CN110808137A - 一种磁性富集材料、水体细菌检测试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本公开属于细菌检测技术领域，具体涉及一种磁性富集材料、水体细菌检测试剂盒及应用。本公开提供了一种磁性温敏富集材料，采用热敏聚合物聚(N‑异丙基异丙烯酰)及刀豆球蛋白A对磁性四氧化三铁纳米颗粒进行修饰，该富集材料通过刀豆球蛋白A对细菌的亲和性实现对水体环境中细菌的吸附作用，通过热敏聚合物的升温相变实现细菌的脱离。本公开还提供了一种包括上述磁性温敏富集材料的试剂盒，还包括对解吸附后的细菌进行显色的试剂。该试剂盒可以实现对水体中细菌的可视化检测，如果颜色溶液发生变化则证明有细菌，并且颜色变化的速度与细菌浓度呈正比。该试剂盒检测速度快，灵敏度高，可应用于水质监测、水污染防治，灾后疫情防控等领域。

Description

一种磁性富集材料、水体细菌检测试剂盒及应用
技术领域
本公开属于细菌检测技术领域，具体涉及一种磁性温敏富集材料，包括该富集材料的水体细菌检测试剂盒以及在水体环境监测及水污染防治领域的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
细菌是一类重要的病原体，它们侵入机体后会分泌产生大量的生物毒素，从而破坏机体的结构和功能，造成宿主感染，引发诸如肠胃炎、肺炎、脓毒症等多种疾病。近年来，随着水污染问题的逐步加重，由水体病原细菌引起的感染疾病已成为危害人民身体健康的重要因素，引起了社会的广泛关注。因此为实现水体质量快速检测，更好地保障社会公共健康和避免经济损失，研究水体细菌的快速分析检测技术具有非常重要的意义。
目前市场上细菌的检测技术主要有细菌培养法和聚合酶链式反应(PCR)法。这两种方法都存在着各自的优缺点。细菌培养法是目前检测细菌最常用的分析方法，但是细菌培养法的耗时较长(几天时间)、且操作繁琐、灵敏度低、稳定性差，尤其是较长的培养时间给实际水体质量检测工作带来了严重不便。PCR法具有灵敏度高、准确性好等优点，且可以同时测定多种细菌。但PCR法的成本及技术水平要求高，且操作繁琐，需经过细菌裂解、核酸提取及扩增等多个步骤。另外，虽然相比传统的细菌培养法，PCR法已大大缩短了细菌的检测周期(3.5-10小时)，但还是难以满足实际现场快速检测的需求。
由于水体环境中细菌的数量比较低(通常在痕量级别1-100CFU/mL)，因此如能进一步提高细菌的检测灵敏度，将会对实际水体质量的检测工作大有帮助。
发明内容
基于上述研究背景，发明人认为，建立一种简便的、灵敏度较高的水体细菌现场快速检测技术非常重要和迫切。基于该技术目的，本公开针对水体中细菌的富集和检测技术进行了研究，提供了一种吸附效率更高，更适应于现场快速检测的方法。
基于上述研究背景，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供一种磁性温敏富集纳米材料，所述纳米材料采用热敏性聚合物对磁性四氧化三铁纳米材料进行功能化修饰，并在热敏聚合物表面偶联细菌特异性分子。
在庄孟瑶的研究中，提供了一种刀豆蛋白A功能化的磁性四氧化三铁纳米材料，在纳米载体表面包裹油酸对磁性四氧化三铁纳米粒子进行保护，再通过多巴胺自聚-氧化作用对复合载体进行表面修饰，该复合载体可通过刀豆蛋白A与细菌表面的甘露糖组分进行特异性识别，从而实现对细菌的吸附作用。本公开提供了一种性能更优的富集材料，采用热敏性聚合物聚(N-异丙基异丙烯酰)作为磁性四氧化三铁的表面修饰，该聚合物首先能够为刀豆蛋白A的附着提供更多的位点，大大提高了对细菌特异性分子(如刀豆蛋白A)的承载能力，提高了对细菌的捕获能力；其次，在磁性四氧化三铁表面附着聚合物能够提高纳米颗粒的稳定性，而聚合物表面的刀豆蛋白A则能够对热敏聚合物起到保护作用，提高整体的稳定性。
优选的，所述热敏聚合物为聚(N-异丙基异丙烯酰)。
优选的，所述细菌特异性分子为抗生素或刀豆蛋白A。
本公开第二方面，提供一种磁性温敏富集纳米材料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：向Fe3O4磁性纳米粒中加入聚(N-异丙基丙烯酰胺)保护的Fe3O4，再依次加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯溶液及刀豆蛋白溶液使其分散均匀既得。
