CN103990123A - 肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料及其制备方法和应用。所述复合材料包括二氧化硅-金纳米核壳粒子、靶向粘附肽以及阿霉素;所述阿霉素经化学修饰形成SH-PEG-Dox前药后以Au-S键连接在二氧化硅-金纳米核壳粒子,所述靶向粘附肽以Au-S键连接在二氧化硅-金纳米复合粒子。本发明材料生物相容性好,具有特定光学性质和良好靶向,能将所载药物运输到肝癌细胞内并快速释放药物,具有化疗和热疗的协同治疗效果。
Description
技术领域
本发明属生物医药材料科学的纳米生物医药技术领域,涉及一种肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是一个全球死亡主要原因之一,根据世界卫生组织(WHO)报道,自2000年以来,每年癌症发病率多达1000万,死亡人数高达740万,约占所有死亡人数的13%,其中肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌和乳癌是每年大多数癌症死亡的罪魁祸首。传统的化学疗法在肿瘤的临床治疗已经取得了显著的成效,但是这些抗癌药物部具有一定的毒副作用,例如:肝脏和肾脏毒性、脱发、心脏毒性、恶心、食欲减退等。阿霉素就是这些常用化疗药物的一种,其作用机理主要是嵌入DNA而抑制核酸的合成,抗瘤谱较广,对多种肿瘤均有作用,属周期非特异性药物,对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用,毒副作用主要源于全身性用药以及药物缺乏靶向到肿瘤组织的特异性,并造成药物使用效率低下。如果能够降低药物的使用量,却同时提高对肿瘤细胞毒性,则可以减轻药物的毒副作用。为了提高疗效,人们开发了各种各样的药物载体系统,如靶向性纳米脂质体,聚合物纳米材料,树枝状聚合物载体都已经报道过。由于肝癌的发生和形成是一个复杂的过程,所以肝癌组织的结构也是很复杂的,受限于肝癌的微环境,造成上述纳米材料在肝癌组织内分布不均匀,从而影响最终治疗效果。例如:尽管肝癌血管有多孔和易渗透的特性,使得纳米材料易于渗透到血管外的一些肝癌组织区域,但是由于血管的渗透压有限,并且肝癌内部组织致密性高,使得大多数纳米材料富集于肝癌血管附近,较少进入到肝癌其它或更深的核心区域,阻止了纳米材料药物载体的治疗效果的完全发挥。
热疗也是一种治疗肝癌的有效辅助手段,常用的热源包括热水浴、灌注、外加磁场、超声波以及侵入式的微波。现有技术中这些方法的缺点就是,肝脏器官位于体内较深入部位,上述加入方式只能加热体表较浅部位,不能够对治疗区域集中加热,并且很容易对肝癌周围的正常组织造成伤害。因此急需一种即可以对肝癌组织内部加热,并可以在肝癌内部有效分散并快速释放化疗药物的新型材料,以解决现有纳米药物载体和热疗手段毒副作用大,治疗效果不佳的缺点。
发明内容
本发明克服现有技术的上述缺陷,提出一种肝癌靶向的载有抗癌药物阿霉素的纳米二氧化硅-金纳米复合材料。该材料生物相容性好,具有特定光学性质,能够良好地靶向到肝癌细胞,将其载有的阿霉素药物运输到肝癌细胞内,并在细胞内溶酶体的酸性条件下能够快速释放阿霉素,同时在807nm激光器照射条件下,纳米复合材料产生的热量可以有效增加Dox的化疗效果,显示出良好的协同治疗效果。
本发明提出一种肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,其包括二氧化硅-金纳米核壳粒子、靶向粘附肽、以及阿霉素;其中,所述阿霉素经化学修饰形成SH-PEG-Dox前药后以Au-S键连接在所述二氧化硅-金纳米核壳粒子,所述靶向粘附肽以Au-S键连接在所述二氧化硅-金纳米复合粒子。
