RU169868U1 - Тест-система для иммунохроматографического определения прокальцитонина в образцах цельной крови, сыворотке или плазме с целью экспресс-диагностики сепсиса - Google Patents

Abstract

Полезная модель относится к устройствам для иммунохроматографического определения прокальцитонина в образцах для экспресс-диагностики сепсиса и может быть использована в иммунологии. Техническим результатом является повышение специфичности и чувствительности тест-системы и обеспечение возможности анализа образцов цельной крови. Тест содержит планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой расположена подложка, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены с сохранением капиллярной проводимости подушка для нанесения образца и конъюгата, фильтрационная подушка, пористая хроматографическая мембрана и абсорбционная подушка. В теле подушки для нанесения образца и конъюгата сформирована поперечная полоса из сухих частиц конъюгата коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами, специфичными к прокальцитонину, а в теле хроматографической мембраны, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая сухие адсорбированные частицы антикальцитониновых антител, специфичных к кальцитонину и контрольная полоса, содержащая сухие адсорбированные частицы моноспецифичных поликлональных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши (RAM). В конъюгате частицы коллоидного золота имеют размер 40-50 нм, а связанные с ними моноклональные мышиные антитела, специфичные к прокальцитонину, приготовлены в виде смеси первых моноклональных мышиных антител, специфичных к катакальцину, и вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к N-концевому фрагменту прокальцитонина, взятых в соотношении 1:1. Антитела тестовой полосы выполнены в виде третьих моноклональных мышиных антител, специфичных к кальцитонину. 3 табл., 2 ил.

Description

Полезная модель относится к устройствам для иммунохроматографического определения прокальцитонина в образцах цельной крови, сыворотке или плазме для экспресс-диагностики сепсиса и может быть использована в здравоохранении, биотехнологии и иммунологии.

Тест-система «ПрокальцитонинТест» для иммунохроматографического выявления прокальцитонина в сыворотке (плазме) или цельной крови человека - одностадийный тест, предназначенный для выявления прокальцитонина иммунохроматографическим методом in vitro. Тест предназначен для профессионального использования и служит вспомогательным средством для диагностики и контроля лечения тяжелых бактериальных инфекций и сепсиса. Стрип-диагностика - современное и интенсивно развивающееся направление быстрой бесприборной качественной или полуколичественной диагностики разнообразных заболеваний человека по анализу биологических жидкостей. Анализ основан на новейших методиках иммунохроматографии и сухой цветной химии.

Прокальцитонин (ПКТ) аминокислотный полипептид с молекулярной массой 12795 Д. В норме синтез ПКТ осуществляется в С-клетках щитовидной железы. У здоровых людей (старше 5 дней) концентрация ПКТ в плазме составляет менее 0,1 нг/мл. Период полувыведения ПКТ в плазме в норме составляет 25-30 часов, а у пациентов с тяжелыми нарушениями функции почек-30-45 часов. Вирусные инфекции, местные инфекции, аллергические состояния, аутоиммунные заболевания и отторжение трансплантата обычно не приводят к заметному повышению концентрации ПКТ (значения менее 0,5 нг/мл). Значения ПКТ от 0,5 до 2 нг/мл находятся в «серой зоне», в которой диагноз сепсиса нельзя поставить. В этих случаях рекомендуется повторить измерение через 6-12 часов, чтобы поставить точный диагноз. Уровень ПКТ выше 2 нг/мл с высокой вероятностью свидетельствует об инфекционном процессе с системным воспалением.

Известным и наиболее близким аналогом (прототипом) является тест-система "BRAHMS PCT®-Q" (производитель компания B.R.A.H.M.S. AG, Германия) для проведения иммунохроматографического определения прокальцитонина (http://www.procalcitonin.com/pd f / P CT-Q/ 10620R03.pdf) содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов. Внутри иммунологической планшеты размещены подложка, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены с сохранением капиллярной проводимости подушка для нанесения жидкого исследуемого образца, конъюгатная подушка для нанесения конъюгата, пористая хроматографическая мембрана и абсорбционная подушка. Подушка для нанесения исследуемого образца имеет зону приема исследуемого жидкого образца сыворотки или плазмы, а на конъюгатной подушке содержится поперечная полоса из сухих частиц конъюгата коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами, специфичными к катакальцину (С-концевой фрагмент молекулы прокальцитонина, состоящий из 21 аминокислотного остатка). Коллоидное золото в конъюгате имеет размер частиц 20-30 нм. Полоса адсорбирована в теле указанной подушки. В теле пористой хроматографической мембраны, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая сухие адсорбированные частицы поликлональных бараньих антикальцитониновых антител, специфичных к кальцитонину (средняя часть молекулы прокальцитонина) и контрольная полоса, содержащая сухие адсорбированные частицы моноспецифичных поликлональных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши (RAM). Кальцитонин - продукт ферментативного расщепления прокальцитонина, представляющего собой пептид, состоящий из 32 аминокислотных остатков. Конструкция иммунологической планшеты обеспечивает контакт подушек, пористой мембраны и абсорбционной подушки друг с другом и позволяет образцу, свободно проходить все пористые материалы за счет действия капиллярных сил. Сыворотка или плазма пациента наносится на подушку для нанесения образца тестовой системы. Конъюгат коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами, специфичными к катакальцину связывается с прокальцитонином (связь осуществляется за C-концевую часть молекулы прокальцитонина) в образце с последующим образованием комплекса антиген-антитело. Этот комплекс под воздействием капиллярной силы распространяется по тестовой системе и в зоне тестовой полосы встречается с фиксированными антикальцитониновыми поликлональными бараньими антителами, специфичными к кальцитонину. В результате последнего связывания формируется сэндвич-комплекс.

