JP4298850B2 - Ｃ型肝炎ウィルス（ｈｃｖ）検出方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウィルス感染症の診断、経過観察、治療方針決定、治療効果判定において近年、遺伝子学的検査によるウィルスの同定及び定量が盛んに行なわれるようになったが、操作的に煩雑で難易度が高い、検査に要する時間が長い、検査コストが高い、検査結果の再現性が必ずしも良くない等の問題点が指摘されている。
【０００３】
また、従来公知のウィルスの同定及び定量方法である、ウィルス表面蛋白をウィルス抗原として測定する方法は、いくつかのウィルスに対して臨床検査ならびに献血スクリーニングに利用されている。しかし多くのウィルス感染の場合、宿主の免疫応答により産生されたウィルス表面抗原に対する抗体により、測定が妨害されたり、宿主の免疫から逃れるためのウィルス側の表面抗原の変異により、表面抗原の測定はウィルスの検出及び定量には適していないケースが多い。
【０００４】
臨床検査の分野でウィルスの内部蛋白を測定するものとしては、ＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼの活性を測定する検査があるが、特殊な検査で煩雑かつ特別な装置が必要であり、一般普及はしていない。
【０００５】
上記のウィルスの同定及び定量方法に代わる方法として、近年、ＨＣＶのコア蛋白質を検体前処理を行った後にＥＩＡ法で測定するキットが開発され、１９９８年より健康保険も適用となり一般の臨床検査に利用されるようになったが、検体前処理操作が煩雑であるため、さらに簡易な前処理方法が望まれている。
【０００６】
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）は、直径約６０ｎｍのＲＮＡウィルスで、エンベロープをもつ。ＨＣＶ ＲＮＡは一本鎖プラス鎖で、約９５００塩基配列よりなっている。遺伝子構造はフラビウィルスに類似しており、５’末端と３’末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）があり、この間に約３０００アミノ酸をコードする翻訳領域が存在する。翻訳領域は、５’側より、構造蛋白をコードするコア領域、エンベロープ領域１、エンベロープ領域２があり、これに続いて非構造領域が存在する。
【０００７】
Ｃ型肝炎の診断は、通常まず血中ＨＣＶ抗体の測定が行われる。この測定には、例えば非構造領域とコア領域の発現蛋白が抗原として用いられる。この測定系に関してはすでに多くのキットが市販され、急性及び慢性肝炎の診断・治療の手段として汎用されている。しかしこの測定は、あくまで血中ＨＣＶ抗体の有無を知るもので、血中のＨＣＶそのものを測定するものではない。
【０００８】
ＨＣＶのコア蛋白を測定する手段は、血中のウィルス量を測定するために開発された系であり、すでにキットが市販され臨床検査に利用されている。このキットは、検体中のＨＣＶよりＨＣＶコア蛋白を放出させる検体前処理ステップと、この検体前処理液中のＨＣＶコア蛋白を、これに対するモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で測定するステップよりなる。
【０００９】
この検体前処理方法は、まず血清検体にポリエチレングリコール溶液を加え冷蔵放置によりＨＣＶを不溶化させた後、遠心処理を行い沈殿画分として回収し、上清を除去してＨＣＶ粒子の濃縮ならびに他の血清成分（反応妨害成分）の除去・低減を行う。次に沈殿画分を再溶解し、アルカリを加えて一定時間放置する。この時、後のＥＩＡ反応時に競合阻害的に働く検体中のＨＣＶ抗体（コア抗体）が、失活する。次いで非イオン性界面活性剤を含む酸性溶液を加えて、検体処理液を中和するとともに、ＨＣＶ粒子のエンベロープを剥離させコア蛋白を露出させる。 以上の処理過程が検体前処理ステップであるが、沈殿画分の再溶解時に尿素溶液を用いると、ＨＣＶ粒子からのコア蛋白放出に効果的であり、尿素の添加も含めた上述の検体前処理方法が、現在臨床検査で利用されている公知の技術である（特開平８−２９４２７）（医学と薬学，３６，（１），１９９６）。
【００１０】
エンベロープをもつウィルスの内部抗原を測定する手段として別の方法は、蛋白質分解酵素処理、熱処理などの処理で、検体中に存在する抗体を不活化したのち、エンベロープ部分を破壊するために非イオン界面活性剤を使うことが提案されている（特開平８−５０１３３）。
【００１１】
より新しい提案としては、ＨＣＶを含む検体を、カオトロピックイオン、酸性化剤、および非イオン性界面活性剤を含む処理液で処理して、検体中に存在する抗体の不活化とエンベロープの破壊を同時に可能とする方法が提案されている（特開平１１−５１９４０）。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、上記のような先行文献を考慮に入れ、従前より簡便でかつ検出系で確実に捕捉しうるウィルス粒子内部蛋白、とりわけＨＣＶコア蛋白を放出させるための方法を提供することにある。詳しくは、従前確立された方法を踏襲しながらも、その工程をより簡略化し、前処理の経済性を上げ、同時に従前の測定の特異性を維持して、ＨＣＶコア蛋白を測定するための方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＨＣＶを含むことが疑われる血清に、蛋白変性剤及び非イオン性界面活性剤を含む第１の溶液並びにアルカリ性の第２の溶液を直接添加する工程と、得られた溶液に酸性溶液を添加してアルカリを中和することにより、ＨＣＶコア蛋白検出用試料を調製する工程と、調製されたＨＣＶコア蛋白検出用試料中のＨＣＶコア蛋白を測定することにより、ＨＣＶを検出する工程と、を含むＨＣＶ検出方法に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、血清等の検体に対して濃縮・除蛋白等の処理を施すことなく、蛋白変性剤及び非イオン性界面活性剤を含む溶液とアルカリ溶液を直接添加し、抗体の不活化とエンベロープの破壊を同時に行い、−定時間後に酸性溶液を添加して検体処理液を中性に戻し、検出系のサンプルとする。
