CN107941773A - 一种基于荧光分子的内毒素的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种基于荧光分子的内毒素的检测方法，制作LPS的标准曲线，用纯水或PBS作系列稀释，按LPS总积与SO体积比为1︰10或1︰20加入5x的SO，37℃避光反应5～10min，以425nm为激发波长，检测470nm的发射波长的荧光，或进行500～700nm的范围扫描，以LPS浓度为横坐标，以470nm的荧光值为纵坐标，作图，用线性拟合的方式得到线性方程，对于待测样品，可参照与标准曲线同样的反应条件和系统，检测未知样品的荧光值，并由标准曲线方程计算出相应的LPS的含量；通过荧光光谱强弱的变化，则用于检测小分子与LPS是否存在相互作用，若用于定性分析，则可在荧光显微镜下观察有无荧光出现的方式。

Description

一种基于荧光分子的内毒素的检测方法

技术领域

本发明涉及内毒素脂多糖(lipidopolysaccharides,LPS)，尤其是涉及可用于其含量及定性检测的一种基于荧光分子的内毒素的检测方法。

背景技术

LPS是一种细菌内毒素，是由糖类和脂类组成。存在于革兰氏细菌细胞的表面，参与细菌与宿主细胞的粘附和毒性的产生。通过菌体裂解而进入细胞内，导致休克等中毒症状，不仅如此，在发热及感染等疾病均伴随有内毒素引起的疾病。因而检测其含量无论是对临床诊断和分析检测方面均具有重要的意义。

迄今为止，药典(2010版一部)采用的LPS检测方法如鲎试剂法，其被广泛采用，但是实验需要鲎血，不利于动物保护。因而寻找高效、灵敏和特异性强的小分子检测试剂，具有重要的意义。

Sypro orange(SO)是含有非极性并带有正电荷的小分子化合物，其通过与蛋白质的非极性区域结合从而被用来对蛋白质染色。而LPS其分子中具有脂A的非极性区域，同时其中与糖基结合的磷酸基团带有负电荷，具备与SO特异性结合的潜力。

迄今为止尚未见有关于SO用于LPS的分析检测及其与之相关用途的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于荧光分子的内毒素的检测方法。

本发明的具体步骤如下：

1)制作LPS的标准曲线，用纯水或PBS作系列稀释，按LPS总积与SO体积比为1︰10或1︰20加入5x的SO，37℃避光反应5～10min；

2)以425nm为激发波长，检测470nm的发射波长的荧光，或进行500～700nm的范围扫描；

3)以LPS浓度为横坐标，以470nm的荧光值为纵坐标，作图，并用线性拟合的方式得到线性方程；

4)对于待测样品，参照与标准曲线同样的反应条件和系统，检测未知样品的荧光值，并由标准曲线方程计算出相应的LPS的含量；

5)通过荧光光谱强弱的变化，用于检测小分子与LPS是否存在相互作用，若用于定性分析，则可在荧光显微镜下观察有无荧光出现的方式。

所述制作LPS的标准曲线可以纯水或PBS配制成1mg/mL。

本发明可用于临床和科学研究。

本发明可用于LPS的含量测定及其细胞内外的定性分析。本发明所用的试剂为商品化的Sypro orange(5000x)，中文为宝石橙；商品化的LPS，用于制作标准曲线。本发明所用的仪器如多功能酶标仪(微量的96孔板检测)或荧光分光光度计(用比色皿检测)等用于样品的荧光检测。

研究表明，SO与LPS具有较强的结合作用，LPS可使SO的荧光增强，且呈现剂量依赖的关系。LPS分子带有负电荷且含有非极性较强的脂A，因而可与带有正电荷和非极性的SO通过静电引力和疏水作用进行结合。因而与基于吸收光谱法的鲎试剂法比较，荧光法具有更高的灵敏度，且SO较易获得，因而用SO检测LPS具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为LPS对SO荧光影响的光谱图。在图1中，横坐标为发射波长(从500nm至800nm)，纵坐标为随着LPS浓度的变化，荧光(F)强度的变化；由图1表明，SO与LPS结合作用，随着LPS浓度的增加，SO的荧光强度增强。其比SO单独存在时的荧光强度高出约20～30倍。

图2为SO与LPS的拟合曲线。在图2中，横坐标为LPS的浓度，纵坐标为荧光强度；由图2表明，SO与LPS具有较强的结合作用。

图3LPS与SO在红细胞体系中的作用。在图3中，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；红细胞模型考察细胞水平LPS对SO的荧光变化，由图3显示，LPS与SO在细胞体系也能有很好的作用。

