JP5351724B2 - Ｃ型肝炎ウイルスのコア蛋白の検出方法及び検出用試薬キット - Google Patents

Description

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのコア蛋白（ＨＣＶコア蛋白）検出方法及び検出用試薬キットに関する。

Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされる伝染性の疾病である。ＨＣＶは、直径約６０ｎｍのＲＮＡウイルスで、エンベロープをもつ。ＨＣＶ ＲＮＡは一本鎖プラス鎖で、約９５００塩基配列よりなっている。遺伝子構造はフラビウィルスに類似しており、５’末端と３’末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）があり、この間に約３０００アミノ酸をコードする翻訳領域が存在する。翻訳領域は、５’側より、構造タンパクをコードするコア領域、エンベロープ領域１、エンベロープ領域２があり、これに続いて非構造領域が存在する。

ＨＣＶを検出するための方法として、コア領域がコードするＨＣＶコア蛋白を抗原とし、免疫学的手法を用いて検出する方法が知られている。ここで、ＨＣＶコア蛋白は、エンベロープを持つHCVの内部に存在する。従って、ＨＣＶコア蛋白を抗原として検出するには、ＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる必要がある。ＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる前処理方法としては、ＨＣＶをアルカリ性溶液で処理した後、酸性溶液で中和する前処理方法が知られている。例えば、特許文献１には、Ｃ型肝炎ウイルスを含む疑いのある試料を、非イオン性界面活性剤、蛋白変性剤及びアルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程、及び第１処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程により、ＨＣＶコア蛋白を遊離させる前処理方法が開示されている。

特開２００１−００４６２１号公報

特許文献１のような、ＨＣＶをアルカリ性溶液で処理した後、酸性溶液で中和する方法を用いれば、簡便に短時間でＨＣＶコア蛋白を検出するための試料を調製することができる。しかしながら、当該方法で調整した試料を使用し、磁性粒子を用いた免疫測定法でＨＣＶコア蛋白を検出する場合、Ｂ／Ｆ分離を行った後、磁性粒子を液相に分散させると磁性粒子の凝集が生じることがある。

従って、本発明は、上述の磁性粒子の凝集を抑制することが可能な、ＨＣＶコア蛋白検出方法、及びＨＣＶコア蛋白検出用試薬キットを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させるのに用いられるアルカリ性物質を含有する試薬、並びに酸性物質を含有する試薬の少なくとも一方に還元剤を添付することにより、粒子の凝集を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア蛋白の検出方法であって、HCVを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程と、第１処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程と、前記HCVコア蛋白と標識抗HCVコア蛋白抗体と磁性粒子とを含む複合体を形成するために前記第２処理工程で得られた試料と標識抗HCVコア蛋白抗体と磁性粒子とを液相中で接触させる接触工程と、前記磁性粒子を液相から分離する分離工程と、分離された磁性粒子を液相に分散する分散工程と、前記磁性粒子が分散された分散液からの標識に基づいて前記HCVコア蛋白を検出する検出工程とを含み、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム及びホスフィンから選択される少なくとも１つを含有する、ＨＣＶコア蛋白検出方法を提供する。
また、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア蛋白の検出用試薬キットであって、アルカリ性物質を含む第１前処理試薬と、酸性物質を含む第２前処理試薬と、標識抗HCVコア蛋白抗体と、磁性粒子とを含み、 前記第１前処理試薬及び前記第２前処理試薬の少なくとも一つが、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム及びホスフィンから選択される少なくとも１つを含有する、試薬キットを提供する。

本発明によれば、磁性粒子を用いた免疫測定法によるＨＣＶコア蛋白の検出において、磁性粒子の凝集を抑制することができる。

本実施形態におけるＨＣＶコア蛋白検出のための試料の前処理方法は、粒子を用いた免疫測定法によるＨＣＶコア蛋白の検出に用いられる、試料の前処理方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程と、第１処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程と、を含み、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、還元剤を含有する。

