.在光学显微镜观察观察到副溶血弧菌BTXS2为短棒状。在扫描电镜下观察到菌体呈0.5-0.8×1.4-2.0μm的短棒状，具有端生鞭毛，(图1D)；
(4)副溶血弧菌生理生化和抗生素抗性分析；
a.使用BIOLOG GENIII测定唯一碳源利用能力；使用API ZYM试剂盒测定酶学特性指标；
b.将细菌的碳源利用和酶促结果与Berger手册和文献进行了比较，结果表明该细菌是副溶血弧菌的一种。它们可以使用71种碳源中的44种，显示出该细菌强大的碳源利用能力。酶学分析结果同样显示该菌具有多种代谢酶，具有优异的代谢能力；
d.抗生素敏感性测定。将菌株采用弧菌显色培养基进行划线分离得到单菌落。将绿色单菌落接种于NA+3％NaCl平板，于30℃培养箱中孵育。待生长良好后从NA+3％NaCl平板中挑取单菌落接种到液体培养基(MHB+3％NaCl)中，培养12h得到菌悬液。少量滴加几滴菌悬液到盛有2ml生理盐水的比浊管中，不断加入菌悬液调整至菌液浓度0.5McF(1.5×108CFU/ml)。用无菌棉签浸透上述0.5McF的菌悬液以30°左右的倾角涂布均匀。将药敏纸片贴在涂布好的平皿上，纸片间距不少于25mm，放置于30℃培养箱中孵育18h观察结果；结果见表1；
表1
Figure BDA0003209313430000051
Figure BDA0003209313430000061
+：生长，-：不生长
由表1可知，抗生素敏感性实验结果表明，BTXS2对青霉素和万古霉素具有耐药性，但对氯霉素，链霉素，氧氟沙星，四环素，红霉素，头孢噻肟，头孢呋辛钠，头孢吡肟，多粘菌素B，头孢哌酮/磺脲霉素(2：1)敏感，表明从环境中分离出的副溶血弧菌BTXS2具有多种抗生素耐药性。应当指出的是，BTXS2已经获得了对“最后一道防线”的抗生素万古霉素的抗药性，这鲜有报道。基于万古霉素常被用于抗生素耐药性细菌的临床治疗这一事实，这可能会增加抗生素耐药性副溶血弧菌的治疗成本。
(5)副溶血弧菌的环境耐受性测定
a.对于pH实验，将BTXS2接种在不同pH的3％NaCl LB肉汤中。肉汤培养基的初始pH分别为5.0至9.0，并通过使用HCl和NaOH调节。将培养物分装至灭菌的96孔板中，并在37℃下孵育13h；
b.对于盐度实验，将BTXS2分别接种在NaCl浓度分别为0.5％，1.8％，2.6％和3％的LB肉汤中，并将pH值调整为7.0。将培养物分装至灭菌的96孔板中，并在37℃下孵育13h；除了pH 5.0外，不同的初始pH值对副溶血弧菌BTXS2的生长没有明显影响。在1.8％，2.6％和3％NaCl LB培养中的生长无统计学差异。这表明副溶血弧菌BTXS2在河口，近海和海洋环境中具有良好的耐受性和生存能力。
(6)副溶血弧菌DNA提取和测序注释分析
a.预先将纯化保种的BTXS2菌培养至指数生长期，8000rpm离心5min，利用天根试剂盒的说明进行细菌基因组的提取；
b.将提取的基因组凝胶电泳观察条带的单一性；结果见图2；
c.细菌基因组建库后利用PacBio平台进行测序，过滤掉低质量序列后，使用SMRTLink v5.0.1软件对reads进行基因组组装。
d.使用Subsystem Technology(RAST)和GeneMarkS注释完整的基因组序列。所有预测的开放阅读框(ORF)已通过在线BLASTP进行了验证，并使用tRNA scan-SE搜索了假定的转移RNA(tRNA)编码基因。
e.利用GO、KEGG、COG、PHI等数据库进一步注释了细菌的基因功能。利用IslandPath-DIOMB软件预测了细菌基因岛；
f.BTXS2宿主的完整基因组序列以登录号CP063525-CP063527保藏在GenBank数据库中；与GO数据库的比较表明，BTXS2包含与病毒结构和繁殖相关的功能基因，表明基因组中存在噬菌体相关基因。与PHI数据库相比，发现BTXS2具有多种威胁人类健康的致病基因，例如引起人类食物中毒，发烧，腹泻，胃炎和其他疾病。此外，还有一些致病基因会导致斑马鱼和斑节对虾的皮肤感染和败血症。所以BTXS2可能对河口和海岸的人类健康和鱼类构成巨大威胁和负面影响；在基因序列中发现了抗生素抗性基因，PCR结果显示BTXS2包含β-内酰胺酶的抗生素抗性基因。并且发现了与外排泵机制有关的抗性基因，这可能在抗生素抗性的展现中起重要作用。在BTXS2中也发现喹诺酮类抗生素耐药基因。同时首次在副溶血弧菌基因组中发现了一种赋予新霉素抗性的丙氨酰-tRNA合成酶的基因alas，这将给副溶血弧菌的治疗带来更大的挑战。
