CN101497665A

CN101497665A - 人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体及其制备方法及应用

Info

Publication number: CN101497665A
Application number: CNA2009101111142A
Authority: CN
Inventors: 金光辉; 王洋; 葛庆; 郭中强; 王恩华
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2009-02-25
Publication date: 2009-08-05
Anticipated expiration: 2029-02-25
Also published as: CN101497665B

Abstract

人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体及其制备方法及应用，涉及一种抗体。提供一种人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体及其制备方法及应用。为兔的血清免疫球蛋白Ig G，由重链55kDa和轻链30kDa两条链组成。先表达和纯化K5多肽；再制备人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体。用于人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体可以特异性与K5蛋白结合；人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体可以检测标本中转染表达K5蛋白质粒的人肺腺癌细胞的K5表达分布；人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体可以检测标本中转染表达K5蛋白质粒的人肺腺癌细胞的K5表达分布。

Description

人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种抗体，尤其是涉及一种人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体及其制备方法及应用。

背景技术

新生血管异常增生所引起的全身组织及器官的损害是目前最为棘手的医学难题之一，是全身许多重大疾病的病因和/或重要病理特征。人纤溶酶原Kringle5(Human PlasminogenKringle 5，K5)是引人注目的抑制血管生成蛋白之一，是目前发现抑制新生血管活性最强的纤溶酶原片段，具有生物活性强、细胞特异性高、分子量小、副作用小、性质比较稳定等诸多显著优点(1、Cao.Y，Chen.A.An，S.S.Ji，R.W，Davidson.D and Llinas.M.Kringle 5 ofplasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth.J Biol Chem，272(36)：22924-22928，1997；2、W.R.Ji，L.G.Barrientos，M.Llinás，H.Gray，X.Villarreal，M.E.DeFord，F.J.Castellino，R.A.Kramer and P.A.Trail.Selective inhibition by kringle 5 of human plasminogen on endothelial cellmigration，an important process in angiogenesis.Biochem Biophys Res Commun，247(2)：414-419，1998；3、Soff，G.A.Angiostatin and angiostatin-related proteins.Cancer Metastasis Rev，19(1-2)：97-107，2000)。已证实了K5在新生血管性疾病如实体瘤(4、Davidson DJ，Haskell C，Majest S，et al.Kringle 5 of human plasminogen induces apoptosis of endothelial and tumor cells throughsurface-expressed glucose-regulated protein 78.Cancer Res，65：4663-4672，2005；5、Perri SR，Nalbantoglu J，Annabi B，et al.Plasminogen kringle 5-engineered glioma cells block migration oftumor-associated macrophages and suppress tumor vascularization and progression.CancerRes，65：8359-8365，2005)、糖尿病性视网膜增生(Zhihong Zhang，Jian-xing Ma，Guoquan Gao，Chaoyang Li，Lihui Luo，Mei Zhang，Wenzhao Yang，Aihua Jiang，Wenhui Kuang，Liying Xu，JiaqiChen，and Zuguo Liu.Plasminogen Kringle 5 Inhibits Alkali-Burn-Induced CornealNeovascularization.Invest Ophthalmol Vis Sci.46：4062-4071，2005)等疾病治疗中具有潜在的应用前景。但目前尚缺乏有效、特异的人源性K5检测抗体，严重制约着K5作用机制的进一步深入探讨及其应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体及其制备方法及应用。

本发明所述人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体为兔的血清免疫球蛋白Ig G，由重链55kDa和轻链30kDa两条链组成。它可以特异性识别并结合K5蛋白，可以有效应用于检测K5蛋白的多种方法，如酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白免疫印迹(Western Blot)、免疫组织化学、免疫荧光等检测。

