KR20160119166A - 활성 간염 바이러스 감염의 탐지용 콤보-간염 항원 분석 및 키트 - Google Patents

활성 간염 바이러스 감염의 탐지용 콤보-간염 항원 분석 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서 대상들에서 간염 바이러스 감염을 탐지 및 진단을 위한 분석, 시스템 및 키트를 공개한다

Description

활성 간염 바이러스 감염의 탐지용 콤보-간염 항원 분석 및 키트{COMBO-HEPATITIS ANTIGEN ASSAYS AND KITS FOR DETECTION OF ACTIVE HEPATITIS VIRUS INFECTIONS}
발명의 배경
1. 발명의 분야
본 발명은 활성 간염 바이러스 감염을 탐지하고 진단하기 위한 분석, 분석 시스템 및 키트에 관계한다.
2. 관련 기술 설명
C형 간염 바이러스 (HCV) 감염은 전세계적으로 대략 1억7천만명에게, 그리고 미국에서만 4-5 백만명에게서 발생된다. HCV 감염은 만성 C형 간염 (CHC), 경화증, 그리고 간세포 암종 (HCC)과 연관되어 있다. HCV 감염은 여전히 검사에 의해 진단되고 있기 때문에 많은 대상에서 의학적 후속조치 및 효과적 치료에 대한 접근이 지연되는 것을 초래한다는 것이 최근 연구에서 나타났다. 또한, Centers for Disease Control and Prevention (CDC)는 1945-1965년 출생자들 모두가 HCV 감염에 대한 검진을 받아야 한다고 권고하였다.
HCV 게놈의 발견 이후, HCV 감염 선별용으로 다양한 항-HCV 항체 테스트가 개발되었다. 항-HCV 항체 테스트는 HCV-감염된 개인에 의해 생성되는 항-HCV 항체들의 존재를 탐지한다. 따라서, 항-HCV 항체 테스트는 면역 반응 및 항체 형성을 위한 시간을 필요로 한다. 이러한 이유로, 항-HCV 항체 테스트는 급성 HCV 감염을 탐지하는데 이용될 수 없다. 비록 제3세대 항-HCV 항체 테스트는 기존 항-HCV 항체 테스트와 비교하였을 때, 민감성 및 특이성은 상당히 개선되었지만, 기존 HCV 감염으로부터 진행중인 활성 HCV 감염을 구별해낼 수가 없는데, 그 이유는 이 바이러스가 제거된 후에도 항-HCV 항체들이 남아있기 때문이다. 추가적으로, 항-HCV 항체 테스트는 면역절충된(immunocompromised), 면역억제성 요법을 받거나, 또는 혈액투석을 하고 있는 대상의 경우 허위 음성 결과가 나올 확률이 높다. 결과적으로, 항-HCV 항체 테스트를 이용하여 HCV 감염에 양성으로 테스트된 이들중에서 활성 HCV 감염을 확인하기 위하여 추가 테스트, 이를 테면, HCV RNA의 PCR 분석이 요구된다. 유감스럽게도, HCV RNA PCR 테스트는 시간이 많이 소요되며, 고가이며, HCV 감염에 대한 선별 테스트로 현재 권장되지 않고 있다.
다른 HCV 테스트들은 HCV 코어 항원 (HCVcAg)을 탐지한다. HCVcAg는 완전한 HCV 비리온 및 HCV RNA-없는 코어 단백질 구조 모두에 존재한다. HCVcAg는 활성 HCV 복제의 표지로 간주되며, 항-HCV 항체들보다 더 일찍 탐지가능하다. 주요 HCVcAg 테스트 시스템으로는 Ortho HCV Core Ag EIA 테스트 (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ), Architect HCVcAg 테스트 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), 그리고 Monolisa HCV Ag/Ab ULTRA 분석 (Bio-Rad, Hercules, CA)이 있다.
Ortho HCV Core Ag EIA 테스트는 항-HCV 음성에서 양성으로 혈청전환(seroconversion)을 위한 윈도우 기간(window period)으로부터 유도된 가망 음성 항-HCV 테스트 결과를 다루기 위하여 항-HCV 테스트와 복합하여 혈액 기증자 스크리닝 테스트로 원래 개발되었다. 이는 인간 혈청 또는 혈장에서 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA, 또는 EIA)이다. 이 분석은 마이크로플레이트 고형 상에 피복되고, 테스트되는 혈청 시료 안에 존재하는 HCVcAg를 포획하기 위하여 HCV 코어 항원의 상이한 영역들에 대하여 특이적인 몇 가지 단일클론 항체들을 이용한다. 그 다음, 홍당무 과산화효소에 접합된 추가 HCVcAg-특이적 단일클론 항체들은 포획된 HCVcAg를 탐지하는데 이용될 것이다. 이 테스트의 민감성 (HCM V2.0 분석)은 1.48 pg/mL의 HCVcAg인 것으로 보고되었으며, 이는 9,707 IU/mL의 HCV RNA에 상응한다 (1). 문헌 평가에서 HCV RNA PCR-양성 경우들에서 이 테스트에 의하면, 가음성(false negative) 결과 비율이 높다는 결론이다. 따라서, Ortho HCV Core Ag EIA의 낮은 민감성은 이의 임상적 가치를 제한시킨다.
Architect HCVcAg 테스트는 인간 혈청 및 혈장 시료에서 HCVcAg의 정량적 결정을 위한 2-단계 화학적발광 극미립자 면역분석 (CMIA)이다. 이 분석은 액체 상에서 아크리디늄 라벨된 뮤린 항-HCV 항체들과 고형 상으로 단일클론 항-HCV 피복된 상자성의 극미립자를 이용한다. 이 테스트의 보고된 탐지 한계는 3.0-20,000 fmol/L의 범위에서 동적 HCVcAg 정량화와 함께, 3 fmol/L, 또는 0.06 pg/mL의 HCVcAg에 있다. 임상적으로, 이는 HCV 유전자유형화에 따라, 428-2700 IU/mL 범위에서 혈청 HCV RNA 수준에 상응한다. 일부 연구에서 이 테스트는 매우 민감성이 있지만, 다른 연구에서는 HCV RNA PCR 결과에 대한 이의 전반적 상관관계는 오직 79.7%이었다고 보고하였으며, 이는 혈청 HCV RNA < 3 log을 가진 대상에서 19.7% 만큼 낮을 수 있다. 탐지불가능한 HCV RNA를 가진 9/405 (2.2%) 대상에서, HCVcAg는 양성 (HCVcAg > 3 fmol/L)으로 보고되었으며, 이들 대상에서 가양성 HCVcAg 테스트 결과를 나타내었다는 것이 또한 보고되었다. 또한, 혈청 HCV RNA는 매우 낮은 수준 (<15 IU/mL)에 있을 때, 더 많은 가양성 결과가 발생될 수 있다. 더욱이, 이 테스트는 판매처에 의해 공급되는 특정 고가의 장비를 통하여 자동화되었으며, 이는 광범위한 임상적 적용, 특히 개발도상국에서 특히 일상적인 실험실에서 채택되는 것이 용이하지 않다. 현재, Architect HCV 코어 항원 테스트는 US과 많은 다른 국가에서 승인되지 않았다. 결과적으로, 이 HCVcAg 테스트 시스템은 경제적이거나, 민감하거나 특이적이지 않으며, 현실적이지도 않고, 광범위한 임상적 응용에 대하여 곤란할 것이다.
Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA 분석은 인간 혈청 및 혈장 시료에서 항-HCV 및 HCVcAg를 모두 동시에 탐지하기 위한 2-단계 ELISA이다. 항-HCV에 대한 간접 테스트와 HCVcAg 탐지를 위한 샌드위치 테스트의 조합에 기초한다. Monolisa HCV Ag-Ab 한외 분석은 HCVcAg 및 항-HCV 항체들을 모두 동시에 탐지함으로써 개선된 수행을 가진 것으로 보고되었지만, HCVcAg 신호로부터 HCV-Ab 신호를 구별해낼 수 없고, 따라서 회복된 또는 과거 HCV 감염으로부터 진행중인 활성 HCV 감염을 구별해낼 수 없다. 추가적으로, 이 테스트는 급성 HCV 감염의 진단율을 증가시키기 위해 기획되었고, 이 분석에서 HCVcAg 성분의 상대적으로 낮은 민감성으로 인하여 이 테스트에서 급성 HCV 감염이 있는 대략 29% 대상을 놓칠 것이라고 이 연구에서 나타내었다.
낮은 HCV RNA 부하(load)를 가진 시료에서 낮은 테스트 민감성 이외에, 현재 HCVcAg 분석의 다른 주요 한계중 하나는 PCR 테스트에 의해 혈청 HCV RNA에 대하여 음성이 아닌, 혈청 항-HCV에 대하여 양성인 대상에서 양성의 확률이 높다는 것을 나타낸다. 이들은 과거 감염은 있지만, 활성 HCV 감염을 가지지 않기 때문에, 이들 대상에서 HCVcAg에 대한 양성 테스트는 가양성으로 간주되어야 한다. 이는 현재 HCVcAg 테스트가 과거 감염으로부터 활성 HCV 감염을 구별낼 수 없는 무능력을 초래한다. 환언하면, 현재 HCVcAg 테스트를 이용하여, HCVcAg에 대해 양성으로 테스트된 대상이 활성 HCV 감염 또는 과거 HCV 감염 때문인지를 말할 수 없다.
따라서, 충분한 민감성 및 특이성을 가지며, 대상에서 활성 간염 바이러스 감염을 탐지하는데 이용될 수 있는 안전하고, 편리한 테스트가 필요하다.
본 발명의 요약
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원이 포함된 시료를 확인하는 분석을 제공하는데, 이 분석은 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하는 다수의 항체에 시료를 접촉시키고, 다수의 항체들에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원의 존부재를 탐지하고, 다수의 항체들에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 특정하고, 그리고 다수의 항체들에 결합된 간염 바이러스 항원이 존재하는 간염 바이러스 항원이 포함된 시료를 식별해내고, 그리고 다수의 항체들에 결합된 간염 바이러스 항원이 포함되지 않은 시료를 식별해내는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원은 HCV 항원 및/또는 B형 간염 바이러스 (HBV) 항원이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HBV 표면 항원 (HBsAg)을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HCV 항원을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택되며, 최소한 하나의 HCV 항원은 HCVcAg이다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 시료는 탐지 단계 전에 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪는다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 시료는 탐지 단계 전에 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 시료는 소변이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 시료는 전혈(whole blood), 혈청, 또는 혈장이다. 일부 구체예들에 있어서, 다수의 항체들은 제 1 항체와 제 2 항체를 포함하며, 전술한 제 1 항체들과 제 2 항체들은 동일한 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 분석은 상기 시료와 다수의 항체들을 혼합하고, 이 혼합물은 다수의 항체들에 특이적으로 결합하는 포획 물질을 가진 기질에 접촉되는 것을 더 포함하는데, 이때 상기 포획물질은 탐지 단계 전에 상기 간염 바이러스 항원에 결합될 수도 또는 결합되지 않을 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 탐지 단계는 다수의 항체들의 각 항체에 탐지가능한 라벨을 부착시키는 것을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 활성 간염 바이러스 감염을 가진 대상을 진단하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 활성 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 진단하는 것을 포함하는데, 이때 대상의 소변 시료 또는 변성 조건을 겪지 않았던 대상의 또다른 시료 (이를 테면, 전혈, 혈청, 혈장 시료, 그리고 이와 유사한 것들)는 본 발명에서 설명된 본 발명의 분석을 이용하여 자유 간염 바이러스 항원을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 분석은 자유 간염 바이러스 항원이 포함된 시료를 확인하기 위함인데, 이 분석은 상기 시료에 다수의 항체들을 접촉시키고, 이때 다수의 항체중 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하며, 다수의 항체들에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원의 존재 또는 부재를 탐지하고, 다수의 항체들에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고, 그리고 다수의 항체에 결합된 간염 바이러스 항원이 존재하는 것으로 탐지되면 자유 간염 바이러스 항원을 포함하는 시료로 확인되며, 그리고 다수의 항체에 결합된 간염 바이러스 항원이 없을 때, 이 시료는 자유 간염 바이러스 항원을 포함하지 않는 것으로 확인되는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 감염은 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원은 HCV 항원 및/또는 HBV 항원이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HBsAg을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HCV 항원을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택되며, 최소한 하나의 HCV 항원은 HCVcAg이다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 다수의 항체들은 제 1 항체와 제 2 항체를 포함하며, 전술한 제 1 항체들과 제 2 항체들은 동일한 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 분석은 상기 시료와 다수의 항체들을 혼합하고, 이 혼합물은 다수의 항체들에 특이적으로 결합하는 포획 물질을 가진 기질에 접촉되는 것을 더 포함하는데, 이때 상기 포획물질은 탐지 단계 전에 상기 간염 바이러스 항원에 결합될 수도 또는 결합되지 않을 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 탐지 단계는 다수의 항체들의 각 항체에 탐지가능한 라벨을 부착시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 방법은 다수의 대상으로부터 활성 간염 바이러스 감염이 있는 또는 없는 대상을 확인하는데 이용된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 활성 간염 바이러스 감염을 가진 대상 또는 과거 감염이 있었고, 깨끗해진(cleared) 간염 바이러스 감염 대상자를 진단하는 방법에 관계하며, 이 방법은 상기 대상으로부터 제 1 시료 및 제 2 시료를 얻고, 이때 제 2 시료는 면역 복합체를 가질 수 있고, 면역 복합체를 가질 수 없거나 및/또는 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪지 않았던 제 1 시료에 다수의 항체를 접촉시키고, 이때 다수 항체의 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원들의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하고, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원의 존재 또는 부재를 탐지하고, 그리고 다수의 항체들에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고, 면역복합체를 해리시키는 조건을 겪은 제 2 시료에 다수의 항체를 접촉시키고, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원의 존재 또는 부재를 탐지하고, 그리고 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고, 그리고 제 1 시료 안에 다수의 항체들에 결합된 간염 바이러스 항원이 존재하는 것으로 탐지될 때, 이 대상은 활성 간염 바이러스 감염을 가진 것으로 진단되며, 제 2 시료 안에 다수의 항체들에 결합된 바이러스 항원이 탐지되지만, 제 1 시료에서 간염 바이러스 항원이 탐지되지 않는 대상은 과거에 간염 바이러스 감염이 있었지만, 깨끗해진 것으로 진단되는 것을 포함한다. 