实施例2筛选噬菌体并鉴定
(1)噬菌体的筛选和纯化
a.取天津渤海河口的水样经过0.22μm滤膜过滤后的滤液，利用超滤离心管在4000rpm离心10min条件下截留滤液中的噬菌体。
b.2ml SMbuffer[100mM NaCl,8mM MgSO4,50mM Tris HCl(pH 7.5)]洗脱截留物，将洗脱液涂布至上层为BTXS2的3％Nacl LB双层平板上，培养24h。
c.选取代表性的噬菌斑并将其转移到1ml的SMbuffer离心管中，30000rpm振荡30min，0.22μm滤膜过滤。
d.将滤液梯度稀释后与对数期宿主BTXS2混合倾注3％Nacl LB双层平板，培养24h后选取代表性的噬菌斑。
e.重复上述操作至获得单一噬菌斑形态的纯净噬菌体，结果见图3；该噬菌体在固体培养基上可以形成透亮噬菌斑，形态大小一致，边缘清晰规则，直径约为3mm的单一性状的噬菌斑(图3A)；
(2)噬菌体液的制备
将噬菌体增殖液与已高压灭菌的20％甘油以1：1的比例混合，即得到噬菌体保存液。噬菌体保存液-80℃保存。
(3)噬菌体形态的观察；
a.挑取多个双层琼脂上的噬菌斑(图3A)加入到2ml SM buffer缓冲液中震荡重悬噬菌体，离心后过0.22μm滤膜去除细菌碎片和琼脂固体从而得到浓缩纯化的噬菌体。
b.取纯化的噬菌体悬浮液加入到铜网表面，吸附15min。
c.噬菌体用磷钨酸(2％w/v，pH7.2)在黑暗中负染10min，利用透射电镜观察。；
e.经过染色后透射电镜观察结果表明该噬菌体是一株肌尾噬菌体，总长度54±1nm，尾部长23±0.5nm，头部长度为31±0.5nm的等距多面体结构，属于肌尾噬菌体科(图3B)；
(4)噬菌体生长生理特性研究
1)噬菌体生长曲线
a.以MOI为0.1将1ml的噬菌体液加入到30ml指数期生长的细菌培养物，吸附10min。
b.通过三次离心(8000rpm，1min，4℃)和5ml新鲜3％Nacl LB液体培养基重悬洗涤除去游离噬菌体，并用30ml的培养基重悬细胞沉淀。
c.前30min每隔10min收集一次样品，30-120min每30min收集一次样品，120-360min每60min收集一次样品，并立即进行平板分析以进行噬菌体滴定。实验设置三组生物平行，计算每个时间点的平均噬菌斑数并绘制一步生长曲线(见图4)。一步增长曲线表明，VB_VpP_BT-1011的潜伏时间为30分钟，上升时间为60分钟。爆发大小为24PFU/cell。
2)噬菌体环境耐受性，见图5；
a.分别配制1mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4母液，二者混合后分别配成pH值为5.0，6.0，7.0，8.0和9.0的磷酸盐缓冲液。
b.取相同量的噬菌体液加入到不同pH值的磷酸盐缓冲液中，分别在噬菌体加入后与37℃培养24h后梯度稀释倾注双层平板计数噬菌体，通过前后噬菌体数量的比值计算噬菌体的存活率(图5A)。
c.分别配制NaCl浓度分别为0％，1.8％，2.6％和3％的人造海水，分别模拟淡水、河口、近海和渤海深海环境，观察24h后VB_VpP_BT-1011噬菌体在不同盐度中的存活率(图5B)。
d.将一定量的VB_VpP_BT-1011噬菌体液加入到模拟淡水(0％NaCl)和模拟海水(3％NaCl)中，将其置于分别代表不同季节的典型温度4℃，11℃，25℃和37℃下，计算放置24h后的生存率(图5C)。
(5)噬菌体衰减曲线
a.配制0％和3％的人造海水，调节pH值为7.0，加入噬菌体浓缩液后置于11℃培养箱，利用倾注双层平板的方法计数初始、第一周、第三周、第五周和第七周的噬菌斑数量，计算噬菌体的存活率，获得其存活率和时间的关系，分析噬菌体的衰减变化规律(图5D)。
b.盐度，pH和温度是影响噬菌体存活和活性的重要因素。
VB_VpP_BT-1011可以在这些环境条件下长时间稳定生存，这表明它具有很强的生存能力，表明该噬菌体可在各个地方分布和传播。因此，由于噬菌体在水环境中占据着重要的位置，所以VB_VpP_BT-1011可能会对自然环境中的微生物群落结构和生态健康产生潜在影响。
(6)噬菌体DNA的提取和测序注释
a.将噬菌体VB_VpP_BT-1011投加到指数生长期的BTXS2中扩增培养24h。
b.加入2％(v/v)的三氯甲烷裂解细菌，8000rpm离心10min以去除细菌碎片，过0.22μm滤膜后将滤液加入到30KDa超滤管超滤浓缩。
