CN101352574A - 一种靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子及其合成 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有生物兼容性的靶向多肽－金/二氧化硅纳米复合粒子及其制备方法，属材料科学的纳米生物医药技术领域。本发明提供的靶向多肽－金/二氧化硅纳米复合粒子是以二氧化硅纳米粒子为核，表面包裹金壳，继而在金壳表面覆盖有肝癌靶向十二肽的纳米复合核壳粒子。本发明采用一种分子交联剂把二氧化硅和金属层进行交联，金属壳外层通过连接臂的含硫基团连接的靶向多肽，该复合核壳粒子在近红外区具有最大紫外吸收和散射峰，并对肝癌细胞具有特定的靶向性，在近红外光源照射下能杀死肝癌细胞，体外生物实验结果显示无生物毒性，这些特点使其在人类各种癌症的光热疗法中具有重要价值。

Description

一种靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子及其合成

技术领域

本发明涉及一种具有生物兼容性的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子，尤其是以二氧化硅纳米粒子为核，表面包裹金壳的纳米核壳粒子，在金壳表面含有靶向多肽的复合纳米粒子，并提供该纳米复合物金/二氧化硅核壳粒子的制备方法，属材料科学的纳米生物医药技术领域。

背景技术

众所周知，固体金纳米粒子具有特殊的光学性质，即等离子共振吸收。这种等离子共振吸收是源于金中的电子与瞬时电磁场之间的耦合产生，这种等离子共振吸收波长可以通过控制纳米粒子的粒径，从而改变由瞬时电磁辐射导致的紫外吸收和散射的波长范围。但是这些纯的金粒子无论怎样改变粒径，最大紫外吸收或散射只能在520nm以下，并且变化程度不明显。如果在非导电介质的纳米粒子上包裹金层，则可使得其在更大范围内改变紫外吸收或散射，甚至到700至2000nm。这对生物学中癌症的光热疗法具有重要意义：800nm以下的光源很难穿透肌肉或者皮肤组织，容易灼伤组织；而800nm以上的光源不被人体组织吸收，可以穿透组织被纳米核壳粒子吸收、放热，从而使其在癌症的光热疗法中具有重要意义。如果在这些具有近红外光学响应的纳米粒子表面通过化学方法或者物理吸附连接对特定癌细胞具有特定导向性的基团，可以实现对特定癌症的靶向治疗。这些表面经过功能化衍生的纳米金核壳粒子被注入癌变部位，在靶向肽的作用下浓集于肿瘤周围，吸收近红外光源，放出热量升温杀死癌细胞，而对正常组织没有灼伤。功能化的纳米复合颗粒的制备已经成为生物医药技术中十分活跃的研究领域。通过控制核-壳结构的组成、形状和尺寸，人们能够定制所需要的纳米复合颗粒，从而满足特定领域的应用需要。

钱卫平(金纳米核壳粒子的制备及其潜在的生物学应用，谈用、丁少华、王毅、钱卫平，化学学报，2005，63(10)，929-933)等曾经报道了共振吸收峰位置分别约在720nm和760nm的金纳米核壳粒子，并研究了其在全血中的光学性质。钱旻等利用噬菌体肽库筛选技术筛选出能与肝癌特异性结合的由十二个氨基酸(A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P)组成的多肽(中国专利，No.200410017049.4)。本发明制备出了在近红外区(＞800nm)具有最大散射峰和紫外吸收的纳米核壳粒子，并且可以通过控制核的大小和壳的厚度来控制核壳粒子的光学性质。再在纳米复合粒子表面结合特异性的靶向肽，进行组装制成具有生物兼容性的靶向纳米金复合核壳粒子，并进一步探索了其在光热疗法治疗肝癌中的在应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物相容性好、水溶性好，具有特定光学性质的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子。

本发明的又一目的在于提供一种靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子的制备方法。

本发明所述的一种靶向纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子为一种以二氧化硅纳米粒子为核，表面包裹金壳，继而在金壳表面覆盖有肝癌靶向十二肽的纳米复合核壳粒子。该靶向纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子包括二氧化硅核和金属壳，以及金属壳外层通过连接臂的含硫基团连接的靶向多肽，核为粒径在50nm至300nm之间的二氧化硅，壳为金，且壳的厚度为5nm至30nm之间，金壳通过交联剂连接在二氧化硅核粒子的表面。