本実施形態において、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つは、還元剤を含む。第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが還元剤を含有することにより、後述する分離工程において、粒子の凝集を抑制することができる。ここで、「還元剤」は、後述する形成工程に影響を及ぼさない還元剤であれば、特に限定されない。本実施形態における還元剤としては、特に、蛋白質のジスルフィド結合を解離させるものが好ましい。より具体的な還元剤としては、例えば、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、ジチオエリトリオール、水酸化ホウ素ナトリウムまたはホスフィンなどが挙げられる。本実施形態における還元剤としては、特にメルカプトエチルアミン、ジチオトレイトールおよびシステイン塩酸塩が好ましい。

第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つに含有される還元剤の濃度は、使用する還元剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、還元剤としてメルカプトエチルアミンを用いる場合、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つに含有されるメルカプトエチルアミンの濃度は、１０〜６０ｍＭが好ましい。

本実施形態において、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つは、さらに無機塩類を含有することが好ましい。第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、さらに無機塩類を含有することにより、後述する分離工程において、粒子の凝集をさらに抑制することができる。ここで、「無機塩類」は、後述する形成工程に影響を及ぼさない塩類であれば、特に限定されない。本実施形態における塩類としては、特に、無機塩が好ましい。より具体的な無機塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムまたは硫酸ナトリウムなどが挙げられる。本実施形態における塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび硫酸ナトリウムが好ましい。

第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つに含有される無機塩類の濃度は、使用する無機塩類の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、無機塩類として塩化ナトリウムを用いる場合、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つに含有される塩化ナトリウムの濃度は、０．１〜１．０Ｍが好ましい。

ここで、「ＨＣＶを含む疑いのある試料」は、生体試料又は生体試料から調製された試料が好ましい。生体試料及び生体試料から調製された試料としては、例えば、尿、糞便、全血、血漿、血清、胆汁、胃腸分泌物、リンパ液、精液、骨髄液、唾液、母乳、組織抽出液、組織ホモジネート、細胞抽出液、細胞ホモジネートなどが挙げられる。

本実施形態において、第１処理工程で用いられる試薬は、さらに非イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。ここで、「非イオン性界面活性剤」は、上述のＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる方法で用いることができる非イオン性界面活性剤であれば、特に限定されない。本実施形態における非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好ましい。具体的なポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Triton X-100、Triton X-114及びNP-40等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Tween-20及びTween-80等）、及びポリオキシエチレンアルキルエーテル（Brij35及びBrij45等）などが挙げられる。本実施形態におけるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。

第１処理工程における、非イオン性界面活性剤の濃度は、使用する非イオン性界面活性剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、非イオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを用いる場合、第１処理工程における、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの濃度は２〜４％が好ましい。

また、本実施形態において、第１処理工程で用いられる試薬は、さらにカオトロピック剤を含有することが好ましい。ここで、「カオトロピック剤」は、蛋白質の分子構造を不安定化する性質を持つ物質であり、例えば尿素、グアニジン塩酸塩、サルチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素ナトリウム、アセトアミド及びホルムアルデヒドなどが挙げられる。本実施形態におけるカオトロピック剤としては、尿素が好ましい。

第１処理工程における、カオトロピック剤の濃度は、使用するカオトロピック剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、カオトロピック剤として尿素を用いる場合、第１処理工程における、尿素の濃度は２〜４Ｍが好ましい。

「アルカリ性物質」は、上述のＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる方法で用いることができるアルカリ性物質であれば、特に限定されない。ここで、アルカリ性物質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム及び硫酸ナトリウムなどが挙げられる。本実施形態におけるアルカリ物質としては、水酸化ナトリウムが好ましい。

第１処理工程における、アルカリ性物質の濃度は、使用するアルカリ性物質の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、アルカリ性物質として、水酸化ナトリウムを用いる場合、第１処理工程における水酸化ナトリウムの濃度は、０．１５〜０．５Ｎが好ましい。

