CN105732810A - 一种降钙素原单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降钙素原单克隆抗体及其应用，该抗体由保藏编号为CGMCC NO：12035的杂交瘤细胞分泌产生。本发明提供的降钙素原单克隆抗体有方向性的识别降钙素原不同抗原表位区域。实验表明：本发明提供的降钙素原单克隆抗体可与降钙素原高度特异性的结合，且灵敏度高、稳定性好，用本发明提供的降钙素原抗体制备的检测试剂可以精确地测定血清中的降钙素原，具有高灵敏度和准确性，与市场上在售试剂检测结果具有高度相关性，与临床诊断具有较高的诊断一致性，可用于临床上对脓毒症或细菌性感染的辅助诊断。

Description

一种降钙素原单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种降钙素原单克隆抗体，具体涉及降钙素原单克隆抗体、降钙素原免疫原的制备及其应用，属于生物技术领域。本发明降钙素原单克隆抗体为由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的、编号为CGMCCNO：12035的杂交瘤细胞分泌产生；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：010-64807355，传真：010-64807288，电子邮件：cgmccim.ac.cn；保藏日期为：2016年01月28日。

背景技术

PCT(降钙素原)是一种无激素活性的降钙素前肽物质，是由位于11号染色体上的Calc-I基因编码产生。PCT由116个氨基酸组成，相对分子量为13000，可在特殊的蛋白酶作用下被分解成3部分，分别为氨基末端的57个氨基酸多肽的降钙素，位于中央区域的33个氨基酸多肽的降钙素和羧基末端21个氨基酸多肽的抗钙素。

正常情况下，PCT是由甲状腺C细胞和肝脏细胞产生，健康人体血清中PCT的含量很低(<0.1ng/ml)，几乎检测不到。当机体受到非甲状腺损伤，如烧伤、败血症、急性细菌感染等，血清中PCT浓度大量上升，而CT含量略有升高。说明除甲状腺C细胞能分泌PCT外，其它细胞也具有能分泌PCT的功能，只是这种功能须在一定条件下才能被诱发。有研究显示，在机体全身细菌感染1-3h开始升高，6h后PCT水平会急剧上升，12-48h上升至最高，2-3天后基本恢复正常，且它在6-24h内不会降解为降钙素，维持一定的稳定水平，在体内的半衰期大约为25～30h(TavaresE,FJ.Immunoneutralizationoftheaminoprocalcitoninpeptideofprocalcitoninprotectsratsfromlethalendotoxaemia:neuroendocrineandsystemicstudies[J].ClinSci.,2010Dec；119(12):519-34.)。

PCT是区别细菌感染和非细菌性感染的重要指标，许多研究发现，在全身细菌、真菌感染时，血清PCT浓度会升高，而在非细菌性(如病毒)感染或是局部炎症反应时保持低水平。其它一些炎症指标如CRP和白细胞数目是炎症反应的标志物，对病毒感染或是细菌感染都有反应。后期研究表明，血清PCT浓度与脓毒症的严重程度呈正相关。健康人血清中PCT含量非常低，局部的细菌感染也只能使PCT水平微量升高，当PCT浓度>2.0ng/mL，并随着PCT浓度的升高，患者确诊为脓毒症的可能性也不断升高。因此，PCT与常规用于炎症诊断的指标相比，是较理想的诊断细菌性感染及脓毒性并发症的一项指标。

临床实验室检测血清降钙素原常用的检测方法，如胶体金标记技术、双抗体夹心免疫化学发光法、胶乳增强免疫比浊法等，其检测试剂盒的研发对所需的单克隆抗体有一定要求，需要两种或两种以上的单克隆抗体，且必须能够识别不同抗原表位，以排除交叉反应、提高反应灵敏度。如果用PCT全抗原直接进行小鼠免疫，最后筛选出的能稳定分泌PCT单克隆抗体的细胞株，很可能是由抗原上免疫原性较强的同一位点刺激机体产生，或是只能识别降钙素或抗钙素，致使最终得到的单克隆抗体不能进行后续应用，导致有效抗体制备时间的延长，人力、财力资源的浪费。所以，我们需要设计一种免疫原，这种免疫原刺激机体产生的抗体针对不同的抗原区域，使制备的抗降钙素原抗体可以快速、有效的应用于特定降钙素原检测试剂盒的研制中。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种可以快速、有效的应用于特定降钙素原检测试剂盒的降钙素原单克隆抗体。