其中,本发明肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料在近红外区700~1200nm具有最大等离子激原共振峰。
具体地,本发明肝癌靶向载有阿霉素的纳米二氧化硅-金纳米复合材料包括三个功能部分组成:(1)以二氧化硅纳米粒子为核、表面包裹金壳的二氧化硅-金纳米复合粒子,纳米复合粒子的粒径为60-300nm;(2)化疗药物(如阿霉素)通过SH-PEG-Dox前药与Au壳形成Au-S键连接在纳米复合粒子上;(3)继而在金壳表面通过巯基连接靶向基团,例如:肝癌特异性粘附肽A54(序列:AGKGTPSLETTP)。
其中,所述二氧化硅-金纳米复合粒子包括核以及壳。其中,所述核为二氧化硅纳米粒子,所述核的粒径为50~300nm。所述壳为金。所述壳的厚度为5~30nm;所述壳通过化学镀沉积于所述核的表面。
其中,所述靶向粘附肽为特异性粘附肽。优选地,所述靶向粘附肽为肝癌靶向肽A54。
其中,所述SH-PEG-Dox前药包括聚乙二醇、以及通过共价键分别连接在所述聚乙二醇两端的胱胺和阿霉素。其中,所述聚乙二醇的分子量为1000~10000Da。
本发明中,SH-PEG-Dox前药中所含的聚乙二醇(PEG)官能基团具有高度生物兼容性、亲水性,且能延长了该纳米复合粒子在体内的循环时间。SH-PEG-Dox前药中,SH为半胱胺基团的巯基;PEG为分子量为1000~10000Da的聚乙二醇;Dox为阿霉素;聚乙二醇两端通过酯键分别连接上阿霉素和半胱胺。
本发明复合材料中,SH-PEG-Dox前药具有良好的pH敏感性,在正常的生理条件下(pH值7.4)阿霉素很少释放出来,而当pH降低到4.5-6.5时,由于氨基甲酸酯键的断裂,阿霉素快速释放。
本发明复合材料中,SH-PEG-Dox前药的药物释放,在模拟溶酶体pH值相近的酸性环 境条件下(醋酸缓冲溶液,pH5.3),可以快速释放出阿霉素药物。
本发明复合材料中,肝癌靶向的载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,受到波长600~2000nm激光器照射时,会将含有此纳米复合材料的液体或肝癌组织加热至40-60摄氏度。具体地,600~2000nm激光器的功率为0.1W-10W。
本发明复合材料中,受激光照射后,引起肝癌部位升温,可以导致纳米复合材料和阿霉素药物更易于通过血管外渗扩散到肝癌组织内部。
本发明提供了一种新的药物载体设计方法、以及癌症热疗与化疗相结合的一种协同治疗方案。具体地,例如,是以二氧化硅-金纳米核壳材料为载体,在金壳表面修饰上肝癌靶向基团以及含有聚乙二醇官能基团的阿霉素前药的复合纳米材料。
具体地,例如,本发明肝癌靶向性的载有阿霉素的纳米复合物-二氧化硅-金纳米复合材料中,SH-PEG-Dox前药在模拟血流生理环境条件的pH7.4下较缓慢的Dox释放,而在模拟细胞内溶酶体的pH5.3下快速的Dox释放提供了有效和足够量的药物释放在肝癌细胞和肝癌组织内。
本发明中,肝癌靶向性载有阿霉素的纳米复合物-二氧化硅-金纳米复合材料的二氧化硅-金纳米核壳粒子的最大等离子体激元共振峰在600~2000nm波长范围内,但其受到波长600~2000nm的二极管或三极管激光器照射时,会将含有此纳米复合材料的液体或肝癌组织加热至40-60摄氏度。
本发明中,肝癌靶向性载有阿霉素的纳米复合物-二氧化硅-金纳米复合材料的靶向基团是利用噬菌体肽库技术筛选的肝癌特异性粘附肽A54(序列:AGKGTPSLETTP),可以特异性的粘附到肝癌细胞BEL-7404,BEL-7402,SMCC-7721,相比单克隆抗体,其具有免疫原性小和的生物相容性高等特点。
