CN110218703A - 一种抗原特异性b细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用 - Google Patents
一种抗原特异性b细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种单克降抗体的制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：步骤一，B细胞的获取、富集及纯化；步骤二，抗原特异性B细胞的获取；步骤三，将上述抗原特异性B细胞永生化细胞系；步骤四，一步法检测永生化细胞系阳性克隆；本发明提供了一种单克隆抗体的方法，该方法能获得抗原特异性B细胞以制备杂交瘤，减少了非抗原特异性细胞的干扰，大大改进传统方法的成功率，准确率；另外本发明采用一步法筛选阳性克隆株，比传统ELISA方法快速简便。
Description
技术领域
本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种抗原特异性B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用。
背景技术
抗体是机体在受抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规额抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中的其他蛋白成分一般抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体 (polyclonal antibody)。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大使它在免疫化学相关诊断试剂研发中带来许多麻烦。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限的快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody)。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
目前，大多数的实验室制备抗体大多采用的是单克隆抗体技术，即用预定抗原免疫正常的Balb/c小鼠，用免疫小鼠的脾脏细胞和体外培养的无限制的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。利用ELISA技术筛选能够稳定分泌抗预定抗原的抗体的细胞株，最终将获得的细胞株通过体外培养或者诱生小鼠产生腹水得到需要的单克隆抗体。其中在筛选的过程中，得到产物的针对性就最终决定了得到的目标单克隆抗体是否可以有效的使用。一般实验室采用的筛选方法是：用预定免疫的抗原包被ELISA板条，4℃过夜后加入封闭液，4℃过夜，洗板。在ELISA板条中加入细胞培养上清，反应1.5小时后洗板，然后加入酶标二抗，经过显色和终止，通过450nm和630nm吸光值筛选得到具有稳定分泌所需抗体的克隆株细胞，因此，筛选克隆化在单克隆抗体的生产过程中直接导致了最终产物的针对性和有效使用率。
传统的ELISA筛选阳性克隆株的方法虽然被广泛的应用，但是，在实际的操作过程中，浪费了大量筛选的时间和原材料，最终产物的有效利用率偏低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：杂交瘤细胞的制备过程中对融合细胞株检测费时费力、成功率不高。
本发明涉及两个方面，具体而言，涉及一种抗原特异性B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用。
步骤一，B细胞的获取、富集及纯化：将免疫后小鼠脾细胞分离剪碎研磨，过200目筛网，采用密度梯度离心纯化；
步骤二，抗原特异性B细胞的获取，将以荧光或生物素标记的蛋白与步骤一中的B细胞进行特异性结合，随后用SA-Bead分选与蛋白特异性结合的细胞；
步骤三，将上述抗原特异性B细胞永生化细胞系：将步骤二中分离出的抗原特异性B 细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，获得永生化的细胞系；
步骤四，一步法检测永生化细胞系阳性克隆：采用磁珠标记的抗原和荧光标记的二抗检测永生化的细胞系，实时检测。
第二方面本发明涉及上述单克隆抗体在特异性降钙素原方面的应用，比如制备降钙素原配对抗体，用于临床诊断。