本发明提供的靶向纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子，其中二氧化硅核粒子形状为球形。组成壳的金属层为一种金形成的单层，或者多层。且交联剂为氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷、二氨丙基二乙氧基硅烷、4-氨丁基二甲基甲氧基硅烷或者苯基三乙氧基硅烷。纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子的形状为球形，纳米核壳粒子的金属层完全包裹二氧化硅粒子核的部分。纳米核壳粒子的金层外表面通过连接臂中的含硫基团生成Au-S键，或者吸附作用，连接靶向性的多肽，连接臂可以是氨基酸残基，或者具有生物兼容性的高分子，或者其他化学基团。含硫基团可以是任何含硫的化学基团，特别是巯基，或二硫键。靶向性多肽包含有十二个氨基酸单元，并具有特定序列(A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P)。本发明所述的一种纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子中最大消光值在600～2000nm的波长范围内，最大紫外吸收在600nm至2000nm的波长范围内。

本发明所述的一种靶向纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子能通过化学作用或吸附作用特定靶向肝癌细胞Bel-7404和Bel-7402。

为得到一种靶向性纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子，本发明采用一种分子交联剂把二氧化硅和金属层进行交联，先通过物理吸附在二氧化硅纳米粒子表面吸附20～30％的纳米金属颗粒，再用化学还原相应金属盐溶液将剩余部分二氧化硅包裹，从而得到具有特殊光学性质的纳米核壳粒子，继而在该纳米核壳粒子表面通过化学方法或物理吸附结合对肝癌细胞具有特定导向性的十二肽。

各步合成如下：

一、纳米金核壳粒子的合成

(1)核壳粒子中以二氧化硅为基质的核的合成

第一步：以极性溶剂用氨水为催化剂还原正硅酸乙酯(TEOS)，通过调节TEOS的用量、氨的用量、醇/水的比例、搅拌速度等得到不同粒径的单分散的二氧化硅粒子。该发明中醇为乙醇时效果最好。

第二步：该二氧化硅粒子在醇中与带氨基的硅烷试剂反应2～3小时，用醇溶液稀释50～100倍后再加热回流1～2小时，使得交联剂与二氧化硅粒子表面的键合更加牢固，形成一种表面氨化的二氧化硅粒子。离心分离，弃去上层清液，沉淀物用超声再分散，反复4～5次除去未反应的硅烷试剂。

(2)以二氧化硅为核的种金粒子的制备

第一步：在水溶液中以还原剂在碱性条件还原高氯酸金盐溶液，得到粒径在1nm至3nm的单分散的金属粒子的胶体溶液，过滤，该溶液在4℃下静置5～50天。该步中还原剂以四羟甲基氯化鏻(THPC)或硼氢化钠(NaBH₄)为佳。反应溶液加入的最佳顺序为碱液、还原剂和高氯酸金盐溶液。

第二步：上步所述的金属胶体溶液与上述制得的表面氨化的二氧化硅粒子溶液混合，温和搅拌2～3小时。本发明中发现把表面氨化的二氧化硅粒子溶液加入到金属胶体溶液中效果较好。

第三步：离心分离弃去未被吸附到二氧化硅粒子表面的胶体溶液，加入乙醇超声分散，此操作反复重复4～5次，得到以二氧化硅为核的种金粒子。此粒子表面金属的覆盖率约为20～30％，剩余部分的覆盖在下步中进行。

(3)以二氧化硅为核的核壳粒子的制备

第一步：配制含有一定浓度的高氯酸金盐溶液和碳酸钾的水溶液。

第二步：上述所得的种金粒子与该溶液按照不同的体积比例混合后，在剧烈搅拌下加入还原剂，反应0.5小时后，离心分离去除未被吸附到种金表面的纳米金属粒子，得到表面完全覆盖有不同厚度金属层的核壳粒子。该步骤中还原剂最好为1％的甲醛水溶液。

二、具有特定序列的肝癌靶向性的十二肽的化学修饰

本发明采用化学方法，在特定序列的靶向十二肽中引入带有含硫基团的化学结构(连接臂)，二者通过共价键联。在多肽上引入某些化学结构(含硫基团)对多肽进行化学修饰的方法是本领域技术人员熟知的方法，具体而言是通过以下方法来实现：

(1)在靶向肽与纳米金核壳粒子之间选择合适的连接臂。这些连接臂一端用于与靶向十二肽进行共价键联，一端通过含硫基团键联到核壳粒子的金层表面。这些连接臂可以是氨基酸残基，也可以是具有生物兼容性的高分子链，如聚乙二醇(PEG)，聚赖氨酸等。