「第１処理工程」は、ＨＣＶを含む疑いのある試料と、アルカリ性物質を含有する試薬を混合する処理であれば、特に限定されない。第１処理工程を行うことにより、ＨＣＶからＨＣＶコア蛋白を遊離することができる。ここで、第１処理工程における、処理時間や処理温度は、試料と試薬の混合条件に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されるものではない。具体的な第１処理工程における処理時間や処理温度としては、例えば、第１処理工程において、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の濃度が２〜４％で、尿素の濃度が２〜４Ｍで、水酸化ナトリウムの濃度が０．１〜０．４Ｎの試薬を用いる場合、２０〜３０℃の処理温度で６〜１０分の処理時間で第１処理工程を行うことができる。

なお、本実施形態における、アルカリ性物質を含有する試薬は、非イオン性界面活性剤とカオトロピック剤とを含有する試薬、及びそれぞれの成分を二つ以上の試薬に分けて含有する試薬キットが含まれる。ここで、試薬キットとしては、例えば、非イオン性界面活性剤及びカオトロピック剤を含有する第１試薬と、アルカリ性物質を含有する第２試薬とを備えた試薬キットなどが挙げられる。

「第２処理工程」では、第１処理工程で得られた試料と、酸性物質を含有する試薬とを混合し、第１処理工程で得られた試料のアルカリを中和する。第２処理工程で得られる試料のｐＨは、後述する形成工程に影響を及ぼさないｐＨであることが好ましい。より具体的な第２処理工程で得られる試料のｐＨとしては、ｐＨ６．５〜８が好ましい。ここで、具体的な第２処理工程における処理時間や処理温度としては、試料と試薬の混合条件に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されるものではない。具体的な第１処理工程における処理時間や処理温度としては、２０〜３０℃の処理温度で３〜１５分である。

「酸性物質」は、特に限定されないが、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸、硫酸などが挙げられる。本実施形態における酸性物質としてはクエン酸が好ましい。ここで、第２処理工程で用いられる酸性物質を含有する試薬における、酸性物質の濃度は、使用する酸性物質や上述の第１工程で使用されたアルカリ性物質などに応じて、適宜調整すればよく、特に制限されない。酸性物質を含有する試薬における、酸性物質の濃度としては、例えば、酸性物質がクエン酸の場合、試薬中のクエン酸の濃度は、０．１〜０．３Ｍが好ましい。

ＨＣＶを含む疑いのある試料は、上述の第１処理工程及び第２処理工程により希釈される。ここで、第１処理工程及び第２処理工程後における、ＨＣＶを含む疑いのある試料の希釈は、ＨＣＶを含む疑いのある試料の種類に応じて、適宜調整すれば良い。例えば、ＨＣＶを含む疑いのある試料が血清の場合、免疫測定に対する血清成分等の影響を抑制し、且つ、ＨＣＶコア蛋白を検出可能な濃度にする観点から、第１処理工程及び第２処理工程後における、血清の希釈は、３〜５倍が好ましい。

なお、粒子を用いた免疫測定法によるＣ型肝炎ウイルスの検出は、ＨＣＶコア蛋白を、公知の粒子を用いた免疫測定法を用いて検出するものであれば良い。また、粒子も、免疫測定法で用いられる公知の粒子であればよく、例えば、磁性粒子、ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられるが、磁性粒子が好ましい。ここで、磁性粒子としては、磁性を有する材料を基材として含み、通常の免疫測定に用いられる粒子であればよい。例えば、基材としてＦｅ_２Ｏ_３および／またはＦｅ_３Ｏ_４、コバルト、ニッケル、フィライト、マグネタイトなどを用いた磁性粒子が知られている。

磁性粒子を用いた免疫測定法を用いてＣ型肝炎ウイルスの検出する場合、液相中で形成されたＨＣＶコア蛋白、抗ＨＣＶコア蛋白抗体および磁性粒子からなる複合体を、磁気分離によって液相から分離してＨＣＶコア蛋白を検出することができる。より具体的には、液相中で、ＨＣＶコア蛋白、標識抗ＨＣＶコア蛋白抗体（以下、単に標識抗体という場合がある）および磁性粒子からなる複合体を形成する。次に、液相中の複合体を磁気分離によって液相から分離する。次に、分離された複合体を液相に分散し、複合体の標識を測定する。そして、測定の結果に基づいて、試料中のＣ型肝炎ウイルスの有無を判定することができる。