【００１５】
なお本発明の対象となる検体は、全血、血漿、血清、尿、髄液、精液、唾液、母乳、粘液等の体液や糞便、病変部組織、膿、喀痰、およびウィルス培養系試料などである。
【００１６】
また、対象となるウィルスは、Ｃ型肝炎ウィルスである。
【００１７】
本発明においては、従前の煩雑な操作や特別な装置も不要であり、所要時間も大幅に短縮される。また検出系に必要なサンプル量を得るために、従前の方法では２００μＬの検体が必要であったが、本発明では４０μＬで測定可能となる。
【００１８】
本発明においては、検体に対して蛋白変性剤を添加する。蛋白変性剤としては、 尿素および塩酸グアニジンが一般的に良く知られているが、チオシアン酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウムなどのカオトロープ剤もコア蛋白放出に効果がある。検体処理時の蛋白変性剤濃度としては０．５Ｍ以上が好ましいが、より好適には１〜５Ｍである。
【００１９】
本発明においては、検体に対して非イオン性界面活性剤を添加する。非イオン性の界面活性剤としてはポリオキシエチレン誘導体が一般的であり、トリトンＸ−１００、ノニデットＰ４０、ツィーン２０、ツィーン８０、ブリッジ３５などが例示される。より好適にはツィーン８０で、処理時の濃度は１〜１０％であり、より好適には２〜４％である。
【００２０】
本発明においては、検体に対して、アルカリ溶液による処理を行う。アルカリとしては−般的には水酸化ナトリウムや水酸化カリウムが用いられ、処理時のアルカリ度は０．０５〜０．５Ｎで、より好適には０．１〜０．４Ｎである。
【００２１】
本発明においては、検体に対して、以上の３つの処理を同時に行う。処理温度および時間は１０〜３０℃で約５〜３０分であり、好適には２０℃付近で１０〜２０分である。処理温度が低すぎたり反応時間が短いと、抗体の不活化、エンベロープの破壊、コア蛋白の放出が充分でなく、逆に処理温度が高く処理時間条件が長くなると、コア蛋白の変性が過度となり、測定値の低下を招く。
【００２２】
抗体の不活化およぴエンベロープの破壊後、検体処理液に適当な酸性溶液を加えることでアルカリを中和する。中和後のｐＨとしては約６〜約８、より好適には約７近辺である。この中和処理により検体前処理は終了し、以降の検出系にかけられる。この前処理により、検体前処理液は元の検体より希釈されることになる。後の検出系への血清成分の妨害等を考慮した場合、元の検体より数倍希釈されるのが望ましいが、検出限界を考慮して約２〜４倍が最適である。
【００２３】
かくして、検体は、希釈処理により最低検出限界が従前の８ｐｇ／ｍＬから２０〜４０ｐｇ／ｍＬとなるので、以降の検出系は従前の検出系より２．５〜５倍検出感度が高いものを用いることが望ましい。検出系の感度を上げる手段としては、高感度発光基質の採用やより高親和性の抗体を用いることで、達成可能と考えられる。（臨床化学，２３，２５９〜２６７，１９９４）
【００２４】
以下に本発明の実施例として、ＨＣＶを例示して具体的に説明する。しかし本発明は、エンベロープを有するを対象とする限りはこの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
ＨＣＶ抗体およびＨＣＶ−ＲＮＡ陰性パネル血清１例と、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清２例を検体として、検体前処理を行った。検体各４０μＬに対して、尿素６Ｍ、ツィーン８０ ６％溶液６０μＬを加え、ついで２．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０μＬを添加し、撹拌した。この検体前処理液を、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃の四温度条件下で、１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、６０分間の六時間条件で処理後、０．４Ｍクエン酸溶液を４０μＬ添加撹拌し、検体前処理液１６０μＬを得た。この検体前処理液を試料として、従前の検出系を用いてＨＣＶコア蛋白の測定を行った（医学と薬学，３６，（１），１９９６）。その結果を、表１及び図１に示した。
【００２６】
両陽性パネルとも最大値が得られるためには、ある程度の処理時間が必要で、処理温度が低い程その所要時間は長くなるが、処理温度を高くすると至適処理時間以降の測定値の低下がより急激となる。処理温度２０℃で１０〜２０分間の処理が、最大値を得られかつ時間変化に対する測定値の変化の小さい好ましい条件であると判断される。これは水酸化ナトリウム濃度０．４Ｎでの処理時の至適条件であるが、水酸化ナトリウム濃度が低い場合には至適条件は、より高い温度やより長い時間に移行し、水酸化ナトリウム濃度が高い場合には至適条件は、より低い温度やより短い時間に移行する。
【００２７】
【表１】

