CN114371287A - 一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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CN114371287A CN202210040310.0A CN202210040310A CN114371287A CN 114371287 A CN114371287 A CN 114371287A CN 202210040310 A CN202210040310 A CN 202210040310A CN 114371287 A CN114371287 A CN 114371287A
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Abstract

本发明公开了一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括免疫磁纳米探针、显色液A、显色液B、10‑106CFU/mL标准菌检测比色卡、磁铁和无菌PBS缓冲液。此外本发明还公开了一种金黄色葡萄球菌的检测方法。本发明的检测试剂盒主要通过免疫磁纳米探针特异性浓缩目标菌实现对金黄色葡萄球菌的快速富集与分离，利用生物酶水解反应和点击化学反应，结合纳米金的比色效应，实现对金黄色葡萄球菌的快速比色检测和定量检测，定量检测变异系数小，线性范围宽，检测限可低至2.4CFU/mL，比色检测限为50CFU/mL。此外，采用本发明检测试剂盒的检测方法操作步骤简单，成本低廉，检测时间短，稳定性好。

Description

一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检 测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
近年来，由食源性病原体引起的食品安全问题已成为全球共同关注的公共卫生问题之一。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)，简称金葡菌，作为一种常见的食源性致病菌，被认为是世界范围内最重要的食源性疾病之一。金葡菌常以奶、肉、蛋、鱼及其制品为载体，其产生的肠毒素可引起局部化脓性感染、伪膜性肠炎，心包炎，严重时可导致脓毒症、败血症等全身感染。同时，金黄色葡萄球菌感染也是我国医院获得性感染的重要原因，并且医院感染发病率呈逐年上升趋势。因此，对其进行现场监控与抽检的现场快速准确检测已成为公共卫生检测领域的研究热点之一。
目前，对于金葡菌检测一般采用分离培养生化鉴定技术、免疫学检测技术和分子生物学检测技术等。分离培养生化鉴定技术存在增菌耗时长、灵敏度较低等不足；基于抗原-抗体特异性反应的免疫学检测方法易出现交叉反应，抗体制备繁琐；分子生物学检测技术所需仪器试剂昂贵、对操作人员要求高等缺点。由于以上检测方法均存在一定的局限性，无法满足组分复杂和含量低的食品样品检测要求，不利于现场快速筛查与检测，难以在食品安全领域的基层质检工作中得到普及应用，因此开发高效准确的现场快速检测新技术对食源性疾病的监控预防具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒及其检测方法，实现对金黄色葡萄球菌的快速特异性检测，本发明具体的技术方案如下：
一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括免疫磁纳米探针、显色液A、显色液B、10-106CFU/mL标准菌检测比色卡、磁铁和无菌PBS缓冲液；
所述显色液A为抗坏血酸磷酸酯与硫酸铜混合液；
所述显色液B为叠氮基和乙炔基修饰的金纳米粒子混合液。
本发明的基本机理与思路为：