(2)在连接臂中引入含硫基团。含硫基团以巯基与二硫键为佳。如果含硫基团是巯基，由于其易被空气或其他物质氧化，需要利用化学保护试剂进行保护。通常使用的化学保护试剂为2-巯基吡啶或三苯基溴甲烷，在催化剂作用下保护含巯基的化合物。催化剂以氯代巯基甲酰氯(ClSCOCl)或氯代巯基甲酸甲酯(ClSCOOCH₃)为佳。如果含硫基团是二硫键，则无需保护。

(3)在连接臂中引入靶向十二肽。由于靶向十二肽中含有游离的胺基和羧基，因此连接臂端基含有胺基或羧基，在催化剂作用下，在非质子溶剂中即可与靶向十二肽缩合，使靶向肽成功键合到连接臂上。此步催化剂为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N，N-二环己基碳亚胺(DCC)为佳。此步中非质子溶剂包括N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二氯甲烷、三氯甲烷等。

(4)利用还原剂或催化剂去除含硫基团的保护基。通过生成二硫键S-S保护巯基的，如用2-巯基吡啶保护巯基的，通常采用还原剂还原二硫键。常用的还原剂有巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇(DTT)等，以DTT为佳；通过三苯基卤代甲烷保护巯基的，去保护的催化剂以三氟乙酸(TFA)为最佳。

三、靶向多肽-金/二氧化硅复合纳米核壳粒子的制备

(1)靶向十二肽通过连接臂上的含硫基团与金生成稳定的Au-S键，从而键联到纳米金核壳粒子表面合成具有靶向性的复合纳米金核壳粒子。化学修饰的靶向十二肽与纳米金核壳粒子在水溶液中混合，4℃下温和搅拌，通过Au-S键合到纳米金核壳粒子表面。

(2)离心除去未反应的多肽，沉淀物超声再分散在二次去离子水中，得到表面键合靶向肽的复合纳米金核壳粒子。

该靶向复合纳米金核壳粒子体外实验表明无生物毒性。本发明所述的一种靶向纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子具有高度的生物兼容性。不同浓度的靶向复合纳米金核壳粒子与细胞作用，利用MTT法检测细胞的存活率以及通过荧光显微镜观测细胞形态。体外实验说明在无外源的红外光源存在下，纳米金核壳粒子具有高度的生物兼容性。同时，靶向十二肽的引入，增强了该复合粒子对肝癌细胞的特异靶向性，在有近红外灯源光照下，能升温杀死肝癌细胞Bel-7404和Bel-7402，因此可应用于癌症的光热疗法。

本发明属创新性的发明，提供一种制备对肝癌具有特殊靶向性的复合纳米金核壳粒子，即将纳米金核壳粒子与对肝癌细胞特定靶向性的十二肽之间通过交联剂连接，形成有机多肽包裹的复合纳米核壳粒子，该复合核壳粒子在近红外区具有最大紫外吸收和散射峰，并对肝癌细胞具有特定的靶向性，在近红外光源照射下能杀死肝癌细胞，体外生物实验结果显示无生物毒性，这些特点使其在人类各种癌症的光热疗法中具有重要意义。

附图说明

图1：二碳酸二叔丁酯保护的PEG胺(Boc-PEG-NH₂)的氢核磁谱图。

图2：红外谱图，蓝线：纳米金核壳粒子的红外谱图；绿线：pH＝3.1时得到的表面键合靶向十二肽的纳米金核壳粒子；红线：pH＝6.0时得到的表面键合靶向十二肽的纳米金核壳粒子。

图3：靶向十二肽与靶向十二肽-纳米金核壳粒子的拉曼光谱。

图4：表面连接有靶向十二肽的纳米金/二氧化硅核壳粒子的TEM图象(200kV)。

图5：粒径约为180nm的二氧化硅-金的核壳粒子以及表面键合靶向十二肽的纳米金/二氧化硅核壳粒子的紫外吸收。横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图6：表面键合靶向十二肽的纳米金/二氧化硅核壳粒子的对人源肝癌细胞Bel-7404和7402毒性实验。横坐标为该粒子的浓度，纵坐标为细胞的存活率。

图7：表面键合靶向十二肽的纳米金/二氧化硅核壳粒子对肝癌细胞Bel-7404的细胞毒性实验(荧光显微镜法)。该粒子的浓度分别为：(a)3.0×10¹⁰；(b)3.0×10⁹；(c)3.0×10⁸个/mL；(d)为阴性对照。

