JP3895262B2 - C型肝炎罹患検査方法 - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
この発明は、C型肝炎罹患検査の方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
C型肝炎ウイルス(HCV)に感染すると、慢性化しやすく、肝硬変を引き起こす確率が高い等の問題がある。このため、C型肝炎ウイルス感染が疑われている患者について、血液中にC型肝炎ウイルスが存在しているか否かを、短時間のうちに確認することができる検査技術は重要である。更に、C型肝炎ウイルスは、HCV感染患者の体内にて遊離状態及び/又は免疫複合体の状態で存在しているが、そのC型肝炎ウイルスが如何なる状態(すなわち、遊離状態あるいは免疫複合体の状態)で存在しているかについて知る適当な方法がなく、このような検査方法の完成が望まれていた。
【0003】
一方、クリオグロブリンは、低温で血清から沈澱する熱タンパク質であり、多くの骨髄腫や、リンパ増殖性疾患、自己免疫疾患及び感染性疾患などの広範な疾患において検出されている(例えば、非特許文献1参照。)。クリオグロブリン血症とC型肝炎との間の関係に関して報告がなされており(例えば、非特許文献2、3参照。)、クリオグロブリン中のHCV−RNAの存在が確認されている(例えば、非特許文献4参照。)。しかし従来法によるクリオグロブリンの確認には大量のHCV感染血清が必要であり、極めて少量のクリオグロブリンの沈澱を検出することは困難であった。
【0004】
発明者らは既にクリオグロブリンを検出する簡易な方法を開発して報告した(例えば、非特許文献5参照。)。この方法は冷却したアガロースゲルプレートを利用したゲル拡散法であり、10μl程度の少量のサンプルで行うことができる。この方法で得られるクリオグロブリンの沈澱リングは極めて明確であり、特にC型肝炎におけるクリオグロブリンの分析に有効である。更に、本発明者らは、この遊離ウイルス相分離検知技術をC型肝炎ウイルスの検査技術として用いる方法を開発した(特願2001-230946)。
【0005】
【非特許文献1】
厚生省新興・再興感染症研究事業「非A非B型肝炎の予防、疫学に関する研究、非A非B型肝炎の臨床的総合研究」平成11年度研究報告書、飯野四郎「C型慢性肝疾患におけるクリオグロブリン血症の検討」
【非特許文献2】
Casato M, et. al., Lancet 1991; 337; 1047-8
【非特許文献3】
Disdier P, et. al., Lancet 1991; 338: 1151-2
【非特許文献4】
Agnello V, et. al., N Engl J Med 1992; 327: 1490-5
【非特許文献5】
Okazaki T, et. al., C1inica1 Chemistry 1998; 44: 1558-1559
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡単な装置と煩雑でない操作にて、血清中のC型肝炎ウイルスの検査方法を提供することを目的とし、更に、C型肝炎ウイルスの感染者に特有の免疫複合体を特定し、これを見積もることのできる手段、即ちC型肝炎患者を見分ける効果的な方法を提供するものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意研究を進めた結果、C型肝炎患者のIgMが健常者のIgMとは異なる変性IgMであること、IgMがGalβ1−3GPと結合し複合体を形成すること、この複合体は特定のレクチンと結合すること、及びこの変性IgMとGalβ1−3GPとの複合体が低温下で凝集し、これが即ちクリオグロブリンであることなどの知見を得た。本発明者らは、このような知見から、C型肝炎ウイルスの感染者に特有の異常IgMから成る免疫複合体を見積もる方法、及びC型肝炎患者を見分ける方法を完成させた。なお、Galβ1−3GPとは、被検者血清試料中に存在するGalβ1−3GalNacの構造を糖鎖末端に持つ糖蛋白質のことである。
