CN102659929B - Trpc6抗原多肽和抗trpc6的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的单克隆抗体。该TRPC6抗原多肽由15个氨基酸组成，具体序列如SEQIDNO:1所示。以前述蛋白分子为抗原，免疫小鼠，制备筛选得到一株杂交瘤细胞株H8，于2012年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-C201236。该细胞株能够持续稳定地分泌抗TRPC6的单克隆抗体。该单克隆抗体能够特异性识别各种组织细胞表达的TRPC6蛋白，可用于ELISA方法的建立，借以监测与TRPC6分子相关的疾病，因此可以用于制备诊断与TRPC6分子相关疾病药物。

Description

TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的单克隆抗体。

背景技术

TRPC6（瞬时受体电位阳离子通道6）蛋白是重要的足细胞膜蛋白之一，其基因突变产物可导致大量蛋白尿，从而引起局灶节段性肾小球硬化（FSGS）和进行性肾衰竭。有研究发现在人类非遗传性蛋白尿性肾脏疾病如FSGS、微小病变性肾病和膜性肾病患者中，TRPC6表达显著增加，并且成群分布，有节段性密集型。FSGS是一种常见的肾小球疾病，人群发生率约为百万分之二，其临床特征为大量蛋白尿、肾病综合征和进行性肾功能不全。FSGS约占激素耐药性肾病综合征儿童的7~15%，占成人激素耐药性肾病综合征的15~20%。

FSGS是一种病理学诊断，其依据是光学显微镜下所描述的一种仅累及部分肾小球(局灶)的部分节段性血管袢的瘢痕形成模式(硬化)。该硬化可发生于多种情况，仅以光学显微镜下病理形态学特征命名的FSGS在临床诊断治疗方面均表现出极大的异质性。由于免疫病理检查可能因穿刺时未取到局灶性的硬化肾小球，或因病理切片制作数目过少而未观察到节段性的硬化病灶，从而会导致FSGS的漏诊。

目前用于检测TRPC6的均为多克隆抗体，在应用中非特异性结合因素多，难于评价和分析结果，而TRPC6单克隆抗体的制备可以克服这些局限性。此外，有关各组织TRPC6表达的测定多以mRNA检测为主，没有在蛋白水平上分析，利用TRPC6单克隆抗体构建体外免疫学技术方法，测定蛋白水平的表达，更有利于疾病的分析与病情愈后监测。

抗人TRPC6多肽单克隆抗体制备是采用淋巴细胞杂交瘤技术，该技术的基础是细胞融合。骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合后，可形成能分泌针对单一抗原表位的均质的高特异性的抗体，即单克隆抗体。由于骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞不能在体外增殖，因此将两种细胞融合后既具有肿瘤细胞无限增殖特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外增殖的缺点，融合的细胞被称为淋巴细胞杂交瘤。

为了能建立简便乙型的检测方法对FSGS进行诊断，首先需要筛选合适的TRPC6多肽序列，获得良好的免疫原，但目前并没有免疫原性好且特异性高的抗原多肽。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种TRPC6抗原多肽。

本发明的另一目的是提供一株能分泌抗上述TRPC6抗原多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的又一目的是提供上述TRPC6抗原多肽的单克隆抗体。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

为了能建立简便易行的检测方法对FSGS进行诊断，首先筛选合适的TRPC6多肽序列，获得良好的免疫原，便可以制备抗TRPC6的单克隆抗体。基于单克隆抗体的优势可用于免疫学方法的构建，可特异性的用于FSGS过程中TRPC6蛋白表达的测定。具体技术方案如下：

一种TRPC6抗原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。TRPC6蛋白共有931个氨基酸，经过对其进行穿膜区域、保守区域等多方面的研究，最终筛选确定15个氨基酸序列即KDLTKVTLGDNVKYY，作为抗原多肽，既避开了穿膜结构，又具有高度的保守性（在人、大鼠和小鼠中均有）。

一株杂交瘤细胞株H8，是由上述TRPC6抗原多肽作为抗原制备得到，能够分泌抗TRPC6的单克隆抗体，于2012年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC-C201236。

一种抗TRPC6的单克隆抗体，是由上述杂交瘤细胞株分泌得到的。

该抗TRPC6的单克隆抗体的制备方法如下：

（1）TRPC6抗原多肽合成，与KLH（keyhole limpet hemocyanin，血蓝蛋白）欧联后免疫小鼠；

（2）杂交瘤细胞株制备与筛选：取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，培养，然后用常规间接ELISA检测技术筛选，建立杂交瘤细胞株；