本发明的检测试剂盒主要通过免疫磁纳米探针特异性浓缩目标菌实现对金黄色葡萄球菌的快速富集与分离，免疫磁性微球易于合成且表面易修饰，因其特有的超顺磁性和良好的生物相容性，免疫磁分离技术是将免疫学和磁纳米技术相结合，集富集、分离功能为一体的技术。利用生物酶水解反应和点击化学反应，结合纳米金的比色效应，实现对金黄色葡萄球菌的快速比色检测和定量检测，定量检测变异系数小，线性范围宽，检测限可低至2.4CFU/mL，比色检测限为50CFU/mL。纳米金比色分析技术基于金纳米粒子独特的光学效应，即纳米金在分散状态下呈红色，在聚集状态下呈蓝色，通过与特定物质结合调控金纳米粒子间距，引起纳米金溶液颜色发生变化，实现简单、高效和低成本的可视化分析检测。以金纳米粒子为颜色基质的“点击化学”反应是在铜(I)离子(Cu+)的存在下，叠氮基和炔基之间的反应导致形成三唑产物，这改变了金纳米粒子的状态以产生不同的颜色，效率高和选择性强。
本技术方案还做如下优化：
进一步地，所述的免疫磁纳米探针为碱性磷酸酶和金黄色葡萄球菌标记的羧基化磁珠。
进一步地，所述的显色液A为抗坏血酸磷酸酯与硫酸铜按1:5比例配置而成，所述抗坏血酸磷酸酯浓度为5mM。
进一步地，所述的免疫磁纳米探针浓度为0.5mg/mL，显色液A0.5mL，显色液B0.5mL。
进一步地，所述的免疫磁纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
1)将将1.08g六水合氯化铁与22mL乙二醇超声混匀；
2)向1)中加入1.2g结晶乙酸钠、0.2g柠檬酸三钠和0.2g聚乙二醇6000；
3)将溶液2)置于反应釜中，在200℃的温度下反应18h，用磁铁分离得到的黑色磁性固体物质，用超纯水和乙醇交替清洗，得到羧基化Fe3O4纳米磁珠；
4)取羧基化Fe3O4纳米磁珠超声分散于PBS缓冲液中，使其浓度为5mg/mL；
5)向4)中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使其浓度为10mg/mL；
6)30min后，用PBS缓冲液清洗并重悬于1mLPBS缓冲液中，加入1mg碱性磷酸酶，室温反应2h，加入0.1μM金黄色葡萄球菌特异性适配体反应12h，得到功能化免疫磁纳米探针。
进一步地，所述的显色液B的制备方法，包括如下步骤：
1)取2mM叠氮基-PEG-SH将其分散于0.5mL甲醇与水体积比为2:1的混合液中；
2)向2)中加入等体积的金纳米溶液，混合反应12h，离心得到叠氮基修饰的金纳米粒子溶液；
3)同样取2mM乙炔基-PEG-SH将其分散于0.5mL甲醇与水体积比为2:1的混合液中；
4)向3)中加入等体积的金纳米溶液，混合反应12h，离心得到乙炔基修饰的金纳米粒子溶液；
5)将2)中得到的叠氮基修饰的金纳米粒子溶液和4)中得到的乙炔基修饰的金纳米粒子溶液按照体积比1:1混合，得到显色液B。
进一步地，所述的金纳米粒子溶液的制备方法，包括如下步骤：
1)将所用器皿用硝酸和盐酸体积比为1:3的混合液在通风橱内浸泡1h，用超纯水冲洗并用氮气吹干；
2)将0.005g的三水合氯金酸置于器皿中加热至沸腾，在搅拌的状态下快速加入0.02g柠檬酸三钠和0.001g柠檬酸，5min后，得酒红色金纳米粒子溶液。
本发明还提供了利用上述检测试剂盒的一种金黄色葡萄球菌的检测方法，包括如下步骤：
1)取待测食品研磨，取5g匀浆，加入10mL无菌PBS缓冲液，充分混匀，取500μL浸出液于离心管中；
2)加入免疫磁纳米探针1mL，室温下漩涡混匀30min，磁分离弃上清，加入显色液A，反应10min，再加入显色液B，反应5min；
3)磁吸附取上清，测定紫外吸收光谱。
采用本发明检测试剂盒的金黄色葡萄球菌的检测方法操作步骤简单，成本低廉，检测时间短，稳定性好。
本发明提供了一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒及其检测方法，该检测试剂盒主要通过免疫磁纳米探针特异性浓缩目标菌实现对金黄色葡萄球菌的快速富集与分离，利用生物酶水解反应和点击化学反应，结合纳米金的比色效应，实现对金黄色葡萄球菌的快速比色检测和定量检测，定量检测变异系数小，线性范围宽，检测限可低至2.4CFU/mL，比色检测限为50CFU/mL。此外，采用本发明检测试剂盒的检测方法操作步骤简单，成本低廉，检测时间短，稳定性好。
附图说明