即ち、本発明は、Galβ1−3GPと親和性のレクチンを固定化した担体に被検者の血清検体を37℃未満の凍結しない寒冷状態で接触させる段階(第1段階)、37℃未満の凍結しない寒冷状態において、前段階で得た担体を冷洗浄した後、この担体にヒトIgMに対する酵素標識第二抗体を接触させる段階(第2段階)、及び前段階で得た担体を冷洗浄した後この担体に結合している標識を検知する段階(第3段階)から成るC型肝炎罹患検査方法である。
【0008】
【発明の実施の形態】
上記のように発明者らは、C型肝炎患者のIgMが健常者のIgMより分子量が正常のものより数千大きい変性IgMであることを見出した。その結果は後述の参考例1に示す。
IgMとGalβ1−3GPとは複合体を形成するが、健常者のIgMとGalβ1−3GPとの複合体は低温下でも凝集しないと考えられる。しかし、C型肝炎患者の変性IgMとGalβ1−3GPとの複合体は低温下で凝集し、これがクリオグロブリンであると考えられる。この凝集状態を寒天ゲル上で観察したことは既に報告した(非特許文献5)。
【0009】
一方、本発明者らは、IgMとGalβ1−3GPとから成る複合体が特定のレクチンと特異的に結合することを見出した。その結果は後述の参考例2に示す。レクチンは、動植物から抽出される糖鎖構造を持つ蛋白であり、凝集・沈降反応その他特異抗体反応に類似した現象をひき起こす。Galβ1−3GPと親和性のレクチンとしては、例えば、実施例で実証したヤシの実のレクチンであるJacalinが好ましい。Galβ1−3GPとの親和性は、例えば、後述の参考例2に記載の方法により知ることができる。
【0010】
レクチン(Jacalin)はC型肝炎患者の変性したIgMとGalβ1−3GPとの複合体も健常者の正常IgM・Galβ1−3GP複合体も区別無く固相に結合する。
しかるに、C型肝炎患者の変性IgMとGalβ1−3GPとの複合体であるクリオグロブリンは低温で凝集するため、本発明の方法のように、系内にレクチン(Jacalin)を置いても結合できなくなってしまうものと考えられる。従って、本発明の方法により、レクチン(Jacalin)と結合することのできない変性IgMとGalβ1−3GPから成る複合体の量を見積もることが可能になる。
【0011】
本発明のC型肝炎ウイルスの検査方法の第1段階と第2段階は、37℃未満の凍結しない寒冷状態で行うが、好ましくは1〜10℃、より好ましくは4℃付近であり、各段階で同じ温度である必要はない。
冷洗浄は、37℃未満、好ましくは1〜10℃で、通常は90mM リン酸緩衝液等を用いて洗浄を行う。
また、第3段階は低温である必要はなく通常は37℃で行う。
酵素標識第二抗体は、ヒトIgMに対する抗体であれば特に制限はないが、HRP標識ヒトIgMウサギ抗体等が一般に用いられる。
【0012】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
参考例1
ゲル上の沈澱物リングに含まれるクリオグロブリンの分析をポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を用いて行った。まず、低温で、クリオ沈澱物リングを切り出して、アガロースゲルに含まれるクリグロブリンを37℃でグリシンを含むDulbeccoリン酸緩衝液(pH7)に溶解する。この溶解液をTris-SDS-βME seprazol(第一化学社製)で処理し、0.025 M Tris-0.195 M グリシン緩衝液(pH8.6)を用いて40mAの一定電流で5〜15%ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動を60分間行った。電気泳動後、分画された免疫グロブリンをImmobilon PVDF 移転膜(第一化学社製)に1時間移転させ、この膜をスキムミルク(Block Ace、大日本製薬社製)でブロックした。これを抗μ鎖抗体(Dako A/S, Glostrup社製)と反応させ、次にPOD標識ウサギ抗体(Dako A/S, Glostrup社製)で着色した。その結果を図1に示す。