При концентрации прокальцитонина >0,5 нг/мл этот сэндвич-комплекс проявляется в виде полосы красного цвета. Интенсивность окрашивания полосы прямо пропорциональна концентрации прокальцитонина в образце, которую при помощи контрольной карты относят к одному из следующих диапазонов: <0,5 нг/мл >0,5 нг/мл >2 нг/мл >10 нг/мл.

Несвязанный конъюгат диффундирует в зону "контрольной полосы", где фиксируется с образованием интенсивной красной контрольной полосы. С помощью этой контрольной полосы проверяется работоспособность тест-системы.

Однако тест-прототип имеет недостаточную специфичность и чувствительность, а также тест не обеспечивает возможность анализа образцов нативной крови.

Техническим результатом заявляемой полезной модели является повышение специфичности и чувствительности тест-системы и обеспечение возможности анализа образцов цельной крови.

Указанный технический результат достигается тем, что в тест-системе для иммунохроматографического определения прокальцитонина в образцах цельной крови, сыворотке или плазме с целью экспресс-диагаостики сепсиса, содержащей иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой имеется зона приема исследуемого образца, подложка, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены с сохранением капиллярной проводимости, подушка для нанесения конъюгата, пористая хроматографическая мембрана и абсорбционная подушка; в теле подушки для нанесения конъюгата сформирована поперечная полоса из сухих частиц конъюгата коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами, специфичными к прокальцитонину, а в теле хроматографической мембраны, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая сухие адсорбированные частицы антикальцитониновых антител, специфичных к кальцитонину (средняя часть молекулы прокальцитонина) и контрольная полоса, содержащая сухие адсорбированные частицы моноспецифичных поликлональных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши (RAM), согласно полезной модели, она снабжена фильтрационной подушкой, расположенной внахлестку и с сохранением капиллярной проводимости между подушкой для нанесения конъюгата и хроматографической мембраной, зона приема исследуемого образца расположена на подушке для нанесения конъюгата перед поперечной полосой из сухих частиц конъюгата коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами, причем в поперечной полосе подушки для нанесения конъюгата частицы коллоидного золота конъюгата имеют размер 40-50 нм, а конъюгат приготовлен в виде смеси частиц коллоидного золота, соединенных с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к катакальцину и частиц коллоидного золота, соединенных со вторыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к N-концевому фрагменту прокальцитонина, взятых в соотношении 1:1; антитела тестовой полосы выполнены в виде третьих моноклональных мышиных антител, специфичных к кальцитонину.

В качестве первых моноклональных мышиных антител, специфичных к катакальцину она содержит моноклональные мышиные антитела РСС14, в качестве вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к N-концевому фрагменту прокальцитонина - моноклональные мышиные антитела 4РС2, а в качестве третьих моноклональных мышиных антител, специфичных к кальцитонину - моноклональные мышиные антитела СВ5.

Указанные технические элементы тест-системы позволяют просто и надежно функционировать, снижать количество ложноположительных результатов путем повышения специфичности и чувствительности теста.

На фиг. 1 приведена схема внешнего вида тест системы, выполненной в виде иммунологической планшеты, а на фиг. 2 - схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете.

Тест-система для проведения иммунохроматографического анализа содержит иммунологическую планшету 1 с овальным окном 2 для внесения образца и прямоугольным окном 3 для просмотра результатов. Внутри иммунологической планшеты 1 размещены подложка 4, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены с сохранением капиллярной проводимости подушка 5 для нанесения исследуемого образца и конъюгата, содержащая сухие частицы конъюгата коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами, фильтрационная подушка 6, пористая хроматографическая мембрана 7 и абсорбционная подушка 8.

