CN104777317B - 一种金纳米粒子探针的制备及其在快速免疫检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金纳米粒子探针的制备以及该探针在快速免疫检测中的应用。所述金纳米粒子探针是通过PEG‑NHS将抗体与胶体金连接起来构成。利用抗原‑抗体的相互作用，将金纳米粒子探针与待测抗原结合，然后向体系中加入金的生长液，引起胶体金溶液颜色的变化。基于胶体金颜色的改变来实现蛋白的定性与定量检测。与传统的ELISA相比免去了多次洗涤与孵化的步骤，具有快速、使用方便、成本低廉等特点，适合现场检测。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测分析领域，尤其涉及一种金纳米粒子探针的制备及其在快速免疫检测中的应用。
背景技术
蛋白质的快速、准确分析是临床诊断、蛋白质组学、制药以及生物学等领域的一门主要学科。依赖于抗原-抗体相互作用的免疫测定被广泛应用于蛋白质的分析。为了检测目标分析物，各种各样不同的标记物被引入到这种免疫分析中，例如荧光团、放射性同位素、电化学发光标记、拉曼标记、DNA条形码以及酶等。在这些信号传感器中，酶联免疫吸附法(ELISA)作为临床检测的黄金标准，通过颜色的变化来检测分析物的含量，这些颜色的变化通过肉眼就可以识别，因此不需要借助于先进的仪器来进行分析。
尽管在蛋白检测中已经取得了相当大的进步，但是基于ELISA检测的诸多方法仍然面临很多的挑战。首先，目标蛋白的捕获抗体在二维表面上是被随机固定的，这常常会导致待检测物不能够充分的被固定的抗体所捕获，因而影响检测的灵敏度。第二，所标记酶的活性对所处的环境条件非常敏感，使得ELISA试剂盒在运输、储存和使用过程中造成不便。第三，在典型的ELISA检测中，多步的孵化和清洗是不可避免的，因此，整个ELISA通常需要几个小时到几天的时间才能得到分析结果。这些缺点使得ELISA不适和作为及时诊断的方法。
发明内容
本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种用于快速免疫检测的金纳米粒子探针的制备及其在蛋白检测方面的应用。所述金纳米粒子探针通过PEG-NHS将待测物质对应的抗体与胶体金相结合，然后用于检测蛋白等大分子物质。本发明中利用控制金纳米粒子探针的生长来改变金纳米颗粒之间的距离，从而产生颜色变化来进行蛋白分析物含量的测定。主要特点是整个检测过程是一个不需洗涤、无酶标记的均相检测体系。
为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于快速免疫检测的金纳米粒子探针的制备，具体步骤如下：
1)向柠檬酸根保护的胶体金(AuNPs)中加入PEG-NHS，室温下反应，PEG-NHS会通过Au-S键固定到金的表面从而形成PEG保护的金纳米粒子(PEG-AuNPs)；得到的PEG-AuNPs离心，将沉淀物重新分散到磷酸盐缓冲液(PBS)中，如此重复两次；
2)将抗体(Ab)与PEG-AuNPs在低温下孵化过夜，Ab会通过与金上的PEG反应从而与金相连接，得到Ab-AuNPs；接下来，向反应混合物中加入磷酸盐缓冲液；将金上没有与抗体反应的PEG失活；上述体系在室温下反应离心，将沉淀物分散在去离子水中，制备得到用于快速免疫分析的金纳米离子探针。
步骤1)所述PEG-NHS具有如下结构
步骤2)所述的抗体是能够特异性识别待检测抗原的抗体。
步骤1)所述胶体金与PEG-NHS的摩尔比值为1:1-50000；室温下反应时间为0.5-10h；离心的转速为10000-14000r/min，离心时间为10-30min；磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.2-7.4。