예를 들면, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 대상을 활성 간염 바이러스 감염을 가진 대상 또는 과거 간염 바이러스 감염이 있었지만 깨끗해진 대상으로 진단하는 방법에 관계하며, 이 방법은 자유 간염 바이러스 항원을 탐지 및/또는 측정하고, 대상으로부터 얻은 하나 또는 그 이상의 시료 안에 전체 간염 바이러스 항원을 탐지 및/또는 측정하고, 그리고 자유 간염 바이러스 항원이 존재하는 것으로 탐지될 때, 활성 간염 바이러스 감염이 있는 것으로 대상을 진단하고, 그리고 전체 간염 바이러스 항원이 존재하는 것으로 탐지되고, 자유 간염 바이러스 항원은 부재하는 것으로 탐지된 대상은 과거 간염 바이러스 감염이 있었지만, 깨끗해진 것으로 진단하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 감염은 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원은 HCV 항원 및/또는 HBV 항원이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HBsAg을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HCV 항원을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택되며, 최소한 하나의 HCV 항원은 HCVcAg이다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 1 시료와 제 2 시료는 전혈, 혈청, 또는 혈장이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 1 시료는 소변이며, 상기 제 2 시료는 전혈, 혈청, 또는 혈장이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 1 시료와 제 2 시료는 동일 견본의 분획(aliquots)일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 다수의 항체들은 제 1 항체와 제 2 항체를 포함하며, 전술한 제 1 항체들과 제 2 항체들은 동일한 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 분석은 상기 시료와 다수의 항체들을 혼합하고, 이 혼합물은 다수의 항체들에 특이적으로 결합하는 포획 물질을 가진 기질에 접촉되는 것을 더 포함하는데, 이때 상기 포획물질은 탐지 단계 전에 상기 간염 바이러스 항원에 결합될 수도 또는 결합되지 않을 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 탐지 단계는 다수의 항체들의 각 항체에 탐지가능한 라벨을 부착시키는 것을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 활성 간염 바이러스 감염을 가졌던 대상, 가지고 있는 대상 또는 가지고 있을 수 있는 대상을 모니터하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 대상으로부터 제 1 시료와 제 2 시료를 얻고, 이때 최소한 상기 제 2 시료는 제 1 시점에서 면역 복합체를 가질 수 있으며, 면역 복합체를 가질 수 없는 및/또는 면역 복합체를 해리하는 조건을 겪지 않았던 제 1 시료에 다수의 항체들을 접촉시키고, 이때 다수 항체에서 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하고, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 간염 바이러스의 존재 또는 부재를 탐지하고, 그리고 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고, 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪었던 상기 제 2 시료에 다수의 항체들을 접촉시키고, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원의 존재 또는 부재를 탐지하고, 그리고 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고, 대상으로부터 제 3의 시료와 제 4의 시료를 획득하고, 이때 최소한 제 4 시료는 제 2 시점에서 면역 복합체를 가질 수 있으며, 면역 복합체를 가질 수 없거나 및/또는 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪지 않았던 제 3 시료에 다수의 항체들을 접촉시키고, 이때 다수의 항체에서 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하고, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원의 존재 또는 부재를 탐지하고, 그리고 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고, 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪었던 제 4 시료에 다수의 항체를 접촉시키고, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바리어스 항원의 존재 또는 부재를 탐지하고, 그리고 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고, 그리고 제 1, 제 2, 제 3, 그리고 제 4 시료간에 다수의 항체들의 항체에 결합된 간염 바이러스 항원의 차이를 계산하는 것을 포함한다. 예를 들면, 일부 구체예들에 있어서, 제 1 시점 기간에서 대상의 하나 또는 그 이상의 시료 안에 자유 간염 바이러스 항원의 존재 또는 부재 및/또는 자유 간염 바이러스 항원과 전체 간염 바이러스 항원의 양은 제 2 시점 기간에서 대상의 하나 또는 그 이상의 시료 안에 자유 간염 바이러스 항원의 존재 또는 부재 및/또는 자유 간염 바이러스 항원과 전체 간염 바이러스 항원의 양과 비교된다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 시점 기간에서 자유 간염 항원과 전체 간염 항원의 비율은 상기 제 2 시점 기간의 자유 간염 항원과 전체 간염 항원의 비율과 비교된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 감염은 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원은 HCV 항원 및/또는 HBV 항원이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HBsAg을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HCV 항원을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택되며, 최소한 하나의 HCV 항원은 HCVcAg이다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 시료들은 전혈, 혈청, 또는 혈장이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 1 시료와 제 3 시료는 소변이며, 상기 제 2 시료와 제 4 시료는 전혈, 혈청, 또는 혈장이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 1 시료와 제 2 시료들은 동일 견본의 분획일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 제 3 시료와 제 4 시료들은 동일 견본의 분획일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 다수의 항체들은 제 1 항체와 제 2 항체를 포함하며, 전술한 제 1 항체들과 제 2 항체들은 동일한 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 분석은 상기 시료와 다수의 항체들을 혼합하고, 이 혼합물은 다수의 항체들에 특이적으로 결합하는 포획 물질을 가진 기질에 접촉되는 것을 더 포함하는데, 이때 상기 포획물질은 탐지 단계 전에 상기 간염 바이러스 항원에 결합될 수도 또는 결합되지 않을 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 탐지 단계는 다수의 항체들의 각 항체에 탐지가능한 라벨을 부착시키는 것을 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 테스트 시료 안의 피분석물을 위한 면역분석을 제공하며, 이 분석은 상기 테스트 시료에 하나 또는 그 이상의 탐지 항체들을 혼합하고, 이때 상기 항체들은 상기 피분석물에 특이적으로 결합하며, 그 다음 상기 혼합물은 포획 항체들을 갖는 분석 기질에 접촉되고, 이때 포획 항체는 상기 분석 기질의 표면에 피복된 또는 고정된 피분석물에 특이적으로 결합하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 면역분석은 효소적 면역분석이다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 테스트 시료 안 피분석물의 측면 유동(lateral flow) 테스트 분석을 제공하는데, 이 분석은 테스트 시료와 상기 피분석물에 특이적으로 결합하는 탐지 항체들과 혼합하며, 이때 항체는 탐지가능한 라벨, 이를 테면, 콜로이드 금이 공액되어 있으며, 그 다음 테스트 라인에 고정된 상기 피분석물에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 테스트 라인의 하류에 있는 대조 라인에 고정된 탐지 항체에 특이적으로 결합하는 항체들을 갖는 테스트 스트립 상에 혼합물을 로딩하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 대상은 포유류, 이를 테면, 인간이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 대상은 본 발명에 따른 분석을 필요로 한다. 본 발명에 따른 분석을 필요로 하는 대상은 활성 간염 바이러스 감염에 걸린 것으로 의심되는 및/또는 과거 간염 바이러스 감염에 걸렸던 대상, 그리고 간염 바이러스에 노출되었던 대상들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원은 HCV 항원 및/또는 HBV 항원이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HBsAg을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HCV 항원을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택되며, 최소한 하나의 HCV 항원은 HCVcAg이다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나, 또는 구성된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 시료 로딩 영역 (이를 테면, 여기에서 상기 시료는 측면 유동 테스트 기질과 우선 접촉되고)을 갖는 측면 유동 테스트 기질, 테스트 영역, 그리고 대조 영역을 제공하고, 이때 포획 시약은 테스트 영역에 고정되며, 전술한 포획 시약은 다수의 항체들이며, 이때 다수의 항체에서 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원은 HCV 항원 및/또는 HBV 항원이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HBsAg을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HCV 항원을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택되며, 최소한 하나의 HCV 항원은 HCVcAg이다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나, 또는 구성된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 다수의 항체들이 포함된 용기, 이때 다수 항체의 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하고, 그리고 다수의 항체들, 다수의 간염 바이러스 항원, 또는 이 둘 모두에 특이적으로 결합하는 포획 시약이 피복된 또는 고정된 기질이 포함된 키트를 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원은 HCV 항원 및/또는 HBV 항원이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HBsAg을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HCV 항원을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택되며, 최소한 하나의 HCV 항원은 HCVcAg이다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 다수의 항체들은 자연에서 볼 수 없는 다수 항체의 농도 및/또는 순도를 가진 조성물이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 키트는 이에 부착된 탐지가능한 라벨을 갖는 또는 공액물을 가진 단일클론 또는 다중클론성 항체를 더 포함하며, 전술한 단일클론 또는 다중클론 항체는 다수의 항체들에게 특이적으로 결합한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 시료 로딩 영역 (이를 테면, 여기에서 상기 시료는 측면 유동 테스트 기질과 우선 접촉되고)을 갖는 측면 유동 테스트 기질, 테스트 영역, 그리고 대조 영역을 포함하는 키트를 제공하고, 이때 포획 시약은 테스트 영역에 고정되며, 전술한 포획 시약은 다수의 항체들이며, 이때 다수의 항체에서 각 항체는 탐지 시약과 함께 포장된 다수의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원은 HCV 항원 및/또는 HBV 항원이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HBsAg을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 간염 바이러스 항원은 HCV 항원을 포함하거나 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택되며, 최소한 하나의 HCV 항원은 HCVcAg이다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 다수의 항체들은 자연에서 볼 수 없는 다수 항체의 농도 및/또는 순도를 가진 조성물이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 키트는 이에 부착된 탐지가능한 라벨을 갖는 단일클론 또는 다중클론성 항체를 더 포함하며, 전술한 단일클론 또는 다중클론 항체는 다수의 항체들에게 특이적으로 결합한다.
상기 간염 바이러스 항원이 다수의 항원, 이를 테면, HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a로 기본적으로 구성되는 경우, 구절 "기본적으로 구성된"이란 다른 항원의 탐지는 다수의 항원, 이를 테면, HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a에서 항원 탐지에 부정적 영향을 주지 않는 한, 상기 분석, 시스템, 및 키트가 간염 바이러스 항원이거나 아닐 수 있는 다른 항원의 탐지를 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 항체들에 결합된 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원의 탐지는 결합된 간염 바이러스 항원 자체를 직접적으로 탐지하는 것이거나, 또는 상기 간염 바이러스 항원에 결합된 하나 또는 그 이상의 항체들을 간접적으로 탐지하는 것일 수 있다. 예를 들면, 주어진 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하는 라벨된 항체는 주어진 간염 바이러스 항원을 직접적으로 탐지하는데 이용될 수 있다. 대안으로, 항원에 결합된 항체에 특이적으로 결합된 라벨된 항체는 간접 탐지용으로 이용될 수 있다.
전술한 전반적인 설명 및 다음의 상세선 설명은 예시적이며 설명을 위함이고, 청구되는 바와 같이 본 발명을 추가 설명하기 위하여 의도된 것이다. 첨부 도면은 본 발명을 더 이해하도록 제공되며, 본 명세서의 일부에 포함되고, 일부를 구성하며, 본 발명의 몇 가지 구체예를 설명하고, 본 발명의 원리를 설명하기 위한 설명과 함께 제공된다.
본 발명은 도면을 참고하여 더 이해되며, 이때:
도 1은 어떻게 HCV 다단백질 전구물질이 HCV 게놈으로부터 해독되고, 그 다음 절단되어 상이한 HCV 구조적 단백질과 비구조적 단백질로 절단되는 지를 도식적으로 보여준다. C: 코어 단백질; E: 외피 단백질; NS: 비구조적 단백질들.
도 2는 본 명세서에서 구체화된 LFT 분석에 이용된 면역크로마토그래픽 스트립의 구조적 도표다. A. 시료 패드; B. 받침 카드; C. 접합 패드; D. 콜로이드 금 입자들이 접합된 포획 항체; E. 니트로셀룰로오스 막; F. 테스트 라인; G. 대조 라인; 그리고 H. 흡수제 패드.
도 3a는 혈청 시료 안에서 콤보-HCV-Ags EIA 분석 (콤보)과 EIA 분석 탐지 HCVcAg 단독 (코어)과 비교하였을 때, OD 값이 상당히 증가되었고, 따라서 민감성을 가진다는 것을 보여주는 막대 그래프다. 이들은 또한 HCV 감염 동안 혈액 시료 안에 HCVcAg이외에, HCV NS3, NS4b, 및 NS5a 항원들의 존재를 확인하였다. 음성(Negative): PCR 분석에 의해 음성 항-HCV 및 혈청 HCV RNA와 함께 혈청 견본을 이용하는 음성 대조 S: PCR 분석에 의해 양성 혈청 HCV RNA와 함께 테스트 혈청 견본. 각 세트에서 첫 번째 막대는 “코어”이며, 각 세트에서 두 번째 막대는 “콤보”이다.
도 3b는 소변 시료 안에서 콤보-HCV-Ags EIA 분석 (콤보)과 EIA 분석 탐지 HCVcAg 단독 (코어)과 비교하였을 때, OD 값이 상당히 증가되었고, 따라서 민감성을 가진다는 것을 보여주는 막대 그래프다. 이들은 또한 HCV 감염 동안 소변 시료 안에 HCVcAg이외에, HCV NS3, NS4b, 및 NS5a 항원들의 존재를 확인하였다. 음성(Negative): PCR 분석에 의해 음성 항-HCV 및 혈청 HCV RNA와 함께 소변 견본을 이용하는 음성 대조 S: PCR 분석에 의해 양성 혈청 HCV RNA와 함께 테스트 소변 견본. 각 세트에서 첫 번째 막대는 “코어”이며, 각 세트에서 두 번째 막대는 “콤보”이다.
도 4는 혈청 견본들을 테스트할 때, 추가 HCVcAg mAb의 첨가는 콤보-HCV-Ags EIA 분석 (실시예 2)의 민감성을 개선시켰다는 것을 보여주는 막대 그래프다. “1 코어” = 하나의 HCVcAg mAb를 이용하여 단독으로 HCVcAg에 대한 EIA 분석; “1 코어 + 콤보” = 하나의 HCVcAg mAb + NS3, NS4b, 및 NS5a에 대한 항체들을 이용하는 콤보-HCV-Ags EIA 분석; “2 코어” = 제 1 HCVcAg mAb 및 제 2 HCVcAg mAb를 이용하여 단독으로 HCVcAg에 대한 EIA 분석; 그리고 “2 코어 + 콤보” = 제 1 HCVcAg mAb 및 제 2 HCVcAg mAb + NS3, NS4b, 및 NS5a에 대한 항체들을 이용하는 콤보-HCV-Ags EIA 분석. PBS: PBS 완충액이용; 음성 대조:PCR 분석에 의해 음성 항-HCV 및 혈청 HCV RNA와 함께 혈청 견본을 이용; 시료: PCR 분석에 의해 양성 혈청 HCV RNA와 함께 테스트 혈청 견본들.
도 5, 패널 a-d는 HCVcAg이외에, HCV RNA-양성 혈청 견본들의 사전-처리를 보여주는데, 변성(denaturation)은 HCVcAg (패널 a), NS3 (패널 b), NS4b (패널 c), 및 NS5a (패널 d)에 대한 EIA에서 측정된 OD 값 또는 민감성을 또한 증가시킨다. 이들은 HCV 감염 동안 혈액 견본들에서 이들 HCV-Ags를 각각 모두 포함하는 면역 복합체의 존재를 또한 확인하였다. 처리된 시료: 테스트 혈청 시료 (S1-S3)는 변성 (실시예 2, 단계 5에 의해); 처리안된 시료: 테스트 혈청 시료 (S1-S3)는 사전-처리되지 않았다 (실시예 2, 단계 5 생략).