图1为本发明的免疫磁纳米探针透射电镜图、Zeta电位图、磁滞回线图；
图中标记说明：a-免疫磁纳米探针透射电镜图；b-免疫磁纳米探针Zeta电位图；c-免疫磁纳米探针磁滞回线图；
图2为本发明的免疫磁纳米探针用量优化图(a:0.05mg，b:0.1mg，c:0.2mg，b:0.3mg，e:0.4mg，f:0.5mg，g:0.6mg，h：阳性对照，i：阴性对照)；
图3为本发明的金纳米粒子相关透射电镜图、紫外光谱图和Zeta电位图；
图中标记说明：a-叠氮基修饰的金纳米粒子透射电镜图；b-乙炔基修饰的金纳米粒子透射电镜图；c-金纳米粒子紫外光谱图；d-金纳米粒子Zeta电位图；
图4本发明的金黄色葡萄球菌的检测结果图；
图中标记说明：a-金黄色葡萄球菌的检测视觉图，b-金黄色葡萄球菌的检测曲线图，c-金黄色葡萄球菌的检测线性回归图；
图5本发明的金黄色葡萄球菌检测试剂盒的选择性示意图；
图中标记说明：a-金黄色葡萄球菌的检测试剂盒的选择性视觉图，b-金黄色葡萄球菌的检测试剂盒的选择性柱状图；
图6金黄色葡萄球菌食品样检测结果图；
图中标记说明：a-金黄色葡萄球菌的检测食品样检测结果曲线图，b-金黄色葡萄球菌的食品样检测结果视觉图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
具体实施例：
一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括免疫磁纳米探针、显色液A、显色液B、10-106CFU/mL标准菌检测比色卡、磁铁和无菌PBS缓冲液。
实例1羧基磁珠的制备
称取1.08gFeCl3.6H2O和22mL乙二醇，将其超声溶解形成红棕色溶液；再取1.2gNaAc和0.2g柠檬酸三钠加入到上述形成的红棕色溶液中，超声形成暗红色溶液；最后，加入0.2gPEG-6000，超声混匀，将所得均质混合液转置于反应釜中，于200℃烘箱中反应18h。用磁铁分离得到的黑色磁性固体物质，用超纯水和乙醇交替清洗，得到羧基化Fe3O4纳米磁珠。
实例2功能化免疫磁纳米探针的制备
取0.5mg羧基化Fe3O4纳米磁珠，用PBS缓冲液清洗并重悬于1mLPBS缓冲液中，加入10mgEDC和10mgNHS活化羧基，30min后，磁吸附，弃上清，用PBS缓冲液清洗并重悬于0.8mLPBS缓冲液中，加入1mg碱性磷酸酶，室温反应2h，加入0.1μM金黄色葡萄球菌特异性适配体(5’NH2-GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCG CTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3′)反应过夜，得到功能化免疫磁纳米探针。
其中，PBS缓冲液配置方法如下：8gNaCl，0.2gKCl，3.63gNa2HPO4.12H2O，0.24gKH2PO4溶于1L超纯水中，调节pH至7.4。
实验结果如图1所示，经透射电镜表征，免疫磁纳米探针尺寸为200±25nm；磁性纳米粒子(MNPs)和免疫磁纳米探针(IMB)的Zeta发生改变，这是由于偶连偶连碱性磷酸酶和适配体后，消耗MNPs表面的负电荷的缘故；而磁滞回线显示偶连前后，IMB的饱和磁强度与MNPs基本一致，矫顽力几乎为零，这为后续检测的快速磁分离奠定基础。
实例3免疫磁纳米探针的用量优化
对已制备免疫磁纳米探针进行紫外照射灭菌处理，根据金黄色葡萄球菌平板计数结果配置106CFU/mL目标菌液。将免疫磁纳米探针分成a:0.05mg，b:0.1mg，c:0.2mg，b:0.3mg，e:0.4mg，f:0.5mg，g:0.6mg每管，加入100μL目标菌液，用灭菌PBS缓冲液补足至1mL，富集30min；磁分离，取上清液50μL，进行涂布法细菌计数。其中h为阳性对照，i为阴性对照。
实验结果如图2所示，随着免疫磁纳米探针用量增大，上清液中金葡菌含量依次降低，当免疫磁纳米探针量为0.5mg/mL时，几乎可以富集所有的目标菌。
实例4金纳米粒子的制备