本发明肝癌靶向载有阿霉素的纳米二氧化硅-金纳米复合材料,既可以通过阿霉素对肝癌细胞起到化疗效果,还可以通过受激光照射的二氧化硅-金纳米核壳粒子起到热疗效果,两者效果的结合可以有效提高杀死肝癌的效果,减少阿霉素的使用量,通过特异性靶向肝癌组织的作用,减少对正常细胞的毒副作用。
本发明还提出了一种肝癌靶向载阿霉素的纳米二氧化硅-金纳米复合材料的制备方法,先合成二氧化硅-金纳米核壳粒子;然后,将已经引入了半胱胺基团的靶向粘附肽通过与金壳形成Au-S键从而键合在所述二氧化硅-金纳米核壳粒子表面;然后,将SH-PEG-Dox前药通过与金壳形成Au-S键从而键合到纳米金核壳粒子表面;合成得到目的产物肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料。包括以下合成步骤:
1)合成二氧化硅-金纳米核壳粒子
按公开技术合成二氧化硅-金纳米核壳粒子,合成方法参考中国专利文件200710040691.8“一种纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子及其制备”。
2)合成胱胺-聚乙二醇-阿霉素化合物(Cys-PEG-Dox)
采用化学方法,以聚乙二醇(PEG)作为连接臂,对其两端进行化学修饰,通过形成共价键在PEG两端分别引入抗癌药物阿霉素和含硫基团的胱胺基团。合成PEG修饰的Dox前药的过程如图1所示,首先使用对硝基苯基氯甲酸酯活化PEG两段的羟基,然后胱胺和抗癌药物Dox通过PEG链上的氯甲酸酯基团和Dox上的氨基反应化学结合到一起,形成Cys-PEG-Dox前药。合成Cys-PEG-Dox前药的具体步骤包括:
(1)功能化聚乙二醇(PEG):由于聚乙二醇(PEG)两端为羟基,反应活性不高,所以首先将聚乙二醇(PEG)通过使用对硝基苯基氯甲酸酯(p-NPC)活化,提高其与氨基的反应活性。
(2)在连接臂中引入阿霉素:在催化剂作用下,在非质子溶剂中阿霉素苯环上的氨基可以和对硝基苯基氯甲酸酯反应,生成氨基甲酸酯键,使阿霉素成功键合到PEG上。本步骤中,催化剂为吡啶或者三乙胺;非质子溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二氯甲烷、三氯甲烷等。
(3)在连接臂中引入含硫基团:含硫基团以含巯基或二硫键的小分子化合物为佳。例如,如果含硫基团是巯基,本发明首先使用胱胺修饰的PEG上,通过二硫键S-S保护巯基的,以利于前药的保存,在使用前将S-S用还原剂打开,生成-SH。常用的还原剂有巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇(DTT)等,优选地,还原剂以DTT为在。
3)合成肝癌靶向载有阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料
(1)制备得以表面键合靶向肽的二氧化硅-金纳米核壳粒子:即,靶向粘附肽在多肽的固相合成时就在端基引入半胱胺基团,然后通过半胱胺基团上硫基与金壳生成稳定的Au-S键,从而键合到纳米金核壳粒子表面合成具有靶向性的纳米金复合核壳粒子。离心除去术反应的靶向性粘附肽,沉淀物超声再分散在二次去离子水中,得到表面键合靶向肽的纳米金复合材料。
(2)制备肝癌靶向载有阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料:即,Cys-PEG-Dox(1mM)水溶液加入DTT还原胱胺的双硫键,生成SH-PEG-Dox,使用透析袋透析除去过量DTT。然后,将其加入到上述步骤(1)制备得到的表面键合靶向肽的纳米金复合材料水溶液中,混合,在常温下搅拌反应,离心分离除去过量的SH-PEG-Dox,得到修饰好的肝癌靶向载有阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,最后将修饰好的肝癌靶向性载有阿霉素的纳米二氧化硅-金纳米复合材料分散于去离子水中。