도 6a는 연속 희석을 테스트하는 혈청 시료에서 콤보-HCV-Ags EIA 분석의 탐지 한계(PCR에 의해 약 188 IU/mL의 혈청 HCV RNA에 대등한)를 보여주는 막대 그래프다.
도 6b는 연속 희석을 테스트하는 또다른 혈청 시료에서 콤보-HCV-Ags EIA 분석의 탐지 한계(PCR에 의해 약 328 IU/mL의 혈청 HCV RNA에 대등한)를 보여주는 막대 그래프다.
도 6c는 상이한 HCV 유전자형에 대한 콤보-HCV-Ags EIA 분석의 탐지 한계(PCR에 의해 약 250 IU/mL의 혈청 HCV RNA에 대등한)를 보여주는 막대 그래프다. 이 그래프는 상이한 HCV 유전자형들에 의해 감염된 대상으로부터 5개 시료의 평균을 나타낸다.
도 7a는 혈청 시료를 이용한 콤보-HCV-Ags EIA 분석은 테스트된 121개 혈청 견본에서 100% 민감성 및 100% 특이성을 나타내는 표로써, 이때 94 IU/mL 내지 14,400,000 IU/mL 범위의 PCR에 의해 혈청 HCV RNA에 대한 38개의 음성과, PCR에 의해 혈청 HCV RNA에 대한 83개의 양성이 포함된다.
도 7b는 콤보 HCV-Ags EIA 분석의 광학 밀도에 의해 측정된 혈청내 HCV-Ags 수준은 통상적인 HCV RNA PCR에 의해 측정된 혈청 HCV RNA 수준과 상당히 연관되어 있음을 보여준다 (r2 = 0.812, p< 0.01).
도 8a는 소변 시료를 이용한 콤보-HCV-Ags EIA 분석은 테스트된 100개 소변 견본에서 98.7% 민감성 및 100% 특이성을 나타내는 표로써, 이때 62,000 IU/mL 내지 9,960,000 IU/mL 범위의 PCR에 의해 혈청 HCV RNA에 대한 20개의 음성과, PCR에 의해 혈청 HCV RNA에 대한 80개의 양성이 포함된다. 테스트된 100명의 대상중에서 하나의 가음성은 혈액투석 (HD)에 있는 말기 신장 질환(ESRD)이 있는 대상에서 유래되었다.
도 8b는 콤보 HCV-Ags EIA 분석의 광학 밀도에 의해 측정된 소변 시료내 HCV-Ags 수준은 통상적인 HCV RNA PCR에 의해 측정된 혈청 HCV RNA 수준과 상당히 연관되어 있음을 보여준다(r2 = 0.821, p< 0.01).
도 9는 혈청 항-HCV에 대하여 양성이지만, PCR에 의해 혈청 HCV RNA에 대하여 음성인 15명의 개인에게서 혈청 견본들 (상위 2개 열)과 소변 견본들 (하위 2개 열)에 대한 콤보 HCV-Ags EIA 테스트 결과를 요약한 표다. 표에서 제시된 바와 같이, 변성 (방법 I) 후, 이들 혈청 견본의 6/15 (40%)는 양성 결과를 나타내었지만, 변성 단계가 생략된 경우 (방법 II), 이들 동일 견본 모두 (100%>) 음성 결과를 나타내었다. 이들 결과에서 혈청 견본들의 변성으로 IC-HCV 복합체로 부터 IC-HCV 항원이 방출되고, 이들 개인들에게서 가양성 테스트 결과가 초래되었음을 나타낸다. 그러나, 동일한 15명의 개인의 소변 견본들의 변성은 100% 음성 테스트 결과를 초래하였고, 이는 동일 견본의 비-변성과 완전히 일치된다. 따라서, 변성 또는 무변성은 동일한 소변 견본을 이용한 콤보 HCV-Ags EIA 테스트 결과에 영향을 주지 않을 것이다.
도 10a는 실시예 5.5에 따라 테스트 (혈청) 시료와 탐지 항체들을 혼합함으로써 콤보-HCV-Ags EIA 분석의 민감성의 예상치 않은 증가를 보여주는 막대 그래프다. NC: PCR에 의해 항-HCV 및 HCV RNA에 대한 혈청 견본 음성을 이용한 음성 대조 ; 2 코어 Abs: EIA를 위하여 항-HCVcAg 항체 2 종류를 이용; 콤보: 콤보 HCV-Ags EIA (실시예 2). 측정된 OD 값에 근거하여, 포획 항체들을 가진 분석 기질에 접촉시키기 전, 탐지 항체들과 테스트 시료의 혼합은 혼합을 하지 않은 콤보 HCV-Ags EIA와 비교하여 민감성이 약 27% 개선되었으며, 반면, 실시예 5.5에 따른 혼합 단계는 혼합 단계 없는 동일한 방법과 비교하였을 때, 2 코어 EIA의 민감성이 8% 개선되었다.
도 10b는 콤보-HCV-Ags EIA 분석을 이용하여 PCR에 의해 양성 혈청 HCV RNA를 갖는 2명의 대상의 연속 희석된 혈청 견본에서 도10a에서 설명된 혼합 단계와 함께, HCV-Ags의 탐지를 보여주는 막대 그래프다. 상기 시료와 탐지 항체들은 함께 혼합 후, 포획 항체들을 가진 분석 기질에 접촉시켰다. NC: 음성 대조, PCR에 의해 항-HCV 및 HCV RNA에 음성인 대상의 혈청 견본 변성 방법은 더 높은 ODs를 가지지만, 이들 방법들은 모두 비슷한 탐지 한계, 이를 테면, 혈청 HCV RNA 140 IU/mL에 대등한 한계를 가진다.
도 10c는 콤보-HCV-Ags EIA 분석을 이용하여 PCR에 의해 양성의 그리고 낮은 혈청 HCV RNA를 갖는 5명의 대상의 소변 견본에서 도10a에서 설명된 혼합 단계와 함께, HCV-Ags의 탐지를 보여주는 막대 그래프다. 상기 시료와 탐지 항체들은 함께 혼합 후, 포획 항체들을 가진 분석 기질에 접촉시켰다. NC: 음성 대조, PCR에 의해 항-HCV 및 혈청 HCV RNA에 대하여 음성인 대상의 소변 견본이다. OD 값은 탐지 한계가 혈청 HCV RNA 63-94 IU/mL에 등가임을 나타내었다.
도 10d는 급성 C형 간염 바이러스 감염으로 임상적으로 진단받은 대상, 이를 테면, PCR에 의해 HCV RNA에 대해 양성이지만, 항-HCV 항체들에 대하여 음성으로 테스트된 대상의 2개 혈청 시료로부터 콤보 HCV-Ags EIA 테스트 결과를 나타내는 그래프다. PBS: PBS 음성 대조; NC: RT PCR에 의해 항-HCV 및 HCV RNA에 대하여 음성 혈청 견조의 음성 대조. S1 및 S2: 급성 HCV 감염의 테스트된 혈청 시료 1 및 2. S1 및 S2 그래프는 콤보 HCV-Ags EIA 테스트를 이용하여 항-HCV 테스트가 양성이 되기 저네, 59일차 (S2)와 65일차(S1)에서 양성 테스트 결과를 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따른 콤보 HCV-Ags 분석은 항-HCV 항체들이 출현하기 전에, 급성 간염 바이러스 감염을 탐지할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 자유 간염 바이러스 항원의 탐지는 대상에서 면역 반응, 이를 테면, 항체 형성의 발생 및/또는 존재와는 독립적이다.
도 11a는 LFT 분석의 테스트 스트립 그림이다. 패널 A) LFT 테스트 스트립에서 HCVcAg 단독으로 이용하면 임의의 양성 신호를 탐지할 수 없고; 패널 B) 콤보-HCV-Ags LFT 테스트 스트립을 이용하면, 혈청 시료 안 특이적 신호가 탐지가능하였고, 그리고 패널 3) 콤보-HCV-Ags LFT 테스트 스트립을 이용하면, 소변 시료안 특이적 신호가 탐지가능하였다. 이들은 또한 HCV 감염 동안 혈청 시료 및 소변 시료 안 모두에 HCVcAg이외에, HCV NS3, NS4b, 및 NS5a 항원들의 존재를 확인하였다. 활성 HCV 감염이 있는 대상의 시료는 PCR을 이용하여 혈청 HCV RNA에 의해 확인되었다. 각 패널에서, 스트립 1: PBS 완충액은 음성 대조임; 스트립 2: 음성 대조로써, 항-HCV에 대하여 양성이지만, HCV RNA에 대하여 음성인 시료 테스트 ; 스트립 3-5 활성있는 HCV-감염된 시료.
도 11b는 소변 시료를 이용한 콤보-HCV-Ags LFT 분석의 테스트 스트립의 그림으로써, 콤보-HCV-Ags LFT 테스트 스트립에 HCVcAg에 대한 추가 mAb를 첨가하면 민감성이 더 증가됨을 보여준다. 패널 A는 1 HCVcAg mAb + NS3, NS4b, 및 NS5a에 대한 항체를 이용한 테스트 스트립이며; 패널 B는 2개의 상이한 HCVcAg mAbs + NS3, NS4b, 및 NS5a에 대한 항체들을 이용한 테스트 스트립을 나타낸다. 각 패널에서, 스트립 C = 음성 대조, PCR에 의해 음성 항-HCV 및 혈청 HCV RNA인 소변 시료; 그리고 스트립 1-5 각각은 차례로 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 및 6이다. GT-5로 유사한 결과가 나타났다 (보이지 않음).
도 12a는 콤보-HCV-Ags LFT 분석을 이용한 테스트 스트립의 도면으로, 실시예 6.3에 따라 테스트 패드에 추가하기 전, 테스트 혈청 시료과 콜로이드 금 용액 (콜로이드 금에 접합된 탐지기 항체들)과 혼합하면, 혈청 테스트 시료에 대한 본 발명에 따른 콤보-HCV-Ags LFT 분석의 민감성이 상당히 개선되었음을 나타낸다.
도 12b는 PCR에 의해 낮은 혈청 HCV RNA 수준을 갖는 5개 혈청 견본들에 대하여 실시예 6.3에 따른 혼합 단계와 함께, 콤보-HCV-Ags LFT 분석을 이용한 테스트 결과를 나타내는데, 콤보 HCV-Ags LFT의 최저 탐지 한계는 26-63 IU/mL의 혈청 HCV RNA 수준에 대등한 범위 안에 있다. C: 음성 대조, PCR에 의해 항-HCV 및 혈청 HCV RNA에 음성인 혈청 견본.
도 12c는 혈청 시료를 이용한 콤보-HCV-Ags LFT 분석은 테스트된 60개 혈청 견본에서 100% 민감성 및 100% 특이성을 나타내는 표로써, 이때 240 IU/mL 내지 1,740,000 IU/mL 범위의 PCR에 의해 혈청 HCV RNA에 대한 20개의 음성과, PCR에 의해 혈청 HCV RNA에 대한 40개의 양성이 포함된다.
도 13a는 콤보-HCV-Ags LFT 분석을 이용한 테스트 스트립의 도면으로, 테스트 패드에 추가하기 전, 테스트 소변 시료과 콜로이드 금 용액 (콜로이드 금에 접합된 탐지기 항체들)과 혼합하면, 소변 시료에 대한 본 발명에 따른 콤보-HCV-Ags LFT 분석의 민감성이 상당히 개선되었음을 나타낸다
도 13b는 PCR에 의해 낮은 혈청 HCV RNA 수준을 갖는 5개 혈청 견본들에 대하여 콤보-HCV-Ags LFT 분석을 이용한, 콤보-HCV-Ags LFT 분석의 테스트 결과를 나타내는데, 소변 견본에서 HCV-Ags LFT의 최저 탐지 한계는 63-94 IU/mL의 혈청 HCV RNA 수준에 대등한 범위 안에 있다. C: 음성 대조, PCR에 의해 항-HCV 및 혈청 HCV RNA에 음성인 소변 견본.
도 13c는 소변 시료를 이용한 콤보-HCV-Ags EIA 분석은 테스트된 93개 소변 견본들에서 100% 민감성 및 100% 특이성을 제공하며, 570 IU/mL 내지 9,960,000 IU/mL 범위에서 PCR에 의해 혈청 HCV RNA에 음성인 15개와 PCR에 의해 혈청 HCV RNA에 양성인 78개를 포함한다.
도 14a는 혈청 HBsAg (#1-5)에 양성인 5명의 대상 및 음성 대조 (#6)의 소변 견본을 이용하여 실시예 5.5에 따라 혼합 단계와 함께 콤보 HBsAg EIA 분석의 OD 값을 나타내는 그래프다. 시료 1-5의 경우, 첫번째 막대는 HBsAg에 대하여 하나의 항체를 이용한 결과이며, 두번째 막대는 HBsAg에 대하여 2개의 상이한 항체를 이용한 결과이다. 음성 대조, 음성 혈청 HBsAg 테스트를 갖는 소변 견본.
도 14b는 HBsAg에 대하여 하나의 항체( “a”로 라벨된 스트립)와 HBsAg에 대한 2개의 상이한 항체 ( “b”로 라벨된 스트립)를 이용하여 양성 혈청 HBsAg를 갖는 6명의 대상으로부터 실시예 6.3에 따른 혼합 단계와 함께 소변 시료의 LFT 테스트 스트립이다. NC, 음성 혈청 HBsAg 테스트를 갖는 음성 대조 소변 견본.
발명의 상세한 설명
도 1에 나타낸 것과 같이, HCV 복제 및 생활 주기 동안, 큰 HCV 전구물질 단백질이 해독되었고, 이는 구조적 단백질(외피 및 코어 단백질) 및 비-구조적 (NS) 단백질이 포함된 다양한 HCV 단백질을 생산하는데 이용된다. 이들 단백질 일부는 매우 보존되었으며, 항원성인데, 그 이유는 감염이 제거된 후에도 HCV에 감염된 대상에서 이에 대응하는 항체들이 탐지가능하기 때문이다.
