CN116790516B - 一种裂解溶藻细菌的噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种裂解溶藻细菌的噬菌体及其应用，属于海洋生命科学技术领域。该噬菌体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.45083，保藏日期为：2022年02月21日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为假交替单胞菌属噬菌体，命名为XC。本发明提供的噬菌体是能够高效杀死主要养殖藻类病害菌的生物手段，具有高效专一，对环境友好的特点，在不破坏微生态平衡的基础上达到养殖海藻防治的作用，是抗生素以及其它抗菌药物无法比拟的，同时符合海洋生态文明建设大背景下的近海海藻养殖产业及其养殖技术与模式的发展观念。
Description
技术领域
本发明属于海洋生命科学技术领域，具体涉及一种以致病性假交替单胞菌作为宿主的噬菌体及其应用。
背景技术
大型养殖海藻往往会受到一些溶藻细菌(Algicidal bacteria)的影响，这些细菌可以通过直接接触或者分泌溶藻物质间接接触杀死藻类，给海藻养殖产业和养殖区生态平衡带来了灾难性后果。 到目前为止，至少有60多种具有溶藻作用的细菌被分离报道，它们主要包括芽孢杆菌(Bacillus)、交替单胞菌(Alteromonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、哈赫拉菌(Hahella chejuensis)、放线菌(Actinobacteria)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)、葡萄球菌(Staphylococcus) 和弧菌(Vibrio) 等。其中，假交替单胞菌是海洋高等藻类附着细菌中最常见的种类之一。
假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)隶属于变形菌门(Proteobacteria)，γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)，交替单胞菌目(Alteromonadales)，假交替单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)。它们外形通常呈杆状，不形成微胞囊和芽孢，且普遍具有极性鞭毛，GC含量分布在 38 % - 50 %，革兰氏染色为阴性，是一类普遍存在于海洋生境中的异养细菌，甚至在极地海域微生物群落中占据 6 %。大量证据表明，该属不仅具有丰富的代谢生产能力，能够有效利用海洋碳源进行复杂碳合成，在与其他微生物的竞争中占据优势，还能分泌多种胞外活性物质，例如胞外酶、胞外毒素、抗生素和胞外多糖等。这些物质通常表现出抗菌、溶菌、杀藻、降解纤维素和果胶以及软化琼胶等多种生物活性, 有助于假交替单胞菌获取营养和竞争生存空间，某些假交替单胞菌也因此成为一些高等真核海藻的致病菌，严重影响海藻养殖产业的发展。
根据文献资料，Sawabe等就从患红斑病(red spot disease)的海带上成功分离出致病菌Pseudoalteromonas bacteriolica，之后又发现Pseudoalteromonas elyakovii 可以引起养殖海带孢子体孔烂症。闫咏等对从养殖发病条斑紫菜上共分离筛选出的51株菌株进行人工感染，最终发现Pseudoalteromonas citrea 是导致养殖紫菜爆发绿斑病的主要致病菌。目前已经被证实，许多假交替单胞菌产生的一些胞外酶具有强烈的溶菌和杀藻活性，Lee等用亚硝基胍处理具有溶藻效应的假交替单胞菌A28时，通过纸片法检测到其含有的丝氨酸蛋白酶具有强烈的溶藻活性，可以高效杀死真核藻类宿主。Taizo Sakata等在日本鹿儿岛海湾海水里分离到的海洋假交替单胞Pseudoalteromonas sp.A1-J11 中发现一种化合物AVS-03d对硅藻的生长有很强的抑制作用。Pseudoalteromonas hodoensis是一种能够分泌AgaA7琼脂酶的假交替单胞菌，可以通过生产琼脂酶水解琼脂，并将水解产物作为唯一的碳和能源来源进行代谢，因此对红藻细胞壁成分具有很强的降解能力, 表现出明显的对红藻的适应性，是导致养殖海藻病烂、品质产值降低的主要元凶。
