CN109406789A - 一种膀胱癌循环细胞检测试剂盒及应用 - Google Patents
一种膀胱癌循环细胞检测试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明实施例公开了一种膀胱癌循环细胞检测试剂盒及应用。所述膀胱癌循环细胞检测试剂盒，包括偶联ABC71抗体的免疫磁珠；ABC71抗体为特异性抗人膀胱癌AG‑CD71的单克隆抗体。本发明实施例具有如下优点：1、本发明实施例提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒特异性强，使用简单方便，其采用的ABC71抗体能特异性识别尿液中人膀胱癌细胞及人膀胱癌组织，ABC71抗体与人膀胱癌组织呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织无交叉反应；2、本发明实施例提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒使用的原料简单易得，成本低廉，便于推广使用，制作方法简单，无三废污染产生，使用中不产生需要特殊处理的医疗垃圾。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫学技术领域，具体涉及一种膀胱癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及应用。
背景技术
膀胱癌是发生在膀胱粘膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。其发病率占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第二位。膀胱癌多数以浸润方式生长，首次治疗后复发率较高。
目前无确切可应用于监测膀胱癌的复发、进展与转移情况的临床血清标志物，膀胱癌诊断及随访主要依靠膀胱镜检，但是侵入性的尿道膀胱镜费用昂贵且操作不便，不仅给患者带来较大痛苦，还存在感染、出血等风险，而应用影像学检查并不能早期发现微小转移灶。
因此，急需一种能早期发现微转移灶的检测方法，以便更早发现膀胱癌的复发与转移,并据此制定有针对性的个体化治疗方案，从而降低膀胱癌的复发率,改善治疗效果及提高患者生存率。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种膀胱癌循环细胞检测试剂盒及应用，用以解决现有技术中膀胱癌微转移灶检测难的问题。
为实现上述目的，本发明实施例第一方面提供了一种膀胱癌循环细胞检测试剂盒，包括偶联ABC71抗体的免疫磁珠；ABC71抗体为特异性抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体。
在一种可能的实现方式中，抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体为鼠抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体。
在一种可能的实现方式中，所述偶联ABC71抗体的免疫磁珠通过以下方法制备得到：
取粒径为2～3um羧基磁性微球，加入到pH＝6.2的EDC/NHS-PBS溶液中进行反应，然后磁分离，在磁分离后的磁性微球中加入抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体，反应6小时，缓冲液洗涤，得到EDC偶联ABC71抗体的羧基磁性微球。
在一种可能的实现方式中，所述偶联ABC71抗体的免疫磁珠通过以下方法制备得到：
取粒径为2～3um氨基磁性微球，加入到pH＝6.2的EDC/NHS-PBS溶液中进行反应，然后磁分离，在磁分离后的磁性微球中加入抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体，反应6小时，缓冲液洗涤，得到EDC偶联ABC71抗体的氨基磁性微球。
在一种可能的实现方式中，所述膀胱癌循环细胞检测试剂盒还包括磁力架、染色液、缓冲液。
在一种可能的实现方式中，所述染色液为瑞氏-吉姆萨染色液。
在一种可能的实现方式中，所述偶联ABC71抗体的免疫磁珠盛放在第一容器中，所述磁力架盛放在第二容器中，所述染色液盛放在第三容器中，所述缓冲液盛放在第四容器中。
在一种可能的实现方式中，所述膀胱癌循环细胞检测试剂盒包括外壳，在所述外壳内设置有第一槽位、第二槽位、第三槽位、第四槽位；其中，第一容器放置在第一槽位中，第二容器放置在第二槽位中，第三容器放置在第三槽位中，第四容器放置在第四槽位中。
本发明实施例第二方面提供了第一方面所述的膀胱癌循环细胞检测试剂盒在制备用于检测膀胱癌的试剂中的用途。
在一种可能的实现方式中，所述用于检测膀胱癌的试剂为用于检测尿液或血液中的膀胱癌循环细胞的试剂。
本发明实施例具有如下优点：
1、本发明实施例提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒特异性强、使用简单方便，其采用的ABC71抗体能特异性识别尿液中人膀胱癌细胞及人膀胱癌组织，ABC71抗体与人膀胱癌组织呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织无交叉反应；