本发明的降钙素原单克隆抗体为由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的、编号为CGMCCNo：12035的、分类命名为杂交瘤细胞株(参据的生物材料(株)：N-PCT-A3)分泌产生。

本发明的另一目的在于提供一种用于制备降钙素原单克隆抗体的免疫原。

本发明所采用的降钙素原免疫原包括独立的降钙素原多肽片段、或者是降钙素原多肽片段偶联载体蛋白得到的偶联物、或者是降钙素原多肽片段与上述的偶联物。

作为一种优选方案，降钙素原多肽片段包括N-PCT(其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示：APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQDYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRS)、降钙素、抗钙素(其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示：DMSSDLERDHRPHVSMPQNAN)。

作为一种优选方案，载体蛋白为具有免疫原性的蛋白质；作为进一步优选方案，所述的载体蛋白为血蓝蛋白、血清蛋白、病毒肽中的一种。

本发明提供的降钙素原抗体是由上述的降钙素原免疫原制备得到的。

作为一种优选方案，所述的降钙素原单克隆抗体可识别的抗原区域包括N-PCT、降钙素、抗钙素。

作为一种优选方案，所述的单克隆抗体为采用单一的降钙素原免疫原对动物进行加强免疫后，经过细胞融合获得的单克隆抗体。

作为一种优选方案，免疫的动物为小鼠、大鼠、豚鼠、兔子中的一种。

一种本发明得到的降钙素原单克隆抗体在对人血清中降钙素原进行检测、该检测是利用胶乳增强免疫比浊法、制作降钙素原检测试剂盒中的应用，在体外测定血清标本中降钙素原含量。

本发明的优点在于：有方向性的提供一种针对降钙素原不同区域的单克隆抗体(创造性的从降钙素原这个完整的免疫原上取出一部分作为免疫原，得到的抗体是针对这一部分的，对后期应用提供了方便)，该单克隆抗体不仅可以与降钙素原高度特异性的结合，无需两种或两种以上的抗体同时使用，而且灵敏度高、特异性好，缩短了有效抗体制备的时间，节省了人力、财力资源。用该发明提供的单克隆抗体制备的检测试剂盒，可以快速、准确地检测人血清中的降钙素原浓度。

附图说明

图1：本发明提供的降钙素原抗体的特异性。

图2：本发明提供的降钙素原抗体分泌的稳定性。

图3：本发明提供的抗体的灵敏度。

图4：本发明提供的抗体制备的试剂与血清样本反应的线性关系。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例：

本发明所提供的降钙素原免疫原是由降钙素原多肽片段偶联载体蛋白得到的。优选的，降钙素原多肽片段包括N-PCT、降钙素、抗钙素。优选的，载体蛋白为具有免疫原性的蛋白质。虽然其他足够大的具备免疫原性的物质也可以作为载体，但是通常情况下选用蛋白质或多肽作为载体，最常用的免疫原性载体包括血蓝蛋白、血清蛋白、病毒肽。本发明中的载体优选为血蓝蛋白。

本发明提供的降钙素原抗体是由上述的降钙素原免疫原制备得到的。优选的，所述的单克隆抗体为采用单一的降钙素原免疫原对动物进行加强免疫后，经过细胞融合获得的单克隆抗体。

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。这些实施例仅为说明本发明的，而并非用来限制本发明的专利范围的。其他对本发明所做的各种改动或修改，同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围内。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述条件进行操作。

实施例1：N-PCT-KLH和KLH-KC免疫原的合成

N-PCT-KLH、KLH-KC免疫原是由巯基化血蓝蛋白(KLH-SH)分别与人工合成的降钙素原多肽片段N-PCT和抗钙素(KC)偶联而成，具体操作步骤如下：

(1)降钙素原多肽片段N-PCT

(APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQDYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRS)与KC(DMSSDLERDHRPHVSMPQNAN)序列，送上海吉尔生物公司合成，合成纯度>95％。