图8：表面键合靶向十二肽的纳米金/二氧化硅核壳粒子在近红外光源照射下杀死肝癌细胞Bel-7402的荧光照片，粒子浓度为3.0×10¹⁰个/mL，光照时间为5min，近红外灯源能量为1W/m²。(a)黄线左上部分为近红外光源光照部分，黄线右下部分为未光照部分(放大倍数：5倍)；(b)近红外光源照射部分的放大(40倍)；(c)为照射部分的放大(40倍)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述：

实施例1：粒径约为180nm的纳米金核壳粒子的合成

(1)核壳粒子中以二氧化硅为基质的核的合成

在100mL洁净的烧杯中加入50mL的绝对无水乙醇和3.0mL的氨水(25％)，在搅拌条件下，向该溶液中加入0.2mL(0.9mmol)的纯度为99.999％的正硅酸乙酯(TEOS)，约15～30mim后溶液变为乳白色的混浊液，继续搅拌8h。得到平均粒径为140nm的二氧化硅粒子。用动态光散射仪测其表面电荷和溶液的pH值。通过调整氨水的浓度和TEOS的用量，可以合成粒径在50～300nm的二氧化硅球形粒子。

(2)二氧化硅表面的氨化

取上述实验所得粒子悬浊液离心分离(2000rpm)，弃上层清夜，沉淀物加入10mL的乙醇，超声分散5min。向该悬浊液中加入400uL的氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下搅拌2h后加入100mL的无水乙醇稀释，稀释液在70℃下加热回流1h，冷却至室温后，以2500rpm的转速离心分离，弃上层清液，重复此操作4～5次。最后所得沉淀用超声分散在10mL的乙醇中备用。用动态光散射仪测其表面电荷和溶液的pH值以及其粒径和粒径分布。

(3)含1～3nm金颗粒的金胶溶液的制备

取80％的四羟甲基氯化鏻(THPC)水溶液1.2mL用二次去离子水稀释至100mL备用。向45.5mL的水溶液中加入1.5mL的NaOH(0.2M)水溶液、1mL的THPC溶液和2.0mL的高氯酸金(HAuCl₄，25mmol)，剧烈搅拌1h后，在室温下放置1天，用孔径为200nm的过滤膜过滤，得到1～3nm的金颗粒。滤液于4℃冰箱中继续放置5～50天备用。高氯酸金(HAuCl₄)为99.9％的纯度。

(4)含1～3nm金颗粒的种金溶液的制备

取上述表面氨化的二氧化硅纳米粒子悬浊液1mL和上述100mL的金胶溶液混合，温和搅拌2～3小时。以2000rpm的转速离心分离弃去未被吸附到二氧化硅粒子表面的胶体溶液，加入乙醇超声分散，此操作反复重复4～5次，得到以二氧化硅为核的种金粒子。该种金粒子最后超声分散在15mL的二次去离子水中备用。该种金粒子粒径约为150nm。并用动态光散射仪测其表面电荷和溶液的pH值以及其粒径和粒径分布。

(5)纳米核壳粒子的制备

把25mg的K₂CO₃和1.5mL的HAuCl₄(25mmol)溶液加入到100mL的二次去离子水中，该混合溶液(PCG)在可在避光下放置一天后使用。取上述种金溶液1mL和60mL的PCG溶液混合，剧烈速度搅拌10mim后，快速加入5mL的甲醛溶液(1％)，继续搅拌0.5h后，以3000～5000rpm的转速离心分离去除未被吸附到种金表面的纳米金属粒子，反复重复此操作最少5次。所得沉淀超声再分散于5mL的水中，该溶液中纳米粒子的浓度约为4×10¹¹个/mL。用透射电境测其粒径并用紫外光谱仪测其紫外吸收，并用动态光散射仪测其表面电荷和溶液的pH值以及其粒径和粒径分布。纳米二氧化硅表面连续包裹了一层金，该金层厚度约为20nm。紫外谱图显示其在约850nm具有最大紫外吸收。