本发明所述人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

1)表达和纯化K5多肽：

2)制备人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体。

所述表达和纯化K5多肽可采用以下方法：将含有K5部分序列的cDNA的质粒pPIC9K-K5，经测序鉴定正确后，利用限制性内切酶Sal I线性化，通过电转化至毕赤酵母GS115中，通过PCR方法鉴定阳性重组子，挑取的阳性重组子经甲醇诱导表达挑选高拷贝阳性菌，进行诱导表达，收集部分酵母上清，经三氯乙酸沉淀法浓缩蛋白后，Tricine SDS-PAGE电泳检测，用硫酸铵盐沉淀法纯化浓缩蛋白、透析后，阴离子交换层析过柱，用洗脱液上柱，流出液即为纯化的K5蛋白。

所述毕赤酵母GS115可购买于Invitrogen公司。进行诱导表达时，为保证表达蛋白的活性，培养条件最好为28～30℃，250rpm，48h，按体积百分比，每24h最好补加甲醇至1％。收集部分酵母上清，经三氯乙酸沉淀法浓缩蛋白后，Tricine SDS-PAGE电泳检测，15.0kDa处有预期的条带。所述用硫酸铵盐沉淀法纯化浓缩蛋白的硫酸铵盐的浓度按质量百分比最好为65％。所述阴离子交换层析最好采用Bio-Rad公司出品的UNOsphere Q cartridge阴离子交换层析。所述洗脱液最好用含0.2mol/L NaCl的洗脱液。

所述制备人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体可采用以下方法：用纯化的15kDa的K5蛋白与弗氏佐剂混合，免疫动物，经纯化获得人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体。

所述免疫动物可选用家兔，小鼠或大鼠等。用纯化的15kDa的K5蛋白与弗氏佐剂混合，免疫动物，经纯化可采用以下方法：第一次用纯化的K5蛋白1mg加弗氏完全佐剂，剧烈震荡，充分乳化后免疫新西兰兔，每隔14天用纯化的K5蛋白0.5mg加不完全弗氏佐剂，与生理盐水乳化，加强免疫两次，用颈动脉取血法接取兔血清，用ELISA法检测多克隆抗体的效价，抗体效价分析表明抗体效价达到1∶1000。将血清总蛋白经过50％硫酸胺沉淀后，结合于protein A柱上，用亲和层析法分离出多克隆抗体。

本发明以毕赤酵母系统表达了K5蛋白的部分多肽，以纯化的K5多肽为抗原，制备了抗K5蛋白的多克隆抗体。本发明所述人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体有如下的应用：

1)蛋白免疫印记实验证明人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体可以特异性与K5蛋白结合。

2)应用免疫组织化学技术，人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体可以检测标本中转染表达K5蛋白质粒的人肺腺癌细胞(A549)的K5表达分布。

3)应用免疫荧光组织化学技术，人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体可以检测标本中转染表达K5蛋白质粒的人肺腺癌细胞的K5表达分布。

附图说明

图1为K5蛋白的表达(Tricine SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色)。在图1中，条带1.pPIC9K-K5菌株；条带2.阴性对照pPIC9K菌株；条带3.蛋白分子量Marker。

图2为K5蛋白的纯化(Tricine SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色)。在图2中，1.蛋白分子量Marker；2.K5 Q Sepharose离子交换介质穿过液；3.同2；4.0.1M NaCl洗脱；5.0.2 MNaCl洗脱；6.0.3 M NaCl洗脱；7.0.4 M NaCl洗脱；8.0.5 M NaCl洗脱。

图3为K5的多克隆抗体效价的ELISA测定。在图3中，K5兔多克隆抗体效价为1∶1000。横坐标为稀释倍数，纵坐标OD450；◆为NC，■为样品。

图4为K5多克隆抗体的纯化(Tricine SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色)。在图4中，条带1.蛋白分子量Marker；条带2.兔血清总蛋白；条带3.硫酸铵沉淀后上清；条带4.硫酸铵沉淀；条带5.穿过液；条带6.洗脱目的带，主要为兔IgG的重链和轻链。

