CN111323596B - 一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒及其制备方法，属于试剂盒领域。该试剂盒包被有金纳米颗粒的免疫磁珠探针、金纳米粒子探针、刻蚀溶液和标准菌液。所述的包被有金纳米颗粒的免疫磁珠探针是先制备包被有金纳米颗粒的磁珠，将磁珠与金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄抗体IgY偶联得到免疫磁珠探针；所述的金纳米粒子探针是先合成金纳米粒子，将其与金黄色葡萄球菌特异性适配体偶联得到的；利用本发明制备的试剂盒进行金黄色葡萄球菌检测具有特异性强、灵敏度高、检测时间短的优势，最低检测浓度低至10cfu/mL，可用于食品中金黄色葡萄球菌的检测。

Description

一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于试剂盒领域，具体提供一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，金葡菌)是一种重要的食源性致病菌，可以通过各种途径污染食品，引发中毒等多种食源性疾病，主要的急性症状有恶心，呕吐，严重可导致死亡。因此，开发一种简单，灵敏，特异的金黄色葡萄球菌检测方法具有重要意义。目前我国对于金葡菌的检测方法以传统的微生物培养、生化鉴定等为主，这些方法操作繁琐、耗时长，难以满足快速检测的要求。
近年来，为了加快检测速度，提高检测结果的准确率，研究者们开发了许多替代方法，如聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、酶联免疫吸附法(ELISA)等，但是这些方法具有成本高、仪器设备复杂或灵敏度较低的缺点，限制了其广泛应用，也不利于样品的现场检测。所以，非常必要有开发一种快，灵敏度高，特异性强的检测手段，来监控食源性致病菌，以保障人们的食品安全。
发明内容
本发明目的是提供一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒能快速、灵敏、简便的检测金黄色葡萄球菌。
本发明首先提供一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，包括：
包被有金纳米颗粒的免疫磁珠探针、金纳米粒子探针、刻蚀溶液和标准菌液。
本发明还提供一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒的制备方法，包括：
步骤一：包被有金纳米颗粒的磁珠的制备
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O溶于去离子水中，剧烈搅拌，逐滴加入NaOH，充分搅拌，使溶液pH值为12；使用永磁铁分离混合物中的黑色固体物质，进行清洗，将固体产物于37℃环境中放置，然后冲洗干燥，得到黑色固体产物；
将上述黑色固体产物溶于去离子水中，超声至分散均匀，加入EDTA-NaOH溶液和CTAB溶液，混合均匀，再加入氯金酸溶液和NaOH溶液，混合均匀，最后加入盐酸羟胺后搅拌至溶液均匀无沉淀；将混合物室温条件下放置，获得包被有金纳米颗粒的磁珠；
步骤二：免疫磁珠探针的制备
取包被有金纳米颗粒的磁珠，加入EDC和NHS活化羧基，磁分离去上清，PBS清洗，加入金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄抗体IgY反应，磁分离去上清，PBS清洗，重悬于PBS中，得到免疫磁珠探针；
步骤三：金纳米粒子探针的制备
称取柠檬酸三钠和柠檬酸，溶于去离子水，制备柠檬酸混合液，取氯金酸溶于去离子水中，得到氯金酸溶液，搅拌加热至剧烈沸腾；然后加入柠檬酸混合液，继续加热搅拌至溶液呈酒红色；移除热源冷却至室温，得到金纳米粒子；
取金黄色葡萄球菌特异性适配体，95℃加热5分钟，4℃冷却5分钟；加入上述金纳米粒子，室温反应过夜，得到金纳米粒子探针；
步骤四：刻蚀溶液和标准菌液的制备
优选的是，所述步骤一的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的摩尔浓度比为2：1。
优选的是，所述步骤一的氯金酸溶液的浓度为1mM，所述的NaOH溶液的浓度为0.1M，所述的盐酸羟胺的浓度为0.01M。
优选的是，所述步骤一的包被有金纳米颗粒的磁珠的尺寸为20.37±0.58nm。
优选的是，所述步骤二的包被有金纳米颗粒的磁珠、EDC、NHS和金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄抗体IgY的质量比为20:100:50:1。
优选的是，所述的步骤二的反应温度为室温，反应时间为2h。
优选的是，所述步骤三的氯金酸溶液和柠檬酸混合液的体积比为1:4。