步骤2)所述抗体与PEG-AuNPs孵化温度为2-10℃；磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH为8.5，室温下反应时间为0.25-5h；离心的转速为10000-14000r/min，离心时间为10-30min。
本发明同时提供了一种将金纳米粒子探针用于快速检测蛋白的方法，包括如下步骤：
将上述方法制备的金纳米粒子探针(Ab-AuNPs)与已知不同浓度的抗原进行孵化；将金的生长液加入到上述孵化液中；然后，用微孔板读数器读取它们在525nm处相应的吸光度值，将抗原的浓度值与它们的–ΔA525做线性拟合，(ΔA525＝A–A0，其中A是向Ab-AuNPs溶液中加入待检测抗原和金的生长液以后在525nm处的吸收，A0是只加入金的生长液后在525nm处的吸收)，根据所得直线方程可以得到未知浓度的待检测抗原。
由于蛋白的尺寸比较大，用蛋白使金纳米粒子聚集后离子间的距离比较大，所以不会产生明显的颜色变化。本发明中通过加入金的生长液来控制金纳米粒子探针的生长，从而改变金纳米颗粒之间的距离，产生颜色变化来进行蛋白分析物含量的测定，整个检测过程示意图如图1所示。
本发明所述Ab-AuNPs与已知浓度蛋白的摩尔比值为1:0-400；加入待检测蛋白后的孵化温度为37℃，孵化时间为0.5-2h；金的生长液是终浓度分别为20mM的盐酸羟胺和120μM的氯金酸溶液的混合液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
由于金纳米颗粒具有很高的消光系数，因此它被用于构建比色的分析方法来检测从离子、有机小分子到DNA、酶等多种分析物，这些分析方法主要运用了由这些目标检测引起的金聚集后产生的光学改变的性质，使溶液产生从红色到蓝色(或紫色)的颜色改变。当发生明显颜色变化的时候，粒子间的距离是小于金纳米粒子直径的。由于蛋白的尺寸比较大，用蛋白使金纳米粒子聚集后离子间的距离仍然会大于金纳米颗粒的尺寸，所以不会产生明显的颜色变化。本发明中利用控制金纳米探针的生长来改变金纳米颗粒之间的距离，从而产生颜色变化来进行蛋白分析物含量的测定。与传统的ELISA相比免去了多次洗涤与孵化的步骤，具有快速、使用方便、成本低廉等分析特点，适合现场检测和家庭个性化诊断。
附图说明
图1利用金纳米离子探针检测示意图。
图2是合成一端为硫辛酸另一端为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基的聚乙二醇(PEG-NHS)连接链。
图3是金纳米粒子探针的制备的示意图。
图4是不同浓度IgG在–ΔA525处的拟合直线图。–ΔA525＝A–A0，其中A是向Anti-IgG-AuNP溶液中加入IgG和金的生长液以后在525nm处的吸收，A0是只加入金的生长液后在525nm处的吸收。生长30s后–ΔA525与IgG的浓度呈线性关系。误差线代表了三次独立实验的标准偏差。
图5是金纳米粒子探针用于检测CEA的结果图，其中(a)是不同浓度CEA在–ΔA525处的拟合直线图；(b)正常人血样(A1-6)和病人血样(B1-6,C1-6,and D1-6)检测结果显色图；(c)用基于金纳米粒子探针和普通ELISA方法检测结果柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。除非本申请上下文中另有其他说明，否则本申请中所用技术术语及缩写均具有本领域技术人员所知的常规含义；除非另有说明，否则下述实施例中所用原料化合物均为商购获得。
按照制备本发明所提到的纳米金粒子探针的制备以及基于此纳米探针的免疫检测分析方法，其具体实施方式如下：
实施例1：
PEG-NHS的合成