Подушка 5 для нанесения образца и конъюгата выполнена из целлюлозы или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна с размером пор 20-25 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см.

Фильтрационная подушка 6 выполнена из пористого материала полисульфона с толщиной слоя 600-650 мкм и объемом пор 55-57 мкл/см. На фильтрационной подушке 6 происходит дальнейшее связывание маркера прокальцитонина с моноклональными антителами и дополнительная очистка раствора от форменных элементов крови человека, которые в последующем мешают визуализации результата.

Пористая хроматографическая мембрана 7 выполнена из нитроцеллюлозы, или полиэфирсульфона, или нейлона с толщиной слоя 125-155 мкм.

Абсорбционная подушка 8 выполнена из пористого материала хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозного волокна с толщиной слоя 400-450 мкм.

Подложка 4 выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала с толщиной слоя 230-270 мкм.

Подушка 5 для нанесения исследуемого образца и конъюгата имеет зону 9 приема исследуемого жидкого образца в виде образца крови (или сыворотки, плазмы) и поперечную полосу 10 из сухих частиц конъюгата, приготовленного в виде смеси частиц коллоидного золота, соединенных с первыми моноклональными мышиными антителами (РСС14), специфичными к катакальцину (C-концевой фрагмент молекулы прокальцитонина, состоящий из 21 аминокислотного остатка) и частиц коллоидного золота, соединенных со вторыми моноклональными мышиными антителами (4РС2), специфичными к N-концевому фрагменту прокальцитонина, взятых в соотношении 1:1.

Коллоидное золото в конъюгате, имеет размер частиц 40-50 нм. Полоса 10 адсорбирована в теле указанной подушки 5 и расположена после зоны 9 приема жидкого исследуемого образца по ходу движения последнего под действием капиллярных сил. В теле пористой хроматографической мембраны 7, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса 11, содержащая сухие адсорбированные частицы третьих моноклональных мышиных антител (СВ5), специфичных к кальцитонину (средняя часть молекулы прокальцитонина) и контрольная полоса 12, содержащая сухие адсорбированные частицы моноспецифичных поликлональных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши (RAM). Кальцитонин - продукт ферментативного расщепления прокальцитонина, представляющего собой пептид, состоящий из 32 аминокислотных остатков.

В таблице 1 приведена характеристика материалов, из которых изготовлены элементы тест-системы.

Конструкция иммунологической планшеты 1 обеспечивает контакт подушек 5 и 6, пористой мембраны 7 и абсорбционной подушки 8 друг с другом и позволяет образцу, свободно проходить все пористые материалы за счет действия капиллярных сил.

В предлагаемой конструкции тест-системы в реакции участвуют конъюгат смеси моноклональных антител, обладающих специфичностью к разным частям молекулы прокальцитонина, что обеспечивает обнаружение необработанных (целых) или частично обработанных молекул прокальцитонина, что повышает специфичность теста. Более крупные частицы коллоидного золота размером 40-50 нм позволяют повысить чувствительность тест-системы за счет более яркой окраски тест-полосы 11. При постоянном числе сайтов связывания количество адсорбированных частиц маркеров будет примерно одинаковым. Отсюда ясно, что крупные частицы обеспечивают большую окраску пятна, поскольку в области d ~ 40-50 нм сечение поглощения прямо пропорционально объему частиц (http://earthpapers.net/biospetsificheskie-vzaimodevstviya-na-metallicheskih -nanochastitsah#ixzz452WaAo4Y).

Заявляемая тест-система работает следующим образом. Вносимый образец нативной крови или сыворотки, или плазмы впитывается подушкой 5, маркер образца взаимодействует с конъюгатом в виде смеси коллоидного золота, связанного с первыми моноклональными мышиными антителами (РСС14) и коллоидного золота, связанного со вторыми моноклональными мышиными антителами (4РС2), нанесенными на подушку 5. В результате образуется окрашенный иммунный комплекс «антиген-антитело». Далее при прохождении фильтрационной подушки 6 происходит дальнейшее связывание маркера прокальцитонина с первыми и вторыми моноклональными антителами (РСС14 и 4РС2) и дополнительная очистка раствора от форменных элементов крови человека, которые в последующем мешают визуализации результата. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль хроматографической мембраны 7, пересекает тестовую полосу 11 и взаимодействует с иммобилизованными на указанной тестовой полосе 11 третьими моноклональными мышиными антителами (СВ5). В результате при наличии прокальцитонина в образце крови или сыворотке выше порогового значения тестовая полоса 11 окрашивается в красный цвет. Если образец крови не содержит прокальцитонин в концентрации выше пороговой, тестовая полоса 11 остается не окрашенной. Далее не связавшийся на тестовой полосе 11 конъюгат движется далее вдоль хроматографической мембраны 7 и неизбежно взаимодействует с иммобилизованными на контрольной полосе 12 моноспецифичными поликлональными кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши (RAM). В результате контрольная полоса 12 также окрашивается в красный цвет (вторая окрашенная полоса). Контрольная полоса 12 является внутренним контролем теста и, если анализ проведен правильно, должна проявляться всегда, независимо от присутствия прокальцитонина в образце крови или сыворотке или плазме.