优选的是，所述步骤三的金黄色葡萄球菌特异性适配体的浓度为10μM。
优选的是，所述步骤三的金黄色葡萄球菌特异性适配体和金纳米粒子的摩尔比为45500:1。
本发明的有益效果
本发明公开了一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒及其制备方法，包括：包被有金纳米颗粒的免疫磁珠探针、金纳米粒子探针、刻蚀溶液和标准菌液。所述的包被有金纳米颗粒的免疫磁珠探针是先制备包被有金纳米颗粒的磁珠，将磁珠与金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄抗体IgY偶联得到免疫磁珠探针；所述的金纳米粒子探针是先合成金纳米粒子，将其与金黄色葡萄球菌特异性适配体偶联得到的；该试剂盒使用时，取待测液与上述两种探针混合形成磁珠-细菌-金纳米粒子复合物，使用磁力架吸附该复合物，吸取上清液中未结合的金纳米粒子探针加入刻蚀液、TMB和过氧化氢显色，从而实现金黄色葡萄球菌的快速特异性检测。利用本发明制备的试剂盒进行金黄色葡萄球菌检测具有特异性强、灵敏度高、检测时间短的优势，最低检测浓度低至10cfu/mL，可用于食品中金黄色葡萄球菌的检测。
附图说明
图1为本发明一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒检测金黄色葡萄球菌的流程图；
图2为本发明实施例2检测方法的波长和吸光度曲线图。
具体实施方式
本发明首先提供一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，包括：
包被有金纳米颗粒的免疫磁珠探针、金纳米粒子探针、刻蚀溶液和标准菌液。
本发明还提供一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒的制备方法，包括：
步骤一：包被有金纳米颗粒的磁珠的制备
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O溶于去离子水中，所述的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的摩尔浓度比优选为2：1，剧烈搅拌，逐滴加入NaOH，NaOH的浓度优选为1M，充分搅拌，使溶液pH值为12；使用永磁铁分离混合物中的黑色固体物质，进行清洗，所述的清洗是优选用去离子水清洗3-5次，高氯酸冲洗1次后用去离子水冲洗2次；
将固体产物于37℃环境中放置，所述的放置时间优选为2h，然后冲洗干燥，所述的冲洗时优选用去离子水彻底冲洗黑色产物3次，所述的干燥时间优选为60-65℃，干燥时间优选为12-24h；得到黑色固体产物；
将上述黑色固体产物溶于去离子水中，超声至分散均匀，得到固体溶液，加入EDTA-NaOH溶液和CTAB溶液，混合均匀，再加入氯金酸溶液和NaOH溶液，混合均匀，最后加入盐酸羟胺后搅拌至溶液均匀无沉淀；将混合物室温条件下放置，所述的放置时间优选为24h，获得包被有金纳米颗粒的磁珠；所述的氯金酸溶液的浓度优选为1mM，所述的NaOH溶液的浓度优选为0.1M，所述的盐酸羟胺的浓度优选为0.01M；所述的固体产物的质量(mg)：EDTA-NaOH溶液的体积(mL)：CTAB溶液的体积(mL)：氯金酸溶液的体积(mL)：NaOH溶液的体积(mL)：盐酸羟胺的质量(mg)比值为20：5：14：3：0.6：150；所述获得的包被有金纳米颗粒的磁珠的尺寸为20.37±0.58nm。
步骤二：免疫磁珠探针的制备
取包被有金纳米颗粒的磁珠，加入EDC和NHS活化羧基，所述的活化时间优选为30分钟，然后磁分离去上清，PBS清洗3-5次，加入金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄抗体IgY，优选在室温反应2小时，磁分离去上清，PBS清洗3次，重悬于PBS中，得到免疫磁珠探针；所述包被有金纳米颗粒的磁珠、EDC、NHS和金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄抗体IgY的质量比为20:100:50:1。
步骤三：金纳米粒子探针的制备
称取柠檬酸三钠和柠檬酸，溶于去离子水，制备柠檬酸混合液，所述的柠檬酸混合液中柠檬酸含量为0.05％(w/v)；取氯金酸溶于去离子水中，得到氯金酸溶液，所述的氯金酸溶液的浓度优选为0.1％(w/v)，150℃加热搅拌10分钟使溶液剧烈沸腾；加入柠檬酸混合液，继续加热搅拌5分钟至溶液呈酒红色；移除热源冷却至室温，得到金纳米粒子；所述的氯金酸溶液和柠檬酸混合液的体积比为1:4。
取金黄色葡萄球菌特异性适配体，所述金黄色葡萄球菌特异性适配体的浓度优选为10μM，95℃加热5分钟，4℃冷却5分钟；加入金纳米粒子，室温反应过夜，得到金纳米粒子探针，所述金黄色葡萄球菌特异性适配体和金纳米粒子的摩尔比为45500:1。