当前，藻类病害问题逐渐发展成为制约我国藻类养殖业健康发展的重要瓶颈，大规模的病害甚至可以导致养殖厂内一半以上的海藻腐烂死亡。尽管许多研究已经证实了海藻病烂与大部分藻类病害都是细菌性疾病引发的，但对于上述病原体的致病原因及其致病机理和海藻的抗病防御体系还不清楚，而传统使用抗生素及化学消毒剂等治疗方法已经产生了诸多问题，例如细菌产生耐药性、养殖水环境的二次污染、病原菌传播引发安全问题、养殖水环境微生态失衡等。因此，对于大型经济海藻的养殖病害还没有完全对症的有效预防措施，目前普遍的做法是通过加强养殖过程中的管理和环境因子（光照，温度，盐度等）的调控来减轻病害，或者采用不断将野生藻株移栽回株系，并手工摘除病菌的方式来治理细菌性病害，但这样并不利于更大规模养殖。
而噬菌体作为一种新兴的微生态抗菌剂，因其环境友好，专一性强的的特点，具有替代抗生素治疗疾病的潜在可能，国内外已有将噬菌体应用到临床疾病治疗、水产养殖中鱼类细感染防治等方向的实例，证明噬菌体正在多个领域受到越来越多的关注。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新分离的噬菌体，另一目的是提供该噬菌体的具体应用以弥补现有的藻类病害防治技术的不足。
一种裂解溶藻细菌的噬菌体，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCC No. 45083，保藏日期为：2022年02月21日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为假交替单胞菌属噬菌体，命名为XC。
进一步的，所述噬菌体是一株能够特异性裂解假交替单胞菌属Pseudoalteromonas hodoensis的长尾噬菌体；该噬菌体头部呈正二十面体，直径为51±1nm，尾部细长不可收缩，长度为86±1 nm；该噬菌体的潜伏期为45min，裂解期为75min，裂解量为241PFU/cell。
更进一步的，所述噬菌体能够在pH值范围为4和10之间、温度-20oC到45oC之间能保持活性的相对稳定，是一种能适应多种环境的烈性噬菌体。
进一步的，所述噬菌体的基因组全长为46,490 bp，共有73个开放阅读框 (openreading frames, ORFs)，其中40个ORFs（54%）被注释为假定蛋白，其余33个ORFs（45%）为编码功能蛋白。
更进一步的，所述33个ORFs编码功能蛋白中，包括辅助噬菌体XC完成高效侵染宿主过程的编码基因： ORF1 能够编码一个属于M15金属肽酶家族的蛋白，这一家族的成员催化活性依赖于含有 Zn2+的活化中心来产生，具有噬菌体内溶素效应的蛋白质能够从内部降解细菌宿主的肽聚糖，促进细胞裂解和子代病毒粒子的释放。ORF57编码DNA 甲基化酶，细菌常常通过限制性修饰（Restriction-Modification, RM）来抵御噬菌体的入侵，在 RM 系统中，甲基化酶催化宿主自身 DNA 甲基化，保证不被限制性内切酶“误伤”。在噬菌体 XC中发现了 DNA 甲基化酶的存在，表明这些噬菌体可以甲基化自己的 DNA 来绕过宿主的RM 系统进入细胞中，提高了感染效率。不仅如此，在XC的基因组中还发现一个携带甘氨酸的 tRNA（ORF64）；tRNA 的存在能够弥补噬菌体和宿主基因之间的密码子使用差异，允许噬菌体感染多个宿主，同时在有足够的营养存在的情况下，噬菌体 tRNA 基因的表达也可以提高感染期间的翻译效率。
进一步的，所述噬菌体能够用于裂解致病假交替单胞菌，具体为Pseudoalteromonas hodoensis，该细菌能够分泌AgaA7琼脂酶水解红藻细胞壁，造成养殖区红藻大规模腐败病烂；即所述噬菌体XC能够用于由致病假交替单胞菌引起的养殖海藻疾病的治理中。