具体实施方式

下面结合具体实例进一步阐述本发明，。

实施例1、荧光光谱法检测LPS的浓度变化

在该实施例中，使用荧光光谱法检测LPS的浓度变化

试验方法：

使用大肠杆菌来源的商品化LPS，溶于PBS(pH 7.4)或超纯水中，使成1mg/mL。SO(5000X)溶于DMSO，购自Sigma公司(上海)。实验前先将LPS用PBS(pH 7.4)稀释至1μM；SO稀释到50X，反应体系的终浓度5X。

取2mL至荧光比色皿并置于荧光分光光度计中，实验在303K温度下进行。SO溶于DMSO中，浓度为5X。实验采取滴加的方式增加体系中LPS的含量，每次加入后都要充分混匀，待体系稳定后重复测定3次。LPS的浓度变化分别为0、0.04、0.06、0.08、0.1、0.16mg/mL。

仪器参数设置：激发波长为465nm，激发及发射狭缝宽度均为5nm，扫描速度为快速扫描(间隔2nm/次)，记录500～700nm的荧光光谱。

A.取少量LPS与SO染液混合加入96孔板中，另加一组不加LPS只有SO染液的对照组，用PBS补齐至250μl。先用酶标仪在425nm的激发光下测量450～800nm波长的吸收峰，测得最高峰对应波长为470nm。然后在470nm下荧光扫描500～800nm波长的荧光峰值，测得最高峰对应波长为610nm。

B.取一个干净的96孔板，按照表1所列出的加样。

表1

将96孔板放置入酶标仪中，在470nm激发光下测量610nm处荧光值。

试验结果：

LPS对SO的荧光具有较强的猝灭作用(图1)，表明LPS浓度变化可以促进SO荧光的增强。

实施例2、LPS与SO的拟合曲线

在该实施例中，使用Origin软件采用Fitting中的liner fitting模块，对LPS与SO的结合曲线进行拟合。

试验方法：

以LPS浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，作图(图2)。

试验结果：

通过拟合得到LPS与SO的线性方程y＝0.07815+143.75x，由该方程可以计算出样品的LPS的含量。

实施例3、LPS对SO荧光的影响与应用

在该实施例中，采用红细胞体系检测LPS对SO荧光的影响，考察其它小分子对葡萄糖吸收的影响，以LPS，SO存在时为参照。

试验方法：

A.将制备好的血样放入37℃恒温培养箱中孵育1h。目的是为了将体系中的葡萄糖消耗干净。此时需要把加样枪头也一并放入培养箱中预热待用，防止加样时温度下降。

B.取一个干净的96孔板，按照表1所列出的加样。含葡萄糖的PBS(GPBS)需要与反应体系分开加入至两排96孔板中，等到进入酶标仪测量时再混合开始反应。测定红细胞吸收葡萄糖时的荧光值参见表2。

表2

将96孔板放入酶标仪中，调整程序，在470nm激发波长下测610nm波长处的荧光值，并在37℃下运行。需要先将96孔板和仪器预先加热至37℃后，退出程序，将右边一排的GPBS用加样器吸取100μl加入左边的反应体系中，并迅速开始程序测定荧光值。

试验结果：

不同浓度的LPS比阳性对照比较，加入小分子后，会影响二者的荧光强度。说明该体系可以用于监测小分子，以及监测红细胞对葡萄糖的吸收。

Claims (2)

1.一种基于荧光分子的内毒素的检测方法，其特征在于其具体步骤如下：

1)制作LPS的标准曲线，用纯水或PBS作系列稀释，按LPS总积与SO体积比为1︰10或1︰20加入5x的SO，37℃避光反应5～10min；

2)以425nm为激发波长，检测470nm的发射波长的荧光，或进行500～700nm的范围扫描；

3)以LPS浓度为横坐标，以470nm的荧光值为纵坐标，作图，并用线性拟合的方式得到线性方程；

4)对于待测样品，参照与标准曲线同样的反应条件和系统，检测未知样品的荧光值，并由标准曲线方程计算出相应的LPS的含量；

5)通过荧光光谱强弱的变化，用于检测小分子与LPS是否存在相互作用，若用于定性分析，则可在荧光显微镜下观察有无荧光出现的方式。

2.如权利要求1所述一种基于荧光分子的内毒素的检测方法，其特征在于所述制作LPS的标准曲线为纯水或PBS配制成1mg/mL。