본 명세서에서 공개된 바와 같이, HCV 코어 항원 (HCVcAg)에 추가하여, 매우 보존된 HCV 비-구조적 (HCV NS) 단백질, 이를 테면, NS3, NS4b, 및 NS5a이 포함된 몇 가지 다른 HCV 단백질은 활성 HCV 감염을 가진 대상, 이를 테면, PCR을 이용하여 혈청 HCV RNA에 양성으로 테스트되는 대상의 혈액 및 소변에서 자유 HCV 항원으로 지속적으로 발현되는 것으로 밝혀진다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, “자유(free) 항원”이란 주어진 대상의 면역 반응에 의해 만들어진 항체가 아직 결합되지 않은, 대상의 고유 면역 복합체의 일부분이 아직 되지 못한 항원을 말한다. 용어 “자유 간염 바이러스 항원”이란 대상의 면역 복합체의 일부분이 아직 되지 못한 간염 바이러스 항원을 말한다. 용어 “자유 HCV 항원”이란 대상의 면역 복합체의 일부분이 아직 되지 못한 HCV 항원을 말한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, “IC 복합체”는 항원과 대상의 면역 반응으로 인한 하나 또는 그 이상의 항체들 사이의 복합체를 지칭한다. “IC-HCV 복합체”는 HCV 항원과 대상의 면역 반응으로 인한 하나 또는 그 이상의 항체들 사이의 HCV 항원 면역 복합체를 지칭한다. 사용의 편의를 위하여, 본 명세서에서 공개된 바와 같이, 대상의 면역 복합체의 일부인 및/또는 일부가 되었던 HCV 항원은 “IC-HCV 항원”으로 명시될 것이다. IC-HCV 항원은 IC 복합체의 여전한 일부분인 HCV 항원과 그리고 비-자연적 조건, 이를 테면, IC-HCV 복합체를 변성시키는 실험실 분석에 의해 IC-HCV 복합체로부터 결합안되거나 (또는 방출된) 것들을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, “전체 HCV 항원”이란 임의의 자유 HCV 항원 전체와 임의의 IC-HCV 항원 전체를 지칭한다. IC-HCV 항원은 활성 HCV 감염을 갖는 대상 (가령, PCR을 이용하여 HCV RNA에 대하여 양성으로 테스트되는 대상)과 과거에 HCV 감염이 있었지만, 깨끗해진 대상 (가령, PCR을 이용하여 HCV RNA에 대하여 음성으로 테스트되는 대상)의 시료(소변 제외)에서 발견될 수 있다. 자유 HCV 항원은 활성 HCV 감염을 가진 대상의 시료(혈액과 소변 모두 포함)에서 발견된다.
본 발명은 시료 안에 자유 간염 바이러스 항원 및/또는 IC-간염 바이러스 항원으로써 다수의 간염 바이러스 항원의 존재를 탐지하기 위한 분석, 분석 시스템 및 키트에 관계한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 시료 안에 다수의 자유 HCV 항원 및/또는 다수의 IC-HCV 항원의 존재를 탐지하기 위한 분석, 분석 시스템 및 키트에 관계한다. 일부 구체예들에 있어서, HCV 항원은 동시에 탐지되거나 및/또는 동일한 분석 단계에서 탐지된다. 상기 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 소변과 같은 생물학적 시료, 또는 자유 HCV 항원 및/또는 IC-HCV 항원이 발견될 수 있는 다른 신체 유체 또는 조직, 또는 합성 시료, 이를 테면, 대조 실험에 이용되는 실험실에서 제작된 시료일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 시료는 소변 시료다.
적합한 HCV 항원은 HCVcAg, HCV E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 다수의 전체 HCV 항원 (가령, 자유 HCV 항원 + IC-HCV 항원)이 탐지된다. 다수의 HCV 항원은 자유 HCV 항원 및/또는 IC-HCV 항원일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 오직 다수의 자유 HCV 항원만 탐지된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, “다수의 자유 HCV 항원”의 특이적 HCV 항원의 언급에서, 자유 HCV 항원으로써 각 HCV 항원을 명시적으로 지적하지 않았다라도, 언급된 다수의 각 HCV 항원은 자유 HCV 항원을 의미한다. 일부 구체예들에 있어서, 다수의 자유 또는 전체 HCV 항원은 HCVcAg을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 다수의 자유 또는 전체 HCV 항원은 HCVcAg 및 하나 또는 그 이상의 E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 다수의 자유 또는 전체 HCV 항원은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 다수의 자유 또는 전체 HCV 항원은 HCVcAg, HCV NS3, NS4b, 및 NS5a 단백질로 구성된다.
본 명세서에서 제공된 바와 같이, 분석, 시스템, 또는 키트와 함께 용어 “콤보-HCV-Ags”의 사용은 본 발명에 따른 분석, 시스템, 또는 키트 (이를 테면, 다수의 자유 또는 전체 HCV 항원이 탐지되는 분석)를 지칭한다. 따라서, 예를 들면, “콤보-HCV-Ags 분석”은 다수의 자유 또는 전체 HCV 항원이 탐지되는 분석을 지칭한다. 본 발명의 상기 분석의 분석 플렛포옴은 당분야에 공지된 효소 면역 분석 (EIAs), 마이크로플레이트-기반 면역분석 (MIAs), 화학적발광 면역분석 (CIAs), 형광 면역분석 (FIA), 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISAs), 또는 측면 유동 테스트 (LFTs)를 포함한 임의의 면역분석일 수 있으며, 자동화된 또는 수동 분석일 수 있다. 상기 다양한 분석은 임의의 적합한 라벨링과 탐지 시스템을 이용할 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, “탐지가능한 라벨”은 분광기, 광화학적 수단, 생화학적 수단, 면역화학적 수단 또는 화학적 수단에 의해 탐지가능한 화합물 또는 조성물이다. 물질을 변형시키기 위하여 “라벨된”이란 용어의 사용, 이를 테면, 라벨된 항체는 이에 부가된 탐지가능한 라벨을 가진 물질을 의미한다. 물질, 이를 테면, 탐지가능한 라벨을 가진 항체란 물질에 정상적으로 연계되거나 접합되지 않은 탐지가능한 라벨이 사람의 손에 의해 물질에 연계되었거나 또는 접합되었다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 구절 “사람의 손에 의해”란 자체가 자연적이지 않는, 사람 또는 사람의 지시하에 있는 물체(이를 테면, 사람에 의해 작동되거나 또는 프로그램되는 로봇 또는 기계)가 명시된 작업을 실행한다는 것을 의미한다. 따라서, 청구범위에서 제시된 단계들은 사람, 이를 테면, 사람 또는 사람의 지시하에 있는 물체에 의해 실행된다.
본 명세서에서 공개된 바와 같이, 본 발명에 따른 콤보-HCV-Ags 분석은 오직 하나의 HCV 항원만이 탐지되는 분석보다 상당히 개선된 민감성을 야기한다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 HCV 감염을 가진 또는 가졌던 대상을 진단하기 위한 분석, 시스템 및 키트에 관계하는데, 이는 대상에서 획득된 시료 안에 다수의 HCV 항원의 존재 (또는 부재)를 탐지하고, 그리고 다수의 HCV 항원이 존재할 때, HCV 감염을 가진, 또는 가졌던 것으로 대상을 진단하는 것을 포함한다.
추가적으로, 본 명세서에서 공개된 바와 같이, 상기 시료는 조건, 이를 테면, 변성 조건에 대하여 테스트되는데, 변성 조건은 IC-HCV 복합체를 해리시켜, 분석 민감성을 증가시킨다. 사실, 본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 탐지 전에, 테스트 시료가 변성 조건을 겪게 되면, 100% 민감성이 야기된다. 하기 실험 결과에 기초하여, 면역 복합체의 여전히 일부가 되는 IC-HCV 항원은 추가 항체들, 이를 테면, 여기에 추가된 탐지 항체들에 의해 용이하게 탐지되거나 결합되지 않는데, 그 이유는 면역 복합체의 항체들이 결합 부위를 차지하고 있기 때문이다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 테스트되는 시료는 탐지 전, IC-HCV 복합체를 해리시키는 변성 조건을 겪는다. 이러한 변성 조건은 약 0.3% Triton X-100, 약 1.5% 3-[(3-클로아미도프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트 (CHAPS), 그리고 약 15% 도데실 술페이트 나트륨 (SDS), pH 약 8.5를 갖는 변성 용액으로 약 56 ℃에서 약 30 분 동안 혈청 견본을 사전-처리하는 것을 포함한다. 유사한 효과를 초래하는 조건들은 당업자에 의해 용이하게 결정되며, 본 명세서에서 고려된다.
본 명세서에서 공개된 바와 같이, HCV 항원은 HCV 감염이 깨끗해진 대상, 이를 테면, PCR에 의해 항-HCV 항체들에 대하여 양성으로, 그리고 HCV RNA에 대하여 음성으로 테스트된 대상의 혈액 안에 IC-HCV 복합체로 남아서 존재할 수 있다. 따라서, 탐지 전, IC-HCV 복합체를 가진 시료가 변성 조건을 겪게 되면 과거에 HCV 감염이 있었지만, 그러나 깨끗해진 대상에서 활성 HCV 감염에 대하여 가양성으로 나올 수 있다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, IC-HCV 항원이 탐지되는 것을 회피하기 위하여, 본 발명의 방법에서 탐지 전, 테스트되는 시료는 IC-HCV 복합체로부터 HCV 항원을 해리시키는 변성 조건을 겪지 않는다. 환언하면, 변성된 IC-HCV 항원의 탐지가 회피되어, 본 발명의 방법은 탐지 전, 시료 안에 존재할 수 있는 IC-HCV 복합체의 변성을 배제시킨다. 또는, 전술한 또다른 방식, 본 발명의 방법은 탐지 전, IC-HCV 복합체로부터 HCV 항원을 해리시키는 조건을 피한다.
본 명세서에서 공개된 바와 같이, 본 발명에 따라 콤보-HCV-Ags 분석을 이용하여 변성 조건 (이를 테면, IC 복합체를 해리시키는 조건)을 겪지 않은 시료 안 다수의 자유 HCV 항원 탐지는 HCV RNA PCR를 이용하여 혈청 HCV RNA 140 IU/mL에 대등한 수준에서 활성 HCV 감염을 탐지하게 된다. 환언하면, 변성 조건을 배제시킨 본 발명의 콤보-HCV-Ags 분석은 혈청 HCV RNA에 대한 PCR 분석에 필적하는 활성 HCV 감염 탐지에 있어서 민감성 및 특이성을 가진다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 활성 HCV 감염을 가진 대상을 진단하기 위한 분석, 시스템 및 키트에 관한 것이며, 이것은 대상으로부터 획득된, 변성 조건을 겪지 않은 시료 안 다수의 자유 HCV 항원의 존재 (또는 부재)를 탐지하고, 다수의 자유 HCV 항원이 존재할 때 활성 HCV 감염을 가진 것으로 대상을 진단하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 공개된 바와 같이, HCV 항원은 PCR을 이용하여 혈청 HCV RNA에 양성으로 테스트된 대상의 소변 시료에서 탐지가능하지만, PCR을 이용하여 혈청 HCV RNA에 음성으로 테스트된 대상의 소변 시료에서 탐지되지 않는다. 추가적으로, IC-HCV 복합체는 존재하지 않는데, 탐지전 소변 시료의 변성은 임의의 HCV 항원 (자유 또는 전체 HCV 항원)에 대한 양성을 테스트하기 위하여 과거 HCV 감염이 있었지만, 깨끗해진 대상의 소변 시료를 야기하지 못한다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 대상의 소변 시료는 오직 자유 HCV 항원의 존재 또는 부재를 탐지하는데 이용될 수 있다. 그 다음 소변 시료 안에 자유 HCV 항원이 존재할 때, 이 대상은 활성 HCV 감염을 가진 것으로 진단을 받게 될 것이고, 자유 HCV 항원이 소변 시료 안에서 탐지되지 않을 때, 활성 HCV 감염을 가지지 않은 것으로 탐지 또는 진단된다.
본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 주어진 단일 항원을 탐지하기 위하여 2개의 상이한 항체를 이용하면, 분석 민감성 및 특이성에서 예상치 못한 우수한 증가가 있게 된다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 동일한 간염 바이러스 항원에 대항하여 2개 또는 그 이상의 상이한 항체를 이용하는 것이 포함된, 간염 바이러스 항원 탐지를 위한 분석, 시스템 및 키트를 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 동일한 간염 바이러스 항원에 대항하여 2개 또는 그 이상의 상이한 항체를 이용하는 상기 분석, 시스템, 및 키트는 본 명세서에서 공개된 바와 같이 콤보-HCV-Ags 분석, 시스템, 또는 키트다.
본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 다수의 HCV 항원에 대항하는 탐지 항체들을 함께 혼합하고, 테스트되는 시료와 항온처리될 때, 콤보-HCV-Ags 분석의 민감성은 상당히 증가되었다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 테스트 시료와 탐지 항체들이 함께 혼합된 후, 포획 항체들이 피복되거나 또는 고정된 분석 기질에 접촉되는 면역 분석을 제공한다.
도 10d에 나타낸 것과 같이, 자유 간염 바이러스 항원(들)의 탐지는 대상에서 면역 반응, 이를 테면, 항체 형성의 발생 및/또는 존재와는 독립적이다. 간염 바이러스 항원에 대항한 항체들을 탐지 또는 측정하는 분석과 달리, 본 발명에 따른 콤보 HCV-Ags 분석은 항-HCV 항체들이 출현하기 전에, 급성 간염 바이러스 감염을 탐지하는데 이용될 수 있다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 대상에서 급성 간염 바이러스 감염을 탐지하고, 이 대상이 상기 간염 바이러스에 대항하는 항체를 발생시키지 전, 급성 간염 바이러스 감염을 가진 것으로 대상을 진단하는 방법들에 관계한다.
본 발명에 따른 분석, 시스템, 그리고 키트의 민감성과 특이성은 상기 분석 조건, 이를 테면, 반응 시간 및 온도를 최적화시키거나, 및/또는 시약을 변형 또는 대체시킴으로써, 이를 테면, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 이용된 상이한 탐지 및 라벨링 시스템에 의해 더 개선될 수 있다.
요약하면, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 간염 바이러스 항원을 위한 면역-기반 분석, 시스템, 그리고 키트를 제공하는데, 이때 (1) 주어진 단일 간염 바이러스 항원에 대한 2개 또는 그 이상의 항체들이 동일한 탐지 단계에서 동일한 시간에 이용되며, (2) 다수의 간염 바이러스 항원은 동일한 탐지 단계에서 동일한 시간에 탐지되며, (3) 상기 간염 바이러스 항원(들)에 대한 탐지 항체들은 상기 시료와 혼합되고, 포획 항체들을 갖고 있는 분석 기질에 접촉되며, (4) 오직 자유 간염 바이러스 항원(들)만 탐지괴거나, 및/또는 (5) 전체 간염 바이러스 항원이 탐지된다.
