CN101805407A - 一种纳米二氧化硅包裹蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种纳米二氧化硅包裹蛋白质的方法，属纳米无机材料与生物高分子化学技术领域。本发明的要点是：将一定量的3-氨丙基三乙氧基硅烷与蛋白质共价连接，然后在反相微乳液体系中，利用氨水催化四乙氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷与蛋白质共价连接产物水解，即可得到包裹绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒。反相微乳体系的组成为环乙烷、聚乙二醇辛基苯基醚、正己醇三者按体积比4∶1∶1混合而成的溶液。本发明所得的产物具有极好的热稳定性和pH稳定性，且具有不易被酶解等优良性能。

Description

一种纳米二氧化硅包裹蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及一种纳米二氧化硅包裹蛋白质的方法，属纳米无机材料与生物高分子化学技术领域。
背景技术
纳米二氧化硅是一种无毒、生物相容性好的无机纳米材料，且其表面易于修饰和改性，尺寸可控性好等优点，被广泛的应用于生物标记、纳米探针、载药体系等生物医学领域。利用纳米二氧化硅包裹特定分子制备特殊材料应用十分广泛，如利用二氧化硅包裹蛋白质、利用纳米二氧化硅包裹载带药物、利用纳米二氧化硅包裹荧光物质提高量子产率等。
每种蛋白质都含有氨基和羟基，它可以共价连接在二氧化硅颗粒的内部。绿色荧光蛋白是蛋白质的一种，绿色荧光蛋白具有荧光信号，它同样可以包含在纳米二氧化硅颗粒的内部。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳米二氧化硅包裹蛋白质的方法。
本发明一种纳米二氧化硅包裹蛋白质的方法，其特征在于具有以下的过程与步骤：
a.3-氨丙基三乙氧基硅烷与蛋白质的共价连接：取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、3-氨丙基三乙氧基硅烷三者按摩尔比1∶2∶1.3混合在pH为7.5的磷酸盐缓冲液中；并使1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量浓度为0.26摩尔/升，然后名入一定量的蛋白质，控制蛋白质与3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为0.9～1.0；磁力搅拌24小时，然后经脱盐和超滤，即得3-氨丙基三乙氧基硅烷与蛋白质共价连接的产物。
b.包裹蛋白质的纳米二氧化硅的制备：将环己烷、聚乙二醉辛基苯基醚、正己醇三者按体积比4∶1∶1的比例混合均匀使呈微乳液混合液体系；然后加入上述混合液总体积的2.7～2.8％的前述预先制备好的3-氨丙基三乙氧基硅烷与蛋白质的共价连接产物；剧烈搅拌均匀后，再加入一定量的四乙氧基硅烷；四乙氧基硅烷的加入量以上述微乳液混合液的总体积为计量基准，为微乳液混合液总体积的0.9～1.0％(体积％)；然后磁力搅拌均匀后加入一定量的氨水引发聚合，在室温下搅拌反应24小时；接着再加入一定量的丙酮使纳米球沉淀出来；丙酮的加入量为上述总反应物体积的2倍；经洗涤数次以除去表面活性剂等杂质，最终得到包含有蛋白质的纳米二氧化硅颗粒。
本发明方法的机理是：利用蛋白质含有的氨基和羧基可以共价连接在二氧化硅颗粒的内部。
本发明利用蛋白质中的一种，利用绿色荧光蛋白，在实验连程中主要选取绿色荧光蛋白，用它有荧光特性，易于检测。本发明方法制得的含有绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅，其荧光信号特强；且具有较好的热稳定性，不易被酶解，以及荧光不易被淬灭等优良性能。
附图说明
图1为本发明所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的透射电子显微镜(TEM)照片图。
图2为本发明所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的荧光强度光谱图。
图3为本发明所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与绿色荧光蛋白热稳定性对比曲线图。
图4为本发明所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与绿色荧光蛋白pH稳定性对比曲线图。
图5为本发明所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与绿色荧光蛋白酶解对比曲线图。
图6为本发明中非共价连接直接包裹绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与共价连接法包裹绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的泄漏研究
图7为本发明所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与绿色荧光蛋白丙烯酰胺淬灭的荧光图
具体实施方式
现将本发明的具体实施例叙述于后。
实施例
本实施例中采用绿色荧光蛋白为例。本实施例的过程和步骤如下：
(1)3-氨丙基三乙氧基硅烷与绿色荧光蛋白共价连接：取一定量的绿色荧光蛋白，溶于2毫升pH为7.5的磷酸盐缓冲液，加入40毫克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，50毫N-羟基丁二酰亚胺，再加入500微升3-氨丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌24小时，经脱盐和超滤即得产物；
(2)包裹绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅的制备：将100微升超纯水和7.2毫升环己烷、1.8毫升聚乙二醇辛基苯基醚、1.8毫升正辛醇的混合液混合，加入300微升上述3-氨丙基三乙氧基硅烷与绿色荧光蛋白共价连接产物，再加入100微升四乙氧基硅烷，磁力搅拌均匀，最后用60微升氨水引发聚合，室温搅拌反应24小时后，加入20毫升丙酮使纳米颗粒沉淀出来，最后用无水乙醇和去离子水离心(12000转/分左右)洗涤数次除去表面活性剂以及未反应的原料等杂质，即可得到包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒。
本实施例所得的包含有绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的透射电子显微镜(TEM)图示于图1中。其荧光度示于图2中。本实施例所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与无二氧化硅包裹的绿色荧光蛋白的性能比较。
各性能比较图参见附图中的图3、图4、图5、图6和图7。
图3为本实施例所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅与无二氧化硅包裹的绿色荧光蛋白热稳定性对比曲线图。从图3中可看出，纳米二氧化硅包裹绿色荧光蛋白具有更好的热稳定性。
图4为本实施例所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅与绿色荧光蛋白pH稳定性对比曲线图。从图4中可看出，纳米二氧化硅包裹的绿色荧光蛋白具有更好的pH稳定性。
图5为本实施例所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与绿色荧光蛋白酶解对比曲线图。从图5可看出，纳米二氧化硅包裹的绿色荧光蛋白具有更好的稳定性。
图6为本发明中非共价连接直接包裹绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与共价连接法包裹绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅包裹绿色荧光蛋白得泄漏性对比曲线。从图6可看出直接法得到的纳米二氧化硅包裹的绿色荧光蛋白经漂洗一次之后基本全部泄漏而共价连接法包裹绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅包裹绿色荧光蛋白经多次洗涤基本不发生泄漏。
图7为本实施例所得包含绿色荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与绿色荧光蛋白丙烯酰胺淬灭的荧光图。从图7中可看出，纳米二氧化硅包裹的绿色荧光蛋白在荧光淬灭剂丙烯酰胺的存在下具有更好的稳定性。