(2)将人工合成的N-PCT(6.8×10³Da)3.2mg和抗钙素(2.4×10³Da)1.2mg分别溶解于1ml0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液中，制成多肽溶液。1mg交联剂Sulfo-SMCC溶于500μl去离子水。将KLH-SH(4×10⁵Da)5mg溶于1ml去离子水，轻轻摇晃使其溶解。

(3)按上述量将Sulfo-SMCC溶液与两种多肽溶液分别混合，混合液在常温孵育30min或者在4℃孵育2h。

(4)步骤(3)制备的含有两种多肽的混合液、分别过脱盐柱除去多余Sulfo-SMCC，制成活化多肽。

(5)在上述活化多肽中分别加入已溶解的KLH-SH溶液，混合均匀，并在常温下孵育2h。

(6)孵育后的反应混合物透析48h，除去反应混合物中未偶联的小分子物质以及盐离子，缓冲液采用0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液，最后制得偶联物，即N-PCT-KLH和KLH-KC免疫原。

实施例2：降钙素原单克隆抗体的制备

N-PCT、KC多肽与上述制备的N-PCT-KLH和KLH-KC偶联物采用常规方法分别接种雄性6-7周龄Balb/c小鼠。首次免疫用0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液将免疫原稀释成1mg/ml，与弗氏完全佐剂进行乳化混合，每只小鼠50μg免疫原。经小鼠腹部皮下与背部皮下注射接种。每隔2～3周，以同样的免疫原量与弗氏不完全佐剂乳化混匀进行加强免疫，共计免疫4次，末次免疫后的1周对免疫小鼠眼眶采血，离心分离血清，采用间接ELISA的方法，用降钙素原全抗原包被酶标板，分别检测免疫效价。结果N-PCT、KC多肽免疫小鼠效价最高为1：2700，N-PCT-KLH和KLH-KC偶联物免疫小鼠效价最高为1：24300，筛选出免疫效价比较高的小鼠(效价为1：24300)，在末次免疫第10天用100μg免疫原腹腔注射，进行冲击免疫，冲击免疫后三天进行细胞融合。分别进行细胞融合后筛选出能稳定分泌降钙素原单克隆抗体共5个细胞株，分别为N-PCT-A3、N-PCT-B5、N-PCT-E3、和KC-B8、KC-D6(下面内容中分别以A3、B5、E3、B8、D6表示)。

选用成年的Balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡，1周左右腹腔注射生长状态良好的单克隆抗体杂交瘤细胞株A3，细胞注射量为10⁶。接种2周左右的小鼠腹部可见明显膨大，用16号针头在小鼠腹部右侧偏下斜着45°扎下，让腹水自然的流入离心管中。离心后吸取上清，先用辛酸硫酸铵初步纯化，再用ProteinG亲和柱纯化，用30mMpH2.7的柠檬酸洗脱，收集洗脱液，即得特异的降钙素原单克隆抗体。其它4株降钙素原单克隆抗体株产生特异的降钙素原单克隆抗体的制备过程同A3相同。

实施例3：降钙素原单克隆抗体识别的特异性鉴定

用2μg/ml的PCT、CT、CGRP、C-反应蛋白对降钙素原单克隆抗体的特异性进行鉴定。采用ELISA方法进行检测，以PCT为阳性对照，结果如图1显示，CT、CGRP、C-反应蛋白均为阴性。说明本发明的PCT单克隆抗体有高度特异性。

实施例4：细胞株分泌抗体稳定性评估

将得到的细胞株扩大培养至25ml培养瓶中，连续培养三个月，每半个月检测一次抗体分泌能力，以评估细胞株分泌单克隆抗体的稳定性。结果如图2所示，确定所获得的抗体能够连续在3个月内稳定分泌抗体。

实施例5：降钙素原单克隆抗体的配对

首先利用辣根过氧化物酶HRP对上述单克隆抗体进行标记，用于后续抗体配对，并用ELISA直接法测定标记的活性，确定标记抗体最佳使用浓度。

使用KLH-N-PCT免疫原制备的降钙素原抗体与KLH-KC免疫原制备的降钙素原单克隆抗体进行配对，以筛选出最佳的抗体组合。将未标记的抗体包被酶标板，PCT全抗原稀释成0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml与酶标抗体最佳工作浓度混合，直接孵育。两种不同免疫原的抗体相互进行配对反应，并以包被抗体与同种标记抗体反应作为阴性对照。结果共筛选出五对反应较强的抗体对，分别为A3-B8，B8-A3，B8-E3，A3-D6，E3-D6。