合成路线如图2所示，首先将1.34g的硫辛酸加入20ml含有0.9g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的无水二氯甲烷溶液中，然后在搅拌的状态向上述溶液中加入1.38g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)和崔化量的二甲基氨基吡啶(DMAP)，得到的最终溶液在5℃下冷却1h，然后再在室温下反应过夜。得到的反应液先用30mL的二氯甲烷稀释，然后再用盐水洗涤(3ⅹ50mL)，用硫酸钠浓缩干燥得到NHS活化的硫辛酸。
将182mg上述活化的物质加入含有1g带有氨基和羧基双官能团的聚乙二醇2000(H2N-PEG2000-COOH)的二氯甲烷溶液中，然后反应过夜。将反应得到的溶液浓缩至10mL，然后缓慢的逐滴加入到50ml冰冷的乙醚中，得到白色的沉淀物，用冰冷的乙醚洗涤后得到中间是PEG一端是硫辛酸的物质。
将0.5g得到的上述物质与31mg NHS,50mg EDC-HCl和催化量的DMAP,加入到10ml的二氯甲烷中，反应过夜后得到的溶液逐滴加入50ml冰冷的乙醚中得到白色的沉淀，进一步用冰冷的乙醚洗涤后得到一端为硫辛酸，另一端为NHS的聚乙二醇衍生物(PEG-NHS)。
实施例2：
金纳米颗粒探针1的制备
金纳米颗粒探针的制备方案如图3所示。向2nM的柠檬酸根保护的金溶液中加入100nM实施例1中所制备的PEG-NHS，室温下反应0.5h后，PEG-NHS链会通过Au-S键系留到金的表面从而形成PEG-AuNPs。得到的PEG-AuNPs在10000r/min的转速下离心30min，然后将沉淀物重新分散到0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中，如此重复两次。最后，将抗体Anti-IgG与PEG-AuNPs在2℃下孵化过夜。接下来，向反应混合物中加入0.01M的磷酸缓冲液(pH 8.5)。在这个基本条件下，PEG上没有反应的NHS基团就会被水解掉，避免了用该体系做免疫反应时NHS与蛋白发生非特异性反应。上述体系在室温下反应5h后离心纯化(30min,10000r/min)得到Anti-IgG-AuNPs，将沉淀物分散在去离子水中做进一步的应用。
实施例3：
金纳米颗粒探针2的制备
向2nM的柠檬酸根保护的金溶液中加入10uM实施例1中所制备的PEG-NHS，室温下反应2h后，PEG-NHS链会通过Au-S键系留到金的表面从而形成PEG-AuNPs。得到的PEG-AuNPs在12000r/min的转速下离心20min，然后将沉淀物重新分散到0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中，如此重复两次。最后，将抗体Anti-IgG与PEG-AuNPs在10℃下孵化过夜。接下来，向反应混合物中加入0.01M的磷酸缓冲液(pH 8.5)。在这个基本条件下，PEG上没有反应的NHS基团就会被水解掉，避免了用该体系做免疫反应时NHS与蛋白发生非特异性反应。上述体系在室温下反应2h后离心纯化(20min,12000r/min)得到Anti-IgG-AuNPs，将沉淀物分散在去离子水中做进一步的应用。
实施例4：
金纳米颗粒探针3的制备
向2nM的柠檬酸根保护的金溶液中加入100uM实施例1中所制备的PEG-NHS，室温下反应10h后，PEG-NHS链会通过Au-S键系留到金的表面从而形成PEG-AuNPs。得到的PEG-AuNPs在14000r/min的转速下离心10min，然后将沉淀物重新分散到0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中，如此重复两次。最后，将抗体Anti-IgG与PEG-AuNPs在4℃下孵化过夜。接下来，向反应混合物中加入0.01M的磷酸缓冲液(pH 8.5)。在这个基本条件下，PEG上没有反应的NHS基团就会被水解掉，避免了用该体系做免疫反应时NHS与蛋白发生非特异性反应。上述体系在室温下反应0.25h后离心纯化(10min,14000r/min)得到Anti-IgG-AuNPs，将沉淀物分散在去离子水中做进一步的应用。