优选的，所述Fe3O4磁性纳米粒的制备方法如下：将Fe3O4分散至乙醇中，离心去除上清液后加入四甲基氢氧化铵溶液再次分散均匀，再加入异丙醇离心除去上清得到所述Fe3O4磁性纳米粒。
优选的，所述二琥珀酰亚胺基碳酸酯溶液为N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的乙腈溶液。
优选的，所述刀豆蛋白溶液为刀豆蛋白A的PBS缓冲溶液。
本公开第三方面，提供第一方面所述磁性温敏富集纳米材料在制备水体细菌检测制剂中的应用。
该富集材料采用磁性四氧化三铁纳米材料，投入水体环境中后可以通过磁铁方面的回收；通过热敏聚合物连接纳米颗粒及刀豆蛋白A，可以通过调节洗脱液的温度方便的实现细菌的解离，无需额外的解吸附操作。并且热敏聚合物表面具有丰富的结合位点用以承载刀豆蛋白A，大大提高了对细菌的捕获能力，提高检测灵敏度。
本公开第四方面，提供一种水体细菌检测试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述磁性温敏富集纳米材料。
优选的，所述试剂盒还包括洗脱液及显色液。
进一步优选的，所述洗脱液为PBS缓冲液，缓冲液中还包括磷酸氢根离子，及氯离子。
在一些具体的实施例中，所述洗脱液中包括PBS、Na2HPO4、NaCl、KH2PO4、KCl。
在一些具体的实施例中，所述洗脱液为经灭菌处理的试剂。
进一步优选的，所述显色液中包括显色剂C1、显色剂C2及含铜离子试剂；所述显色剂C1为炔基(SH-ALK)修饰的金纳米颗粒，所述显色剂C2为叠氮基团(SH-N3)修饰的金纳米颗粒。
金纳米颗粒分别进行炔基及叠氮基团功能化修饰，利用细菌还原Cu2+引发点击反应的策略，促使炔基及叠氮基团修饰的金纳米颗粒间发生交联团聚，进而通过纳米金溶液颜色的变化(由红到灰)实现对水体细菌的高特异性现场快速检测。
进一步优选的，所述洗脱液的工作温度为-2～2℃。
本公开提供的试剂盒，通过富集材料捕获水体环境中的细菌，通过调节洗脱液加入的温度实现细菌与纳米材料的脱离，经本公开验证，洗脱液加入待测液体的时的温度，即工作温度，优选为-2～2℃，低温状态下聚合物可通过溶胀作用从磁性纳米材料表面脱离，实现菌体的脱附，其中，最适宜的工作温度为0℃。
本公开第五方面，提供一种对水体中细菌进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将第一方面所述磁性温敏富集纳米材料加入待测水体中，震荡一段时间使所述纳米材料中分析吸附水体中的细菌；
(2)通过磁铁固体磁性温敏富集材料，去除液体部分；
(3)向步骤(2)中得到的磁性温敏富集材料中加入工作温度的洗脱液后震荡，之后获取液体部分；
(4)向步骤(3)中得到的液体部分中加入显色剂，观察其颜色变化并测试紫外光谱。
本公开第六方面，提供第一方面所述磁性温敏富集纳米材料及第四方面所述水体细菌检测试剂盒在水体监测领域的应用。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
1.本公开为了提高水体中细菌检测的灵敏度和速度，对细菌富集技术进行了深入研究，提供了一种富集效率更高的吸附材料，以磁性纳米材料作为载体，通过热敏聚合物可以方便的实现细菌的吸附和脱离，并且为细菌吸附因子提供更为丰富的结合位点。
2.本公开还提供了一种用于水体中细菌检测的试剂盒，所述试剂盒中包括富集材料、洗脱液及显色液。基于上述磁性温敏富集纳米材料，本公开以磁性纳米材料作为载体，可以通过磁铁将纳米材料进行方便的固定，并且通过调整洗脱液的工作温度即可实现细菌的快速脱附，通过可视化观察试剂的颜色变化即可方便的确定水中细菌的浓度，尤其适用于现场办公的检测要求。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为本公开中基于磁性温控富集细菌纳米试剂及点击反应辅助纳米金比色法的水体细菌快速检测示意图；
图2为实施例3中菌液加入显色剂后的颜色变化图；
其中图2A为未加入硫酸铜溶液，溶液呈现红色；
图2B为加入硫酸铜溶液后30s，溶液由红开始变蓝；
图2C为加入硫酸铜溶液后30min，溶液逐渐转变为深蓝色；
图2D为加入硫酸铜溶液后3h，溶液均变为无色。