图5为Western blot检测酵母细胞表达的K5蛋白。

图6为多克隆抗体用于免疫组化检测K5的分布。图6A为转染pcDNA3.1(+)质粒的A549细胞，图6B为转染pcDNA3.1(+)-K5质粒的A549细胞。

图7为多克隆抗体用于免疫荧光检测K5的分布。图7A为转染pcDNA3.1(+)质粒的A549细胞，图7B为转染pcDNA3.1(+)-K5质粒的A549细胞；标尺为20μm。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

1.K5蛋白的构建，表达，纯化：

(1)K5质粒的构建：将含有K5的cDNA(Genbank)的质粒pPIC9K(朱明等构建)转化大肠杆菌TOP10中，在含氨苄青霉素(终浓度100ug/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。DNA序列分析结果表明DNA序列与人纤溶酶原Kringle5的cDNA(Genebank)序列完全相同。

K5的表达纯化：将经限制性内切酶Sal I线性化CIAP去磷酸化处理的pPIC9K-K5质粒电转化到毕赤酵母GS115中，电转参数：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。经过高浓度G418抗生素(浓度3mg/ml)筛选的阳性酵母菌在28～30℃，250rpm，培养48h后离心收集菌体，换用含1％(v/v)甲醇的培养基继续培养诱导48h，并且每24h补加甲醇至1％(v/v)。离心收集酵母上清，用65％硫酸铵盐沉淀法纯化浓缩蛋白、透析后，将样品加入UNOsphere Qcartridge阴离子交换层析过柱，通过含0.2mol/L NaCl的洗脱液将K5洗脱。流出液经TricineSDS-PAGE电泳检测，K5的纯度在98％以上。

图1给出K5蛋白的表达(Tricine SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色)。在图1中，条带1.pPIC9K-K5菌株；条带2.阴性对照pPIC9K菌株；条带3.蛋白分子量Marker。

图2给出K5蛋白的纯化(Tricine SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色)。在图2中，1.蛋白分子量Marker；2.K5Q Sepharose离子交换介质穿过液；3.同2；4.0.1M NaCl洗脱；5.0.2MNaCl洗脱；6.0.3M NaCl洗脱；7.0.4M NaCl洗脱；8.0.5M NaCl洗脱。

2.K5蛋白的多克隆抗体制备纯化及其效价测定：

多克隆抗体的生产可用纯化的K5蛋白直接注射动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂。

用1mg上述K5蛋白加上完全弗氏佐剂加，完全乳化后，于新西兰兔背部、腹股沟处注射5个点进行初次免疫，每隔14天再用K5蛋白加不完全弗氏佐剂加强免疫两次。采用经5.4ug/mL K5蛋白包被的96孔聚苯乙烯微量滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。ELISA实验的抗体效价分析表明，抗体效价达到1∶1000。将血清总蛋白经过50％硫胺沉淀后，结合于protein ASepharose柱上，用亲和层析法分离出多克隆抗体。

图3给出K5的多克隆抗体效价的ELISA测定。在图3中，K5兔多克隆抗体效价为1∶1000。

图4给出K5多克隆抗体的纯化(Tricine SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色)。在图4中，条带1.蛋白分子量Marker；条带2.兔血清总蛋白；条带3.硫酸铵沉淀后上清；条带4.硫酸铵沉淀；条带5.穿过液；条带6.洗脱目的带，主要为兔IgG的重链和轻链。

3.K5蛋白的多克隆抗体的特异性检测：

蛋白免疫印记检测：上述制备的酵母表达上清经Tricine SDS-PAGE电泳后，电转PVDF膜。10％小牛血清封闭非特异性结合位点，加入K5蛋白的多克隆抗体(1∶500)，于4℃过夜，TBST溶液洗涤1h后，加1∶50000稀释的HRP标记二抗，置于室温振荡2h，用TBST溶液洗涤2h后，在新鲜的ECL底物液中反应3min，进行医学X-光片曝光。Western blot实验证明多克隆抗体可特异性与K5蛋白结合。图5给出Western blot检测酵母细胞表达的K5蛋白。