实施例2：以含巯基的氨基酸作为连接臂合成靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子

(1)半胱氨酸巯基的保护

向溶有半胱氨酸(1.21g，0.01mol)和三乙胺(1.01g，0.01mol)的干燥二氯甲烷(DCM)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的50mL混合溶剂(体积比9∶1)中滴甲加三苯基氯甲烷(2.78g，0.01mol)，在氮气保护下，反应24小时后，减压蒸除绝大部分溶剂，向残余物中加入10mL蒸馏水，超声分散后，离心分离，弃去上层清液，所得固体真空干燥，得巯基保护的半胱氨酸。

(2)通过半胱氨酸向靶向十二肽中引入含硫基团-巯基

把巯基保护的半胱氨酸(C)的胺基固定在树脂上，在其基础上利用商业固相合成法继续合成特定序列的靶向十二肽(A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P)，然后利用三氟乙酸把所得产物从树脂上切割下来并同时使得巯基去保护基，得到含巯基的和靶向十二肽的十三肽(C-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P)。

(3)表面通过氨基酸连接臂键合有靶向十二肽的纳米金核壳粒子的合成

取上述实例1(5)中实验所得平均粒径为180nm的金/二氧化硅核壳粒子悬浊液1mL，离心分离(1000～2000rpm)，弃上层清夜，沉淀物加入50mL的蒸馏水，超声分散5min。向该悬浊液中加入25mg的实施例2(2)中所得十三肽，4℃下搅拌6h后，溶液由绿色逐渐变为黑色。以2500rpm的转速离心分离，弃去上层清液，沉淀物继而分散于10mL灭菌的生理盐水中，再离心分离。重复此操作3～4次以除去未反应的十三肽，得到表面通过氨基酸连接臂键合有靶向十二肽的纳米金核壳粒子。最后所得沉淀用超声分散在1mL的灭菌生理盐水中备用。用动态光散射仪测其表面电荷和溶液的pH值以及其粒径和粒径分布。

实施例3：以含巯基的聚乙二醇(PEG)作为连接臂合成靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子

(1)PEG的功能化修饰

第一步：向PEG两端引入卤代基。取PEG2000(数均分子量2000，10g，5mmol)溶于甲苯(250mL)，油水分离器共沸除水。加入新鲜蒸馏的吡啶(0.41mL，5mmol)和二氯亚砜(3.54mL，50mmol)，75℃回流12h。冷却至室温，旋转蒸发除去绝大部分溶剂，再溶于二氯甲烷，用无水碳酸钾干燥12h，过滤。收集滤液用中性三氧化二铝(20g，120℃活化2h)吸附处理，过滤，将滤液浓缩后用乙醚沉淀，收集沉淀并用二氯甲烷溶解，乙醚重沉淀一次，离心，固体真空干燥，得到产物7g，记为Cl-PEG-Cl(产率66％)。

第二步：PEG两端通过卤代基引入叠氮基。取Cl-PEG-Cl(7g，3.4mmol)溶于DMF(20mL)，加入叠氮化钠(3.85g，59mmol)，70℃回流搅拌24h。反应液冷却至室温后过滤，旋蒸除去绝大部分DMF，再溶于二氯甲烷，过滤，滤液浓缩后，用乙醚沉淀，得到产物6.3g，记为N₃-PEG-N₃(产率89％)。

第三步：PEG两端叠氮基还原为胺基。取N₃-PEG-N₃(2.5g，1.2mmol)溶于四氢呋喃(THF，20mL)，加入三苯基磷(0.8g，3.5mmol)，用蒸馏水(127.5uL，7.1mmol)稀释。50℃氮气保护下回流36h，旋蒸除去大部分有机溶剂，残余物溶解在蒸馏水中，4℃静置12h，过滤，滤液浓缩后，冷冻干燥，得到产物2.1g，记为H₂N-PEG-NH₂(产率89％)。

第四步：PEG两端胺基中一端胺基进性保护。取H₂N-PEG-NH₂(2.1g，1.01mmol)溶于100mL二氯甲烷。6h内向该溶液中缓慢滴加溶有二碳酸二叔丁酯(Boc，240uL，1.01mmol)的二氯甲烷溶液(20mL)，氮气保护下室温搅拌12h，浓缩后乙醚中沉淀，离心，所得固体真空干燥，200-400目硅胶柱层析分离产物，淋洗剂为氯仿/二氯甲烷(v∶v＝16∶1)，得到产物1g，记为Boc-PEG-NH₂(产率44％)。