实施例5：
金纳米颗粒探针4的制备
向2nM的柠檬酸根保护的金溶液中加入100nM实施例1中所制备的PEG-NHS，室温下反应0.5h后，PEG-NHS链会通过Au-S键系留到金的表面从而形成PEG-AuNPs。得到的PEG-AuNPs在10000r/min的转速下离心30min，然后将沉淀物重新分散到0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中，如此重复两次。最后，将抗体Anti-CEA与PEG-AuNPs在2℃下孵化过夜。接下来，向反应混合物中加入0.01M的磷酸缓冲液(pH 8.5)。在这个基本条件下，PEG上没有反应的NHS基团就会被水解掉，避免了用该体系做免疫反应时NHS与蛋白发生非特异性反应。上述体系在室温下反应5h后离心纯化(30min,10000r/min)得到Anti-CEA-AuNPs，将沉淀物分散在去离子水中做进一步的应用。
实施例6：
金纳米颗粒探针5的制备
向2nM的柠檬酸根保护的金溶液中加入10uM实施例1中所制备的PEG-NHS，室温下反应2h后，PEG-NHS链会通过Au-S键系留到金的表面从而形成PEG-AuNPs。得到的PEG-AuNPs在12000r/min的转速下离心20min，然后将沉淀物重新分散到0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中，如此重复两次。最后，将抗体Anti-CEA与PEG-AuNPs在10℃下孵化过夜。接下来，向反应混合物中加入0.01M的磷酸缓冲液(pH 8.5)。在这个基本条件下，PEG上没有反应的NHS基团就会被水解掉，避免了用该体系做免疫反应时NHS与蛋白发生非特异性反应。上述体系在室温下反应2h后离心纯化(20min,12000r/min)得到Anti-CEA-AuNPs，将沉淀物分散在去离子水中做进一步的应用。
实施例7：
金纳米颗粒探针6的制备
向2nM的柠檬酸根保护的金溶液中加入100uM实施例1中所制备的PEG-NHS，室温下反应10h后，PEG-NHS链会通过Au-S键系留到金的表面从而形成PEG-AuNPs。得到的PEG-AuNPs在14000r/min的转速下离心10min，然后将沉淀物重新分散到0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中，如此重复两次。最后，将抗体Anti-CEA与PEG-AuNPs在4℃下孵化过夜。接下来，向反应混合物中加入0.01M的磷酸缓冲液(pH 8.5)。在这个基本条件下，PEG上没有反应的NHS基团就会被水解掉，避免了用该体系做免疫反应时NHS与蛋白发生非特异性反应。上述体系在室温下反应0.25h后离心纯化(10min,14000r/min)得到Anti-CEA-AuNPs，将沉淀物分散在去离子水中做进一步的应用。
实施例8：
金纳米颗粒探针用于快速检测IgG的步骤：
得到的Ab-AuNPs通过两步法可以直接用来检测IgG，不需要洗涤和信号放大步骤(例如酶的应用)。
第一步，将0.5nM的实施例4中制备的Anti-IgG-AuNPs与不同浓度(0,10,20,50,100,and 200ng/mL)的IgG在37℃下孵化0.5h。
第二步，将金的生长液(终浓度为20mM的盐酸羟胺和120μM的氯金酸)加入到上述孵化液中，随着IgG浓度的增大，溶液会从红色变为紫红色。最后，拍摄照片并用Synergy2微孔板读数器读取它们在525nm处相应的吸光度值，图4为IgG的不同浓度值与它们相对应的–ΔA525值做线性拟合，其中，ΔA525＝A–A0，A是向Anti-IgG-AuNPs溶液中加入待检测抗原和金的生长液后在525nm处的吸收，A0是只加入金的生长液后在525nm处的吸收，两者在一定的范围内呈线性关系，在3σ(σ＝S0/S；S0,空白样品的标准偏差；S,标准曲线的斜率)处的最低检测限为3.74ng/ml。