从上述5对抗体对中，根据抗体对能够检测到的最低限的PCT全抗体浓度，筛选出灵敏度最高的抗体对进行后续实验，利用双抗体夹心ELISA检测抗体灵敏度。将抗原按比例稀释为0ng/ml、0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、100ng/ml进行双抗体夹心实验。如图3所示，A3-B8、E3-D6在抗原浓度为0.25ng/ml、0.5ng/ml时具有相对较高的OD450值。因此，将两抗体对选为最优抗体对。

实施例6：本发明提供的降钙素原单克隆抗体的应用

利用本发明得到的降钙素原单克隆抗体对人血清中降钙素原进行检测，该检测是利用胶乳增强免疫比浊法，制作降钙素原检测试剂盒，在体外测定血清标本中降钙素原含量。检测原理为，包被有降钙素原抗体的胶乳颗粒可与血清中的降钙素原产生凝集反应，形成抗原抗体复合物，其浊度高低在一定量抗体存在时与血清中PCT成正比，通过测定特定浊度的吸光度值，参考校准曲线即可计算出血清中的PCT浓度。

首先对制备的试剂做线性范围的测定，取高浓度血清和低浓度血清按不同比例混合，稀释成7个不同浓度的样本，其中0ng/ml为生理盐水。在生化仪上用本试剂从低值到高值，然后从高值到低值对8个不同浓度的样本分别平行测定5次。测定值为Y，理论值为X。做线性回归曲线。结果见图4，线性范围在0.05～60ng/ml，r≥0.995。

为进一步评价本发明提供的降钙素原制备的试剂在临床应用的实用性，采用宁波美康生物科技股份有限公司公司的PCT检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)作为参比产品，对在宁波美康国宾体检中心体检中心与美康中医院选出的56例样本作为研究对象。宁波美康生物公司PCT检测试剂盒与本发明提供的抗体制备的试剂盒都在Hitachi7180全自动生化仪上对样本进行检测。对检测结果进行分析。临床检测结果表明本发明提供的抗体制备的检测试剂盒对降钙素原的检测具有较高的灵敏度和准确性，且本发明提供的抗体制备的试剂盒与产品实际和对比检测结果无统计学差异(P＝0.0315)，同时两种试剂检测结果呈显著相关(r＝0.953)。

综上所述，本发明提供的降钙素原抗体可与降钙素原高度特异性的结合，且灵敏度高、稳定性好，用本发明提供的降钙素原抗体研制的免疫试剂可以精确地测定血清样本中的降钙素原，具有高灵敏度、准确性，与市场上在售试剂检测结果具有高度相关性，与临床诊断具有较高的诊断一致性，可用于临床上对脓毒症或细菌性感染的辅助诊断。

Claims (9)

1.一种降钙素原单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体为采用免疫原对动物进行加强免疫后，经过细胞融合获得的单克隆抗体；该抗体由保藏编号为CGMCCNO：12035的杂交瘤细胞分泌产生。

2.根据权利要求1所述的降钙素原单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体可识别的抗原区域包括N-PCT、降钙素、抗钙素。

3.根据权利要求1所述的降钙素原单克隆抗体，其特征在于：所述的动物为小鼠、大鼠、豚鼠、兔子中的一种。

4.一种用于制备权利要求1所述的降钙素原单克隆抗体的免疫原。

5.根据权利要求4所述的免疫原，其特征在于：所述的免疫原包括独立的降钙素原多肽片段或者降钙素原多肽片段偶联载体蛋白得到的偶联物。

6.根据权利要求5所述的免疫原，其特征在于：所述的降钙素原多肽片段包括N-PCT、降钙素、抗钙素中的一种。

7.根据权利要求5所述的免疫原，其特征在于：所述的载体蛋白为具有免疫原性的蛋白质。

8.根据权利要求7所述的免疫原，其特征在于：所述的载体蛋白为血蓝蛋白、血清蛋白、病毒肽。

9.一种降钙素原单克隆抗体在制作降钙素原检测试剂盒中的应用。