과학적인 그리고 임상적 연구를 위하여 이용되는 것에 추가하여, 본 발명의 분석 및 시스템은 (1) 대상에서 자유 간염 바이러스 항원(들)의 존재를 스크리닝하는데 이용되며, 이의 존재는 상기 대상이 활성 간염 바이러스 감염을 가지고 있는 지를 진단하는데 이용될 수 있으며; (2) 간염 바이러스 RNA에 대한 확인 PCR 테스트의 필요없이, 간단한 하나의 테스트 방법을 이용하여 해결된 과거 HCV 감염/노출로부터 진행중인 활성 간염 바이러스 감염을 구별해내는데 이용될 수 있으며; (3) 자유 간염 바이러스 항원이 존재하고, 그리고 항-간염 바이러스 항체들 및/또는 간염 바이러스 항원 면역 복합체가 없는 것을 특징으로 하는 감염의 초기 단계, 이를 테면, 사전-혈청전환 윈도우 기간에 활성 간염 바이러스 감염을 확인하는데 이용되며, (4) 면역절충된 그리고 항-간염 바이러스 항체들을 생산할 수 없는 개인, 이를 테면, 면역억제성 치료 또는 혈액투석을 받는 대상에게서 간염 바이러스 감염을 확인하는데 이용되며; (5) 간염 바이러스 RNA 수준을 모니터하고, 이를 테면, 간염 바이러스 RNA 수준의 지표로써 자유 간염 바이러스 항원의 양을 이용하고; 그리고 (6) 대상에서 간염 바이러스 감염의 치료에 대한 효과를 모니터하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예들은 단일 단계, 이를 테면, 간염 바이러스 항원(들)의 존재를 탐지하기 위하여 LFT 테스트 스트립의 테스트 패드 상에 테스트 시료를 로딩함으로써 실행되기 때문에, 이러한 분석, 시스템, 그리고 키트는 비용-효과적이며, 편리하고, 시간-절약되며, 입수가능하며, 실험실 또는 관리 시점에서 병원에서 의사가 그리고 집에서 대상이 용이하게 실행할 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위함이며, 이에 한정되지 않는다.
실시예들
재료들:
본 명세서의 실험에서 구체화된 단일클론 항체들 (mAb) 및 다중클론 항체들 (pAb)은 다음과 같이 표 A에서 제시된다:
Figure pct00001
방법
실시예 1 - HCV RNA PCR
본 명세서에서 공개된 바와 같이, 혈청 HCV RNA의 존재는 당분야에 공지된 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 방법을 이용하여 분석되었다. 구체적으로, 혈청 HCV RNA는 Roche COB AS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV 분석을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 정량화되었으며, 이 경우는 43 IU/mL의 더 낮은 탐지 한계와 100 IU/mL의 정량적 한계를 가지며 (Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA); 또는 Abbott RealTime HCV 분석을 이용하여 정량화되었으며, 이 경우는 12 IU/mL의 더 낮은 탐지 한계와 정량적 한계를 가지고 있었다 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).
실시예 2 -EIA 프로토콜
다음의 프로토콜은 다른 명시가 없는 한, 본 명세서에서 공개된 EIA 실험에 이용되었다.
단계 1. 분석 기질의 코팅. 96-웰 PVC 미량적정 플레이트는 상기 분석 기질로 이용되었으며, 그러나, 다른 기질들, 이를 테면, 당분야에 공지된 분석 비드가 이용될 수 있다. 미량적정 플레이트의 각 테스트 웰은 탄산염/중탄산염 완충액 (pH 약 7.0-9.5, 이를 테면, 약 9.0)으로 희석된 포획 항체들의 충분한 양, 50-200 μL, 이를 테면, 약 100 μL으로 피복되었다. 상기 포획 항체들은 HCVcAg-1 (약 5-20 μg/mL, 이를 테면, 약 10 μg/mL), HCVcAg-2 (약 5-20 μg/mL, 이를 테면, 약 10 μg/mL), NS3 (약 5-20 μg/mL, 이를 테면, 약 5 μg/mL), NS4b (약 5-20 μg/mL, 이를 테면, 약 5 μg/mL), 및 NS5a (약 5-20 μg/mL, 이를 테면, 약 5 μg/mL)에 대한 단일클론 항체들의 혼합물이었다.
단계 2. 항온처리(Incubation). 단계 1의 미량적정 플레이트를 덮고, 하룻밤 동안 4 ℃(또는 37 ℃에서 약 15-120 분, 이를 테면, 약 60 분)에서 항온처리되었다.
단계 3. 세척(Washing). 단계 2 이후, 상기 미량적정 플레이트는 각 웰에 약 100-400 μL, 이를 테면, 약 300 μL의 TBS-T 용액 (세척 용액)으로 채워 3회 세척되었으며, 그리고 상기 플레이트는 싱크위에 걸쳐두었다. 남아있는 세척 용액은 플레이트를 종이 타올로 두드려 제거되었다.
단계 4. 비-특이적 결합의 차단 그 다음 각 웰은 약 1-5%, 이를 테면, 약 3%, BSA가 포함된 약 150-300 μL, 이를 테면, 약 300 μL의 차단 완충액을 추가함으로써 처리되었다. 그 다음 상기 플레이트는 피복된 웰 안에 남아있는 단백질-결합 부위를 차단시키기 위하여, 약 15-90 분, 이를 테면, 약 60 분 동안 실온에서 항온처리되었다.
임의선택적 단계 5. 테스트 시료의 전처리. 이를 테면, 혈청 또는 혈장 시료에서 실행될 때, 약 25-150 μL, 이를 테면, 약 100 μL의 테스트 시료는 1.5 mL의 원심분리 튜브 안에서 약 50-200 μL, 이를 테면, 약 50 μL의 전처리 용액 (0.3% Triton X-100, 1.5% 3-[(3-클로아미도프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트 (CHAPS) 및 15% 도데실 술페이트 나트륨 (SDS))와 혼합된 후, 그 다음 56 ℃에서 약 30-60 분, 이를 테면, 약 60 분 동안 항온처리되었다.
단계 6. 혈청/혈장 또는 소변 견본 로딩 미량적정 플레이트의 각 웰로부터 차단 완충액을 제거한 후, 약 50-300 μL, 이를 테면, 약 100 μL의 전처리된 혈청 또는 혈장 시료, 또는 약 50-300 μL, 이를 테면, 약 100 μL의 처리안된 소변 시료는 각 웰에 추가되었다. 그 다음 플레이트를 덮고, 실온에서 약 30-120 분, 이를 테면, 약 90 분 동안 부드러운 교반 하에 항온처리되었다.
단계 7. 세척(Washing). 그 다음 웰들은 약 150-300 μL, 이를 테면, 약 300 μL의 TBS-T 용액으로 채워 3회 세척되었으며, 그리고 상기 플레이트는 싱크위에 걸쳐두었다. 남아있는 세척 용액은 플레이트를 종이 타올로 두드려 제거되었다.
단계 8. 탐지 항체들의 로딩 단계 7 이후, 약 50-300 μL, 이를 테면, 약 100 μL의 탐지 항체들이 각 테스트 웰에 추가되었다. 본 발명에 따른 콤보-HCV-Ags 분석의 경우, 제 1 탐지 항체들은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a에 대한 다중클론 항체들의 혼합물이었다. 기존 기술에 따른 분석의 경우, 탐지 항체들은 오직 항-HCVcAg 항체들로 구성되었다. 그 다음 미량적정 플레이트를 덮고, 실온에서 약 30-120 분, 이를 테면, 약 90 분 동안 부드러운 교반 하에 항온처리되었다.
단계 9. 세척(Washing). 결합안된 탐지 항체들을 제거하기 위하여, 웰들은 약 150-300 μL, 이를 테면, 약 300 μL의 TBS-T 용액으로 채워 3회 세척되었으며, 그리고 상기 플레이트는 싱크위에 걸쳐두었다. 남아있는 세척 용액은 플레이트를 종이 타올로 두드려 제거되었다.
단계 10. HRP-접합된 항체들의 로딩 탐지 항체들의 종류에 대하여 특이적인 HRP-접합된 IgG 항체들 약 50-300 μL, 이를 테면, 약 100 μL을 각 테스트 웰에 추가하였다. 상기 HRP-접합된 IgG 항체들은 사용 직전 1:3000-1:5000, 이를 테면, 약 1:4000 희석 배수의 농도로 희석되었다. 그 다음 플레이트를 덮고, 실온에서 약 15-90 분, 이를 테면, 약 30 분 동안 항온처리되었다.
단계 11. 세척(Washing). 결합안된 항체들을 제거하기 위하여, 웰들은 약 150-300 μL, 이를 테면, 약 300 μL의 TBS-T 용액으로 채워 3회 세척되었으며, 그리고 상기 플레이트는 싱크위에 걸쳐두었다. 남아있는 세척 용액은 플레이트를 종이 타올로 두드려 제거되었다.
단계 12. 발색반응. 약 50-300 μL, 이를 테면, 약 100 μL의 기질 용액 (OPD)이 각 테스트 웰에 추가되었고, 실온에서 약 5-30분, 보통 약 15 분 동안 항온처리되었고, 이어서 약 25-50 μL, 이를 테면, 약 50 μL의 정지 용액을 추가하여 효소적 반응을 중단시킨다.
광학적 밀도는 ELX 800 Universal Microplate Reader (Bio-TEK Instruments, Inc., Winooski, VT)에서 1차 파장으로 450nm을 이용하여 측정되었다. 평균 음성 OD 값 + 3 x 표준 편차 (SD)에 의해 컷 오프 값이 측정되었다. 테스트된 OD 값이 컷 오프 값 보다 큰 경우(>) 테스트 결과는 양성으로 간주되었으며; 테스트된 OD 값이 컷 오프 값보다 작다면(<) 테스트 결과는 음성으로 간주되었고; 그리고 테스트된 OD 값이 컷 오프 값과 동일하다면(=), 테스트 결과는 애매모호한 것으로 간주되었다.
실시예 3 - LFT 프로토콜
A. 테스트 스트립
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 명세서의 실험에서 구체화된 LFT 테스트 스트립은 다음의 성분들을 포함한다: A = 시료 패드, B = 받침 카드, C = 접합 패드, D = 콜로이드 금 입자들이 접합된 포획 항체, E = 니트로셀룰로오스 막, F = 테스트 라인, G = 대조 라인, H = 흡수제 패드. 상기 테스트 스트립은 다른 명시가 없다면, 다음과 같이 구성되었다. 그러나, 다른 테스트 스트립, 당분야에 공지된 딥스틱(dipsticks) 등이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 용어 "테스트 스트립”은 본 명세서에서 LFT 분석에 이용되는 시료 패드를 갖는 분석 기질을 일반적으로 지칭하기 위하여 이용되며, 이때 테스트 시료는 시료 패드에 로딩되며, 하기에서 설명하는 것과 같이, 포획 항체들을 갖는 테스트 라인과 대조 라인을 통하여 흐르게 된다. 본 명세서의 LFT 실험은 콜로이드 금 라벨링 시스템의 사용으로 구체화되지만, 당분야에 공지된 기타 라벨링 시스템이 이용될 수 있다.
단계 1. 탐지기 항체들의 콜로이드 금 접합 이용되는 콜로이드 금 용액의 pH 값은 0.2 M 탄산칼륨염에 의해 약 7.4-9.0, 이를 테면, 약 8.5로 조정되었다. 오직 HCVcAg만을 탐지하는 분석의 경우, HCVcAg에 대한 단일클론 항체는 약 5-20 μg/mL, 이를 테면, 약 10 μg/mL의 농도를 제공하기 위하여 5.4mL의 전체 용적에서 콜로이드 금 용액과 혼합되었다. 본 발명에 따른 콤보-HCV-Ags 분석을 위하여, HCVcAg-1, HCVcAg-2, NS3, Ns4b, 및 NS5a에 대한 단일클론 또는 다중클론 IgG 항체들은 5.4mL의 전체 용적에서 콜로이드 금 용액과 혼합되었다. 이들 각 항 HCV 항체의 농도는 약 5-20 μg/mL, 이를 테면, 약 10 μg/mL이었다. 상기 혼합물은 약 15-60 분 동안, 이를 테면, 약 30 분 동안 실온에서 활발하게 교반시킨 후, 0.6 mL의 약 5-20%, 이를 테면, 약 10%, BSA (pH 9.0)가 추가되어, 금 콜로이드의 과도한 반응성을 차단시켰다. 그 다음 상기 혼합물은 약 15-60 분, 이를 테면, 약 30 분 동안 실온에서 교반되었다. 상기 혼합물은 12,000 rpm, 4 ℃에서 약 15-60 분, 이를 테면, 약 30 분 동안 원심분리되었고, 그리고 생성된 접합된 펠렛은 재-현탁되었고, 2 mM 붕사 완충액 (pH 9.0, 약 1-5%, 이를 테면, 약 1%, BSA 함유)을 이용하여 2회 세척되었다. 접합물(conjugate)의 1:100 희석 후, 540 nM의 파장에서 10 ± 0.5에 이르도록 OD 값이 조정되었다. 상기 펠렛은 붕사 완충액 (약 1-5 mM, 이를 테면, 약 2 mM, pH 9.0, 20% 슈크로스, 및 약 1-5%, 이를 테면, 약 1%, BSA 함유)에서 재-현탁되었고, 사용때까지 4 ℃에서 유지되었다.
단계 2. 접합 패드의 처리. 상기 접합물 패드 (도 2 “C”)는 약 1-5%, 이를 테면, 약 3%, BSA, 약 0.5-5%, 이를 테면, 약 1%, Tween 20, 약 0.1-1.5%, 이를 테면, 약 0.3%, 폴리비닐피롤리돈 K30, 및 약 0.02% 아지드 나트륨를 포함하는 약 10-50 mM, 이를 테면, 약 20 mM의 인산염 완충액 (pH 약 7.0-8.0, 이를 테면, 약 7.4)으로 약 5-60 분, 이를 테면, 약 10 분 동안 실온에서 처리되었고, 그 다음 37 ℃에서 약 15-60 분, 이를 테면, 약 30 분 동안 건조되었다.
단계 3. 처리된 접합 패드에 콜로이드 금에 접합된 탐지기 항체의 로딩. 도 2 “D”에 나타낸 것과 같이, 단계 1에서 콜로이드 금 입자들에 접합된 HCV-Ags 특이적 탐지기 항체들은 그 다음 BioDot XYZ 플렛포옴 (BioDot, Irvine, CA)을 이용하여 약 10-30 μL/cm, 이를 테면, 약 10 μL/cm의 비율로 처리된 접합물 패드 (단계 2에서 준비된) 상에 제공되고, 그 다음 37 ℃에서 약 15-60 분, 이를 테면, 약 30 분 동안 건조된다.
단계 4. 테스트 라인에 HCV 항원에 특이적인 포획 항체의 로딩. 약 0.5-2 mg/mL, 이를 테면, 약 1 mg/mL의 포획 항체들은 약 0.1-2 μL/cm, 이를 테면, 약 0.9 μL/cm의 비율 및 약 2-10 cm/sec, 이를 테면, 약 4 cm/초의 속도로 니트로셀룰로오스 막 상의 테스트 라인에 제공되었다. 본 발명에 따른 콤보-HCV-Ags 분석의 경우, 포획 항체들은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a에 특이적인 다중클론 포획 단일클론 또는 다중클론 항체들의 혼합물이었다. 오직 HCVcAg를 탐지하는 분석의 경우, 상기 포획 항체들은 HCVcAg에 대한 항체만으로 구성되었다.