Результаты определяются визуально в течение 30 минут. При положительном результате тестирования появляются две окрашенные полосы - тестовая и контрольная. Интенсивность цвета контрольной и тестовой полос может быть различной.

При отрицательном результате появляется только одна полоса 12 -контрольная. Если контрольная полоса 12 не проявилась, результаты теста считаются недействительными.

Данные исследований, подтверждающие достижение технического результата. Являясь эффективным средством диагностирования, экспресс-тесты позволяют визуально в течение 30 минут определить наличие антигенов.

Качество работы теста и, соответственно показатели чувствительности и специфичности, зависят от качества используемых в тесте моноклональных антител и индивидуальных особенностей исследуемого маркера.

Так по результатам исследования на 150 представленных образцов крови с использованием заявляемой конструкции теста имеются следующие диагностические показатели, представленные в таблице 2.

Было проведено исследование с целью сравнения результатов заявленной тест-системы и результатов стандартной тест-системы (BRAHMS РСТ® - Q. Иммунохроматографический тест для определения прокальцитонина (ПКТ) в сыворотке и плазме человека), которая используется для диагностики септических состояний и контроля лечения тяжелых бактериальных инфекций и сепсиса.

Исследовано 200 образцов крови пациентов, проходящих лечения в различных отделениях лечебных учереждений (клиник г. Новосибирска и г. Красноярска). Применение комплекса коллоидное золото большего размера частиц - смеси моноклональных антител к диаметральным частям молекулы прокальцитонина в конъюгате и нанесения на тестовую линию моноклональных антител к центральной части молекулы, позволяет уменьшить количество ложноотрицательных результатов, при этом не увеличивая ложноположительных результатов.

Из данных, приведенных в таблице 3, можно заключить, что чувствительность экспресс-теста (производства ООО НПО "БиоТест") по трем диапазонам концентраций ПКТ превышает чувствительность набора BRAHMS РСТ® - Q. Специфичность заявленного теста значительно выше специфичности набора BRAHMS РСТ® - Q.

Claims (2)

1. Тест-система для иммунохроматографического определения прокальцитонина в образцах цельной крови, сыворотке или плазме с целью экспресс-диагностики сепсиса, содержащая иммунологическую планшету 1 с окном 2 для внесения образца и окном 3 для просмотра результатов, внутри которой имеется зона 9 приема исследуемого образца, подложка 4, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены с сохранением капиллярной проводимости, подушка 5 для нанесения конъюгата, пористая хроматографическая мембрана 7 и абсорбционная подушка 8; в теле подушки 5 для нанесения конъюгата сформирована поперечная полоса 10 из сухих частиц конъюгата коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами, специфичными к прокальцитонину, а в теле хроматографической мембраны 7, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса 11, содержащая сухие адсорбированные частицы антикальцитониновых антител, специфичных к кальцитонину (средняя часть молекулы прокальцитонина) и контрольная полоса 12, содержащая сухие адсорбированные частицы моноспецифичных поликлональных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши (RAM), отличающаяся тем, что она снабжена фильтрационной подушкой 6, расположенной внахлестку и с сохранением капиллярной проводимости между подушкой 5 для нанесения конъюгата и хроматографической мембраной 7, зона 9 приема исследуемого образца расположена на подушке 5 для нанесения конъюгата перед поперечной полосой 10 из сухих частиц конъюгата коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами, причем в поперечной полосе 10 подушки 5 частицы коллоидного золота конъюгата имеют размер 40-50 нм, а конъюгат приготовлен в виде смеси частиц коллоидного золота, соединенных с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к катакальцину и частиц коллоидного золота, соединенных со вторыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к N-концевому фрагменту прокальцитонина, взятых в соотношении 1:1; антитела тестовой полосы 11 выполнены в виде третьих моноклональных мышиных антител, специфичных к кальцитонину.

2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве первых моноклональных мышиных антител, специфичных к катакальцину, она содержит моноклональные мышиные антитела РСС14, в качестве вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к N-концевому фрагменту прокальцитонина, - моноклональные мышиные антитела 4РС2, а в качестве третьих моноклональных мышиных антител, специфичных к кальцитонину, - моноклональные мышиные антитела СВ5.

Images