步骤四：刻蚀溶液和标准菌液的制备
刻蚀溶液的配置
将终浓度为1μM的磷酸和终浓度为1μM的过氧化氢溶于去离子水中，充分混匀，低温避光保存；
标准菌液的制备
取-80℃保存菌种，进行菌株活化，将活化后的菌株在1％氯化钠胰蛋白脉琼脂平板上划线分纯，37℃培养18-24小时后，挑取单个菌落，接种1％氯化钠胰蛋白脉液体培养基，37℃振荡培养12-18小时，取1mL菌液10倍倍比稀释平板倾注法进行活菌计数，剩余的菌液用0.5％甲醛在4℃下灭活24小时，将灭活的菌液4000rpm离心15min，收集菌体，然后用PBS溶液充分混匀，制成菌悬液，用PBS溶液调节菌悬液浓度为109cfu/mL，存于4℃冰箱中备用。
将上述制备得到的金黄色葡萄球菌检测试剂盒用于金黄色葡萄球菌的检测，具体方法为：
取待测液100μL，免疫磁珠探针50μg，金纳米粒子探针175μL和PBS 100μL于室温反应30分钟；磁分离，吸取100μL上清液体加入刻蚀液，反应30分钟；加入TMB 50μL，过氧化氢2μL，反应5分钟；加入终止液反应5分钟，于紫外分光光度计测吸收光谱。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，实施例中涉及到的原料均为商购获得。
实施例1
步骤一：包被有金纳米颗粒的免疫磁珠探针的制备
将摩尔浓度比为2:1的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O溶于去离子水中，剧烈搅拌；逐滴加入浓度1M的NaOH，充分搅拌，使溶液pH值为12；使用永磁铁分离混合物中的黑色固体物质，去离子水清洗3次，高氯酸冲洗1次后用去离子水冲洗2次；将固体产物于37℃环境中放置2小时；去离子水彻底冲洗黑色产物3次后置于真空干燥箱中60℃烘干过夜。
称取烘干后的20mg黑色固体产物溶于5mL去离子水中，超声至分散均；加入5mLEDTA-NaOH溶液和14mL CTAB溶液，混合均匀；加入终浓度为1mM的3mL氯金酸溶液和终浓度为0.1M 0.6mL NaOH溶液，混合均匀；加入150mg盐酸羟胺后搅拌至溶液均匀无沉淀；将混合物室温条件下放置24小时，获得包被有金纳米颗粒的磁珠。
步骤二：免疫磁珠探针的制备
取包被有金纳米颗粒的磁珠2mg，加入10mg EDC和5mg NHS活化羧基，30分钟后磁分离去上清，PBS清洗3-5次，加入100μg金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄抗体IgY，室温反应2小时，磁分离去上清，PBS清洗3次，重悬于PBS中，得到免疫磁珠探针。
步骤三：金纳米粒子探针的制备
称取0.1g柠檬酸三钠和0.005g柠檬酸，溶于去离子水，制备柠檬酸含量为0.05％(w/v)柠檬酸混合液，取500μL氯金酸溶于去离子水中使其浓度为0.1％(w/v)；150℃加热搅拌10分钟使溶液剧烈沸腾；加入2mL柠檬酸混合液，继续加热搅拌至溶液呈酒红色；移除热源冷却至室温，得到金纳米粒子。取10μL浓度为10μM金黄色葡萄球菌特异性适配体，95℃加热5分钟，4℃冷却5分钟；加入1mL金纳米粒子，室温反应过夜，得到金纳米粒子探针。
步骤四：
刻蚀溶液的配置
将终浓度为1μM的磷酸和终浓度为1μM的过氧化氢溶于去离子水中，充分混匀，低温避光保存。
标准菌液的制备
取-80℃保存菌种，进行菌株活化。将活化后的菌株在1％氯化钠胰蛋白脉琼脂平板上划线分纯，37℃培养18-24小时后，挑取单个菌落，接种1％氯化钠胰蛋白脉液体培养基，37℃振荡培养12-18小时。取1mL菌液10倍倍比稀释平板倾注法进行活菌计数。剩余的菌液用0.5％甲醛在4℃下灭活24小时，将灭活的菌液4000rpm离心15min，收集菌体，然后用PBS溶液充分混匀，制成菌悬液，用PBS溶液调节菌悬液浓度为109cfu/mL，存于4℃冰箱中备用。
实施例2基于磁分离和纳米金刻蚀技术检测金黄色葡萄球菌
检测流程图如图1所示：取待测液100μL，免疫磁珠探针50μg，金纳米粒子探针175μL和PBS 100μL于室温反应30分钟；磁分离，吸取100μL上清液体加入刻蚀液，反应30分钟；加入TMB 50μL，过氧化氢2μL，反应5分钟；加入终止液反应5分钟，于紫外分光光度计测吸收光谱。
实验结果表明：本发明检测方法稳定，最低检测浓度低至10cfu/mL，检测时间短，70分钟可以完成检测，符合快速检测要求。对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌，单核细胞增生李斯特菌，大肠杆菌O157：H7，副溶血性弧菌和弗氏志贺菌进行检测，只有金黄色葡萄球菌呈现出阳性结果，其余均为阴性。可见，该方法灵敏度高、特异性强，结果如图2、表1所示。所有实验均具有良好的重复性。
表1对金黄色葡萄球菌的特异性检测结果
Figure BDA0002407110610000071
实施例3模拟样品的检测