进一步的，所述宿主假交替单胞菌Pseudoalteromonas hodoensis保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCC No. 24416，保藏日期为：2022年02月21日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为Pseudoalteromonas hodoensis，命名为H7。
本发明的优点和技术效果：
本发明提供的噬菌体XC特异性强，对温度、pH的耐受能力较强，可以适应多种环境，且能够有效针对性解决海藻养殖过程中，由致病性假交替单胞菌引起的藻类病害问题。在治疗养殖海藻细菌性疾病方面有很大的优势，该优势具体为：（1）不破坏海藻正常附生菌群，只针对相对应的病原菌，有很强的特异性；（2）不会引起细菌耐药性和抗性；（3）可依靠宿主菌增殖，一次给药可达到其它抗菌药物多次给药的效果；（4）在机体内停留时间短、代谢快；（5）研发生产时间短；（6）不会对养殖环境造成二次污染，绿色环保。
本发明提供的噬菌体是能够高效杀死主要养殖藻类病害菌的生物手段，具有高效专一，对环境友好的特点，在不破坏微生态平衡的基础上达到养殖海藻防治的作用，是抗生素以及其它抗菌药物无法比拟的，同时符合海洋生态文明建设大背景下的近海海藻养殖产业及其养殖技术与模式的发展观念。
附图说明
图1为本发明中噬菌体XC的电子透射电镜观察图。
图2为本发明中噬菌体XC的一步生长曲线图。
图3为本发明中噬菌体XC的pH耐受曲线。
图4为本发明中噬菌体XC的温度耐受曲线。
图5为本发明假交替单胞菌的细菌密度测定值。
图6为本发明中噬菌体XC的全基因组图谱。
具体实施方式
以下通过具体实施例并结合附图对本发明进一步解释和说明。
实施例1：
一种噬菌体XC的分离方法，包括以下步骤：
（1） 通过0.22μm滤膜过滤的海水样品，用SM缓冲液进行梯度稀释（0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10），之后和对数生长期的新鲜假交替单胞菌Pseudoalteromonas hodoensis菌液各取200μL混合均匀，侵染10~20 min后，采用双层平板法培养。
（2） 观察到平板上出现透明斑块后，用无菌移液枪枪头（1mL）将带有斑块的整块琼脂戳中，吹打到2mLSM缓冲液中，4℃放置过夜。次日使用0.22μm孔径的无菌滤膜过滤样品以除去琼脂碎片，与假交替单胞菌Pseudoalteromonas hodoensis菌液混合侵染后双层平板法倒板；此步骤重复3-5次，直到获得单一纯净的噬菌体样品。
（3） 将200μL纯净的噬菌体XC样品加入到20mL正在对数生长中的宿主菌液中，培养48 h后8,000×g离心该混合体系。上层的液体经0.22μm滤膜过滤，3,800×g超滤浓缩至1mL后转移到200mL的宿主培养液中，培养48 h后再次离心浓缩，重复此步骤直至混合培养体系扩大至1L；之后利用密度梯度离心法得到纯净的噬菌体富集条带，即得到噬菌体XC。
实施例2：噬菌体XC的特性实验
1、电镜观察试验：
吸取20μL噬菌体富集条带滴加在干燥的铜网上，等待15min后滴加2%的磷钨酸（PTA）溶液，再次等待10min，在灯下烤干后，将铜网放置在透射电子显微镜下进行观察。经形态学鉴定观察，如图1所示，此噬菌体属于长尾噬菌体，命名为XC（vB_PhoS_XC）。
2、一步生长曲线实验（裂解宿主细菌）：
具体步骤如下：
（1）将1mL纯净的噬菌体样品XC（MOI=0.01）放入等体积宿主菌液中，在28℃下吸附15-20 min。
（2）吸取1mL上述混合液，13,000×g离心1min，舍去上层液体，加入1 mL Zobell2216E培养液短暂涡旋混匀沉淀；重复此步骤三次以除掉未吸附的噬菌体。
（3）将最后一次混合液重新放入到50 mL Zobell 2216E培养液中，28 ℃恒温振荡培育并开始计时；最开始的1h中取样每隔5min一次，之后的1 h取样每隔10 min一次，最后的1h取样每隔30 min一次；每次取样1mL且设置三组平行。