단계 5. 대조 라인에 마우스 IgG에 특이적인 포획 항체 로딩 도 2 “G”에 나타낸 바와 같이, 마우스 IgG에 특이적인 다중클론 포획 항체 약 0.5-2 mg/mL, 이를 테면, 약 1 mg/mL는 약 0.1-2 μL/cm, 이를 테면, 약 0.9 μL/cm의 비율, 및 약 2-10 cm/sec, 이를 테면, 약 4 cm/sec의 속도로 니트로셀룰로오스 막 상의 대조 라인에 제공되었으며, 그 다음 37 ℃에서 약 15-90 분, 이를 테면, 약 30 분 동안 건조되었다.
단계 6. 측면 유동 스트립의 어셈블링 흡수제 패드 (도 2 “H”), 니트로셀룰로오스 막 (단계 4 및 5에서와 같이 처리된, 도 2 “E”), 접합물 패드 (단계 3에서와 같이 처리된, 도 2 “C”), 및 시료 패드 (도 2 “A”)는 그 다음 받침 카드 (도 2 “B:)상의 스트립으로 어셈블리되고, 즉, 약 1-내지 2-mm 겹쳐지도록 연속적으로 플라스틱 눈금(scale) 판에 부착된다. 어셈블리된 플레이트는 CM 4000 절단기 (BioDot, Irvine, CA)를 이용하여, 약 2-10 mm, 이를 테면, 약 3 mm의 폭 조각으로 절단되었다. 생성된 테스트 스트립은 건조제와 함께 플라스틱 주머니 안에 포장되고, 실험을 위하여 4 ℃ 또는 실온에서 보관되었다.
B. LFT 분석 프로토콜
희석된 테스트된 시료 (약 100-300 μL, 이를 테면, 약 250 μL) 또는 음성 대조 (이를 테면, PBS 용액, 또는 PCR에 의해 측정되었을 때, HCV 감염이 없는 대상의 시료)가 상기 시료 패드에 추가되었고, 실온에서 약 5-45 분, 보통 약 15 분 동안 방치해두었다.
테스트 견본이 상기 시료 패드 (도 2 “A”)에 로딩된 후, 이 견본은 신속하게 접합물 패드 (도 2 “C”)로 확산된다. 테스트된 시료에 주어진 HCV 항원이 포함되어 있다면, 이 항원은 콜로이드성 금 입자들에 접합되고, 도 2 “D” 영역에 로딩된 HCV 탐지기 단일클론 항체들과 반응할 것이다. 이들 HCV Ags/Abs 복합체는 모세관 작용을 통하여 크로마토그래피적으로 니트로셀룰로오스 막을 따라 이동할 것이다(도 2 “E”). 결국, 이들 HCV Ags/Abs 복합체는 사전로딩된 HCV-특이적 포획 단일클론 또는 다중클론 항체들과 반응할 것이고, 그리고 테스트 라인 영역에서 고정되어, 색을 띈 밴드가 형성되는데, 이는 양성 테스트 결과를 나타낸다(도 2 “F”). 과량의 HCV-특이적 탐지기 항체들 접합물 (또는 테스트된 견본에 HCV-Ags가 포함되지 않는 경우 반응안된)은 막을 따라 이동하고, 사전-로딩된 염소 항-마우스 항체에 의해 대조 라인 영역에 고정되어, 대조 라인에서 색을 띈 밴드가 된다 (도 2 “G”). 따라서, 양성 시료는 2개의 밴드, 테스트 라인 영역에 하나 그리고 대조 라인 영역에 하나를 나타낼 것이며, 한편 음성 시료는 대조 라인 영역에서 오직 하나의 밴드만을 나타낼 것이다.
따라서, 테스트 라인과 대조 라인 모두에서 색을 띈 라인이 있다면, 이 테스트 시료는 주어진 HCV 항원(들)에 대하여 양성인 것으로 간주되었다. 테스트 라인 영역에 색을 띈 라인이 없다면, 이 테스트 시료는 주어진 HCV 항원(들)에 대하여 음성인 것으로 간주되었다. 그러나, 대조 라인 영역에 색을 띈 라인이 없다면, 이 테스트 결과는 무효인 것으로 간주되었다.
실시예 4 -시료에서 HCV 항원들의 탐지
4.1 혈액 시료
HCVcAg에 추가하여, 활성 HCV 감염을 가진 대상의 혈청 시료 안에 HCV 항원이 존재하는 지를 판단하기 위하여, 다음의 실험이 실행되었다. 구체적으로, 혈청 HCV RNA에 대하여 양성으로 테스트된 대상에서 획득된 혈청 시료는 실시예 1에서 제시된 바와 같이 테스트되었다.
웨스턴 블랏에서 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a는 6개의 모든 HCV 유전자형에 대하여 활성 HCV 감염을 가진 대상의 혈청 시료 안에 존재하는 것으로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음).
4.2 소변시료
활성 HCV 감염을 가진 대상의 소변 시료 안에 HCV 항원이 존재하는 지를 판단하기 위하여, 다음의 실험이 실행되었다.. 구체적으로, 혈청 HCV RNA에 대하여 양성으로 테스트된 대상에서 무작위로 획득된 소변 시료를 수집하였고, 사용전 까지 -80℃에 보관하였다.
웨스턴 블랏에서 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a는 6개의 모든 HCV 유전자형에 대하여 활성 HCV 감염을 가진 대상의 소변 시료 안에 존재하는 것으로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음). IC-HCV 복합체가 소변에 존재하지 않기 때문에, 소변안에 존재하는 HCV 항원은 모두 자유 HCV 항원이다.
실시예 5 -EIA 실험
5.1 혈청 시료
하나의 시료에서 동시에 다수의 HCV 항원 탐지가 실현가능한지, 그리고 HCV 감염에 대하여 충분한 민감성 및 특이성을 제공할 것인지를 판단하기 위하여, 혈청 HCV RNA에 대하여 양성으로 테스트된 대상의 혈청 시료 및 소변 시료는 단계 5와 함께, 실시예 2의 EIA 프로토콜을 이용하여 테스트되었는데, 그러나 오직 HCVcAg만을 탐지하는 분석의 경우, HCVcAg에 대한 단일클론항체만 상기 분석 기질에 피복되었으며, 콤보-HCV-Ags 분석의 경우, 상기 분석 기질에 피복된 포획 항체에는 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a에 대한 단일클론 항체들이 포함되었다.
도 3a 및 3b에서 제공된 데이터에서 단일 EIA 분석 시스템 (이를 테면, 콤보-HCV-Ags EIA 분석)에서 다수의 HCV 항원의 복합 탐지가 혈청 시료에서 실현가능함을 나타낸다. 추가적으로, 도 3a에서 제공된 바와 같이, 콤보-HCV-Ags EIA 분석의 민감성은 오직 하나의 HCV 항원, 이를 테면, HCVcAg이 탐지되는 EIA 분석보다 거의 2배가 된다.
양을 알고 있는 혈청 HCV RNA를 가진 2개의 혈청 시료 (PCR에 의해 측정됨)의 연속 희석물의 분석에서 단계 5와 함께, 실시예 2의 EIA 프로토콜을 이용하여 콤보-HCV-Ags EIA 분석의 탐지 한계가 결정되었다. 상기 시료는 PBS로 희석되었다. PBS 그리고 활성 HCV 감염에 대하여 음성 (가령, PCR에 의해 항-HCV 및 HCV RNA에 대하여 음성)으로 테스트된 대상의 혈청 시료 모두가 음성 대조로 이용되었다. 희석안된 혈청 (대조)은 기준(baseline) HCV RNA 47,000 또는 82,000 IU/mL을 가지고 있었다. 도 6a 및 6b에서 나타낸 바와 같이, HCV 항원은 188 및 328 IU/mL에 대등한 혈청 HCV RNA에 등가인 1:250 희석에서도 탐지가능하였다.
탐지 한계가 HCV 유전자형에 독립적인지를 판단하기 위하여, 각 HCV 유전자형에 있어서 공지된 양의 혈청 HCV RNA를 갖는 일련의 혈청 시료 희석물이 유사하게 분석되었다. 도 6c는 유전자형 각각에서 얻은 결과를 나타내는데, 콤보-HCV-Ags EIA 분석은 250 IU/mL와 같은 낮은 혈청 HCV RNA 수준에 대응하는 낮은 탐지 한계가 가능하며, HCV 유전자형에 독립적임을 보여준다. 도 7a는 혈청 시료를 이용한 콤보-HCV-Ags EIA 분석은 100% 민감성 및 100% 특이성을 나타내는 표다.
도 7b에 나타낸 바와 같이, 혈청 시료에 있어서 콤보-HCV-Ags EIA 분석 시스템을 이용하여 측정된 광학 밀도 (OD) 값은 HCV RNA PCR에 의해 측정된 혈청 HCV RNA 양에 대응한다 (r2 = 0.812, p< 0.01).
5.2 소변 시료
상기 5.1에서 제시된 것과 유사한 실험이 소변 시료에서 실행되었는데, 단 실시예 2의 EIA 프로토콜은 단계 5 없이 실행되었다. 도 8a에서 제시된 바와 같이, 소변 시료를 이용한 콤보-HCV-Ags EIA 분석은 98.7% 민감성과 100% 특이성을 가진다. 테스트된 100명의 대상중에서 하나의 가음성은 혈액투석 (HD)에 있는 말기 신장 질환(ESRD)이 있는 대상에서 유래되었다. 도 8b에서 나타낸 바와 같이, 콤보 HCV-Ags EIA 분석의 광학 밀도에 의해 측정된 소변 시료내 HCV-Ags 수준은 HCV RNA PCR에 의해 측정된 혈청 HCV RNA 수준과 상당히 연관되어 있음을 보여준다(r2 = 0.821, p< 0.01).
5.3 혈청 테스트 시료의 전처리
혈청 시료는 IC-HCV 복합체로부터 HCV 항원을 해리하도록 전처리될 수 있다. 항-HCV에 대하여 양성이나, 혈청 HCV RNA에 대하여 음성으로 알려진 15명의 대상 (이를 테면, 과거 HCV 감염이 있었지만, 현재 활성 HCV 감염은 없는 대상)의 혈청 시료 결과는 단계 5 (방법 I, 변성된)와 함께 실시예 2에 따라 분석되었고, 단계 5 없이 (방법 II, 변성안된) 실시예 2에 따라 분석된 동일한 15명의 대상의 혈청 시료 결과와 비교되었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 혈청 시료 (방법 I)의 변성은 테스트된 혈청 견본의 6/15 (40%)에서 양성 테스트 결과를 초래한다. 이들 데이터에서 이전에 있었지만, 해결된 HCV 감염을 가진 대상의 혈액 안에 IC-HCV 항원이 존재할 수 있다는 것이 설명되었다. 이들 대상은 활성 HCV 감염을 가지고 있지 않기 때문에, 이들 양성 테스트 결과는 가양성이다. 한편 도 9에서 나타낸 바와 같이, 동일한 15명의 대상의 소변 견본들을 변성시키도 이러한 가양성 결과가 야기되지 않는데, 그 이유는 IC-HCV 항원이 소변 견본들안에 존재하지 않기 때문이다.
따라서, 오직 전체 간염 바이러스 항원(들)의 탐지만 원하는 경우 (이를 테면, 자유 간염 바이러스 항원(들)의 탐지가 필요없거나, 또는 IC-간염 바이러스 항원(들)로부터 자유 간염 바이러스 항원(들)을 구별해낼 필요가 없는 경우), 탐지 전, 테스트될 시료를 변성 조건을 겪게 함으로써 상기 분석 민감성은 증가될 수 있다. 소변 시료는 간염 바이러스 면역 복합체를 포함하고 있지 않기 때문에, 소변 시료를 변성 조건을 거치더라도 분석 민감성은 증가되지 않을 것이라는 것을 주지해야한다.
다른 한편, 오직 자유 간염 바이러스 항원(들)만의 탐지를 원하는 경우(이를 테면, IC-간염 바이러스 항원은 탐지지 않는), 예를 들면, 대상이 활성 간염 바이러스 감염을 가진 것으로 진단하기 위하여, 면역 복합체가 정상적으로 발견되지 않는 시료 (이를 테면, 소변 시료)를 테스트하거나 또는 IC-간염 바이러스 항원이 포함될 수 있는 시료를 탐지 전 변성 조건을 겪지 않게 함으로써 분석 특이성이 증가될 수 있다.
일부 상황에서, 대상에서 자유 간염 바이러스 항원(들) 및 전체 간염 바이러스 항원(들) 모두를 분석하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 진행중인 HCV 감염을 가진 대상에서 이 대상의 임상 현시를 구별하고, 이 대상의 면역 반응, 임상적 과정 및 치료 반응을 모니터하기 위하여, 자유 HCV 항원(들)의 양은 전체 HCV 항원(들)의 양과 비교되었다. 예를 들면, 대상에서 IC-HCV 항원의 양 증가 및 자유 HCV 항원의 양 감소는 예를 들면, HCV 제거의 우호적 가능성, 간 손상의 가능성 감소, HCV 치료에 대한 상이한 반응, 및/또는 다른 임상적 여병의 위험 감소를 나타낼 수 있다. 다른 한편, 대상에서 IC-HCV 항원의 양의 감소와 자유 HCV 항원의 양의 증가는 예를 들면, HCV 감염을 제거하는 대상의 능력에 양성 또는 음성적 영향, 또는 대상의 면역 시스템이 절충되었음을 나타낼 수 있다.
5.4 2가지 상이한 항체를 이용한 HCVcAg 의 탐지
제 2 HCVcAg 탐지 항체의 추가로 콤보-HCV-Ags EIA의 분석 민감성이 더 증가되는지를 판단하기 위하여 (이때 탐지되는 다수의 자유 HCV 항원에는 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a이 포함됨), 단계 5와 함께 실시예 2의 EIA 프로토콜, 그리고 제 2 항-HCVcAg 탐지 항체를 이용하여, HCV RNA에 양성인 대상의 시료가 테스트되었다. 도 4의 막대 그래프에서 나타낸 바와 같이, 혈청 견본들에 대하여 콤보-HCV-Ags EIA 분석 (실시예 2)에 상기 제 2 항-HCVcAg 탐지 항체의 추가는 상기 분석 민감성 (2 코어 + 콤보 vs. 1 코어 + 콤보)을 증가시키고, 그리고 HCVcAg (2 코어 + 콤보 vs. 2 코어)에 특이적인 상이한 2개 항체를 이용하여 HCVcAg 만을 측정하는 EIA 분석보다 우수하다.