制备猪肉浸出液：精确称取5.0000g猪肉，加入5mL灭菌PBS，研磨均匀后，用滤纸过滤，用0.22μM滤膜过滤滤出液；取不同浓度的金黄色葡萄球菌接种至该浸出液中，用本发明方法对其进行检测。取待测液100μL，免疫磁珠探针50μg，金纳米粒子探针175μL和PBS 100μL于室温反应30分钟；磁分离，吸取100μL上清加入刻蚀液，反应30分钟；加入TMB 50μL，过氧化氢2μL，反应5分钟；加入终止液反应5分钟，于紫外分光光度计测吸收光谱。
参考所做的标准曲线图，确定样品中副溶血性弧菌的数量。定量检测该菌浓度的范围在10-106cfu/mL。如表2所示，本发明方法检测稳定，加标回收率范围为100-112.2％。
表2模拟样品(猪肉)检测结果
Figure BDA0002407110610000081

Claims (9)

1.一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其特征在于，包括：
包被有金纳米颗粒的免疫磁珠探针、金纳米粒子探针、刻蚀溶液和标准菌液；
所述的一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒的制备方法，包括：
步骤一：包被有金纳米颗粒的磁珠的制备
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O溶于去离子水中，剧烈搅拌，逐滴加入NaOH，充分搅拌，使溶液pH值为12；使用永磁铁分离混合物中的黑色固体物质，进行清洗，将固体产物于37℃环境中放置，然后冲洗干燥，得到黑色固体产物；
将上述黑色固体产物溶于去离子水中，超声至分散均匀，加入EDTA-NaOH溶液和CTAB溶液，混合均匀，再加入氯金酸溶液和NaOH溶液，混合均匀，最后加入盐酸羟胺后搅拌至溶液均匀无沉淀；将混合物室温条件下放置，获得包被有金纳米颗粒的磁珠；
步骤二：免疫磁珠探针的制备
取包被有金纳米颗粒的磁珠，加入EDC和NHS活化羧基，磁分离去上清，PBS清洗，加入金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄抗体IgY反应，磁分离去上清，PBS清洗，重悬于PBS中，得到免疫磁珠探针；
步骤三：金纳米粒子探针的制备
称取柠檬酸三钠和柠檬酸，溶于去离子水，制备柠檬酸混合液，取氯金酸溶于去离子水中，得到氯金酸溶液，搅拌加热至剧烈沸腾；然后加入柠檬酸混合液，继续加热搅拌至溶液呈酒红色；移除热源冷却至室温，得到金纳米粒子；
取金黄色葡萄球菌特异性适配体，95℃加热5分钟，4℃冷却5分钟；加入上述金纳米粒子，室温反应过夜，得到金纳米粒子探针；
步骤四：刻蚀溶液和标准菌液的制备。
2.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其特征在于，所述步骤一的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的摩尔浓度比为2：1。
3.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其特征在于，所述步骤一的氯金酸溶液的浓度为1mM，所述的NaOH溶液的浓度为0.1M，所述的盐酸羟胺的浓度为0.01M。
4.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其特征在于，所述步骤一的包被有金纳米颗粒的磁珠的尺寸为20.37±0.58nm。
5.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其特征在于，所述步骤二的包被有金纳米颗粒的磁珠、EDC、NHS和金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄抗体IgY的质量比为20:100:50:1。
6.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其特征在于，所述的步骤二的反应温度为室温，反应时间为2h。
7.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其特征在于，所述步骤三的氯金酸溶液和柠檬酸混合液的体积比为1:4。
8.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其特征在于，所述步骤三的金黄色葡萄球菌特异性适配体的浓度为10μM。
9.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，其特征在于，所述步骤三的金黄色葡萄球菌特异性适配体和金纳米粒子的摩尔比为45500:1。
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