（4）样品中放入20μL戊二醛，在黑暗环境中固定15min，立即用液氮冷冻；之后室温下解冻样品，并用SM缓冲液（pH 8）适当稀释，用DNA染色剂SYBR Green I 将样品在80℃下染色10min。
（5）同时取1mL计时初始时的宿主菌液放入20μL戊二醛，在黑暗中固定15min后立即用液氮冷冻；室温解冻样品并用TE缓冲液（Tris-EDTA；pH8）适当稀释，用DNA染色剂SYBRGreen I 将样品在80℃下染色1h。
（6）采取流式细胞仪测定噬菌体的丰度和计时初始时被感染的宿主细菌的丰度，绘制噬菌体的一步生长曲线，如图2所示。
从图2可以看出，噬菌体XC的潜伏期大约为45 min；之后进入到指数爆发阶段，用时大约75min，裂解量为241PFU/cell；据此能够得出该结论：噬菌体XC的细菌裂解能力和侵染性较强。
噬菌体XC裂解宿主细菌的结果如图5所示，空白对照表示未添加噬菌体。由图5可知，添加噬菌体后，宿主细菌密度在80分钟后显著下降，到180分钟时几乎接近于零，表明噬菌体对假交替单胞菌有明显抑制作用。
实施例3：噬菌体XC的稳定性实验
1、pH稳定性
向100μL噬菌体XC样品（106PFU/mL）中各加入900 μL 不同pH值（3-12）的SM缓冲液，在28℃条件下培养2 h。分别取200μL不同 pH 梯度的样品与等体积宿主菌液混合，15min后倒双层平板，28 ℃培养12 h，计算并绘制 pH 影响趋势图；重复三次。
如图3实验结果显示，噬菌体XC在pH值范围为4和10之间性质较为稳定。
2、热稳定性
分别取200μL噬菌体XC样品（106 PFU/mL；pH=7.0）于-20℃、4℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃条件下放置2 h；待各管中温度回落至室温水平，加入200μL宿主菌液，侵染15 min后倒双层平板，28 ℃培养12 h后计算噬菌斑数量；重复三次。
如图4实验结果显示，噬菌体XC在-20℃～45℃之间都能保持非常稳定的效价，55℃后活力才开始下降。
实施例4：噬菌体XC基因组的提纯与测序
具体步骤如下：
（1）噬菌体XC样品依次使用 HP Viral DNA/RNA Kit（OMEGA）和 DNeasy PowerClean pro Cleanup Kit（Qiagen）进行基因组的提取和纯化。
（2）通过超声将纯化后的 DNA 样本破碎至350bp 大小，然后将 DNA片段末端修复、加尾、折叠，PCR 后对产物进行纯化（AMPure-XP系统）并构建 DNA文库，之后利用Illumina NovaSeq PE150测序。
（3）分别使用RAST (https://topaz.gatech.edu/GeneMark/)和GeneMarks(http://t opaz.gatech.edu/GeneMark/)软件测定噬菌体序列中的开放阅读框 (openreading frames, ORFs)；之后将ORFs分别与NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中基于BLASTP算法的非冗余（NR）蛋白质数据库，Pfam (https://pfam.xfam.org/sear ch/sequence)数据库以及PDB (http://www.rcsb.org/) 数据库进行比对，选取score 最高的比对结果（E-value≤10-5 ; id-entity>40%; coverage>40%）进行筛选整合，得到噬菌体基因组最终注释信息。