本実施形態における、第２処理工程で得られた試料を用いて、ＨＣＶコア蛋白、標識抗体および磁性粒子からなる複合体を形成する場合、第２処理工程後、標識抗体及び第２処理工程で得られた試料に含まれるHCVコア蛋白を含む複合体を、粒子上に形成させればよい。

ここで、「標識抗体」は、免疫測定法で一般的に用いられる公知の標識物質により標識された抗体であれば、特に限定されない。また、標識抗体は、ＨＣＶコア蛋白と抗原抗体反応により結合する。ここで、標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３２Ｐなどが挙げられる。なお、標識物質としては、酵素が好ましい。

標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質は、標識物質として用いる酵素に応じて、適宜公知の基質を選択すればよい。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合の基質としてはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標登録）、（４−クロロ−３−（メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１^３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（商標登録）（３−（４−メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発光基質；４−メチルウムベリフェニル・ホスフェート（４ＭＵＰ）などの蛍光基質；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリンなどの発色基質が挙げられる。

なお、標識抗体は、当該分野において公知の方法で作成することができる。例えば、抗体のチオール（−ＳＨ）を用いて上記の標識物質を抗体と結合させる方法が知られている。より具体的には、チオール基と反応できる官能基、例えばマレイミド基を導入した上記の標識物質を、抗体と反応させることにより、抗体を標識物質で標識できる。

標識抗体及び第２処理工程で得られた試料に含まれるHCVコア蛋白を含む複合体を、粒子上に形成するには、標識抗体と、磁性粒子と、第２処理工程で得られた試料に含まれるHCVコア蛋白とを液相中で接触させればよい。これにより、HCVコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体が、形成される。ここで、標識抗体とHCVコア蛋白は、抗原抗体反応により結合し、標識抗体−HCVコア蛋白複合体を形成する。さらに、標識抗体−HCVコア蛋白複合体は、HCVコア蛋白複合体と磁性粒子に結合可能な物質を介して、磁性粒子に結合させることができる。ここで、HCVコア蛋白複合体と磁性粒子に結合可能な物質としては、例えば、ＨＣＶコア蛋白と磁性粒子に結合する粒子結合抗体が挙げられる。ＨＣＶコア蛋白と磁性粒子に結合する粒子結合抗体を用いた場合、磁性粒子上には標識抗体−HCVコア蛋白−粒子結合抗体複合体が形成される。

ここで、「ＨＣＶコア蛋白と粒子に結合する粒子結合抗体」は、上述の標識抗体とは異なるＨＣＶコア蛋白のエピトープと抗原抗体反応により結合し、且つ粒子に結合可能な抗体であれば特に制限されない。なお、粒子に結合可能な抗体は、当該技術において公知の方法を用いて作成することができる。例えば、抗体に粒子結合部位を結合させ、粒子に粒子結合部位に結合可能な結合物質を固定化することで、粒子に結合可能な抗体を作成することができる。すなわち、粒子結合部位と結合物質との結合能を利用して、抗体を粒子に結合可能にすることができる。

上記の粒子結合部位と結合物質は、形成工程において、特異的に結合できる物質の組み合わせであれば特に限定されない。これらの組み合わせとして、例えばビオチンとアビジン類、ハプテンと抗ハプテン抗体、ニッケルとヒスタチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどが挙げられる。粒子結合部位と結合物質の組み合わせとしては、ビオチンとアビジン類との組み合わせが好ましい。粒子結合部位と結合物質との組み合わせに用いられる各々の物質は、どちらを粒子結合部位または結合物質を使用してもよい。より好ましい組み合わせとしては、粒子結合部位がビオチンを含み、結合物質がアビジン類を含む組み合わせが挙げられる。なお、「アビジン類」とは、アビジン及びスプレプトアビジンを含むことを意味する。