レーン1は健常者のもので、レーン2〜6はHCV患者のものである。HCV患者のもののうちクリオグロブリンの沈澱が多いものについては、健常者のものより数キロダルトン大きい異常mu画分が確認された。
即ち、この結果から、C型肝炎患者で異常なIgMが作られていることが確認された。これは、HCVがリンパ球に入り免疫機構に対して悪さをしている証拠ではないかと考えられる。
【0013】
参考例2
750mLの水に、組成物Aと組成物Bとを加え、充分に彊搾した後、沸騰湯浴中で溶解させた。
(1)組成物A:
NaCl 800mg
KCl 200mg
リン酸一水素ナトリウム 1150mg
リン酸二水素ナトリウム 200mg
(2)組成物B:
アジ化ナトリウム 0.75g
グリシン 56.25g
アガロース 4.50g
溶解に際しては、5分毎にスターラーで撹拝し、均一なアガロース溶液とになるようにした。
【0014】
アガロース溶液を溶解後直ちに直径30mmのプレートに注ぎ、室温で凝固させてアガロースゲルプレートを得る。このアガロースゲルプレートに直径5mmの凹み(ウェル)を7個程度形成し、これを冷蔵保存した。
C型肝炎ウイルスの感染者と健常者から所定の手段で採取した血清試料20μLを37℃に維持し、これを室温にて、アガロースゲルプレートの凹みへ注入した。その後20分間静置して、血清試料をゲルプレート内に染み込ませた。
【0015】
このゲルプレートを4℃附近に置き、12時間以上の時間をかけてインキュベートした。その結果を図2のNo.3(C型肝炎ウイルスの感染者)とNo.4(健常者)に示す。No.3でのみ、凹みの周辺に白い沈澱物リングが観察された。即ち、既報(非特許文献5)と同様に、変性IgMとGalβ1-3GPとの複合体が凹みの周辺に凝集沈澱したと考えられる。
【0016】
一方、上記血清試料にJacalin Pure(EY社製)を血清試料10μlあたり1μgとなるように加え、約2時間静置した後、参考例2のプレートの凹みに注入して、上記と同様の操作を行った。その結果をその結果を図2のNo.2(C型肝炎ウイルスの感染者)とNo.1(健常者)に示す。いずれにも凹みの周辺にも白い沈澱物リングは観察されなかった。
これらの結果を表1にまとめる。表中、凹みの周辺に白い沈澱物が観察されたものを+、観察されなかったものを−とした。
【0017】
【表1】
Jacalin処理のものを無処理のものと比べると、HCV患者の凹みの周辺の白い沈澱物がJacalin処理により観察されなくなった。
この結果から、HCV患者のクリオグロブリン沈澱物には変性IgMとGalβ1-3GPとの複合体が含まれるもの考えられる。しかし、Jacalinが複合体を形成するGalβ1-3GPと特異的に結合し、凹みの周辺に移動することが出来なくなり、凹みの周辺の白い沈澱物がJacalin処理により観察されなくなったと考えられる。
【0018】
実施例1
この実施例では、HCV患者のクリオグロブリン沈澱物に含まれる変性IgMとGalβ1-3GPとの複合体を測定することを目的とする。
Galβ1-3GPと親和性が確認されたJacalinをコーティングした酵素結合免疫収着検定法(以下「ELISA」という。)反応用プレートを以下の手順で作製した。
1.プレート(costar社製6穴丸底 高吸差能タイプ)各穴にコーティングバッファーで稀釈したJacalin Pure(EY社製)溶液(1μg/mL)を100μLずつ添加し2〜8℃で一晩放置する。
2.上記プレートを洗浄液(90mM リン酸緩衝液(NaCl,8.0g;Na2HPO4,1.15g;KH2PO4,0.2g;KCl,0.2g;Tween20,0.5g;DW,1L)、以下洗浄液は同様のものを使用した。)で3回洗浄し、イオン交換水で5倍に稀釈したブロッキング剤(日本油脂製N102ブロッキング剤)を各プレート穴へ150μL添加し、室温で2時間放置する。
3.上記プレートを洗浄液で3回洗浄し、水分を完全に除去する為2,500rpm、10分間遠心する。プレートシーラーを貼り付けて冷蔵庫で48時間以上静置して使用する。
【0019】