本发明还提出了肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料的应用。本发明应用中,所述纳米复合材料可以通过表面修饰的靶向性粘附肽主动靶向到肝癌组织,而较少被免疫系统所清除,使得更多的阿霉素有效地到达需要治疗的组织。
本发明应用中,所述纳米复合材料不仅可以通过表面修饰的靶向性粘附肽主动靶向到肝癌组织,而且可以通过细胞吞噬作用进入细胞内,同时由于细胞溶酶体的酸性环境,使得阿霉素从pH敏感的聚合物链段上释放下来,快速达到治疗的有效浓度,杀死肝癌细胞。
本发明应用中,富集所述纳米复合材料的肝癌组织在受到波长600~2000nm激光器照射后,可以通过等离子激原共振将光能转换成热能,产生的热能温度可达40-60摄氏度,可以将肝癌细胞快速杀死。该热能可以提高阿霉素的药物疗效,可以将化学疗法和光热疗法结合起来,达到协同治疗肝癌的目的,有效减少药物使用量,提高治疗效果。而且,该热能可以使得肝癌组织的血管扩张,细胞间隙扩大,纳米复合材料更易于在肝癌组织中扩散。
具体地,将肝癌细胞BEL-7402接种于覆有盖玻片的24孔培养板中,细胞与肝癌靶向性载有阿霉素的纳米二氧化硅-金纳米复合材料共培养,为了研究热疗和化疗协调治疗效果,与肝癌靶向性载有阿霉素的纳米二氧化硅-金纳米复合材料共培养的细胞分为两组:第一组37℃下培养6小时;第二组先43℃高温条件下培养0.5小时后再于37℃下培养5.5小时。结果显示经过43℃热处理后,与肝癌靶向性载有阿霉素的纳米二氧化硅-金纳米复合材料共培养的肝癌细胞凋亡和死亡的比例明显升高,显示出良好的热疗和化疗相结合的协同作用。
本发明创新地公开了一种对肝癌具有特殊靶向性、且载有pH响应阿霉素前药的纳米复合材料。本发明复合材料显示出良好的pH响应释放药物的行为,并且可以较稳定地存在生理条件下(pH7.4)。
其次,在溶酶体的低pH值条件下,本发明复合材料载有的阿霉素在细胞内能较好地快速释放出来,达到有效治疗浓度,因此以较少的阿霉素用量就可实现良好的毒性效果从而杀死癌细胞。
此外,热疗毒性实验显示,本发明纳米复合材料和肝癌细胞共培养时,与37℃孵育条件相比,经过43℃热处理后,与纳米复合材料共培养的癌细胞凋亡和死亡的比例明显升高,显示出本发明具有良好的热疗和化疗相结合的协同作用。
寻找合适的新热源是近期研究的热点,本发明首次创新地提出将二氧化硅-金纳米核壳材料的热疗和阿霉素的化疗效果结合起来实现协同治疗效果,并专门地特别设计了合成了pH敏感的药物释放模型和靶向治疗模型。
具体地,本发明靶向性热疗试剂纳米核壳材料结合化疗药物阿霉素(Dox)的复合纳米材料,以达到降低药物毒性,有效增强对治疗目标的化疗效果。
本发明中,首先通过氨基甲酸酯键分别将胱胺和Dox连接到了亲水性聚合物聚乙二醇(PEG)上,二硫苏糖醇(DTT)还原后合成SH-PEG-Dox前药,然后通过巯基将连接有Dox的PEG修饰到纳米核壳材料上,PEG不仅起到将Dox连接到纳米核壳材料上的作用,还可以起到增强纳米材料的体内循环时间,避免纳米核壳材料被RES系统吞噬。当本发明纳米复合材料受激光照射后,引起肝癌部位升温可以导致纳米复合材料和药物更易于扩散到肝癌组织内部,从而更有效杀死癌细胞和肿瘤的核心组织,避免癌症的复发和转移。
研究表明,细胞质和体液pH值为7.4,而内涵体、溶酶体等细胞器的pH值显酸性。由于SH-PEG-Dox前药具有良好的pH敏感性,在正常生理条件下(pH值7.4)阿霉素很少释放出来,而当载有Dox的纳米复合材料被细胞吞噬后在溶酶体内立即快速的释放,这是因为溶酶体内的pH值在4.5-6.5之间,而SH-PEG-Dox在此pH值下,连接PEG和Dox的氨基甲酸酯键易断链,从而Dox从纳米复合材料上释放下来,可以在短时间内在细胞内到达足够高的药物治疗浓度,提高肝癌的治疗效率。