2、本发明实施例提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒使用的原料简单易得，成本低廉，便于推广使用，制作方法简单，无三废污染产生，使用中不产生需要特殊处理的医疗垃圾。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的偶联ABC71抗体的免疫磁珠的结构示意图。
图2为本发明实施例3提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒的结构示意图。
图中：1.磁性微球，2.EDC层2，3.ABC71抗体，4.第一槽位，5.第二槽位，6.第三槽位，7.第四槽位，8.盖子。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、右”、“中间”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
循环肿瘤细胞(circulating tumor cell)简称CTC，是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。在肿瘤发展过程中播散并存活于外周血中，与肿瘤的转移和预后密切相关。CTC检测通过捕捉检测外周血中恒量存在的CTC，监测CTC类型和数量变化的趋势，以便实时监测肿瘤动态、评估治疗效果，实现实时个体治疗。目前，对于循环肿瘤细胞的检测和分析比较困难，研究主要集中在寻找循环肿瘤细胞的特异性标志物并提高检测手段的敏感性和特异性。
尿液是膀胱癌理想的肿瘤标记物来源。寻找一种能够通过尿液来检测膀胱癌的高效、简便、快速、灵敏的诊断方法很有必要。
免疫磁珠细胞分选法可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞。其原理是细胞表面抗原与连接在磁珠上特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
实施例1
本实施例提供了一种偶联ABC71抗体的免疫磁珠及其制备方法，其中，ABC71抗体为特异性抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体。
本实施例提供的偶联ABC71抗体的免疫磁珠采用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)作为交联剂，将鼠抗人膀胱癌的单克隆抗体ABC71偶联于磁性微球上。本实施例提供的偶联ABC71抗体的免疫磁珠的结构如图1所示，磁性微球1外包覆EDC层2，ABC71抗体3固定在EDC层2上。
磁性微球可以为羧基磁性微球，也可以为氨基磁性微球。
当磁性微球为羧基磁性微球时，制备方法如下：
取一定量的2～3um羧基磁性微球，加入25ul EDC/NHS-PBS溶液(pH＝6.2)，室温下反应30min，磁分离，磁性微球中加入鼠抗人膀胱癌的单克隆抗体ABC71，室温下反应6h，用PBS溶液洗涤，制得EDC偶联ABC71抗体的羧基磁性微球。
当磁性微球为氨基磁性微球时，制备方法如下：
取一定量的2～3um氨基磁性微球，加入鼠抗人膀胱癌的单克隆抗体ABC71和25ulEDC/NHS-PBS溶液(pH＝6.2)，室温下反应3h，磁分离，用PBS溶液充分洗涤，制得EDC偶联ABC71抗体的氨基磁性微球。
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺交联剂。EDC/NHS-PBS溶液为使用PBS缓冲液配置的EDC/NHS溶液。PBS缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。
本发明实施例提供的偶联ABC71抗体的免疫磁珠特异性强，使用简单方便，其采用的ABC71抗体能特异性识别尿液中人膀胱癌细胞及人膀胱癌组织，ABC71抗体与人膀胱癌组织呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织无交叉反应；
本发明实施例提供的偶联ABC71抗体的免疫磁珠盒使用的原料简单易得，成本低廉，便于推广使用，制作方法简单，无三废污染产生，使用中不产生需要特殊处理的医疗垃圾。
实施例2
在本实施例中介绍ABC71抗体的制备方法。在本实施例中，ABC71抗体也可以称为ABC71单克隆抗体。
(1)杂交瘤细胞的制备
1)动物免疫及细胞培养：将人膀胱癌组织匀浆后提取总蛋白，免疫Balb/C小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，按每只小鼠50ug总蛋白的剂量进行腹腔免疫。每隔两周对小鼠再次免疫。小鼠血清效价达到要求后再加强免疫一次，3天后取小鼠脾脏制备成脾细胞悬液，准备进行细胞融合。复苏小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(ATCC CRL-1772)，并用8-AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选以维持细胞对HAT的敏感性。