次に、健常者10名(表2のNo.1〜10)から血清を採取し、このプレートを用いて下記の手順でELISAによる検定を行った。
1.反応プレートを室温に戻し、洗浄液で3回洗浄後タッピングして水分を除去する。
2.上記プレートに37℃で保存した血清検体50μlを注入後4℃で2時間静置する。
3.冷洗浄液で3回洗浄後、抗体稀釈液(0.85%NaCl)で5,000倍に稀釈したHRP標識抗ヒトIgMウサギ抗体(ダコ社)100μLを各プレート穴へ添加し、ミキサーにかけ、4℃で1時間反応させる。
4.冷洗浄液で3回洗浄後、TMBZ発色試薬(クエン酸1水和物,12.80g/L;Na2HPO4,10.90g/L;H2O2,0.15ml/L;10mg/mlTMBZ,10ml/L)100μLを各プレート穴へ添加し、室温で30分間反応させる。
5.反応停止用リン酸溶液(リン酸,34mL;DW,500mL)100μLを各プレート穴に加え、反応を終了する。
6.プレートリーダーにかけて、450nmで測光し吸光度(Abs)を求める。
【0020】
実施例2
HCV患者15名(表2のNo.11〜25)から採取した血清を用いて、実施例1と同様の試験を行った。
実施例1(No.1〜10)と実施例2(No.11〜25)の結果を表2に示す。
なお、同時に同血清検体をHCV・EIA 2nd「アボット」キットで検査し、サンプルをHCV関連抗原と反応させた後の吸光度をカットオフ値の吸光度で割った値(C−IDX)を表2に示す。このキットはHCVコア抗原とHCV関連抗原を含み、サンプル中のHCV関連抗体の有無を検査する。
【0021】
【表2】
この表2から、HCV患者の吸光度(No.11〜25)は健常者のもの(No.1〜10)に比べて有意に低いことがわかる。
【0022】
JacalinはC型肝炎患者の変性したIgMとGalβ1−3GPとの複合体も健常者の正常IgM・Galβ1−3GP複合体も区別無く固相に結合する。図3に示すように、健常者の正常IgM・Galβ1−3GP複合体を担体に固定化したJacalinと結合させて検知することができる。
しかし、C型肝炎患者のIgMは参考例1で明らかなように健常者のIgMよりも分子量が数千大きく、健常者のものとは異なる変性IgMである。このような変性IgMからなる複合体は冷却すると凝集し、Jacalinと結合することができなくなってしまうものと考えられる。その結果、図4に示すように、ELISAによる検定による数値が低くなるものと考えられる。即ち、この値は、HCV感染(たぶんリンパ球への感染)に伴う変性IgM産生を示すものであると考えられる。即ち、本発明の方法は、C型肝炎患者の変性IgMを見積もる手段を与えるものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】健常者とC型肝炎の患者から得た6つのクリオ沈澱物のPAGEパターンを示す図である。レーン1は健常者のもの、レーン2〜6はHCV患者のものを示す。矢印はmu鎖バンドを示す。mu−0は通常のもの、mu−1とmu−2は異常のものを示す。
【図2】冷アガロースゲル上のC型肝炎の患者と健常者のクリオ沈澱物リングを示す図である。No.1とNo.4は健常者のもの、No.2とNo.3はHCV患者のもの、No.1とNo.2はJacalinで処理したもの、No.3とNo.4は無処理のものを示す。No.3の凹みの周辺にのみ白い沈澱物が観察された。
【図3】ELISA法により、健常者の正常IgM・Galβ1−3GP複合体を担体に固定化したJacalinと結合させて検知する方法(実施例1)の概略を示す図である。
【図4】ELISA法により、C型肝炎患者の変性IgM・Galβ1−3GP複合体を担体に固定化したJacalinと結合させて検知する方法(実施例2)の概略を示す図である。
【発明の属する技術分野】
この発明は、C型肝炎罹患検査の方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