なお、粒子結合部位を抗体に結合させる方法は、当該技術において公知である。例えば、粒子結合部位がビオチンを含む場合、抗体中のアミノ基やチオール基などと反応性を有する基を介してビオチンを抗体に結合させることができる。アミノ基と反応性を有する基としてはＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基が挙げられ、チオール基と反応性を有する基としてはマレイミド基などが挙げられる。

また、結合物質を粒子に固定化する方法も、当該技術において公知である。該固定化は、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組み合わせなどにより行うことができる。例えば、結合物質がアビジン類である場合、物理的吸着によりアビジンを粒子に直接固定化することができる。また、アビジン類と結合可能な物質、例えばビオチンが結合した粒子にアビジン類を結合させることで、アビジン類を粒子に固定化することもできる。また、特開2006−226689号公報に記載の方法により、アビジン類を粒子に固定化することも可能である。なお、市販のアビジン類を結合させた粒子を用いることもできる。 例えば、ＪＳＲ株式会社やダイナルバイオテック社などから、アビジン類を結合させた粒子を購入することもできる。

次に、液相中のＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体を磁気分離によって液相から分離する。より具体的には、ＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体を含む液が入った容器の壁面に磁石を近づける。これにより、磁石を用いて複合体を容器の壁面に固定する。そして、複合体を容器の壁面に固定した状態で液相を吸引除去することで、分離工程を行うことができる。この分離を行うことにより、液相中に存在する、非イオン性界面活性剤、カオトロピック剤、及び複合体の形成に使用されなかった標識抗体など、後述する複合体の標識の測定において不要又は悪影響を及ぼす成分を除去することができる。

なお、ＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体を磁気分離によって液相から分離する際に、複合体を洗浄することもできる。例えば、上述の分離された複合体に、洗浄液を添加して複合体を懸濁し、さらに複合体を洗浄液から磁気分離することで、複合体を洗浄することができる。この洗浄工程を行うことで、複合体の標識の測定において不要又は悪影響を及ぼす成分を、さらに除去することができる。この洗浄も、磁性粒子を用いた免疫測定法において公知である。ここで、洗浄液としては、ＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体に影響を及ぼさない緩衝液が好ましい。また、洗浄液は、界面活性剤を含有する緩衝液が特に好ましい。より具体的な洗浄液としては、たとえば、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）及びＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）などが挙げられる。なお、ＨＩＳＣＬ洗浄液（シスメックス社製）などの、市販の洗浄液を用いることもできる。

次に、分離された複合体を液相に分散し、複合体の標識を測定する。分離された複合体の液相への分散は、分離された複合体を、基質液や緩衝液等の液相に分散させればよい。 ここで、標識の測定は、上述の標識抗体に用いた標識物質の種類に応じて、適宜適切な測定方法で行えばよく、特に限定されない。例えば、該標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることにより発生する光、色などを適切な装置を用いて測定することにより行うことができる。該装置としては、分光光度計、ルミノメータなどが挙げられる。また、標識物質が放射性同位体である場合、シンチレーションカウンターなどの従来公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。

そして、測定の結果に基づいて、試料中のＣ型肝炎ウイルスの有無を判定する。このＣ型肝炎ウイルスの有無を判定は、前記測定の結果に基づいて行う。具体的には、上述の測定において、ＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体に由来する標識が測定された場合、試料中にＨＣＶが有ると判定する。逆に、上述の測定においてＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体に由来する標識が測定されなかった場合、試料中にＨＣＶが無いと判定する。例えば、測定で得られた測定値と予め設定した閾値を比較する。そして、測定値が閾値以上の場合に、試料中にＨＣＶが有ると判定することができる。また逆に、測定値が閾値未満の場合に、試料中にＨＣＶが無いと判定することができる。ここで閾値は、公知の方法で適宜設定すれば良い。閾値の設定の方法としては、例えば、複数の予めＨＣＶが含まれていることが分かっている試料と、複数の予めＨＣＶが含まれていないことが分かっている試料とについて、それぞれの測定値を取得する。そして、ＨＣＶが含まれている試料の集団と、ＨＣＶが含まれていない試料の集団とを、二等分できる中央値を閾値として設定することができる。