此外,纳米复合材料表面修饰具生物活性的靶向性粘附肽,以促使纳米复合材料与肝癌组织特异性结合,减少其在正常组织中的含量,减少毒副作用。
例如,与其它治疗系统相比,本发明肝癌靶向的载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料显示出了较多优良特性,包括:良好的纳米药物载体功能、pH敏感性的药物释放系统、热疗/化疗相结合的协同治疗效果,可以载入阿霉素,可以在低pH值条件下释放阿霉素。既可以在激光照射下生热杀死癌细胞,也可以通过阿霉素的化学作用杀死癌细胞。
附图说明
图1:SH-PEG-Dox合成路线示意图。
图2:Cys-PEG-Dox的1HNMR谱图。
图3:本发明肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料的结构示意图。其中,1表示纳米二氧化硅核,2表示金壳,3表示阿霉素,4表示PEG链段,5表示靶向性粘附肽。
图4:靶向性粘附肽、二氧化硅-金纳米复合材料、靶向性粘附肽修饰的二氧化硅-金纳米复合材料的傅立叶变换红外光谱图。其中,1表示靶向性粘附肽A54,2表示二氧化硅-金纳米复合材料,3表示靶向性粘附肽修饰的二氧化硅-金纳米复合材料
图5:受到激光照射后含纳米复合材料溶液的温度变化曲线。其中,GNs表示纳米二氧化硅-金核壳粒子。
图6:pH响应的阿霉素的体外释放图。
图7(A)、7(B)、7(C):修饰有靶向肽的纳米复合材料的TEM照片和粒径分布柱状图。
图8:本发明BEL7402纳米复合材料热疗和化疗协调治疗的流式细胞术检测结果。其中,6表示阴性对照组,7表示不含靶向肽的纳米复合材料组对照组,8表示含靶向肽的纳米复合材料组,“+”表示热治疗组,“-”表示无热疗组。
图9:本发明BEL7402纳米复合材料热疗和化疗协调治疗的光学和荧光显微镜照片。其中,9表示阴性对照组,10表示含靶向肽的纳米复合材料组,“+”表示热治疗组,“-”表示无热疗组。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。
阿霉素体外释放测定:本发明采用透析法进行体外药物释放,称取Cys-PEG-Dox样品,溶解后装入截留分子量1000的透析袋中,置于盛有醋酸盐缓冲溶液(pH5.3)和磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)离心管中。然后将其置于恒温振动箱中,37℃,100rpm转速条件下,定时取释放液,并立即补加等量的缓冲溶液。释放出的阿霉素的量使用分光光度计分析其在488nm处吸光强度。
激光照射纳米核壳材料的温度测定:将含有二氧化硅-金纳米复合粒子的水溶液置于96孔板的一个孔中,使用功率为1.07W的807nm的近红外激光器(HPD1010-9MM)距离液面1cm处以垂直角度照射,溶液的温度变化使用MET-100红外测温仪监控,同时以去离子水溶液作为空白对照。
荧光显微镜研究纳米复合材料靶向性和热疗效果:将细胞接种于覆盖有盖玻片的12孔板中,将修饰有靶向肽的纳米复合材料与肝癌细胞共培养,未加纳米复合材料的肝癌细胞作为阴性对照组,在此基础上分成正常组和热疗组,接着共培养一段时间后,取出盖玻片,使用PBS洗涤,使用PI染色,并使用多聚甲醛固定细胞,再用PBS洗去残留的多聚甲醛,甘油封片剂封片后置于倒置荧光显微镜下观察拍照。
纳米复合材料协同治疗效果的评价:为了研究热疗和化疗协同治疗效果,使用流式细胞术来评价纳米复合材料的热疗毒性。首先将修饰有靶向肽的纳米复合材料、未修饰靶向肽的纳米复合材料与肝癌细胞共培养,未加纳米复合材料的肝癌细胞作为阴性对照组,在此基础上分成正常组和热疗组,在经过一段时间的共培养后将各组癌细胞用PBS洗涤后,使用 Annexin V-FITC和PI染色,并使用流式细胞仪(BD FACSCalibur,BD Bioscience)分析各组癌细胞凋亡和死亡情况。