2)细胞融合：将步骤1)制备好的脾细胞悬液与骨髓瘤细胞进行融合，具体方法参照《精编免疫学实验指南》((美国)J.E.科学根(美国)D.H.马古利斯等，科学出版社，2009年1月出版)。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞培养基中培养。24小时后，加HAT选择培养基(购自Sigma公司；HAT即H:Hypoxanthine次黄嘌呤，A:Aminopterin甲氨喋呤，T:Thymidine胸腺嘧啶核苷)进行选择性培养。
3)抗体检测：通过ELISA(酶联免疫吸附剂测定)方法确定分泌抗体的杂交瘤细胞株。具体方法是：提取膀胱癌组织总蛋白，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)4℃包被过夜，加入5％牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭3小时。PBST(磷酸盐吐温缓冲液)洗涤3次，然后再加入100ul待检上清，37℃孵育1h。洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗IgG-HRP(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，37℃孵育1h。洗涤3次，加入50ul TMB(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)显色5min后，加入50ul终止液。用酶标仪读取波长为450nm的OD值。OD值大于阴性对照OD值的2倍以上的视为阳性。
4)杂交瘤的克隆化和冻存：使用有限稀释法将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养。经过5轮的克隆化培养，筛选出高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养。
(2)ABC71单克隆抗体的制备和纯化
将上述分泌ABC71单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩大培养，并收集细胞培养上清。采用Protein G对ABC71单克隆抗体进行亲和层析纯化。步骤是：首先用磷酸盐缓冲液PBS平衡Protein G亲和层析柱(购自GE公司)；然后将含ABC71单克隆抗体的细胞培养上清通过Protein G亲和层析柱；随后用PBS洗涤层析柱，直到流出柱子的洗涤液的OD值接近零；使用0.2mol/L的甘氨酸-HCl溶液(PH2.8)洗脱Protein G亲和层析柱，收集洗脱液，测定OD值。含ABC71单克隆抗体的洗脱液经PBS透析后，于-20℃冻存。
本发明中的ABC71单克隆抗体的鉴定：
使用本发明制备的ABC71单克隆抗体对人膀胱癌组织和人正常膀胱组织切片进行免疫组化。结果表明，人膀胱癌组织经ABC71单克隆抗体免疫组化染色后呈现阳性反应，而人正常膀胱组织经ABC71单克隆抗体免疫组化染色后呈现阴性反应。本发明制备的ABC71单克隆抗体与人膀胱癌组织呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织无交叉反应。
表1免疫组化检测抗人膀胱癌ABC71单克隆抗体对人膀胱癌组织与正常膀胱组织的免疫反应。
表1
| 组织(癌组织和正常组织) | ABC71抗体 |
| 人膀胱癌组织(病人#1) | 强阳性(+++) |
| 人正常膀胱组织(病人#1) | 阴性(－) |
| 人膀胱癌组织(病人#2) | 强阳性(+++) |
| 人正常膀胱组织(病人#2) | 阴性(－) |
| 人膀胱癌组织(病人#3) | 强阳性(+++) |
| 人正常膀胱组织(病人#3) | 阴性(－) |
| 人膀胱癌组织(病人#4) | 阳性(++) |
| 人正常膀胱组织(病人#4) | 阴性(－) |
| 人膀胱癌组织(病人#5) | 强阳性(+++) |
| 人正常膀胱组织(病人#5) | 阴性(－) |
ABC71单克隆抗体的详细制备信息已公布于专利号2017106928722的专利申请文件中。
实施例3
本实施例提供了一种膀胱癌循环细胞检测试剂盒，如图2所示，其包括外壳，外壳的盖子8设置的外壳的上端，外壳内设置有第一槽位4、第二槽位5、第三槽位6、第四槽位7。
本实施例提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒，包括实施例1提供的偶联ABC71抗体的免疫磁珠、磁力架、染色液、缓冲液。
偶联ABC71抗体的免疫磁珠盛放在第一容器(未示出)中，所述磁力架盛放在第二容器(未示出)中，染色液盛放在第三容器(未示出)中，缓冲液盛放在第四容器(未示出)中。
所述染色液可以为瑞氏-吉姆萨染色液。
缓冲液可以为PBS缓冲液。
第一容器放置在第一槽位4中，第二容器放置在第二槽位5中，第三容器放置在第三槽位6中，第四容器放置在第四槽位7中。
本实施例提供的膀胱癌循环细胞(CTC)检测试剂盒特异性强，使用简单方便，其采用的ABC71抗体能特异性识别尿液中人膀胱癌细胞及人膀胱癌组织，ABC71抗体与人膀胱癌组织呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织无交叉反应；