（3）单抗的纯化及鉴定：对所得杂交瘤细胞株分泌的单抗进行纯化，可以采用辛酸-硫酸铵沉淀法或离子交换层析法纯化，SDS-PAGE电泳分析纯化结果，经鉴定最终得到抗TRPC6的单克隆抗体。

上述抗TRPC6的单克隆抗体可作为体外免疫诊断试剂用于检测与TRPC6分子表达相关疾病，如局灶性节段性肾小球硬化等。也可以用于TRPC6蛋白过表达的组织及疾病监测，或经改造人源化后与药物偶联进行免疫靶向治疗。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1. 分析特性表明，本发明的TRPC6抗原多肽的抗原指数预测1.034，表露性预测值1.000，柔韧性预测值1.008，β-转角预测值1.022。其中作为免疫原最重要的参数为抗原指数，其预测值与网上检索的序列EKLSMEPNQEETN（SEEQ ID NO:2，抗原指数预测：0.928）比较有优势，免疫效果较佳，检测小鼠血清抗体效价1:12800，达到制备单克隆抗体的要求。

2. 本发明的杂交瘤细胞株可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变就可以无限量的生产抗体，适合持续性研究及进一步的产业化。

3. 本发明的抗TRPC6的单克隆抗体，同已有的多克隆抗体相比，具有以下优点：①免疫用的抗原可以不纯，但可获得大量高度特异的、均一的抗体。理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制。②由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如 ELISA技术、胶体金技术等。③由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，经改造人源化后与药物偶联可免疫导向治疗，此外也可用于放射免疫诊断等。

同类产品是多克隆抗体，其缺点是抗体类型不均一，在应用检测中非特异性结合因素多，难以判断和分析结果。经初步建立的测定方案1检测大鼠脑蛋白的TRPC6蛋白表达，测定结果的OD值为0.9，可测定总蛋白含量为2.5μg/mL，同样多抗测定结果的OD值为0.4，可测定总蛋白含量为10μg/mL水平，可见二者的敏感度不同，采用双单抗建立的酶标方法敏感，而换成多抗敏感度降低，并且有非特异因素。

本发明的抗TRPC6的单克隆抗体可特异性识别各种组织细胞表达的TRPC6蛋白，该单克隆抗体可用于ELISA方法的建立，借以监测与TRPC6分子表达相关的组织和疾病。

附图说明

图1. 蛋白软件RPC6合成肽序列图谱。

具体实施方式

以下结合实施例进一步解释本发明，除作特殊说明外，均为本领域常规实验技术手段。

实施例1 TRPC6抗原多肽设计

（1）TRPC6合成肽段的序列筛选

以TRPC6蛋白为研究对象，在TRPC6分子上寻找一段序列，不能太长，15个氨基酸左右，必须是保守区内，在不同种属间不变；并确定是胞内还是包外段（TRPC6分子复杂，有6次跨膜结构）；比对种属间的同源性（NCBI中的protein blast）；同时要考虑其他蛋白是否也有此序列，用于鉴定诊断的抗体最好此段序列在同一家族的其他分子中没有才具有特异性，否则易发生交叉反应，不能作为体外诊断试剂的应用。

（2）TRPC6合成肽段抗原表位及亲水性等分析

选择的序列作为TRPC6合成肽段进行抗原表位等特性预测，应按照以下几点要求设计：亲水性、表露性、柔韧性、免疫原性及结构分析，应用IEDB分析方法（immune epitope database,IEDB），同时通过蛋白质软件（Lasergene710WinInstall）以及protein blast分析确定，并与已知的制备抗体的序列（TRPC6多克隆抗体）比较。经过上述几项分析，所筛选的肽段亲水性较好，且在1.9~2.9之间，相对比较均匀；从抗原性预测分析该序列抗原性各段均较好，在0.998~1.071之间；再进一步应用蛋白软件进行序列特性分析，该序列的α-螺旋、β-转角、亲水性以及抗原指数上均符合以上IEDB分析结果，尤其抗原指数优势显著，结果见图1。

通过以上系列性分析，最终获得一段符合要求的序列，即KDLTKVTLGDNVKYY（SEQ ID NO:1）。

实施例2 制备抗TRPC6的单克隆抗体

（1）抗原肽合成与动物免疫

根据实施例1设计的抗原多肽，该多肽与KHL偶联，免疫BALB/c健康小鼠，鼠龄在6～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。采用多点免疫，二、三次免疫后采用间接ELISA法测定小鼠血清效价，选择免疫效价高者进行加强免疫后准备细胞融合。

（2）骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备

选择小鼠骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞株（购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）用10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，细胞在培养液中呈半贴壁状态，每3~5天传代一次，传代时用吸管轻轻吹下瓶壁上的细胞，再转入新的培养液即可，一瓶细胞可分2~3瓶，传代3代后收集细胞，计算细胞数量，以备细胞融合使用。选用8周左右的Balb/c小鼠，制备脾细胞悬液，作为饲养细胞备用。