4.利用K5多克隆抗体检测K5：

对表达K5蛋白的哺乳动物细胞标本，经PBS清洗，福尔马林固定后，使用K5兔多克隆抗体包被，与HRP标记的二抗反应后，经DAB显色，苏木素返蓝，脱水，晾干后树脂固定在显微镜下观察；或加入绿色荧光标记二抗反应，DAPI染核，晾干后利用共聚焦显微镜检测标本。结果显示，K5兔多克隆抗体能够应用于免疫组织化学及免疫荧光技术实验中，检测标本中K5蛋白和突变修饰的K5的表达和分布情况。

图6给出多克隆抗体用于免疫组化检测K5的分布。图6A为转染pcDNA3.1(+)质粒的A549细胞，图6B为转染pcDNA3.1(+)-K5质粒的A549细胞。

图7给出多克隆抗体用于免疫荧光检测K5的分布。图7A为转染pcDNA3.1(+)质粒的A549细胞，图7B为转染pcDNA3.1(+)-K5质粒的A549细胞。

Claims

1.人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体，其特征在于为兔的血清免疫球蛋白Ig G，由重链55kDa和轻链30kDa两条链组成，以特异性识别并结合K5蛋白，有效应用于检测K5蛋白的多种方法。

2.如权利要求1所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)表达和纯化K5多肽：

2)制备人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体。

3.如权利要求2所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述表达和纯化K5多肽采用以下方法：将含有K5部分序列的cDNA的质粒pPIC9K-K5，经测序鉴定正确后，利用限制性内切酶Sal I线性化，通过电转化至毕赤酵母GS115中，通过PCR方法鉴定阳性重组子，挑取的阳性重组子经甲醇诱导表达挑选高拷贝阳性菌，进行诱导表达，收集部分酵母上清，经三氯乙酸沉淀法浓缩蛋白后，Tricine SDS-PAGE电泳检测，用硫酸铵盐沉淀法纯化浓缩蛋白、透析后，阴离子交换层析过柱，用洗脱液上柱，流出液即为纯化的K5蛋白。

4.如权利要求3所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述进行诱导表达时，培养条件为28～30℃，250rpm，48h，按体积百分比，每24h补加甲醇至1％。

5.如权利要求3所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述用硫酸铵盐沉淀法纯化浓缩蛋白的硫酸铵盐的浓度按质量百分比为65％。

6.如权利要求3所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述洗脱液用含0.2mol/L NaCl的洗脱液。

7.如权利要求2所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述制备人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体采用以下方法：用纯化的15kDa的K5蛋白与弗氏佐剂混合，免疫动物，经纯化获得人纤溶酶原Kringle5蛋白的多克隆抗体。

8.如权利要求7所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述免疫动物为家兔，小鼠或大鼠。

9.如权利要求7所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体的制备方法，其特征在于用纯化的15kDa的K5蛋白与弗氏佐剂混合，免疫动物，经纯化采用以下方法：第一次用纯化的K5蛋白1mg加弗氏完全佐剂，剧烈震荡，充分乳化后免疫新西兰兔，每隔14天用纯化的K5蛋白0.5mg加不完全弗氏佐剂，与生理盐水乳化，加强免疫两次，用颈动脉取血法接取兔血清，用ELISA法检测多克隆抗体的效价，抗体效价分析表明抗体效价达到1∶1000，将血清总蛋白经过50％硫酸胺沉淀后，结合于protein A柱上，用亲和层析法分离出多克隆抗体。

10.如权利要求1所述的人纤溶酶原Kringle5多克隆抗体在以特异性与K5蛋白结合，检测标本中转染表达K5蛋白质粒的人肺腺癌细胞的K5表达分布或检测标本中转染表达K5蛋白质粒的人肺腺癌细胞的K5表达分布中的应用。