따라서, 일부 구체예들에 있어서, 동일한 항원에 대하여 하나 이상의 항체, 이를 테면, 제 2 항체가 본 발명의 콤보-HCV-Ags EIA 분석, 시스템, 그리고 키트에 이용된다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 상기 제 2 항체는 단일클론 항체들 또는 다중클론 항체들이다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체는 단일클론 항체이고, 상기 제 2 항체는 다중클론 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 제 2 항체는 포획 항체들, 탐지 항체들, 또는 이둘 모두다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 제 2 항체는 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체 및 제 2 항체는 HCVcAg에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 제 2 항원에 대한 두번째 세트의 제 1 항체와 제 2 항체는 본 발명의 콤보-HCV-Ags EIA 분석, 시스템, 그리고 키트에 이용된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 주어진 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 주어진 항원에 대하여 생성되거나 또는 다른 항원보다 주어진 항원에 선호적으로 결합하는 것이다.
5.5 테스트 시료와 탐지 항체의 혼합
다수의 HCV 항원에 대항하는 모든 탐지 항체들을 함께 혼합되고, 테스트되는 시료와 항온처리되는지를 판단하기 위하여, HCV RNA에 대하여 양성으로 테스트된 대상의 혈청 시료와 소변 시료는 모두 실시예 2의 EIA 프로토콜(단계 5와 함께 또는 없이)과 다음의 변형을 이용하여 테스트되었다: 단계 1에서 설명된 바와 같이 항-HCV 특이적 항체들을 피복하는 대신, 미량적정 플레이트의 테스트 웰들은 탄산염/중탄산염 완충액 (pH 약 7.0-9.5, 이를 테면, 약 9.0)에 희석된 충분한 양, 50-200 μL, 이를 테면, 약 100 μL의 포획 항체들, 이를 테면, 항-마우스 IgG 항체들로 피복되었다. 농도는 약 0.5-1.5 μg/mL, 이를 테면, 약 1.0 μg/mL이었다. 미량적정 플레이트는 하룻밤 동안 4 ℃(또는 37 ℃에서 약 15-120 분, 이를 테면, 약 60 분)에서 항온처리되었다. 그 다음, 단계 6-8 대신, 테스트되는 시료는 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a에 대한 제 1 탐지 항체와 제 2 탐지 항체 (이를 테면, 상이한 2개의 HCVcAg mAb, 그리고 NS3, NS4b, 및 NS5a에 대한 다중클론 항체들을 포함)와 혼합 후, 테스트 웰에 로딩되었다. 간략하게 설명하자면, 약 25-150 μL, 이를 테면, 약 100 μL의 테스트 시료 (혈장 또는 소변)는 각각 약 5-20 μg/mL, 이를 테면, 약 10 μg/mL의 농도에서 모든 탐지 항체와 함께, 총 약 100-300 μL, 이를 테면, 약 250 μL 최종 용적으로 혼합되었다. 테스트 웰로부터 차단 완충액을 제거한 후, 테스트 혼합물 (탐지 항체들과 혼합된 테스트 시료)은 약 150-300 μL, 이를 테면, 약 250 μL의 용적으로 포획항체들을 갖고 있는 테스트 웰에 추가되었다.
도 10a에 나타낸 바와 같이, 모든 항체들을 함께 혼합하고, 테스트 시료와 함께 항온처리되면 분석 민감성이 상당히 증가되었으며, 테스트 시간도 약 30 분 단축되었다. 따라서, 본 발명은 또한 EIA 분석 방법을 제공하며, 이때 상기 테스트 시료는 탐지 항체들과 혼합되고, 그 다음 상기 혼합물은 분석 기질 상에 피복된 또는 고정된 포획 항체들을 갖고 있는 분석 기질에 추가된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 콤보-HCV-Ags EIA 분석 방법은 테스트 시료와 탐지 항체들을 혼합하고, 그 다음 테스트 시료와 그 다음 탐지 항체들을 별도로 로딩하는 대신, 분석 기질 상에 피복된 또는 고정된 포획 항체들을 갖고 있는 분석 기질에 상기 혼합물을 추가하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 EIA 분석을 실행하기 위한 키트를 제공하며, 이때 키트는 다수의 항체들이 포함된 용기, 이때 다수의 각 항체는 다수의 HCV 항원의 HCV 항원에 특이적으로 결합하고, 탐지 시약을 포함하는 용기, 그리고 다수의 항체들, 탐지 시약, 그리고 테스트될 시료이 혼합될 수 있는 용기, 그리고 기질상에 피복된 또는 고정된 다수의 HCV 항원에 특이적으로 결합되는 포획 시약을 가진 기질을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 혼합용 용기는 다수의 항체들을 갖는 용기 또는 탐지 시약을 갖는 용기다.
상기 분석 기질상에 피복된 포획 항체들 (항-마우스 IgG 항체들)을 갖는 기질과 접촉되기 전, 모든 탐지 항체들과 혼합되는, 콤보-HCV-Ags EIA 분석의 탐지 한계는 공지의 양의 HCV RNA를 갖는 피복된 2개의 혈청 시료의 연속 희석을 이용하여 측정되었다. PCR에 의해 항-HCV 및 HCV RNA에 대하여 음성인 혈청 시료는 음성 대조로 이용되었다. 희석안된 혈청 (대조)은 기준 혈청 HCV RNA 1,124-1,140 IU/mL을 가지고 있었다. 도 10b에서 나타낸 바와 같이, HCV 항원은 약 140 IU/mL에 등가인 혈청 HCV RNA에 대한 희석에서 탐지가능하도록 남아있었고, 실시예 2의 단계 5에 따라 변성되었거나 되지 않았다(변성된 시료의 OD 값이 더 높았지만, 그러나 변성된 시료와 비-변성된 시료 모두에 대한 탐지 한계는 비슷하다).
유사하게, 상기 분석 기질 상에 피복된 포획 항체들 (항-마우스 IgG 항체들)을 가진 분석 기질에 접촉되기 전, 모든 탐지 항체와 소변 테스트 시료가 혼합된 콤보-HCV-Ags EIA 분석의 탐지 한계는 RT PCR에 의해 공지된 양의 혈청 HCV RNA를 갖는 대상의 5가지 소변 시료의 연속 희석물을 이용하여 측정되었다. PCR에 의해 항-HCV 및 혈청 HCV RNA에 대하여 음성으로 테스트된 대상의 소변 시료는 음성 대조로 이용되었다. 도 10c에서 나타낸 바와 같이, 탐지 한계는 약 63-94 IU/mL의 혈청 HCV RNA에 대응한 범위 안에 있었다.
실시예 6 - LFT 실험
본 명세서에서 구체화된 모든 LFT 실험은 오직 자유 항원(들)을 탐지하지만, 상기 시료들은 탐지전 변성 조건을 겪지 않았기 때문에, 탐지 전 전체 항원(들)은 테스트 시료, 이를 테면, 혈청 시료의 변성에 의해 탐지될 수 있다.
6.1 다수의 HCV 항원 탐지
LFT 분석 시스템을 이용하여 자체 또는 다수의 HCV 항원 (이를 테면, HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a)에 의해 HCVcAg 탐지 가능성을 판단하기 위하여, 테스트 스트립은 실시예 3에서 제시된 바와 같이 구축되었고, 테스트되었다.
도 11a, 패널 A에서 나타난 바와 같이, HCVcAg에 대한 단일 단일클론 항체를 이용하는 LFT 분석 시스템은 높은 역가의 혈청 HCV RNA, 이를 테면, 14,400,000 IU/mL를 가지는 대상으로부터 획득된 소변 시료 안 양성 신호를 야기하는데 불충분하였다. 그러나, 본 발명에 따른 콤보-HCV-Ags LFT 분석 시스템-다수의 HCV 항원에 대한 항체들이 포함된 테스트 스트립-을 이용하여, 혈청 HCV RNA를 갖는 대상으로부터 혈청 시료 (도 11a, 패널 B) 및 소변 (도 11a, 패널 C) 시료 모두에 대한 양성 신호가 획득되었다. 컬럼 1 및 2는 음성 대조였다.
따라서, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 LFT 테스트 스트립을 제공하는데, 이는 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 집단으로부터 선택된 최소한 상이한 2개의 HCV 항원에 대하여 특이적인 포획 항체 및 탐지 항체들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 LFT 테스트 스트립을 제공하는데, 이는 HCVcAg에 대한 포획 항체 및 탐지 항체 그리고 E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 집단으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 항원을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 LFT 테스트 스트립을 제공하는데, 이는 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a에 대한 포획 항체 및 탐지 항체들을 포함한다.
6.2 2개의 상이한 항체들을 이용하여 HCVcAg 의 탐지
HCVcAg에 대한 추가 항체의 사용이 실시예 6.2의 콤보-HCV-Ags LFT 분석의 민감성을 증가시킬 수 있는 지를 판단하기 위하여, 테스트 스트립은 실시예 3에서 제시된 바와 같이 구축되었고, 테스트되었고, HCVcAg에 대한 제 2 항체는 다수의 HCV 항원에 대한 항체 혼합물에 추가되었다. 도 11b에서 나타낸 바와 같이, HCVcAg에 대한 제 2 항체의 추가는 본 발명에 따른 콤보-HCV-Ags LFT 분석의 민감성을 증가시키고 (2개 항-HCVcAg mAbs을 가진 패널 B vs. 1개 항-HCVcAg mAb를 가진 패널 A), 그리고 결과는 HCV 유전자형과는 독립적이다 (컬럼 C, 대조; 스트립 1-5는 차례로 HCV GT 1, 2, 3, 4, 및 6를 나타내었다).
따라서, 일부 구체예들에 있어서, 동일한 항원에 대한 하나 이상의 항체, 이를 테면, 제 2 항체가 본 발명의 콤보-HCV-Ags LFT 분석, 시스템, 그리고 키트에 이용된다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 상기 제 2 항체는 단일클론 항체들 또는 다중클론 항체들이다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체는 단일클론 항체이고, 상기 제 2 항체는 다중클론 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 제 2 항체는 포획 항체들, 탐지 항체들, 또는 이둘 모두다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 제 2 항체는 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체 및 제 2 항체는 HCVcAg에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 제 2 항원에 대한 제 2 세트의 제 1 및 제 2 항체는 본 발명의 콤보-HCV-Ags LFT 분석, 시스템, 그리고 키트에 이용된다.
따라서, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 동일한 항원에 대한 하나 이상의 항체, 이를 테면, 제 2 항체를 포함하는 LFT 테스트 스트립을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 상기 제 2 항체는 단일클론 항체들 또는 다중클론 항체들이다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체는 단일클론 항체이고, 상기 제 2 항체는 다중클론 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 제 2 항체는 포획 항체들, 탐지 항체들, 또는 이둘 모두다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 제 2 항체는 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 군에서 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체 및 제 2 항체는 HCVcAg에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 제 2 항원에 대한 제 2 세트의 제 1 항체와 제 2 항체가 본 발명의 콤보-HCV-Ags LFT 테스트 스트립에 이용된다.
6.3 금- 접합된 용액과 테스트 시료의 혼합
테스트 스트립 상에 사전-로딩되는 것 대신, 콤보-HCV-Ags LFT 분석의 분석 민감성 및 특이성의 손실없이 테스트되는 시료와 다수의 HCV 항원에 대한 탐지 항체를 혼합할 수 있는지를 판단하기 위하여, 실시예 3의 단계 3은 생략되었다. 접합물 패드 상에서 콜로이드 금과 접합된 탐지 항체 없이 테스트 스트립을 이용하여 분석을 실행하기 위하여, 테스트 시료는 실시예 3, 단계 1에서 생성된 콜로이드 금 용액과 혼합되었고, 그 다음 상기 시료 패드에 추가되었다.
도 12a 및 12b에서 나타낸 바와 같이, 상기 시료 패드에 추가하기 전, 테스트 혈청 시료와 콜로이드 금 용액 (콜로이드 금과 접합된 탐지 항체)을 혼합시키면 26-63 IU/mL의 혈청 HCV RNA 수준에 등가 범위 안에서 탐지 한계를 갖는 혈청 테스트 시료에 대하여 본 발명에 따른 콤보-HCV-Ags LFT 분석의 민감성이 상당히 개선되었다. 콤보-HCV-Ags LFT 분석은 혈청 시료를 이용하여 100% 민감성 및 100% 특이성을 나타낸다(도 12c).
유사하게, 도 13a 및 13b에서 나타낸 바와 같이, 상기 시료 패드에 추가하기 전, 소변 테스트 시료와 콜로이드 금 용액 (콜로이드 금과 접합된 탐지 항체)을 혼합시키면 63-94 IU/mL의 혈청 HCV RNA 수준에 등가 범위 안에서 탐지 한계를 갖는 혈청 테스트 시료에 대하여 본 발명에 따른 콤보-HCV-Ags LFT 분석의 민감성이 상당히 개선되었다. 콤보-HCV-Ags LFT 분석은 소변 시료를 이용하여 100% 민감성 및 100% 특이성을 나타낸다(도 13c).
따라서, 본 발명은 또한 LFT 분석 방법을 제공하고, 이때 테스트 시료는 테스트 스트립의 LFT 시료 패드에 추가되기 전, 탐지가능한 라벨, 이를 테면, 콜로이드 금으로 접합된 탐지 항체들과 혼합된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 콤보-HCV-Ags LFT 분석 방법은 테스트 시료와 탐지가능한 라벨, 이를 테면, 콜로이드 금에 접합된 탐지 항체들을 혼합하고, 그 다음 탐지가능한 라벨에 접합된 탐지 항체들이 로딩된 테스트 스트립을 이용하는 대신, 테스트 스트립의 시료 패드에 상기 혼합물을 추가하고, 그리고 혼합안된 테스트 시료를 상기 시료 패드에 추가하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 그러나, 탐지가능한 라벨, 이를 테면, 콜로이드 금에 접합된 탐지 항체가 로딩된 테스트 스트립은 탐지가능한 라벨에 접합된 탐지 항체와 혼합된 테스트 시료를 테스트하는데 이용된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 LFT 분석을 실행하기 위한 키트를 제공하는데, 이 키트는 탐지가능한 라벨, 이를 테면, 콜로이드 금 용액, 항체들이 포함된 조성물과 함께 포장된 테스트 스트립, 그리고 용기를 포함하며, 이때 탐지가능한 라벨은 탐지가능한 라벨과 접합된 탐지 항체들이 되도록 항체와 혼합될 수 있고, 그리고 테스트 스트립 상에 로딩하기 전, 테스트될 시료와 혼합될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 키트는 탐지가능한 라벨, 이를 테면, 콜로이드 금에 접합된 탐지 항체들과 함께 포장된 테스트 스트립, 그리고 용기를 포함하며, 이때 상기 테스트될 시료와 탐지 항체들이 혼합될 수 있다. 키트에서 제공된 테스트 스트립에는 탐지가능한 라벨, 이를 테면, 콜로이드 금에 접합된 탐지 항체들이 사전 로딩되거나 또는 로딩되지 않을 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 키트는 활성 HCV 감염의 탐지용이며, 따라서 탐지 항체들은 HCVcAg, E1, E1, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 집단에서 선택된 최소한 2개의 HCV 항원에 특이적으로 결합하는 항체들의 혼합물을 포함하고, 이를 테면, 전술한 혼합물은 제 1 HCV 항원에 대하여 특이적인 제 1 항체, 제 2 HCV 항원에 특이적인 제 2 항체, 등을 포함한다.