【００２８】
実施例２
ＨＣＶ抗体およびＨＣＶ−ＲＮＡ陰性血清１例と、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清２例を検体として、それぞれ１０回ずつ以下の操作により検体前処理を行った。検体各４０μＬに対して、尿素６Ｍ、ツィーン８０ ６％溶液６０μＬを加え、ついで２．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０μＬを添加し、撹拌した。室温で１０分間処理後、０．４Ｍクエン酸溶液を４０μＬ添加撹拌し、検体前処理液１６０μＬを得た。この検体前処理液を試料として、従前の検出系を用いてＨＣＶコア蛋白測定を行った（医学と薬学，３６，（１），１９９６）。その結果を、表２に示した。
【００２９】
陰性パネルは全て検出限界（４０ｐｇ／ｍＬ）未満であり、陽性パネルの測定値のＣＶは４％前後であった。前処理操作を含むＥＩＡ測定の結果としては、満足できる結果であった。
【００３０】
【表２】

【００３１】
実施例３
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性患者血清各３０例について、その４０μＬに対して尿素６Ｍ、ツィーン８０ ６％溶液６０μＬを加え、ついで２．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０μＬを添加し、撹拌した。室温で１０分間処理後、０．４Ｍクエン酸溶液を４０μＬ添加撹拌し、検体前処理液１６０μＬを得た。この検体前処理液を試料として、従前の検出系を用いてＨＣＶコア蛋白の測定を行った。 ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性患者血清３０例については、従前の検体前処理法（ＰＥＧ法）でも前処理を行い、同じＨＣＶコア蛋白の測定を行った（医学と薬学，３６，（１），１９９６）。その結果を、表３、表４に示した。
【００３２】
健常人３０例の血清は全て検出限界（４０ｐｇ／ｍＬ）未満であり、特異性上の問題は認められなかった。ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性患者３０例の血清については、本発明の前処理法での測定値と従前の処理法（ＰＥＧ法）での測定値の比をとると、１．０〜３．１（平均値１．８）であった。従前の方法より高値に出ることに関しては、従前の前処理法ではＰＥＧ 処理による沈殿画分にＨＣＶが１００％回収されておらず、回収率が検体毎に血清の状態により異なるためと推測された。従って本発明の前処理法は従前の前処理法に比べて、よりウィルス量を反映した結果が得られる可能性が示唆される。
【００３３】
【表３】

【００３４】
【表４】

【００３５】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の検体前処理手段は、従前の方法に比較して、行程の簡略化、短時間処理を可能とするものであり、従来約３時間をかけてなされていた処理を、２０分程度で達成可能とするものであり、ＨＣＶコア蛋白の検査業務の効率化を極めて増進させるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清２例のＨＣＶコア蛋白測定値に対する、検体処理時間及び検体処理温度の影響を示す図である。

Claims (1)

1. Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）を含むことが疑われる血清に、蛋白変性剤及び非イオン性界面活性剤を含む第１の溶液並びにアルカリ性の第２の溶液を直接添加する工程と、
   得られた溶液に酸性溶液を添加してアルカリを中和することにより、ＨＣＶコア蛋白検出用試料を調製する工程と、
   調製されたＨＣＶコア蛋白検出用試料液中のＨＣＶコア蛋白を測定することにより、ＨＣＶを検出する工程と、
   を含むＨＣＶ検出方法。

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