分别称取0.1g柠檬酸三钠和0.005g柠檬酸，加10mL去离子水溶解混匀，制成柠檬酸盐溶液备用。量取52mL超纯水、500μL1％HAuCl4.3H2O溶液于三颈烧瓶中，在磁力搅拌加热器中剧烈搅拌并加热至沸腾，溶液完全沸腾后加入柠檬酸盐溶液2mL，继续反应5min，观察溶液颜色变化。反应结束后，将溶液冷却至室温，将所制备金纳米溶液于4℃避光保存备用。
实例5显色液B的制备
取2mM叠氮基-PEG-SH将其分散于0.5mL甲醇：水混合液中(甲醇：水＝2:1)，向其加入等体积的金纳米溶液，混合反应12h，离心得到叠氮基修饰的金纳米粒子，同样取2mM乙炔基-PEG-SH将其分散于0.5mL甲醇：水混合液中(甲醇：水＝2:1)，向其加入等体积的金纳米溶液，混合反应12h，离心得到乙炔基修饰的金纳米粒子。将得到的叠氮基修饰的金纳米粒子溶液和乙炔基修饰的金纳米粒子溶液按照1:1混合，得到显色液B。
实验结果如图3所示修饰叠氮基和乙炔基后，金纳米粒子紫外吸收峰有稍微红移，Zeta修饰后同样发生改变。
实例6金黄色葡萄球菌检测实验
取待测样品液100μL，功能免疫磁纳米探针1mL，于室温反应30min,磁分离，去上清，PBS缓冲液洗3遍，加入0.5mL显色液A反应10min，再加入显色液B，显色5min，于紫外分光光度计测吸收光谱。
如图4所示，随着金黄色葡萄球菌浓度增大，检测管颜色依次由蓝色变成蓝紫色到红色，当金葡菌浓度为50CFU/mL时，检测管与空白管之间有明显差别，因此金黄色葡萄球菌可视化检测限为50CFU/mL。将检测管在紫外分光光度计下扫描光谱，得到不同浓度下的光谱图，以Δ(A530/A760)为纵坐标，金葡菌浓度为横坐标，得到10-106CFU/mL范围内，金黄色葡萄球菌检测线性曲线，期中R2＝0.9975，说明在该范围内，数据的一致性较好，检测结果较可靠。
实例7金黄色葡萄球菌检测试剂盒的选择性
选取常见的4种食源性致病菌：单核细胞增生性李斯特菌，大肠杆菌O157：H7，副溶血性弧菌和沙门氏菌，将本发明检测方法对其检测，取待测样品液各100μL，功能免疫磁纳米探针1mL，于室温反应30min,磁分离，去上清，PBS缓冲液洗3遍，加入0.5mL显色液A反应10min，再加入显色液B，显色5min，于紫外分光光度计测吸收光谱。
实验结果如图5a所示，当检测体系中含有金黄色葡萄球菌时，检测管颜色为红，其他菌检测管颜色和空白管颜色一致。图5b所示为根据紫外光谱按照(Δ(A530/A760)所得柱状图，可见空白管和干扰菌之间无差异性，加入金葡菌管，与其他管之间有明显差异，说明该检测试剂盒对金葡菌有优异的选择性。
实例8本发明对猪肉中金黄色葡萄球菌的检测
1)制备猪肉浸出液：精确称取5g猪肉，加入10mL灭菌PBS缓冲液，研磨均匀后，用滤纸过滤，用0.22μm滤膜对滤出液进行抽滤；
2)使用本发明对金黄色葡萄球菌进行检测：
取不同浓度的金黄色葡萄菌接种于该浸出液中，用本发明检测方法对其进行检测。取待测样品液100μL，功能免疫磁纳米探针1mL，于室温反应30min,磁分离，去上清，PBS缓冲液洗3遍，加入0.5mL显色液A反应10min，再加入显色液B,显色5min，于紫外分光光度计测吸收光谱。
图6a为标准菌液在10-106CFU/mL范围内的标准曲线，分别加入不同浓度样品(50CFU/mL，500CFU/mL，5000CFU/mL)后，结果如图6b所示，根据标准曲线，确定样品中金黄色葡萄菌的数量。计算加标回收率为91.15-106.36％。这表明所该检测方法在食品检测中具有良好的适用性。
由此可见，本发明提供的基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒主要通过免疫磁纳米探针特异性浓缩目标菌实现对金黄色葡萄球菌的快速富集与分离，利用生物酶水解反应和点击化学反应，结合纳米金的比色效应，实现对金黄色葡萄球菌的快速比色检测和定量检测，定量检测变异系数小，线性范围宽，检测限可低至2.4CFU/mL，比色检测限为50CFU/mL。此外，采用本发明检测试剂盒的检测方法操作步骤简单，成本低廉，检测时间短，稳定性好。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (8)