实施例9：
一、金纳米颗粒探针用于快速检测CEA的步骤：
第一步，将0.5nM的实施例7中制备的Anti-CEA-AuNPs与不同浓度(0,10,20,50,100,和200ng/mL)的CEA在37℃下孵化1h。
第二步，将金的生长液(终浓度为20mM的盐酸羟胺和120μM的氯金酸)加入到上述孵化液中，随着CEA浓度的增大，溶液会从红色变为紫红色。最后，拍摄照片并用Synergy2微孔板读数器读取它们在525nm处相应的吸光度值，图5(a)为CEA的不同浓度值与它们相对应的–ΔA525值做线性拟合，其中，ΔA525＝A–A0，A是向Anti-CEA-AuNPs溶液中加CEA和金的生长液后在525nm处的吸收，A0是只加入金的生长液后在525nm处的吸收，两者在一定的范围内呈线性关系，标准曲线方程为Y＝0.00053X+0.0022，在3σ(σ＝S0/S；S0，空白样品的标准偏差；S，标准曲线的斜率)处的最低检测限为5.66ng/ml。
二、金纳米颗粒探针用于检测临床血样中CEA
第一步，将0.5nM的实施例2中制备的Anti-CEA-AuNPs与6个健康人和18个患有不同程度癌症病人的血清在37℃下孵化1h。
第二步，将金的生长液(终浓度为20mM的盐酸羟胺和120μM的氯金酸)加入到上述孵化液中，拍摄照片并用Synergy 2微孔板读数器读取它们在525nm处相应的吸光度值。由于病人血清中含有CEA的量高于正常人血清，大部分癌症样品检测结果呈现紫红色，而健康人样品检测结果呈现红色，如图5(b)所示。根据Synergy 2所测试各样品的吸光度值，计算病人血清样品的ΔA525值，根据上述标准曲线得到各病人血清中CEA的含量。图5(c)中列出了各病人血清样品中CEA的含量以及同样的样品用普通基于HRP显色的ELISA方法得到的结果，该方法得到了与普通ELISA相似的检测结果。
Claims (2)
1.一种用于快速检测蛋白抗原的方法，该方法采用的金纳米粒子探针经如下步骤制成：
1)向柠檬酸根保护的胶体金AuNPs中加入PEG-NHS，室温下反应，PEG-NHS会通过Au-S键固定到胶体金的表面从而形成PEG保护的金纳米粒子PEG-AuNPs；得到的PEG-AuNPs离心，将沉淀物重新分散到磷酸盐缓冲液中，如此重复两次；
2)将抗体Ab与PEG-AuNPs在低温下孵化过夜，Ab会通过与金上的PEG反应从而与金相连接，得到Ab-AuNPs；接下来，向反应混合物中加入磷酸盐缓冲液；将金上没有与抗体反应的PEG失活；上述体系在室温下反应，离心，将沉淀物分散在去离子水中，制备得到用于快速免疫分析的金纳米粒子探针；
其特征在于所述快速检测蛋白抗原的方法包括如下步骤：
将上述方法制备的金纳米粒子探针Ab-AuNPs与已知浓度的蛋白抗原进行孵化；将金的生长液加入到上述孵化液中；然后，用微孔板读数器读取它们在525nm处相应的吸光度值，将蛋白抗原的浓度值与它们的–ΔA525做线性拟合，ΔA525＝A–A0，其中A是向Ab-AuNPs溶液中加入待检测蛋白抗原和金的生长液后在525nm处的吸收，A0是只加入金的生长液后在525nm处的吸收，根据所得直线方程得到未知浓度的待检测蛋白抗原。
2.根据权利要求1所述的快速检测蛋白抗原的方法，其特征在于Ab-AuNPs与已知浓度蛋白抗原的摩尔比值为1:0-400；加入待检测蛋白抗原后的孵化温度为37℃，孵化时间为0.5-2h；金的生长液是终浓度分别为20mM的盐酸羟胺和120μM的氯金酸溶液的混合液。
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