噬菌体XC的全基因组图谱如图6所示，从图6中能看出编码功能蛋白的基因片段，所述33个ORFs编码功能蛋白中，包括辅助噬菌体XC完成高效侵染宿主过程的编码基因：ORF1 能够编码一个属于M15金属肽酶家族的蛋白，这一家族的成员催化活性依赖于含有Zn2+的活化中心来产生，具有噬菌体内溶素效应的蛋白质能够从内部降解细菌宿主的肽聚糖，促进细胞裂解和子代病毒粒子的释放。ORF57编码DNA甲基化酶，细菌常常通过限制性修饰（Restriction-Modification, RM）来抵御噬菌体的入侵，在 RM 系统中，甲基化酶催化宿主自身 DNA 甲基化，保证不被限制性内切酶“误伤”。在噬菌体XC中发现了DNA 甲基化酶的存在，表明这些噬菌体可以甲基化自己的DNA 来绕过宿主的RM系统进入细胞中，提高了感染效率。不仅如此，在XC的基因组中还发现一个携带甘氨酸的tRNA（ORF64）。tRNA 的存在能够弥补噬菌体和宿主基因之间的密码子使用差异，允许噬菌体感染多个宿主，同时在有足够的营养存在的情况下，噬菌体 tRNA 基因的表达也可以提高感染期间的翻译效率；所述ORF1、ORF57和ORF64的具体序列见序列表。
上述实施例提供了一株能够高效降解Pseudoalteromonas hodoensis 菌株的噬菌体XC。噬菌体XC能特异性裂解Pseudoalteromonas hodoensis，在短时间内迅速降低样本中宿主数量。根据一步生长曲线数据，噬菌体XC的潜伏期仅为45分钟，45分钟后大量噬菌体完成复制，迅速裂解宿主菌，使原本浑浊的宿主菌菌液澄清。同时，根据pH和温度耐受实验的数据，该噬菌体能够在在pH值范围为4和10之间、温度-20oC到45oC之间能保持活性的相对稳定，说明噬菌体XC可以有效适应多种恶劣环境，对养殖藻类病害达到高效防治目的。对XC的基因组进行测序分析后发现，噬菌体XC的基因组中除去维持噬菌体基本形态的结构基因外，存在如M15家族金属肽酶、DNA 甲基化酶、以及甘氨酸tRNA等多种编码基因，能够辅助该噬菌体完成高效侵染宿主的过程，提高感染效率。
综上，噬菌体XC是一株能够高效裂解藻类致病细菌Pseudoalteromonas hodoensis的，对复杂海洋环境具有优秀适应性的烈性噬菌体。对于由Pseudoalteromonas hodoensi引起的养殖红藻的病害防治有着传统抗生素治疗无法比拟的优越性，对推动我国沿海地带藻类养殖品质和产量的发展有着重要意义。
Claims (7)
1. 一种裂解溶藻细菌的噬菌体，其特征在于，该噬菌体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCC No. 45083，保藏日期为：2022年02月21日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为假交替单胞菌属噬菌体，命名为XC。
2. 如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体是一株长尾噬菌体；该噬菌体头部呈正二十面体，直径为51 ± 1nm，尾部细长不可收缩，长度为86 ± 1 nm；该噬菌体的潜伏期为45min，裂解期为75min，裂解量为241PFU/cell。
3.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体能够在pH值范围为4和10之间、温度-20℃到45℃之间能保持活性的稳定，是能够适应多种环境的烈性噬菌体。
4. 如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体的基因组全长为46,490 bp，共有73个开放阅读框ORFs，其中40个ORFs被注释为假定蛋白，其余33个ORFs编码功能蛋白。
5.权利要求1所述的噬菌体在裂解致病假交替单胞菌中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述噬菌体在由致病假交替单胞菌引起的养殖海藻疾病的治理中的应用。
7. 如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述致病假交替单胞菌具体为Pseudoalteromonas hodoensis。
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