c.浓缩液中加入DNA酶Ⅰ和RNA酶A至终浓度为1μg/ml放置30min，然后在80℃孵育15min以灭活DNaseI和RNA酶A。
d.按照Solarbio病毒DNA提取试剂盒提取噬菌体DNA，经过凝胶电泳检测条带的纯度和完整性。
e.使用SMRT Link v5.0.1软件对reads进行基因组组装。使用SubsystemTechnology(RAST)和GeneMarkS注释完整的基因组序列。
f.将噬菌体的序列与抗生素抗性基因数据库进行比较，结果表明该噬菌体没有任何抗生素抗性基因。VB_VpP_BT-1011噬菌体具有与大多数dsDNA噬菌体相同的模块化基因组结构。使用RAST数据库注释测序结果，发现噬菌体重组蛋白NinG，DNA复制解旋酶蛋白DnaC/DnaI，重组功能蛋白，单链DNA结合蛋白，噬菌体相关的核酸内切酶蛋白，噬菌体末端大亚基，噬菌体主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白基因。编码这些蛋白质的基因在噬菌体的结构以及感染，重组和复制的功能中起着重要作用。
上述VB_VpP_BT-1011噬菌体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年06月08日，保藏编号为CGMCC No.22379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；副溶血弧菌BTXS2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年06月08日，保藏编号为CGMCC No.22677，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例3
噬菌体的宿主范围
a.测试了针对24种细菌菌株的噬菌体VB_VpP_BT-1011的宿主范围(8株副溶血弧菌，4株河流弧菌，3株霍乱弧菌，3株溶藻弧菌，2株创伤弧菌，1株金黄色葡萄球菌，1株链球菌，1株大肠杆菌和1株铜绿假单胞菌)。通过斑点接种法，将5μL噬菌体原液滴在不同的细菌平板上，并在37℃孵育24h。孵育后，检查斑块的外观，成斑孵育实验的结果如表2所示；
表2
Figure BDA0003209313430000101
Figure BDA0003209313430000111
+：生长，-：不生长
结果显示，噬菌体只能感染BTXS2，表明噬菌体VB_VpP_BT-1011对BTXS2具有高度特异性。
噬菌体对宿主菌的抑制作用
a.将VB_VpP_BT-1011噬菌体分别以10-6-103的不同MOI与BTXS2宿主混合，并在37℃下孵育。不接种VB_VpP_BT-1011噬菌体的相同浓度的BTXS2宿主培养物用作阳性对照。
b.在酶标仪上每15分钟测量一次培养物的光密度(OD600)。实验样品一式八份，以确保实验结果的可靠性。结果见图6；
结果显示，该噬菌体对副溶血弧菌BTXS2具有明显的抗菌作用。当MOI为0.00001-0.001时，MOI越高，对宿主细菌的控制效果越明显，这表明MOI是影响噬菌体抗菌的重要因素。当MOI为0.01时，宿主细菌的浓度首先增加，但是随着噬菌体的扩展，宿主细菌的浓度在150分钟后开始降低。当MOI为0.1-1000时，宿主细菌BTXS2的生长从开始受到很强的抑制作用，宿主菌被抑制在一个很低的水平。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (1)

1.噬菌体VB_VpP_BT-1011在制备对抗副溶血弧菌BTXS2中的试剂中的应用，其特征在于，所述噬菌体VB_VpP_BT-1011保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年06月08日，保藏编号为CGMCC No.22379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)BTXS2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年06月08日，保藏编号为CGMCCNo.22677，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
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