图3为实施例3中大肠杆菌及金黄色葡萄球菌紫外测定图谱；
其中，图3A为浓度为105大肠杆菌洗脱液紫外图谱；
图3B为浓度为107大肠杆菌紫外图谱；
图3C为浓度为105金黄色葡萄球菌洗脱液紫外图谱；
图3D为浓度为107金黄色葡萄球菌紫外图谱；
图4为实施例2中所述试剂盒样品图；
从左至右依次为四氧化三铁纳米颗粒溶液，PBS洗脱液，SH-ALK修饰的金纳米颗粒溶液，SH-N3修饰的金纳米颗粒溶液，CuSO4溶液，依次为黑色、无色、红色、紫红色及蓝色。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，为了克服现有技术中中的不足，本公开提供了一种磁性温敏富集纳米材料，及水体中细菌检测试剂盒。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
本实施例中，提供一种磁性纳米温敏富集试剂及其制备方法。
所述磁性纳米温敏富集试剂的制备方法如下：
取62.2mgFe3O4，加入5ml乙醇，4mL水，超声至完全分散。离心去除上清液后加入10mL 0.2M四甲基氢氧化铵溶液，震荡5min，超声至完全溶解。加入4ml异丙醇，离心去除上清液。用6ml丙酮洗涤两次。
取127.0mg聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)加水超声至完全溶解，加入处理好的Fe3O4，室温下震荡反应3h，得聚合物保护的Fe3O4。产物离心去除水。用500μL乙腈洗涤两次。加入B溶液500μl，超声至完全分散，室温振荡反应10min，离心去除反应液。用500μL乙腈洗涤两次，加入500μL C溶液，室温震荡反应一小时后，离心去除上清液，PBS洗涤三次后，冰箱保存。
B液：N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯10mM(溶剂是乙腈)。
C液：刀豆蛋白A(ConA)，30mg/mL，(PBS缓冲溶液)。
实施例2
本实施例中提供一种用于水体中细菌含量快速检测试剂盒，具体为一种基于纳米金点击还原快速检测水体中细菌污染的试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)实施例1所述磁性纳米温敏富集试剂；
(2)洗脱液；
(3)显色剂。
其中，洗脱液为灭菌处理的10mM PBS缓冲液(PH＝7.4)，所述缓冲液中还包括8mMNa2HPO4，136mM NaCl，2mM KH2PO4，2.6mM KCl。
所述显色剂为包括显色剂C1,C2及硫酸铜；其中C1为炔基修饰的金纳米悬浮溶液，C2为叠氮修饰的金纳米颗粒溶液。
所述显色剂中C1，C2，CuSO4的浓度为200mM。
本实施例中还提供显色剂C1及C2的制备方法，具体步骤如下：
取100ml 0.006％的氯金酸(HAuCl4)溶液，加热搅拌至沸腾，5min后，快速加入3ml1％的柠檬酸钠(C6H5Na3·2H2O)溶液，沸腾30min至酒红色，冷却至室温，储存备用。
两个100ml圆底烧瓶中各加入50ml制备的纳米金溶液，向圆底烧瓶①中加入8.4mgALK-PEG-SH，1.24mg SH-PEG,向圆底烧瓶②中加入6.8mg SH-PEG，9.0mg SH-PEG-N3，搅拌反应12h。反应完成后，8000r离心10min，去除多余PEG，下层修饰后的纳米金溶液冷藏保存。圆底烧瓶①中得到的产品为显色剂C1，圆底烧瓶②中得到的产品为显色剂C2。
实施例3
本实施例中，提供一种对水体中细菌进行快速检测的方法，所述方法通过实施例2中的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
(1)取待检测水样5mL，5000r离心2分钟；
(2)取1mL上清液重悬沉淀物，弃掉其余上清液体；
(3)向步骤(2)中得到的重悬液中加入磁性纳米温敏富集试剂(100μL)，震荡30min。菌液与磁性四氧化三铁纳米颗粒充分接触，细菌被聚合物表面的刀豆蛋白A特异性捕捉。用磁铁将磁性纳米材料吸至壁侧，移液枪移去上清液。
(4)向步骤(3)中得到的磁性纳米颗粒中加入0℃的洗脱液(100μL)，快速震荡(2min)。纳米颗粒表面的热敏聚合物在低温下会发生溶胀，将细菌释放到洗脱液中，起到富集浓缩细菌的作用。用磁铁将磁性纳米材料吸至壁侧，收集清液。重复该步骤两次，并合并两次清液。