Claims (1)

1.一种纳米二氧化硅包裹蛋白质的方法，其特征在于具有以下的过程与步骤：
a.3-氨丙基三乙氧基硅烷与蛋白质的共价连接：取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、3-氨丙基三乙氧基硅烷三者按摩尔比1∶2∶1.3混合在pH为7.5的磷酸盐缓冲液中；并使1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量浓度为0.26摩尔/升，然后名入一定量的蛋白质，控制蛋白质与3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为0.9～1.0；磁力搅拌24小时，然后经脱盐和超滤，即得3-氨丙基三乙氧基硅烷与蛋白质共价连接的产物。
b.包裹蛋白质的纳米二氧化硅的制备：将环己烷、聚乙二醉辛基苯基醚、正己醇三者按体积比4∶1∶1的比例混合均匀使呈微乳液混合液体系；然后加入上述混合液总体积的2.7～2.8％的前述预先制备好的3-氨丙基三乙氧基硅烷与蛋白质的共价连接产物；剧烈搅拌均匀后，再加入一定量的四乙氧基硅烷；四乙氧基硅烷的加入量以上述微乳液混合液的总体积为计量基准，为微乳液混合液总体积的0.9～1.0％(体积％)；然后磁力搅拌均匀后加入一定量的氨水引发聚合，在室温下搅拌反应24小时；接着再加入一定量的丙酮使纳米球沉淀出来；丙酮的加入量为上述总反应物体积的2倍；经洗涤数次以除去表面活性剂等杂质，最终得到包含有蛋白质的纳米二氧化硅颗粒。
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