なお、粒子を用いた免疫測定法によるＣ型肝炎ウイルスの検出として、磁性粒子を用いた免疫測定法を説明したが、ＨＣＶコア蛋白検出のための試料の前処理方法の適用は、これに限られない。磁性粒子以外の粒子としては、ラテックス粒子、赤血球、及びゼラチン粒子等が挙げられる。磁性粒子以外の粒子を用いた場合、磁気分離の代わりに、遠心分離を行うことで、複合体を液相から分離することができる。

＜還元剤による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
本例で使用する試薬は以下に示す。

第１処理試薬：
カオトロピック剤として尿素を６Ｍ、界面活性剤としてＢｒｉｊ３５（シグマ社製）を４％、及びアルカリ性物質として水酸化ナトリウムを０．４５Ｎ含む水溶液を、第１処理試薬とした。

第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２処理試薬Ａ〜Ｃの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ａ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
（第２処理試薬Ｂ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
（第２処理試薬Ｃ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
ＮａＣｌ ０．６ｍＭ

ここで、第２処理試薬Ｂには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第２処理試薬Ｃには、還元剤としてメルカプトエチルアミン、及び無機塩類としてＮａＣｌが含まれている。

標識抗体試薬：
標識抗体として、ＡＬＰで標識された抗ＨＣＶ抗体（ＡＬＰ標識ＨＣＦ３−８０７）を用いた。ここで、ＨＣＦ３−８０７としては、ＮＩＴＥ Ｐ−８４２で受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４２で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託された細胞である。具体的な標識抗体試薬の作製は、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したALPを混合して、反応させることで標識抗体を調製する。この方法で調製したALP標識抗体20μｌを、980μｌの希釈液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５) ２５ｍＭ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、ＢＳＡ ０．２５％、ＮａＮ３ ０．０２％、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＺｎＣｌ２ ０．１ｍＭ）で50倍に希釈し、標識抗体試薬とした。

第１抗体試薬：
第１抗体として、ビオチン及びＤＮＰで修飾された抗体（Ｂｉｏｔｉｎ／ＤＮＰ標識ＨＣＦ４−１０４）を用いた。ここで、ＨＣＦ４−１０４としては、ＮＩＴＥ Ｐ−８４１で受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４１で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託された細胞である。具体的な第１抗体試薬の作製は、ビオチン化試薬（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagents:ピアス社）をBSAに添加して、次いでDNP標識試薬（DNP-X acid SE:ABD Bioquest社）を添加することでBiotin/DNP標識したBSAを調製する。次に、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したBiotin/DNP標識したBSAを混合して、反応させることで第１抗体を調製する。この方法で調製した5 μｌの第１抗体を、495 μｌの希釈液で１００倍に希釈し、第１抗体試薬とした。

磁性粒子試薬：
第２抗体として抗ＤＮＰ抗体（ＤＮＰ−１７５３）を固定化した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０；インビトロジェン社製）を用いた。ここで、ＤＮＰ−１７５３としては、ＮＩＴＥ Ｐ−８４５で受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４５で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託された細胞である。100μｌの該磁性粒子を、900μｌの希釈液で10倍に希釈し、磁性粒子試薬とした。

還元剤による、磁性粒子の凝集の抑制効果を、以下の通り確認した。
＜第１処理工程＞
４０μｌのＨＣＶ陰性血清と、６０μｌの第１処理試薬とを混合し、室温にて８分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。
＜第２処理工程＞
第１処理工程で得られた試料に、６０μｌの第２処理試薬Ａ〜Ｃをそれぞれ添加し、室温にて５分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。なお、第２処理工程後の試料はｐＨ７〜７．５であることをｐＨ試験紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）により確認した。
＜形成工程＞
第２処理工程で得られた１６０μｌの試料と、７５μｌの標識抗体試薬とを、反応キュベット（ＨＩＳＣＬ用反応キュベット；シスメックス社製）で混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの第１抗体試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、８０μｌの磁性粒子試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
＜分離工程＞
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置（ＭＩＮＩＴＵＢＥ ＭＡＧ ＳＥＰＡＲＡＴＯＲ：ＳＰＨＥＲＯ ＴＥＣＨ社製）を用いて磁気分離を行った。