本实施例提供的膀胱癌循环细胞(CTC)检测试剂盒使用的原料简单易得，成本低廉，便于推广使用，制作方法简单，无三废污染产生，使用中不产生需要特殊处理的医疗垃圾。
实施例4
本实施例提供了一种检测膀胱癌CTC的方法，包括如下步骤：
a.采集体液样本，体液可以为血液，也可以为尿液。
b.取实施例3提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒中的偶联ABC71抗体的免疫磁珠，加入到a采集的体液样本中，混合均匀，作用10～30min。
c.将b得到的混合液放到磁力架上，磁力架吸附免疫磁珠(连同膀胱癌细胞一起被吸附)。
d.瑞氏-吉姆萨染色，细胞病理判读膀胱癌循环细胞。
本实施例提供的检测膀胱癌CTC的方法特异性强，操作简单方便，其采用的ABC71抗体能特异性识别尿液中人膀胱癌细胞及人膀胱癌组织，ABC71抗体与人膀胱癌组织呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织无交叉反应。
实施例5
在本实施例对实施例3提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒的效果进行研究。
a.采集膀胱癌患者的血液样本和尿液样本。
b.取实施例3提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒中的偶联ABC71抗体的免疫磁珠，加入到a采集的血液样本或尿液样本中，混合均匀，作用10～30min。
c.将b得到的混合液放到磁力架上，磁力架吸附免疫磁珠(连同膀胱癌细胞一起被吸附)。
d.瑞氏-吉姆萨染色，细胞病理判读膀胱癌循环细胞。
本实施例提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒特异性强，使用简单方便，其采用的ABC71抗体能特异性识别尿液中人膀胱癌细胞及人膀胱癌组织，ABC71抗体与人膀胱癌组织呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织无交叉反应；
本实施例提供的膀胱癌循环细胞检测试剂盒使用的原料简单易得，成本低廉，便于推广使用，制作方法简单，无三废污染产生，使用中不产生需要特殊处理的医疗垃圾。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种膀胱癌循环细胞检测试剂盒，其特征在于，包括偶联ABC71抗体的免疫磁珠；
ABC71抗体为特异性抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的膀胱癌循环细胞检测试剂盒，其特征在于，抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体为鼠抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的膀胱癌循环细胞检测试剂盒，其特征在于，所述偶联ABC71抗体的免疫磁珠通过以下方法制备得到：
取粒径为2～3um羧基磁性微球，加入到pH＝6.2的EDC/NHS-PBS溶液中进行反应，然后磁分离，在磁分离后的磁性微球中加入抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体，反应6小时，缓冲液洗涤，得到EDC偶联ABC71抗体的羧基磁性微球。
4.根据权利要求1所述的膀胱癌循环细胞检测试剂盒，其特征在于，所述偶联ABC71抗体的免疫磁珠通过以下方法制备得到：
取粒径为2～3um氨基磁性微球，加入到pH＝6.2的EDC/NHS-PBS溶液中进行反应，然后磁分离，在磁分离后的磁性微球中加入抗人膀胱癌AG-CD71的单克隆抗体，反应6小时，缓冲液洗涤，得到EDC偶联ABC71抗体的氨基磁性微球。
5.根据权利要求1所述的膀胱癌循环细胞检测试剂盒，其特征在于，所述膀胱癌循环细胞检测试剂盒还包括磁力架、染色液、缓冲液。
6.根据权利要求5所述的膀胱癌循环细胞检测试剂盒，其特征在于，所述染色液为瑞氏-吉姆萨染色液。
7.根据权利要求6所述的膀胱癌循环细胞检测试剂盒，其特征在于，所述偶联ABC71抗体的免疫磁珠盛放在第一容器中，所述磁力架盛放在第二容器中，所述染色液盛放在第三容器中，所述缓冲液盛放在第四容器中。
8.根据权利要求7所述的膀胱癌循环细胞检测试剂盒，其特征在于，所述膀胱癌循环细胞检测试剂盒包括外壳，在所述外壳内设置有第一槽位、第二槽位、第三槽位、第四槽位；其中，第一容器放置在第一槽位中，第二容器放置在第二槽位中，第三容器放置在第三槽位中，第四容器放置在第四槽位中。
9.权利要求1-8任一项所述的膀胱癌循环细胞检测试剂盒在制备用于检测膀胱癌的试剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的膀胱癌循环细胞检测试剂盒在制备用于检测膀胱癌的试剂中的用途，其特征在于，所述用于检测膀胱癌的试剂为用于检测尿液或血液中的膀胱癌循环细胞的试剂。
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