（3）细胞融合

细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。取加强免疫三天后的小鼠，首先眼球放血，收集血清可用于阳性对照。然后拉颈处死取小鼠脾细胞方法同饲养细胞，获得免疫小鼠脾细胞悬液，计算活细胞数量(5x10⁷ /只)。脾细胞与骨髓瘤细胞为5:1比例，在PEG作用下融合，分别加入96孔培养板，4-5板，常规选择HAT、HT培养基培养，观察生长情况，当细胞克隆长满覆盖大于10％孔底时测定上清中单抗分泌阳性者为保留阳性孔，将进一步经过有限稀释法进行亚克隆筛选。

（4）有限稀释法

筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续生长。融合细胞克隆后经有限稀释后（一般稀释至0.8个细胞/孔），按Poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。同样是细胞培养至覆盖大于10％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。经过三次亚克隆话筛选，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。

经过反复冻存和复苏的杂交瘤细胞系，经染色体分析稳定，抗体检测保持阳性的细胞系进行建株并命名（H8），同时送武汉大学保藏中心保藏，保藏号为CCTCC-C201236。

（5）单克隆抗体的制备、冻存及建株

单克隆抗体的制备包括体外制备和体内腹水制备。体外细胞培养应采用无血清培养法；体内普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞株H8接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10mL的腹水。

（6）腹水制备及单抗的纯化、鉴定：

采用小鼠腹水瘤方法制备腹水，收集腹水，共进行三次实验，得到的单抗分别编号为H8-1、H8-2和H8-3。三批单抗用正辛酸-硫酸铵法纯化，SDS-PAGE电泳鉴定重链和轻链；同时采用ELISA法分析抗体的类型及其亚类。纯化结果见表1。

表1  腹水纯化前后效价比较

（注：以上阴性对照OD值为0.16±0.002，*表示P值<0.05，SPSS19.0统计处理。）

 实施例3 单抗在TRPC6分子过表达组织中检测的应用

（1）单抗在免疫标记技术中的应用

采用辣根过氧化酶标记单克隆抗体，构建双抗体夹心法。标记方法为高碘酸钠法，标

记的酶标抗体活性良好，工作浓度为2.5μg/mL，可作为酶标抗体用于酶联免疫吸附试验。

（2）单抗配对实验

经交叉配对实验后，得到最佳配对方案为H8-1作为包被一抗，夹心上层为酶标H8-2，可见单抗H8-1和单抗H8-2为抗原表位不同位点的单抗。其他配对OD值结果较低，筛选原则为OD值近1.0 的为最佳，由此可见，该抗体配对方案为首选。结果量化指标包被量为5.0μg/mL，酶标抗体量为2.5μg/ mL(参考文献：李萍,马亚茹,陆俭等.Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立.细胞与分子免疫学杂志,2011,27(12):1330-1334.)

（3）在检测大鼠脑蛋白中TRPC6的应用

以上方法可用于TRPC6过表达组织的测定。由于正常大鼠脑蛋白是较早前研究所认为的TRPC6表达量最高的组织，首先使用单抗进行测定。提取大鼠脑组织总蛋白，定量为13.21 μg/mL，然后测定，OD值为1.0～1.26，以正常小鼠血清为阴性对照，OD值为0.26，有统计学意义，p<0.05。

表2 测定大鼠脑蛋白TRPC6的结果

（注：脑蛋白浓度指的是提取的大鼠总蛋白浓度；阴性对照为正常小鼠血清）

注明：方案1：包被H8-1（2.5μg/ mL），酶标H8-2（2.5μg/ mL），其他步骤按照常规ELISA操作；方案2：包被H8-1（5μg/ mL），比方案1包被量提高一倍，其他步骤按照常规ELISA操作。

以上结果为进一步验证双抗体夹心ELISA法增加了可行性，同时也将为今后的进一步测定应用提供实验数据。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  广东药学院

 

<120>  TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的单克隆抗体

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

 

Lys Asp Leu Thr Lys Val Thr Leu Gly Asp Asn Val Lys Tyr Tyr

1               5                   10                  15 

 

 

<210>  2

<211>  13

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  2

 

Glu Lys Leu Ser Met Glu Pro Asn Gln Glu Glu Thr Asn

1               5                   10             

 

 

Claims (1)

1.一株杂交瘤细胞株H8，其特征在于由TRPC6抗原多肽作为抗原制备得到，能够分泌抗TRPC6的单克隆抗体，于2012年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-C201236。