分離工程において磁気分離した磁性粒子に、ＨＩＳＣＬ洗浄液（シスメックス社製）を３００μｌ添加し、ボルテックスミキサーを用いて分散させ、反応キュベットを静置した後、粒子の凝集を評価した。

ここで、粒子の凝集の評価は、目視により観察し、凝集の程度を次の３段階に分けて評価した。
＋＋：凝集が認められる。
＋：やや凝集が認められる。
−：凝集が認められない。
第２処理工程において、第２処理試薬Ａ〜Ｃを用いた試料における、反応キュベット内の凝集の評価を表１に示す。

表１から明らかなように、第２処理工程において、メルカプトエチルアミンを含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が認められた。一方、メルカプトエチルアミンを含む、第２処理試薬Ｂ又は第２処理試薬Ｃを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が確認が認められなかった。このことから、第２処理試薬に還元剤を添加することで、分離工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。

＜還元剤の種類及びＨＣＶの存在による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
還元剤を含有する第２処理試薬による凝集抑制が、還元剤の種類に依存するものであるかを調べるため、以下の第２処理試薬Ｄ〜Ｆを調製した。また、試料として使用する血清中のＨＣＶの存在の有無が凝集に影響するかを調べるため、本例では、ＨＣＶ陰性血清に代えて、ＨＣＶ陽性血清を用いた。

第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２試薬Ｄ〜Ｆの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ｄ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ４５ｍＭ
（第２処理試薬Ｅ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
ジチオトレイトール ４５ｍＭ
（第２処理試薬Ｆ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
システイン塩酸塩 ９０ｍＭ

ここで、第２処理試薬Ｄには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第２処理試薬Ｅには、還元剤としてジチオトレイトールが含まれている。また、第２処理試薬Ｄには、還元剤としてシステイン塩酸塩が含まれている。

上述した第２処理試薬Ｄ〜Ｆ、及びＨＣＶ陽性血清を用いること以外は、実施例１と同様に、磁性粒子の凝集の抑制効果を確認した。なお、コントロールとして、第２処理液Ａによる、磁性粒子の凝集の抑制効果も確認した。凝集の評価結果を表２に示す。

表２から明らかなように、第２処理工程において、メルカプトエチルアミンを含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、ＨＣＶ陽性血清を用いた場合でも、磁性粒子の凝集が認められた。一方、メルカプトエチルアミンを含む第２処理試薬Ｄでは、ＨＣＶ陽性血清を用いた場合でも、実施例１と同様に磁性粒子の凝集が認められなかった。また、ジチオトレイトールを含む第２処理試薬Ｅ、およびシステイン塩酸塩を含む第２処理試薬Ｆを用いて処理した試料でも、第２処理試薬Ｄと同様に、磁性粒子の凝集が認められなかった。このことから、還元剤の種類を問わず、第２処理試薬に還元剤を添加することで、分離工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。また、血清中のＨＣＶの存在の有無にかかわらず、第２処理試薬に還元剤を添加することで、分離工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。

＜無機塩類による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
還元剤及び無機塩類を含有する第２処理試薬による凝集抑制が、無機塩類に依存するものであるかを調べるため、以下の第２処理試薬Ｇ〜Ｉを調製した。

第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２試薬Ｄ〜Ｆの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ｇ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
塩化ナトリウム ０．６Ｍ
（第２処理試薬Ｈ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
塩化カリウム ０．６Ｍ
（第２処理試薬Ｉ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
硫酸ナトリウム ０．６Ｍ

ここで、第２処理試薬Ｇには、無機塩類として塩化ナトリウムが含まれている。また、第２処理試薬Ｈには、無機塩類として塩化カリウムが含まれている。さらにまた、第２処理試薬Ｉには、無機塩類として硫酸ナトリウムが含まれている。