(2)功能化的PEG中巯基的引入

第一步：巯基的保护。向含有4.77g(38mmol)氯代巯基甲酸甲酯的100mL干燥二氯甲烷溶液中滴加50mL溶有4.0g(38mmol)3-巯基丙酸的二氯甲烷。滴加完毕后室温搅拌90min，减压蒸除溶剂，残余物溶解在100mL干燥的二氯甲烷中。向此溶液中缓慢滴加含有2-巯基吡啶(4.19g，38mmol)的二氯甲烷溶液(50mL)，滴加完毕后反应过夜，减压蒸除溶剂，得油状产物，为巯基保护的3-巯基丙酸。

第二步：PEG中巯基的引入。向溶有三乙胺(0.2g，2mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.09g，1mmol)的干燥二氯甲烷溶液(50mL)中加入巯基保护的3-巯基丙酸(0.22g，1mmol)，反应在室温下搅拌2h，再在氮气保护下，滴加实施例3(1)中第四步所得的Boc-PEG-NH₂(2g，约1mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)，回流72h后，蒸除绝大部分溶剂，残余物溶解在1mL的二氯甲烷中，于-20℃下用1∶1的乙醚和正己烷混合溶剂重沉淀，过滤，收集所得固体，用三氯甲烷和甲醇作为淋洗剂(v∶v＝95∶5)，硅胶柱层析分离，收集主要组分，产物记为Boc-PEG-PSH。

(3)功能化的PEG中靶向十二肽的引入

第一步：引入巯基后的PEG中胺基的去保护。实施例3(3)中所得的产物Boc-PEG-PSH(0.2g，约2mmol)溶于三氟乙酸(TFA)和干燥二氯甲烷混合溶剂中(2mL，v∶v＝1∶1)，在25℃下搅拌反应3h后，减压蒸除溶剂，残余物再溶解于1mL的二氯甲烷中，于-20℃下用1∶1的乙醚和正己烷混合溶剂重沉淀，所得固体用三氯甲烷、甲醇和氨水为淋洗剂(v∶v∶v＝89∶10∶1)，硅胶柱层析分离(230-400目)，收集主要组分，产物记为H₂N-PEG-PSH。

第二步：引入靶向十二肽。50mg(0.5mmol)的靶向十二肽溶于5mL干燥的二氯甲烷/DMF(v∶v＝4∶1)中，并加入催化剂量的4-二甲胺基吡啶(DMAP)和21mg(0.1mmol)的N，N-二环己基碳亚胺(DCC)，4℃下反应过夜，过滤除去反应生成的沉淀，收集滤液，加入溶有100mg(约0.5mmol)的H₂N-PEG-SH二氯甲烷溶液，继续反应24h，减压蒸除绝大部分溶剂后，残余物溶于5mL的蒸馏水中，用截留分子量为1000的透析袋透析，冷冻干燥所得产物，记为Pep-PEG-PSH。

(4)PEG中巯基的去保护

实施例3(3)中所得的产物Pep-PEG-PSH(0.1g，约0.5mmol)溶于5mL蒸馏水中，于4℃下加入DTT(0.063，0.5mmol)搅拌2h后，继续搅拌过夜，可得产物Pep-PEG-SH。该反应液无需处理直接进行下步反应。

(5)表面通过含巯基的PEG连接臂键合有靶向十二肽的纳米金核壳粒子的合成

取上述实例1(5)中实验所得平均粒径为180nm的金/二氧化硅核壳粒子悬浊液2mL，离心分离(1000～2000rpm)，弃上层清夜，沉淀物加入100mL的蒸馏水，超声分散5min，置于4℃备用。向该溶液中加入实施例3(4)中所得的产物Pep-PEG-SH的5mL反应液，在4℃条件下缓慢搅拌4h，离心分离(2500rpm)，弃去上层清液，沉淀物继而分散于10mL灭菌的生理盐水中，再离心分离。重复此操作3次以除去未反应的含巯基和靶向十二肽的PEG，得到表面通过PEG连接臂键合有靶向十二肽的纳米金核壳粒子。最后所得沉淀用超声分散在2mL的灭菌生理盐水中备用。

实施例4：以含二硫键的聚乙二醇(PEG)作为连接臂合成靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子

(1)功能化的PEG中二硫键的引入

向溶有三乙胺(0.2g，2mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.09g，1mmol)的干燥二氯甲烷溶液(50mL)中加入硫辛酸(0.21g，1mmol)，反应在室温下搅拌2h，再在氮气保护下，滴加实施例3(1)中第四步所得的Boc-PEG-NH₂(2g，约1mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)，回流72h，蒸除绝大部分溶剂，残余物溶解在1mL的二氯甲烷中，于-20℃下用1∶1的乙醚和正己烷混合溶剂重沉淀，过滤，收集所得固体，用三氯甲烷和甲醇作为淋洗剂(v∶v＝100∶5)，硅胶柱层析分离，收集主要组分，产物记为Boc-PEG-SSH。