数据处理:本发明所涉及的实验数据使用Origin8.0和Excel 2003软件处理,所有的结果均由平均值±标准差形式显示。
本发明中,SH-PEG-Dox合成路线示意图如图1所示。Cys-PEG-Dox的1HNMR谱图如图2所示。
实施例1:纳米二氧化硅-金核壳粒子的制备
首先使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷氨化二氧化硅纳米粒子表面,接着使用四羟甲基氯化磷还原合成的金纳米颗粒来功能化二氧化硅纳米材料表面合成种核纳米粒子,最后氯金酸溶液在甲醛还原下,溶液中生成大量金纳米晶体,然后这些晶体以种核上的金纳米颗粒为成核位点生长,最终形成完整的核壳结构的纳米二氧化硅-金核壳粒子。本实施例合成二氧化硅-金纳米核壳粒子的具体过程,参考中国专利文件200710040691.8“一种纳米复合物二氧化硅-金属核壳粒子及其制备”。
实施例2:聚乙二醇二胺(NH2-PEG-NH2)的合成
PEG→NPC-PEG-NPC
将PEG2000(10.0g,10mmol)和新蒸吡啶(3.955g,50mmol)加入70mL干燥的二氯甲烷(DCM)溶液中,氮气保护,冰浴条件下将溶解在10mL DCM中的p-NPC(8.07g,40mmol)逐滴加入到反应体系中,滴加完毕后,将反应液升到常温条件继续反应24小时。反应结束后,p-NPC活化的PEG2000使用预冷的冰乙醚重沉淀,真空干燥后备用。
实施例3:Cys-PEG-Dox的合成
将胱胺盐酸盐(Cys,0.612g,2.72mmol)和TEA(0.568g,5.61mmol)溶解于5mL的DMF中,在常温氮气保护条件下将PEG-NPC(2.787g,0.540mmol)的DMF溶液(10mL)逐滴加入到烧瓶中,反应过夜,反应液使用预冷的冰乙醚重沉淀两次后真空干燥得Cys-PEG-NPC粗产品。然后将Cys-PEG-NPC(0.2g,0.08mmol)溶解在10mL DMSO中,再加入50mg的盐酸阿霉素(0.08mmol)和57μLTEA,氮气保护常温条件下反应48小时,反应结束后,反应液中加入30mL水溶液,然后使用截留分子量1000的透析袋透析3天,以除去未反应的胱胺和Dox。透析结束后冷冻干燥得紫红色的Cys-PEG-Dox干粉。UV-vis检测Cys-PEG-Dox在488nm处吸收峰强度,测定Cys-PEG-Dox前药中阿霉素的含量为18.8%。标准曲线由一系列不同浓度溶解在DMSO中的阿霉素来建立。
实施例4:合成肝癌靶向肽A54修饰的纳米复合材料
向实施例1制备得到的二氧化硅-金核壳粒子水溶液1mL中(168×1011个/mL)加入100 μL的多肽A54水溶液(100μM)。混合液在常温下轻微搅拌3小时,然后使用截留分子量(MWCO)3000的超滤离心管离心除去未反应的多肽A54,得到经肝癌靶向肽A54修饰的纳米复合材料。最后将肝癌靶向肽A54修饰的二氧化硅-金复合粒子分散于1mL去离子水中,储藏在4℃冰箱中备用。如图4所示的傅立叶变换红外光谱图,其中,1表示靶向性粘附肽A54,2表示二氧化硅-金纳米复合材料,3表示本实施例产物靶向性粘附肽修饰的二氧化硅-金纳米复合材料。
实施例5:合成阿霉素修饰的复合纳米材料