C型肝炎ウイルス(HCV)に感染すると、慢性化しやすく、肝硬変を引き起こす確率が高い等の問題がある。このため、C型肝炎ウイルス感染が疑われている患者について、血液中にC型肝炎ウイルスが存在しているか否かを、短時間のうちに確認することができる検査技術は重要である。更に、C型肝炎ウイルスは、HCV感染患者の体内にて遊離状態及び/又は免疫複合体の状態で存在しているが、そのC型肝炎ウイルスが如何なる状態(すなわち、遊離状態あるいは免疫複合体の状態)で存在しているかについて知る適当な方法がなく、このような検査方法の完成が望まれていた。
【0003】
一方、クリオグロブリンは、低温で血清から沈澱する熱タンパク質であり、多くの骨髄腫や、リンパ増殖性疾患、自己免疫疾患及び感染性疾患などの広範な疾患において検出されている(例えば、非特許文献1参照。)。クリオグロブリン血症とC型肝炎との間の関係に関して報告がなされており(例えば、非特許文献2、3参照。)、クリオグロブリン中のHCV−RNAの存在が確認されている(例えば、非特許文献4参照。)。しかし従来法によるクリオグロブリンの確認には大量のHCV感染血清が必要であり、極めて少量のクリオグロブリンの沈澱を検出することは困難であった。
【0004】
発明者らは既にクリオグロブリンを検出する簡易な方法を開発して報告した(例えば、非特許文献5参照。)。この方法は冷却したアガロースゲルプレートを利用したゲル拡散法であり、10μl程度の少量のサンプルで行うことができる。この方法で得られるクリオグロブリンの沈澱リングは極めて明確であり、特にC型肝炎におけるクリオグロブリンの分析に有効である。更に、本発明者らは、この遊離ウイルス相分離検知技術をC型肝炎ウイルスの検査技術として用いる方法を開発した(特願2001-230946)。
【0005】
【非特許文献1】
厚生省新興・再興感染症研究事業「非A非B型肝炎の予防、疫学に関する研究、非A非B型肝炎の臨床的総合研究」平成11年度研究報告書、飯野四郎「C型慢性肝疾患におけるクリオグロブリン血症の検討」
【非特許文献2】
Casato M, et. al., Lancet 1991; 337; 1047-8
【非特許文献3】
Disdier P, et. al., Lancet 1991; 338: 1151-2
【非特許文献4】
Agnello V, et. al., N Engl J Med 1992; 327: 1490-5
【非特許文献5】
Okazaki T, et. al., C1inica1 Chemistry 1998; 44: 1558-1559
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡単な装置と煩雑でない操作にて、血清中のC型肝炎ウイルスの検査方法を提供することを目的とし、更に、C型肝炎ウイルスの感染者に特有の免疫複合体を特定し、これを見積もることのできる手段、即ちC型肝炎患者を見分ける効果的な方法を提供するものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意研究を進めた結果、C型肝炎患者のIgMが健常者のIgMとは異なる変性IgMであること、IgMがGalβ1−3GPと結合し複合体を形成すること、この複合体は特定のレクチンと結合すること、及びこの変性IgMとGalβ1−3GPとの複合体が低温下で凝集し、これが即ちクリオグロブリンであることなどの知見を得た。本発明者らは、このような知見から、C型肝炎ウイルスの感染者に特有の異常IgMから成る免疫複合体を見積もる方法、及びC型肝炎患者を見分ける方法を完成させた。なお、Galβ1−3GPとは、被検者血清試料中に存在するGalβ1−3GalNacの構造を糖鎖末端に持つ糖蛋白質のことである。
即ち、本発明は、Galβ1−3GPと親和性のレクチンを固定化した担体に被検者の血清検体を37℃未満の凍結しない寒冷状態で接触させる段階(第1段階)、37℃未満の凍結しない寒冷状態において、前段階で得た担体を冷洗浄した後、この担体にヒトIgMに対する酵素標識第二抗体を接触させる段階(第2段階)、及び前段階で得た担体を冷洗浄した後この担体に結合している標識を検知する段階(第3段階)から成るC型肝炎罹患検査方法である。
【0008】
【発明の実施の形態】