1.一种基于免疫磁分离和点击化学反应的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于，包括免疫磁纳米探针、显色液A、显色液B、10-106CFU/mL标准菌检测比色卡、磁铁和无菌PBS缓冲液；
所述显色液A为抗坏血酸磷酸酯与硫酸铜混合液；
所述显色液B为叠氮基和乙炔基修饰的金纳米粒子混合液。
2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的免疫磁纳米探针为碱性磷酸酶和金黄色葡萄球菌适配体标记的羧基化磁珠。
3.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的显色液A为抗坏血酸磷酸酯与硫酸铜按1:5比例配置而成，所述抗坏血酸磷酸酯浓度为5mM。
4.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的免疫磁纳米探针浓度为0.5mg/mL，显色液A为0.5mL，显色液B为0.5mL。
5.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的免疫磁纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
1)将将1.08g六水合氯化铁与22mL乙二醇超声混匀；
2)向1)中加入1.2g结晶乙酸钠、0.2g柠檬酸三钠和0.2g聚乙二醇6000；
3)将溶液2)置于反应釜中，在200℃的温度下反应18h，用磁铁分离得到的黑色磁性固体物质，用超纯水和乙醇交替清洗，得到羧基化Fe3O4纳米磁珠；
4)取羧基化Fe3O4纳米磁珠超声分散于PBS缓冲液中，使其浓度为5mg/mL；
5)向4)中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，使其浓度为10mg/mL；
6)30min后，用PBS缓冲液清洗并重悬于1mLPBS缓冲液中，加入1mg碱性磷酸酶，室温反应2h，加入0.1μM金黄色葡萄球菌特异性适配体反应12h，得到功能化免疫磁纳米探针。
6.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的显色液B的制备方法，包括如下步骤：
1)取2mM叠氮基-PEG-SH将其分散于0.5mL甲醇与水体积比为2:1的混合液中；
2)向2)中加入等体积的金纳米溶液，混合反应12h，离心得到叠氮基修饰的金纳米粒子溶液；
3)取2mM乙炔基-PEG-SH将其分散于0.5mL甲醇与水体积比为2:1的混合液中；
4)向3)中加入等体积的金纳米溶液，混合反应12h，离心得到乙炔基修饰的金纳米粒子溶液；
5)将2)中得到的叠氮基修饰的金纳米粒子溶液和4)中得到的乙炔基修饰的金纳米粒子溶液按照体积比1:1混合，得到显色液B。
7.根据权利要求6所述的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的金纳米粒子溶液的制备方法，包括如下步骤：
1)将所用器皿用硝酸和盐酸体积比为1:3的混合液在通风橱内浸泡1h，用超纯水冲洗并用氮气吹干；
2)将0.005g的三水合氯金酸置于器皿中加热至沸腾，在搅拌的状态下快速加入0.02g柠檬酸三钠和0.001g柠檬酸，5min后，得酒红色金纳米粒子溶液。
8.一种金黄色葡萄球菌的检测方法，使用权利要求1-7任意一项所述的金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：
1)取待测食品研磨，取5g匀浆，加入10mL无菌PBS缓冲液，充分混匀，取500μL浸出液于离心管中；
2)加入免疫磁纳米探针1mL，室温下漩涡混匀30min，磁分离弃上清，加入显色液A，反应10min，再加入显色液B，反应5min；
3)磁吸附取上清，测定紫外吸收光谱。
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