在实施例3得到的Cys-PEG-Dox(1mM)水溶液加入与10mM DTT还原胱胺的双硫键,生成SH-PEG-Dox。过量的DTT使用截留分子量1000的透析袋透析除去。然后将SH-PEG-Dox加入到实施例4得到的1mL肝癌靶向肽A54修饰的二氧化硅-金核壳粒子(168×1011个/mL)水溶液中,混合溶液在常温下搅拌反应3小时,离心分离除去过量的SH-PEG-Dox,得到目的产物肝癌靶向的载有阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,最后将肝癌靶向的载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料修饰好的分散于1mL去离子水中,储藏在4℃冰箱中备用。
实施例6:阿霉素体外释放测定
本实施例采用透析法进行体外药物释放,精密称取二份20mg的Cys-PEG-Dox样品,溶解后装入截留分子量1000的透析袋中,分别置于盛有50mL醋酸盐缓冲溶液(pH5.3)和磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)离心管中。然后将其置于恒温振动箱中,37℃,100rpm转速条件下,定时取1mL释放液,并立即补加等量的缓冲溶液。释放出的阿霉素的量使用分光光度计分析其在488nm处吸光强度,实验重复3次。标准曲线使用PBS缓冲溶液配制的一系列的Dox溶液来标定。实验结果如图6所示的pH响应的阿霉素的体外释放图,表明本实施例复合材料载有的阿霉素能较快释放,以较小阿霉素用量实现良好毒性效果。
实施例7:显微镜研究纳米复合材料靶向性
将3×105个肝癌细胞BEL-7402细胞接种于覆盖有盖玻片的12孔板中,培养24小时后,等细胞覆盖面积达到孔板面积的80%时,吸弃先前的培养基,加入含有肝癌靶向的载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料培养基(含有10%FBS和1%双抗),为了研究热疗和化疗的协同作用,分成两组,第一组37℃下培养6小时;第二组43℃下培养0.5小时后再37℃下培养5.5小时。接着共培养1-12小时,未加纳米复合材料的癌细胞组作为阴性对照组,治疗结束后,取出载有细胞的盖玻片,PI染色30-60秒,染色结束后使用PBS洗涤3次,并使用4%多聚甲醛固定细胞,再用PBS洗去残留的多聚甲醛,甘油封片剂封片后置于倒置荧光显微镜下观察拍照。如图9所示的BEL7402纳米复合材料热疗和化疗协调治疗的光学和荧光显微镜 照片。其中,9表示阴性对照组,10表示含靶向肽的纳米复合材料组,“+”表示热治疗组,“-”表示无热疗组。
实施例8:纳米复合材料协同治疗效果的评价
使用流式细胞术来评价本发明肝癌靶向的载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料的热疗毒性。首先,将肝癌细胞BEL-7402接种6孔培养板中,每孔接种2.5×105个细胞,在37℃下含有5%浓度CO2潮湿空气环境中培养24小时后,为了研究热疗对化疗效果的影响,将与肝癌靶向的载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料共培养的细胞分为两组:第一组37℃下培养6小时;第二组43℃下培养0.5小时后再37℃下培养5.5小时。作为对照,未修饰靶向肽的载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料和未加纳米复合材料的细胞培养组进行同样的操作处理。培养结束后,胰酶消化细胞,收集细胞悬液,冰冷的PBS洗涤2次,用1×Binding Buffer重悬细胞,调整细胞浓度为1×106个/mL,取100μL细胞悬液至5mL流式细胞管中,加入5μLAnnexin V-FITC和5μL PI,混匀,室温避光染色15分钟,每管再加入400μL的Binding Buffer,使用流式细胞仪(BD FACSCalibur,BD Bioscience)分析细胞凋亡和死亡情况。如图8所示的BEL7402纳米复合材料热疗和化疗协调治疗的流式细胞术检测结果。其中,6表示阴性对照组,7表示不含靶向肽的纳米复合材料组对照组,8表示含靶向肽的纳米复合材料组,“+”表示热治疗组,“-”表示无热疗组。