(5)向步骤(4)中得到的清液中依次加入显色剂C1(250μL)、C2(250μL)、硫酸铜溶液D(200μL)。轻微震荡后观察其颜色变化。
(6)紫外测定：以清水作为紫外测定的基线，分别取1000μL SH-ALK修饰的金溶液和和1000μLSH-N3修饰的金溶液混匀，分成两份，一份加入20μLPBS洗脱液混合均匀，用紫外测定300-800nm处的吸收值；另外一份加入20μL PBS洗脱液和20μL CuSO4溶液，混合均匀后测定其300-800nm处的吸收值，观察峰值变化情况。
菌液浓度与检测效果如图2所示，图2中试剂瓶中菌液浓度从高到低依次为104、105、106、107CFU/mL，加入显色剂后，溶液颜色如图2A所示，呈现红色，再加入硫酸铜溶液之后，试剂颜色从红色开始逐渐转变为蓝色，菌浓度越高颜色变化越快，因而图2B中4个试剂瓶呈现出由红到紫再到蓝的轻微渐变。
通过用紫外分光光度计分别测定相同波长下金原液加PBS洗脱液的混合液以及该混合溶液加入CuSO4溶液的吸光度曲线可知，加入CuSO4溶液后峰值明显向下移动且发生红移，说明细菌与纳米金结合，在铜离子做催化剂的条件下发生点击反应而聚集，因而最大吸收峰发生偏移，且因为溶液中细菌浓度减小，所以峰值还会下降。且观察不同浓度的PBS洗脱液还可以看出，细菌浓度越大，位移越大，峰值下降也越明显。
通过实验观察可知，在铜离子存在条件下，显色剂与菌液混合后，溶液颜色由红色变为紫色，一段时间后变为灰蓝色，久置后都变为无色。且菌液浓度越高，颜色变化越快。说明在铜离子做催化剂的条件下，纳米金确实和菌液发生了显色反应，且颜色变化速度与细菌浓度呈现正相关，经检测本公开提供的检测方法可检测出103CFU/mL及以上的细菌浓度。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种磁性温敏富集纳米材料，其特征在于，所述纳米材料采用热敏性聚合物对磁性四氧化三铁纳米材料进行功能化修饰，并在热敏聚合物表面偶联细菌特异性分子。
2.如权利要求1所述磁性温敏富集纳米材料，其特征在于，所述热敏聚合物为聚(N-异丙基异丙烯酰)。
3.如权利要求1所述磁性温敏富集纳米材料，其特征在于，所述细菌特异性分子为抗生素或刀豆蛋白A。
4.一种磁性温敏富集纳米材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：向Fe3O4磁性纳米粒中加入聚(N-异丙基丙烯酰胺)保护的Fe3O4，再依次加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯溶液及刀豆蛋白溶液使其分散均匀既得。
5.权利要求1-3任一项所述磁性温敏富集纳米材料在制备水体细菌检测制剂中的应用。
6.一种水体细菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述磁性温敏富集纳米材料。
7.如权利要求6所述水体细菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗脱液及显色液；优选的，所述洗脱液为PBS缓冲液，缓冲液中还包括磷酸氢根离子，及氯离子。
8.如权利要求6所述水体细菌检测试剂盒，其特征在于，所述显色液中包括显色剂C1、显色剂C2及含铜离子试剂；所述显色剂C1为炔基修饰的金纳米颗粒，所述显色剂C2为叠氮基团修饰的金纳米颗粒；优选的，所述洗脱液的工作温度为-2～2℃。
9.一种对水体中细菌进行检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1-3任一项所述磁性温敏富集纳米材料加入待测水体中，震荡一段时间使所述纳米材料中分析吸附水体中的细菌；
(2)通过磁铁固体磁性温敏富集材料，去除液体部分；
(3)向步骤(2)中得到的磁性温敏富集材料中加入工作温度的洗脱液后震荡，之后获取液体部分；
(4)向步骤(3)中得到的液体部分中加入显色剂，观察其颜色变化并测试紫外光谱。
10.权利要求1-3任一项所述磁性温敏富集纳米材料及第四方面所述水体细菌检测试剂盒在水体监测领域的应用。
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