与现有技术相比，本发明的主要优势如下：首先，本发明采用生物素标记的抗原分离抗原特异性的B细胞，随后经磁珠分离，去除了大量非抗原特异性的B细胞和脾内其他细胞，实现了对抗原特异性B细胞的富集，提高了融合效率，减少了筛选的工作量。其次，本发明采用一步法代替传统ELISA检测永生化细胞系阳性克隆，简便快速。
附图说明
图1是具体实施方案中单克隆抗体配对结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
降钙素原(procalcitonin)，PCT是二十世纪九十年代才发现的细菌、真菌性感染的特异性标志物，是一种无激素活性的降钙素前肽，由116个氨基酸组成，分子量大约为13KD。它可以在酶的作用下逐步裂解成57个氨基酸的氨基降钙素原(N-PCT)、32个氨基酸的降钙素(calcitonin，CT)和21个氨基酸的降钙蛋白。降钙素原是11号染色体上降钙素I基因(CALC) 的表达产物。在不存在感染的情况下，甲状腺外CALC-I表达被抑制，而主要局限于甲状腺和肺的神经内分泌细胞一定程度的表达；细菌感染诱导全身各种组织多种细胞类型的CALC-I 表达和降钙素原连续性释放。近年来研究表明在严重全身性细菌、真菌、寄生虫、急性疟疾感染、全身性炎症反应综合症(SIRS)、多器官功能衰竭综合征(MODS)的诊断方面，降钙素原是一个具有高灵敏度、特异性的新指标。
用重组降钙素原(PCT)免疫Balb/c小鼠，取出效价高的的小鼠脾脏的B细胞，密度梯度离心分离后与生物素标记的降钙素原4℃旋转孵育，随后与磁珠分离出抗原特异性B细胞后与，。HGPRT-/TK-(次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶缺陷)、不分泌抗体的骨髓瘤细胞融合，用 HAT培养基筛选出杂交瘤，一步法检测阳性克隆，再经有限稀释法克隆抗体分泌阳性杂交瘤，在动物体内生产单克隆抗体。最后在体外通过化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)和病人血清等完成对抗体株的鉴定工作。
取PCT免疫后效价较高的小鼠脾脏，无菌分离剪碎、研磨过200目筛网，PBS洗两遍，Percoll分离液(密度1.0777g/ml)25*2000rmp/min，由上而下取第三层淋巴细胞，PBS洗两遍。与生物素标记的降钙素原4℃旋转孵育30min。
将上述孵育好的细胞与磁珠4℃旋转孵育15min，磁力架分离PCT特异性B细胞，并计数。
骨髓瘤细胞的准备：于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养，融合当天将细胞从皿里轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内，1000r/min离心6分钟，弃去上清，加入20ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于20ml不完全培养基，混匀计数待用。
在50ml离心管中将PCT特异性B细胞和Sp2/0按1∶5比例混合，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。1000r/min离心6分钟，上清尽量除净，洗涤2次。在1min之内加入0.6mlPEG，边加边搅拌，37℃水浴1min，后在1min内加入1ml RPMI1640培养基，轻轻搅拌，2min内加入5ml，2min内加入10ml。1000rpm离心10min，去上清。加入20mlHAT培养基，混匀细胞，加入到昨日铺有滋养细胞的384孔板中，50ul/孔，置37℃二氧化碳培养箱中培养。第4天HAT培养液半量换一次，第5天换HAT培养液一次。
第6天加含生物素标记的PCT和SA-Bcads培养液，孵育一小时，加入goat F(ab)2anti-rat Fcγ fragment-specific FITC conjugate二抗，使用Operetta高内涵细胞筛选仪器筛选阳性克隆。
挑选阳性克隆采用有限稀释法进行第2、3次克隆化，当所有单细胞集落的培养孔抗体检测阳性，且反应程度基本一致时停止克隆。挑选形态良好，抗体活性较高的细胞克隆进行扩大培养。
杂交瘤细胞的冻存：收集PCT细胞于离心管中，将上述细胞悬液离心1000rpm，5min。去上清，加入预冷的冻存液悬起细胞，按照2-3×106个细胞/ml冻存液加入细胞冻存管中，将加有细胞的冻存管置入-70℃冰箱过夜，最后转入液氮长期保存。
单抗腹水制备：选用6-8周Balb/c小鼠，用500ul石蜡油腹腔致敏，3-5天后小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射量为2-5×106个/只，10-14天左右腹水诱生后采集腹水，4℃离心，9000rmp，30min。取上清ProteinG纯化抗体，加入适量甘油混匀放置-20℃冰箱备用。
辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体：采用改良过碘酸钠法。重悬5mgHRP于1.2ml 三蒸水中，加入0.1M高点酸钠(溶于10mMpH7.0PB)0.3ml，室温避光氧化25min；加入0.16M 乙二醇(0.1ml/ml HRP)终止反应；对pH4.4醋酸钠缓冲液透析过夜，期间更换透析液3次，加入欲标记的抗体(4株)5mg，再用Ph9.5碳酸盐缓冲液透析，在避光条件下搅拌4h；加入新鲜配制的6mg/ml NaBH4溶液约100ul，混匀，4℃反应2h；标记后的酶标抗体用50％饱和硫酸铵沉淀，4℃离心，9000rmp，30min。加等体积甘油，-20℃保存备用。
单抗酶结合物活性测定：以直接ELISA法检测。即以PCT包被酶标反应板(包被浓度2μg/ml)，封闭后加入系列稀释的单抗酶标物，每孔100μl，37℃反应60min后加入TMB底物显色液，反应10-1min后用2M H2SO4终止反应，测OD450/570值。
包被抗体与酶标抗体的配对实验：分别比较不同包被浓度、不同包被抗体和不同工作浓度酶标记抗体配对时检测PCT的灵敏度。实验证明用(3株)抗体包被(包被液0.02MpH7.0PB，每孔100μl，4℃过夜)，标记辣根过氧化物酶的(3株)单抗联合使用作为检测抗体时，检测灵敏度最高达到0.001pg/ml。
病样鉴定抗体
1.包被：把上述配对好的抗体A稀释至10μg/ml，100μl/孔加至发光板，4℃过夜；
2.洗板机洗板3次，每次每孔注洗液350μl，停留15秒最后拍干；
3.封闭：用洗涤液洗去包被液，用封闭液封闭，每孔200μl，37℃放置2h；
4.洗板机洗板3次，每次每孔注洗液350μl，停留15秒最后拍干；
5.加样品：将已知的高、中、低病人血清加入包被好的发光板，50μl/孔，37℃放置1h. (同时做阴性对照孔和阳性对照孔)；
6.洗板机洗板3次，每次每孔注洗液350μl，停留15秒最后拍干；
7.加酶标二抗：将B-HRP抗体按比例1∶1000稀释，100μl/孔，37℃放置1h；
8.洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μl，停留15秒最后拍干；
9.加发光液：即用即配，100μl/孔；
10.化学发光仪读数；
经上述双抗体夹心法检测结果显示，可以实现病人血样的检测，可以用于试剂盒的组装。除了双抗体夹心法，此抗体原料还可以用于其他检测方法的应用。
以上实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下对本发明方法、步骤或条件所做的修改和替换，均属于本发明的范围。
Claims (5)
1.一种抗原特异性B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，B细胞的获取、富集及纯化：将免疫后小鼠脾细胞分离剪碎研磨，过200目筛网，采用密度梯度离心纯化。
步骤二，抗原特异性B细胞的获取，将以荧光或生物素标记的蛋白与步骤一中的B细胞进行特异性结合，随后用SA-Bead分选与蛋白特异性结合的细胞。
步骤三，将上述抗原特异性B细胞永生化细胞系：将步骤二中分离出的抗原特异性B细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，获得永生化的细胞系。
步骤四，一步法检测永生化细胞系阳性克隆：采用磁珠标记的抗原和荧光标记的二抗检测永生化的细胞系，实时检测。
2.如权利要求1，所述的一种抗原特异性B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备，其特征在于，所述密度梯度离心使用的是Percoll分离液，密度1.0777g/ml。
3.如权利要求1所述的一种抗原特异性B细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备，其特征在于，所述抗原特异性B细胞的获取，采用生物素标记的蛋白与步骤一中的B细胞进行特异性结合，随后用SA-Bead分选与蛋白特异性结合的细胞。
4.如权利要求1所述的一步法检测永生化细胞系阳性克隆：采用磁珠标记的抗原和荧光标记的二抗检测永生化的细胞系，实时检测。
5.权利要求1-4任一项所述制备方法获得的单克隆抗体在制备临床诊断型抗体中的应用。
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