以上实施例7和8表明,与37℃孵育条件相比,经过43℃热处理后,与纳米复合材料共培养的癌细胞凋亡和死亡的比例明显升高,显示本发明具有良好的热疗和化疗相结合的协同作用。
实施例9
实施例1中第(1)步中的聚乙二醇2000(PEG2000)分别用聚乙二醇1000(PEG1000)、聚乙二醇4000(PEG4000)替代进行功能化修饰,得到不同链长的SH-PEG-Dox。
Claims (10)
1.一种肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,其特征在于,包括二氧化硅-金纳米核壳粒子、靶向粘附肽、以及阿霉素;其中,所述阿霉素经化学修饰形成SH-PEG-Dox前药后以Au-S键连接在所述二氧化硅-金纳米核壳粒子,所述靶向粘附肽以Au-S键连接在所述二氧化硅-金纳米复合粒子。
2.如权利要求1所述的肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,其特征在于,所述复合材料在近红外区700~1200nm具有最大等离子激原共振峰。
3.如权利要求1所述的肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,其特征在于,所述二氧化硅-金纳米复合粒子包括核、以及壳;其中,所述核为二氧化硅纳米粒子,所述核的粒径为50~300nm;所述壳为金,所述壳的厚度为5~30nm;所述壳通过化学镀沉积于所述核的表面。
4.如权利要求1所述的肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,其特征在于,所述靶向粘附肽为特异性粘附肽。
5.如权利要求4所述的肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,其特征在于,所述靶向粘附肽为肝癌靶向肽A54。
6.如权利要求1所述的肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,其特征在于,所述SH-PEG-Dox前药包括聚乙二醇、以及通过共价键分别连接在所述聚乙二醇两端的胱胺和阿霉素。
7.如权利要求7所述的肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料,其特征在于,所述聚乙二醇的分子量为1000~10000Da。
8.一种肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料的制备方法,其特征在于,合成二氧化硅-金纳米核壳粒子;将引入半胱胺基团的靶向粘附肽通过与金壳形成Au-S键从而键合在所述二氧化硅-金纳米核壳粒子表面;再将SH-PEG-Dox前药通过与金壳形成Au-S键从而键合到纳米金核壳粒子表面,合成得到所述肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料。
9.一种肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料的应用,其特征在于,所述纳米复合材料通过表面修饰的靶向性粘附肽主动靶向到肝癌组织,并通过细胞吞噬作用进入细胞内。
10.一种肝癌靶向载阿霉素的二氧化硅-金纳米复合材料的应用,其特征在于,富集所述纳米复合材料的肝癌组织在波长600~2000nm激光器照射后,通过所述纳米复合材料的等离子激原共振将光能转换成热能。
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