上記のように発明者らは、C型肝炎患者のIgMが健常者のIgMより分子量が正常のものより数千大きい変性IgMであることを見出した。その結果は後述の参考例1に示す。
IgMとGalβ1−3GPとは複合体を形成するが、健常者のIgMとGalβ1−3GPとの複合体は低温下でも凝集しないと考えられる。しかし、C型肝炎患者の変性IgMとGalβ1−3GPとの複合体は低温下で凝集し、これがクリオグロブリンであると考えられる。この凝集状態を寒天ゲル上で観察したことは既に報告した(非特許文献5)。
【0009】
一方、本発明者らは、IgMとGalβ1−3GPとから成る複合体が特定のレクチンと特異的に結合することを見出した。その結果は後述の参考例2に示す。レクチンは、動植物から抽出される糖鎖構造を持つ蛋白であり、凝集・沈降反応その他特異抗体反応に類似した現象をひき起こす。Galβ1−3GPと親和性のレクチンとしては、例えば、実施例で実証したヤシの実のレクチンであるJacalinが好ましい。Galβ1−3GPとの親和性は、例えば、後述の参考例2に記載の方法により知ることができる。
【0010】
レクチン(Jacalin)はC型肝炎患者の変性したIgMとGalβ1−3GPとの複合体も健常者の正常IgM・Galβ1−3GP複合体も区別無く固相に結合する。
しかるに、C型肝炎患者の変性IgMとGalβ1−3GPとの複合体であるクリオグロブリンは低温で凝集するため、本発明の方法のように、系内にレクチン(Jacalin)を置いても結合できなくなってしまうものと考えられる。従って、本発明の方法により、レクチン(Jacalin)と結合することのできない変性IgMとGalβ1−3GPから成る複合体の量を見積もることが可能になる。
【0011】
本発明のC型肝炎ウイルスの検査方法の第1段階と第2段階は、37℃未満の凍結しない寒冷状態で行うが、好ましくは1〜10℃、より好ましくは4℃付近であり、各段階で同じ温度である必要はない。
冷洗浄は、37℃未満、好ましくは1〜10℃で、通常は90mM リン酸緩衝液等を用いて洗浄を行う。
また、第3段階は低温である必要はなく通常は37℃で行う。
酵素標識第二抗体は、ヒトIgMに対する抗体であれば特に制限はないが、HRP標識ヒトIgMウサギ抗体等が一般に用いられる。
【0012】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
参考例1
ゲル上の沈澱物リングに含まれるクリオグロブリンの分析をポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を用いて行った。まず、低温で、クリオ沈澱物リングを切り出して、アガロースゲルに含まれるクリグロブリンを37℃でグリシンを含むDulbeccoリン酸緩衝液(pH7)に溶解する。この溶解液をTris-SDS-βME seprazol(第一化学社製)で処理し、0.025 M Tris-0.195 M グリシン緩衝液(pH8.6)を用いて40mAの一定電流で5〜15%ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動を60分間行った。電気泳動後、分画された免疫グロブリンをImmobilon PVDF 移転膜(第一化学社製)に1時間移転させ、この膜をスキムミルク(Block Ace、大日本製薬社製)でブロックした。これを抗μ鎖抗体(Dako A/S, Glostrup社製)と反応させ、次にPOD標識ウサギ抗体(Dako A/S, Glostrup社製)で着色した。その結果を図1に示す。
レーン1は健常者のもので、レーン2〜6はHCV患者のものである。HCV患者のもののうちクリオグロブリンの沈澱が多いものについては、健常者のものより数キロダルトン大きい異常mu画分が確認された。
即ち、この結果から、C型肝炎患者で異常なIgMが作られていることが確認された。これは、HCVがリンパ球に入り免疫機構に対して悪さをしている証拠ではないかと考えられる。
【0013】
参考例2
750mLの水に、組成物Aと組成物Bとを加え、充分に彊搾した後、沸騰湯浴中で溶解させた。
(1)組成物A:
NaCl 800mg
KCl 200mg
リン酸一水素ナトリウム 1150mg
リン酸二水素ナトリウム 200mg
(2)組成物B:
アジ化ナトリウム 0.75g
グリシン 56.25g
アガロース 4.50g
溶解に際しては、5分毎にスターラーで撹拝し、均一なアガロース溶液とになるようにした。
【0014】
アガロース溶液を溶解後直ちに直径30mmのプレートに注ぎ、室温で凝固させてアガロースゲルプレートを得る。このアガロースゲルプレートに直径5mmの凹み(ウェル)を7個程度形成し、これを冷蔵保存した。
C型肝炎ウイルスの感染者と健常者から所定の手段で採取した血清試料20μLを37℃に維持し、これを室温にて、アガロースゲルプレートの凹みへ注入した。その後20分間静置して、血清試料をゲルプレート内に染み込ませた。
【0015】
このゲルプレートを4℃附近に置き、12時間以上の時間をかけてインキュベートした。その結果を図2のNo.3(C型肝炎ウイルスの感染者)とNo.4(健常者)に示す。No.3でのみ、凹みの周辺に白い沈澱物リングが観察された。即ち、既報(非特許文献5)と同様に、変性IgMとGalβ1-3GPとの複合体が凹みの周辺に凝集沈澱したと考えられる。
【0016】
一方、上記血清試料にJacalin Pure(EY社製)を血清試料10μlあたり1μgとなるように加え、約2時間静置した後、参考例2のプレートの凹みに注入して、上記と同様の操作を行った。その結果をその結果を図2のNo.2(C型肝炎ウイルスの感染者)とNo.1(健常者)に示す。いずれにも凹みの周辺にも白い沈澱物リングは観察されなかった。
これらの結果を表1にまとめる。表中、凹みの周辺に白い沈澱物が観察されたものを+、観察されなかったものを−とした。
【0017】
【表1】
Jacalin処理のものを無処理のものと比べると、HCV患者の凹みの周辺の白い沈澱物がJacalin処理により観察されなくなった。
この結果から、HCV患者のクリオグロブリン沈澱物には変性IgMとGalβ1-3GPとの複合体が含まれるもの考えられる。しかし、Jacalinが複合体を形成するGalβ1-3GPと特異的に結合し、凹みの周辺に移動することが出来なくなり、凹みの周辺の白い沈澱物がJacalin処理により観察されなくなったと考えられる。
【0018】
実施例1
この実施例では、HCV患者のクリオグロブリン沈澱物に含まれる変性IgMとGalβ1-3GPとの複合体を測定することを目的とする。
Galβ1-3GPと親和性が確認されたJacalinをコーティングした酵素結合免疫収着検定法(以下「ELISA」という。)反応用プレートを以下の手順で作製した。
1.プレート(costar社製6穴丸底 高吸差能タイプ)各穴にコーティングバッファーで稀釈したJacalin Pure(EY社製)溶液(1μg/mL)を100μLずつ添加し2〜8℃で一晩放置する。
2.上記プレートを洗浄液(90mM リン酸緩衝液(NaCl,8.0g;Na2HPO4,1.15g;KH2PO4,0.2g;KCl,0.2g;Tween20,0.5g;DW,1L)、以下洗浄液は同様のものを使用した。)で3回洗浄し、イオン交換水で5倍に稀釈したブロッキング剤(日本油脂製N102ブロッキング剤)を各プレート穴へ150μL添加し、室温で2時間放置する。
3.上記プレートを洗浄液で3回洗浄し、水分を完全に除去する為2,500rpm、10分間遠心する。プレートシーラーを貼り付けて冷蔵庫で48時間以上静置して使用する。
【0019】
次に、健常者10名(表2のNo.1〜10)から血清を採取し、このプレートを用いて下記の手順でELISAによる検定を行った。
1.反応プレートを室温に戻し、洗浄液で3回洗浄後タッピングして水分を除去する。
2.上記プレートに37℃で保存した血清検体50μlを注入後4℃で2時間静置する。
3.冷洗浄液で3回洗浄後、抗体稀釈液(0.85%NaCl)で5,000倍に稀釈したHRP標識抗ヒトIgMウサギ抗体(ダコ社)100μLを各プレート穴へ添加し、ミキサーにかけ、4℃で1時間反応させる。