(2)功能化的PEG中靶向十二肽的引入

第一步：引入二硫键后的PEG中胺基的去保护。实施例4(1)中所得的产物Boc-PEG-SSH(0.2g，约2mmol)溶于三氟乙酸(TFA)和干燥二氯甲烷混合溶剂中(2mL，v∶v＝1∶1)，在25℃下搅拌反应3h后，减压蒸除溶剂，残余物再溶解于1mL的二氯甲烷中，于-20℃下用1∶1的乙醚和正己烷混合溶剂重沉淀，所得固体用三氯甲烷、甲醇和氨水为淋洗剂(v∶v∶v＝90∶9∶1)，硅胶柱层析分离(230-400目)，收集主要组分，产物记为H₂N-PEG-SSH。

第二步：引入靶向十二肽。50mg(0.5mmol)的靶向十二肽溶于5mL干燥的二氯甲烷/DMF(v∶v＝4∶1)中，并加入催化剂量的4-二甲胺基吡啶(DMAP)和21mg(0.1mmol)的N，N-二环己基碳亚胺(DCC)，4℃下反应过夜，过滤除去反应生成的沉淀，收集滤液，加入溶有100mg(约0.5mmol)的H₂N-PEG-SSH二氯甲烷溶液，继续反应24h，减压蒸除绝大部分溶剂后，残余物溶于5mL的蒸馏水中，用截留分子量为1000的透析袋透析，冷冻干燥所得产物，记为Pep-PEG-SSH。

(3)表面通过含二硫键的PEG连接臂键合有靶向十二肽的纳米金核壳粒子的合成

取上述实例1(5)中实验所得平均粒径为180nm的金/二氧化硅核壳粒子悬浊液2mL，离心分离(1000～2000rpm)，弃上层清夜，沉淀物加入100mL的蒸馏水，超声分散5min，置于4℃备用。向该溶液中加入实施例4(2)中所得的产物Pep-PEG-SSH的5mL反应液，在4℃条件下缓慢搅拌4h，离心分离(2500rpm)，弃去上层清液，沉淀物继而分散于10mL灭菌的生理盐水中，再离心分离。重复此操作3次以除去未反应的含二硫键和靶向十二肽的PEG，得到表面通过含二硫键的PEG连接臂键合有靶向十二肽的纳米金核壳粒子。最后所得沉淀用超声分散在2mL的灭菌生理盐水中备用。

实施例5：

实施例1中第(2)步中的氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)分别用氨丙基三甲氧基硅烷、二氨丙基二乙氧基硅烷、4-氨丁基二甲基甲氧基硅烷或者苯基三乙氧基硅烷替代对二氧化硅表面进行胺化。其他同实施例1。

实施例6：

实施例3中第(1)步中的聚乙二醇2000(PEG2000)分别用聚乙二醇1000(PEG1000)、聚乙二醇400(PEG400)替代进行功能化修饰，得到不同链长的连接臂连接靶向十二肽和含硫基团。其他同实施例3。

实施例7：MTT实验

肝癌细胞Bel-7404和7402全部被0.1％胰酶消化，再悬浮于新鲜的RPMI1640培养液(含有10％小牛血清和1％双抗)中，并接种于96孔板中(1×10⁴个/孔)，每孔中加入100uL，在37℃和含有5％浓度CO₂潮湿空气环境下培养过夜，弃去该培养液，然后加入含有不同浓度的纳米金核壳颗粒(3.0×10¹⁰，6.0×10⁹，1.2×10⁹，2.4×10⁸，4.8×10⁷，9.6×10⁶，1.3×10⁶，2.6×10⁵个/mL)的培养基RPMI1640(100uL)，继续培养48小时后，加入10uL的MTT(0.5mg/mL)，继续培养4小时后，弃去含有MTT的培养基，加入100uL的DMSO，溶解甲臜晶体，然后放在BIO-TEK酶标仪(Powerwave XS，USA)上用570纳米的滤光片来读甲臜晶体的吸光度，细胞存活率的计算是与阴性对照组比较下算出的。