上述した第２処理試薬Ｇ〜Ｉを用いること以外は、実施例２と同様に、磁性粒子の凝集の抑制効果を確認した。なお、コントロールとして、第２処理液Ａによる、磁性粒子の凝集の抑制効果も確認した。凝集の評価結果を表３に示す。

表３から明らかなように、第２処理工程において、無機塩類を含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が認められた。一方、塩化ナトリウムを含む第２処理試薬Ｇ、塩化カリウムを含む第２処理試薬Ｈ、及び硫酸ナトリウムを含む第２処理試薬Ｉでは、磁性粒子の凝集がやや認められたものの、第２処理試薬Ａに比べ、磁性粒子の凝集の抑制効果が認められた。このことから、還元剤の磁性粒子の凝集の抑制効果より低いが、無機塩類にも磁性粒子の凝集の抑制効果があることが示された。従って、還元剤及び無機塩類の添加により、より効果的に磁性粒子の凝集が抑制できることが示唆された。

Claims (16)

1. Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア蛋白の検出方法であって、
   HCVを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程と、
   第１処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程と、
   前記HCVコア蛋白と標識抗HCVコア蛋白抗体と磁性粒子とを含む複合体を形成するために前記第２処理工程で得られた試料と標識抗HCVコア蛋白抗体と磁性粒子とを液相中で接触させる接触工程と、
   前記磁性粒子を液相から分離する分離工程と、
   分離された磁性粒子を液相に分散する分散工程と、
   前記磁性粒子が分散された分散液からの標識に基づいて前記HCVコア蛋白を検出する検出工程とを含み、
   第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム及びホスフィンから選択される少なくとも１つを含有する、ＨＣＶコア蛋白検出方法。
2. 前記標識抗HCVコア蛋白抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する粒子結合抗体が前記磁性粒子に固定されており、
   前記試料中にHCVが含まれている場合は、前記接触工程により、前記粒子結合抗体に前記HCVコア蛋白が結合し、前記HCVコア蛋白に前記標識抗HCVコア蛋白抗体が結合することによって前記複合体が形成される、請求項１記載の方法。
3. 第１処理工程で用いられる試薬が、さらに非イオン性界面活性剤を含有する、請求項１または２に記載の方法。
4. 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤から選択される請求項３に記載の方法。
5. 第１処理工程で用いられる試薬が、さらにカオトロピック剤を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. カオトロピック剤が、尿素、グアニジン塩酸塩、サリチル酸ナトリウム、アセトアミド及びホルムアミドから選択される少なくとも１つである請求項５に記載の方法。
7. アルカリ性物質が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化マグネシウムから選択される少なくとも１つである請求項１〜６いずれかに記載の方法。
8. 酸性物質が、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸及び硫酸から選択される少なくとも１つである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、無機塩類を含有する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 無機塩類が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及び硫酸ナトリウムから選択される少なくとも１つである請求項９に記載の方法。
11. 前記分離工程の後、前記磁性粒子を洗浄液中に分散し、前記洗浄液と前記磁性粒子とを分離することにより、前記磁性粒子を洗浄する洗浄工程をさらに含み、洗浄された磁性粒子を前記分散工程において分散させる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア蛋白の検出用試薬キットであって、
    アルカリ性物質を含む第１前処理試薬と、酸性物質を含む第２前処理試薬と、標識抗HCVコア蛋白抗体と、磁性粒子とを含み、
    前記第１前処理試薬及び前記第２前処理試薬の少なくとも一つが、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム及びホスフィンから選択される少なくとも１つを含有する、試薬キット。
13. 第１前処理試薬及び第２前処理試薬の少なくとも一つが、無機塩類を含有する、請求項１２に記載の試薬キット。
14. 第１前処理試薬が、さらに非イオン性界面活性剤を含有する、請求項１２または１３に記載の試薬キット。
15. 第１前処理試薬が、さらにカオトロピック剤を含有する、請求項１２〜１４のいずれかに記載の試薬キット。
16. 前記標識抗HCVコア蛋白抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する粒子結合抗体が前記磁性粒子に固定されている、請求項１２〜１５のいずれかに記載の試薬キット