4.冷洗浄液で3回洗浄後、TMBZ発色試薬(クエン酸1水和物,12.80g/L;Na2HPO4,10.90g/L;H2O2,0.15ml/L;10mg/mlTMBZ,10ml/L)100μLを各プレート穴へ添加し、室温で30分間反応させる。
5.反応停止用リン酸溶液(リン酸,34mL;DW,500mL)100μLを各プレート穴に加え、反応を終了する。
6.プレートリーダーにかけて、450nmで測光し吸光度(Abs)を求める。
【0020】
実施例2
HCV患者15名(表2のNo.11〜25)から採取した血清を用いて、実施例1と同様の試験を行った。
実施例1(No.1〜10)と実施例2(No.11〜25)の結果を表2に示す。
なお、同時に同血清検体をHCV・EIA 2nd「アボット」キットで検査し、サンプルをHCV関連抗原と反応させた後の吸光度をカットオフ値の吸光度で割った値(C−IDX)を表2に示す。このキットはHCVコア抗原とHCV関連抗原を含み、サンプル中のHCV関連抗体の有無を検査する。
【0021】
【表2】
この表2から、HCV患者の吸光度(No.11〜25)は健常者のもの(No.1〜10)に比べて有意に低いことがわかる。
【0022】
JacalinはC型肝炎患者の変性したIgMとGalβ1−3GPとの複合体も健常者の正常IgM・Galβ1−3GP複合体も区別無く固相に結合する。図3に示すように、健常者の正常IgM・Galβ1−3GP複合体を担体に固定化したJacalinと結合させて検知することができる。
しかし、C型肝炎患者のIgMは参考例1で明らかなように健常者のIgMよりも分子量が数千大きく、健常者のものとは異なる変性IgMである。このような変性IgMからなる複合体は冷却すると凝集し、Jacalinと結合することができなくなってしまうものと考えられる。その結果、図4に示すように、ELISAによる検定による数値が低くなるものと考えられる。即ち、この値は、HCV感染(たぶんリンパ球への感染)に伴う変性IgM産生を示すものであると考えられる。即ち、本発明の方法は、C型肝炎患者の変性IgMを見積もる手段を与えるものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】健常者とC型肝炎の患者から得た6つのクリオ沈澱物のPAGEパターンを示す図である。レーン1は健常者のもの、レーン2〜6はHCV患者のものを示す。矢印はmu鎖バンドを示す。mu−0は通常のもの、mu−1とmu−2は異常のものを示す。
【図2】冷アガロースゲル上のC型肝炎の患者と健常者のクリオ沈澱物リングを示す図である。No.1とNo.4は健常者のもの、No.2とNo.3はHCV患者のもの、No.1とNo.2はJacalinで処理したもの、No.3とNo.4は無処理のものを示す。No.3の凹みの周辺にのみ白い沈澱物が観察された。
【図3】ELISA法により、健常者の正常IgM・Galβ1−3GP複合体を担体に固定化したJacalinと結合させて検知する方法(実施例1)の概略を示す図である。
【図4】ELISA法により、C型肝炎患者の変性IgM・Galβ1−3GP複合体を担体に固定化したJacalinと結合させて検知する方法(実施例2)の概略を示す図である。
Claims (4)
- Galβ1−3GPと親和性のレクチンを固定化した担体に被検者の血清検体を37℃未満の凍結しない寒冷状態で接触させる段階、37℃未満の凍結しない寒冷状態において、前段階で得た担体を冷洗浄した後、この担体にヒトIgMに対する酵素標識第二抗体を接触させる段階、及び前段階で得た担体を冷洗浄した後この担体に結合している標識を検知する段階から成るC型肝炎罹患検査方法。
- 前記レクチンがJacalinである請求項1に記載の方法。
- 前記寒冷状態が1〜10℃である請求項1又は2に記載の方法。
- 前記酵素標識第二抗体がHRP標識ヒトIgMウサギ抗体であり、450nmの吸光度で標識を感知する請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
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