实施例8：荧光显微镜研究细胞毒性及纳米金核壳粒子粒子在近红外光源下抑制肝癌细胞性能

将盖玻片放于12孔腔的培养板的孔里，Bel-7402培养在覆玻片上，(每孔含有7.5×10⁵个细胞和1.5mL的RPMI1640培养基)，在37℃和含有5％浓度CO₂潮湿空气环境下培养过夜后，该培养基被3.0mL的含纳米金核壳颗粒的培养基置换，然后继续培养48小时。取出盖玻片，用PBS小心冲洗以后，细胞用95％乙醇来固化30分钟，然后用1％冰醋酸浸泡30秒，再把细胞放置于100ug/mL浓度的AO溶液中染色15分钟，PBS洗涤，再浸入0.1M氯化钙溶液45秒，再用PBS洗涤后，铺盖于载玻片上，用荧光显微镜观察，细胞在暗场显微镜下成像，使用装配有可分别激发和发射490nm和520nm波长的冷光CCD摄像头Motic AE31荧光显微镜来拍摄。观察纳米金核壳粒子粒子在近红外光源下抑制肝癌细胞性能只需在细胞固化前进行近红外光源照射即可，其他操作相同。

本项目所得纳米颗粒的粒径分布用MARLVEN公司Zetasizer Nano-ZS型动态光散射(DLS)测试，测试温度为25℃，入射激光波长为633nm。透射电境图片用JEOL公司的JEM2100F型透射电境测试(200kV)。紫外光谱仪为紫外光谱仪为上海亚研电子有限公司UV1900PC型紫外仪。

上述实施例仅用以说明本发明但并不局限于此，应该理解在不脱离本发明的精神范围内还可有多种变通或替换方案。

Claims (14)

1.一种靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子，包括二氧化硅核、金属壳，以及靶向多肽，其特征在于核为粒径在50nm至300nm之间的二氧化硅，壳为金，且壳的厚度在5nm至30nm之间，金壳通过交联剂连接在二氧化硅核粒子的表面，金属壳外层通过连接臂的含硫基团连接的靶向多肽，其中连接臂为氨基酸残基，或者具有生物兼容性的高分子。

2.如权利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子，其特征在于二氧化硅核粒子形状为球形。

3.如权利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子，其特征在于组成壳的金属层为一种金形成的单层，或者多层。

4.如权利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子，其特征在于交联剂为氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷、二氨丙基二乙氧基硅烷、4-氨丁基二甲基甲氧基硅烷或者苯基三乙氧基硅烷。

5.如权利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子，其特征在于纳米复合物金/二氧化硅核壳粒子的形状为球形。

6.如权利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子，其特征在于纳米核壳粒子的金属层完全包裹二氧化硅粒子核的部分。

7.如权利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子，其特征在于连接臂中的含硫基团生成Au-S键连接靶向性的多肽。

8.如权利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子，其特征在于含硫基团为巯基或二硫键。

9.如权利要求1所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子，其特征在于靶向性多肽的序列为(从N端到C端)：A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P。

10.一种靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)制备纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子；

(2)化学修饰肝癌靶向性的十二肽：在连接臂中引入含硫基团；并通过靶向十二肽中含有游离的胺基和羧基，和连接臂端基含有的胺基或羧基的作用，在可溶性非质子溶剂中即可与靶向十二肽缩合，使靶向肽成功键合到连接臂上；

(3)靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子的制备：将(1)中所得纳米核壳粒子加入到(2)所得靶向多肽的水溶液中，搅拌，离心分离，得靶向纳米复合物金/二氧化硅核壳粒子。

11.如权利要求10所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子的制备方法，其特征在于(2)中的非质子溶剂，包括N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二氯甲烷或者三氯甲烷。

12.如权利要求10所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子的制备方法，其特征在于(2)中含硫基团为巯基时，化学修饰肝癌靶向性的十二肽时要利用化学试剂进行保护，修饰完毕要利用还原剂或催化剂去除含硫基团的保护基。

13.如权利要求12所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子的制备方法，其特征在于化学试剂为2-巯基吡啶，或三苯基溴甲烷，或碘乙酰胺，或氯化苄，或N-乙基丁烯二亚酰胺，或对氯汞苯甲酸。

14.如权利要求12所述的靶向多肽-金/二氧化硅纳米复合粒子的制备方法，其特征在于还原剂为巯基乙醇，或巯基乙酸，或二硫苏糖醇(DTT)。

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