실시예 7 - HBsAg 에 대하여 2개의 상이한 항체를 이용한 HBV 분석
혈청 HBsAg에 대하여 양성인 대상의 소변 시료 안에 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg)의 존재. 구체적으로, 단계 5 없이, 실시예 5.5의 EIA 프로토콜(기질 상에 포획 항체들을 갖는 분석 기질과 접촉 전 시료와 탐지 항체를 혼합)과 HBsAg에 대항하는 하나 또는 2개의 항체들을 이용. HBsAg에 대한 항체는 표 A에서 제시된다. 다른 HBV 항원은 탐지되지 않았다. 도 14a에서 나타낸 바와 같이, HBsAg에 대한 상이한 2개 항체를 이용하면 분석 민감성이 약 0.26 내지 1.6 배 증가되었다.
혈청 HBsAg에 대한 양성 대상의 소변 시료에 HBsAg 존재. 구체적으로, 실시예 6.3의 LFT 프로토콜(테스트 스트립에 접촉시키기 전, 시료와 탐지 항체의 혼합) 및 HBsAg에 대항하는 하나 또는 2개의 항체들을 이용. HBsAg 항체들은 표 A에서 제시된다. 다른 HBV 항원은 탐지되지 않았다. 도 14b에 나타낸 바와 같이, HBsAg에 대항하는 상이한 2개 항체를 이용한 LFT 분석 ( “b”로 라벨된 테스트 스트립 참고)은 HBsAg에 대한 오직 하나의 항체를 이용하는 LFT 분석 (“a”로 라벨된 테스트 스트립 참고)과 비교하였을 때 상당히 우수한 결과를 초래한다.
따라서, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 시료 안 HBsAg를 탐지하기 위한 면역-기반 분석, 시스템, 그리고 키트를 제공하고, 이는 최소한 2개의 상이한 항체들, 이를 테면, HBsAg에 대한 제 1 항체와 HBsAg에 대한 제 2 항체의 이용을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 상기 제 2 항체는 단일클론 항체들 또는 다중클론 항체들이다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체는 단일클론 항체이고, 상기 제 2 항체는 다중클론 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 제 2 항체는 포획 항체들, 탐지 항체들, 또는 이둘 모두다. 일부 구체예들에 있어서, 제 1 항체와 제 2 항체는 포획 항체들을 갖는 분석 기질에 접촉되기 전, 테스트 시료와 혼합된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 시료는 탐지 전 변성된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 시료는 소변 시료다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 시료는 전혈, 혈청, 또는 혈장 시료다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 분석은 EIA 분석이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 분석은 LFT 분석이다.
본 발명의 공개 내용의 이해 또는 완성하는데 필요한 수준으로, 본 명세서에서 언급된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은 이들 각각이 개별적으로 통합된 것과 같은 수준으로 본 명세서에서 참고자료에 명시적으로 포함된다.
본 발명의 예시적인 구체예들이 설명되지만, 본 명세서내의 것들은 오직 예시적이며, 본 발명의 범위 안에서 다양한 다른 대안, 채택 및 변형이 있을 수 있음을 당업자들은 주지해야 한다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 특이적 구체예에 제한되지 않지만, 다음의 청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (23)

  1. 다음을 포함하는, 간염 바이러스 항원이 포함된 시료를 식별해내기 위한 분석:
    상기 시료에 다수의 항체들을 접촉시키고, 이때 다수의 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하고,
    상기 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원의 존재 또는 부재를 탐지하고,
    다수의 항체들에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고, 그리고
    상기 시료에서 다수의 항체들의 항체에 결합된 간염 바이러스 항원이 존재하는 것은 간염 바이러스 항원을 포함하는 시료로 식별되며, 그리고 다수의 항체들의 항체에 결합된 간염 바이러스 항원이 존재하지 않는 시료는 간염 바이러스 항원을 포함하지 않는 시료로 식별되며,
    이때 상기 간염 바이러스 항원은 C형 간염 바이러스 (HCV) 항원, B형 간염 바이러스 (HBV) 항원, 또는 이둘 모두가 된다.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 시료는 탐지 단계 전에 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪게되는, 분석.
  3. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 시료는 탐지 단계 전에 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪게되지 않는, 분석.
  4. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 시료는 소변인, 분석.
  5. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 시료는 전혈, 혈청, 또는 혈장인, 분석.
  6. 청구항 1-5중 임의의 하나에 있어서, 이때 HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 집단에서 선택되는, 분석.
  7. 청구항 1-5중 임의의 하나에 있어서, 이때 HCV 항원은 HCVcAg, E1, E2, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성된 집단으로부터 선택되며, 그리고 HCV 항원중 최소한 하나는 HCVcAg인, 분석.
  8. 청구항 1-5중 임의의 하나에 있어서, 이때 HCV 항원은 HCVcAg, NS3, NS4b, 및 NS5a을 포함하거나, 기본적으로 구성되거나, 또는 구성된, 분석.
  9. 청구항 1-5중 임의의 하나에 있어서, 이때 다수의 항체들은 제 1 항체와 제 2 항체를 포함하며, 전술한 제 1 항체들과 제 2 항체들은 동일한 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하는, 분석.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 분석은 상기 시료와 다수의 항체들을 혼합하는 것을 더 포함하고, 이 혼합물은 다수의 항체들에 특이적으로 결합하는 포획 물질을 가진 기질에 접촉되는 것을 더 포함하는데, 이때 상기 포획물질은 탐지 단계 전에 상기 간염 바이러스 항원에 결합될 수도 또는 결합되지 않을 수 있는, 분석.
  11. 청구항 1 또는 청구항 10에 있어서, 이때 상기 탐지 단계는 다수의 항체들의 각 항체에 탐지가능한 라벨을 부착시키는 것을 포함하는, 분석.
  12. 대상이 활성 간염 바이러스 감염을 가지고 있는 지를 진단하는 방법에 있어서, 이 방법은
    청구항 3 또는 청구항 4에 따라 대상의 시료가 HCV 항원을 포함하는 것으로 확인되면, 상기 대상은 활성 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염을 가진 것으로 진단되며,
    청구항 3 또는 청구항 4에 따라 대상의 시료가 HBV 항원을 포함하는 것으로 확인되면, 상기 대상은 활성 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 가진 것으로 진단되며, 또는
    청구항 3 또는 청구항 4에 따라 대상의 시료가 HCV 항원을 포함하지 않는 것으로 확인되면, 상기 대상은 활성 간염 바이러스 감염을 가지지 않는 것으로 진단되는 것을 포함하는, 방법.
  13. 다수의 대상중에서 활성 간염 바이러스 감염이 있는 또는 없는 대상을 식별해내는 방법에 있어서, 이 방법은
    청구항 3 또는 청구항 4에 따라 다수의 대상의 시료를 테스트하고,
    대상의 시료가 HCV 항원을 포함하는 것으로 확인되면, 상기 대상은 활성 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염을 가진 것으로 진단되며,
    대상의 시료가 HBV 항원을 포함하는 것으로 확인되면, 상기 대상은 활성 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 가진 것으로 진단되며, 또는
    대상의 시료가 HCV 항원을 포함하지 않는 것으로 확인되면, 상기 대상은 활성 간염 바이러스 감염을 가지지 않는 것으로 진단되는 것을 포함하는, 방법.
  14. 대상이 활성 간염 바이러스 감염을 가지고 있는지, 또는 과거 간염 바이러스 감염이 있었지만, 현재 깨끗한 상태인 지를 진단하는 방법에 있어서, 이 방법은
    대상으로부터 제 1 시료와 제 2 시료를 획들하고, 이때 상기 제 1 시료는 면역 복합체를 가질 수 있거나 또는 없을 수 있고, 상기 제 2 시료는 면역 복합체를 가질 수 있으며,
    상기 제 1 시료에 다수의 항체를 접촉시키고, 이때 상기 시료는 면역 복합체를 가질 수 없거나 및/또는 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪지 않았으며, 이때 다수의 항체의 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하며, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원이 존재 또는 부재하는지를 탐지하고, 그리고 다수의 항체의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고,
    상기 제 2 시료에 다수의 항체들을 접촉시키고, 이때 상기 시료는 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪었으며, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원이 존재 또는 부재하는지를 탐지하고, 그리고 다수의 항체의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고,
    그리고
    다수의 항체들의 항체에 결합된 간염 바이러스 항원이 상기 제 1 시료 안에 존재하는 것으로 탐지되면, 이 대상은 활성 간염 바이러스 감염을 가진 것으로 진단되며, 그리고 다수의 항체들의 항에체 결합된 간염 바이러스 항원이 상기 제 2 시료 안에서 탐지되지만, 간염 바이러스 항원이 상기 제 1 시료 안에서 탐지되지 않는 경우, 이 대상은 과거에 간염 바이러스 감염이 있었지만, 깨끗해진 것으로 진단되며,
    이때 상기 간염 바이러스는 C형 간염 바이러스 (HCV)이며, 상기 간염 바이러스 항원은 HCV 항원이거나 또는 상기 간염 바이러스는 B형 간염 바이러스 (HBV)이며, 상기 간염 바이러스 항원은 HBV 항원인, 방법.
  15. 활성 간염 바이러스 감염을 가졌었는지, 현재 가지고 있는지 또는 가질 수 있는 대상을 모니터하는 방법에 있어서, 이 방법은

    대상으로부터 제 1 시료와 제 2 시료를 얻고, 이때 최소한 상기 제 2 시료는 제 1 시점에서 면역 복합체를 가질 수 있고,
    상기 제 1 시료에 다수의 항체를 접촉시키고, 이때 상기 시료는 면역 복합체를 가질 수 없거나 및/또는 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪지 않았으며, 이때 다수의 항체의 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하며, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 간염 바이러스이 존재 또는 부재하는지를 탐지하고, 그리고 다수의 항체의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고,
    상기 제 2 시료에 다수의 항체들을 접촉시키고, 이때 상기 시료는 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪었으며, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원이 존재 또는 부재하는지를 탐지하고, 그리고 다수의 항체의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고,
    대상으로부터 제 3 시료와 제 4 시료를 얻고, 이때 최소한 상기 제 4 시료는 제 2 시점에서 면역 복합체를 가질 수 있고,
    상기 제 3 시료에 다수의 항체를 접촉시키고, 이때 상기 시료는 면역 복합체를 가질 수 없거나 및/또는 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪지 않았으며, 이때 다수의 항체의 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하며, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원이 존재 또는 부재하는지를 탐지하고, 그리고 다수의 항체의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고,
    상기 제 4 시료에 다수의 항체들을 접촉시키고, 이때 상기 시료는 면역 복합체를 해리시키는 조건을 겪었으며, 다수의 항체들의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원이 존재 또는 부재하는지를 탐지하고, 그리고 다수의 항체의 항체에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원을 임의선택적으로 측정하고, 그리고
    제 1 시료, 제 2 시료, 제 3 시료, 그리고 제 4 시료 간에 다수의 항체들에 결합된 임의의 간염 바이러스 항원의 차이를 산출하고,
    이때 상기 간염 바이러스는 C형 간염 바이러스 (HCV)이며, 상기 간염 바이러스 항원은 HCV 항원이거나 또는 상기 간염 바이러스는 B형 간염 바이러스 (HBV)이며, 상기 간염 바이러스 항원은 HBV 항원인, 방법.
  16. 다음을 포함하는 키트:
    다수의 항체들이 포함된 용기, 이때 다수의 항체에서 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하고, 그리고
    다수의 항체들 및/또는 다수의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하는 포획 시약이 피복된 또는 고정된 기질,
    이때 상기 간염 바이러스 항원은 C형 간염 바이러스 (HCV) 항원, B형 간염 바이러스 (HBV), 또는 이둘 모두가 된다.
  17. 청구항 16에 있어서, 이때 상기 다수의 항체들은 자연에서 볼 수 없는 다수 항체의 농도 및/또는 순도를 가진 조성물인, 키트.
  18. 청구항 16에 있어서, 부착된 탐지가능한 라벨을 갖는 단일클론 항체, 부착된 탐지가능한 라벨을 갖는 다중클론 항체, 또는 이 둘 모두를 더 포함하며, 이때 상기 탐지가능한 라벨을 갖는 전술한 항체들은 다수의 항체들에 특이적으로 결합하는, 키트.
  19. 시료 로딩 영역, 테스트 영역, 그리고 대조 영역을 갖는 측면 유동 테스트 기질에 있어서, 이때 포획 시약은 테스트 영역에 고정되며, 전술한 포획 시약은 다수의 항체들이며, 이때 다수의 항체에서 각 항체는 다수의 간염 바이러스 항원의 간염 바이러스 항원에 특이적으로 결합하고,
    이때 상기 간염 바이러스 항원은 C형 간염 바이러스 (HCV) 항원, B형 간염 바이러스 (HBV), 또는 이둘 모두가 되는, 측면 유동 테스트 기질.
  20. 다음을 포함하는 키트:
    청구항 19의 측면 유동 테스트 기질, 그리고
    탐지 시약.
  21. 테스트 시료안 피분석물을 위한 면역분석에 있어서, 이 분석은
    상기 테스트 시료에 하나 또는 그 이상의 탐지 항체들을 혼합하고, 이때 상기 항체들은 상기 피분석물에 특이적으로 결합하며, 그 다음 상기 혼합물은 포획 항체들을 갖는 분석 기질에 접촉되고, 이때 포획 항체는 상기 분석 기질의 표면에 피복된 또는 고정된 피분석물에 특이적으로 결합하는 것을 포함하는, 분석.
  22. 테스트 시료안 피분석물을 위한 측면 유동 테스트 분석에 있어서, 이 분석은

    테스트 시료에 콜로이드 금에 접합된 탐지 항체들을 혼합하고, 이때 상기 항체는 콜로이드 금에 접합되며, 피분석물에 특이적으로 결합하고, 그 다음
    테스트 라인에 고정된 상기 피분석물에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 테스트 라인의 하류에 있는 대조 라인에 고정된 탐지 항체에 특이적으로 결합하는 항체들을 갖는 테스트 스트립 상에 혼합물을 로딩하는 것을 포함하는, 분석.
  23. 청구항 21 또는 청구항 22에 있어서, 이때 피분석물은 HBsAg 및 제 1 항체 및 제 2 항체이며, HBsAg에 특이적으로 결합하는 제 1 항체와 제 2 항체들이 이용되는, 분석.
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