CN1468956A

CN1468956A - 高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒及其用途

Info

Publication number: CN1468956A
Application number: CNA021360286A
Authority: CN
Inventors: 钱其军; 杨琴; 吴孟超
Original assignee: 杨琴
Priority date: 2002-07-15
Filing date: 2002-07-15
Publication date: 2004-01-21
Also published as: WO2004007703A1; AU2003257770A1

Abstract

本发明提供了高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段的肿瘤细胞特异性增殖的病毒及其用途。该病毒能并且基本上限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。通过将编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列插入所述肿瘤细胞内增殖的病毒基因组中，随着病毒在肿瘤细胞内复制，使编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加，从而在肿瘤细胞高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段，抑制肿瘤的生长及转移。

Description

高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒及其用途

技术领域

本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种能高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途。

背景技术

Kohler和Milstein在1975年创立的单克隆抗体制备技术，为肿瘤的治疗提供一种新的方法——肿瘤的导向治疗法。在肿瘤导向治疗研究初期，人们给予极大的热情和不切合实际的期望，但早期的临床研究的疗效十分不理想。其主要原因为：1.在早期的临床试验中应用的是鼠源性抗体，在人体内会产生针对鼠源性抗体的抗抗体(HAMA)，它会中和治疗性的鼠源性抗体，使其被快速清除，因此鼠源性抗体在人体内半衰期很短，故疗效不确切，同时鼠源性抗体会导致人体过敏反应，从而产生毒副作用；2.抗体的亲和力和特异性不高，多数抗体特别是一些基因工程小分子抗体或人源化抗体自身亲和力较低，特异性不高，从而不能有效靶向肿瘤细胞，因此其临床上抗肿瘤疗效不确切；3.肿瘤自身抗原表达的差异及抗原的调变也是影响抗体治疗成功的因素。近5年来随着现代生物技术的发展，抗体技术两个关键性技术获得突破，1.人源化抗体技术和人抗体制备技术的成熟，基本上可以克服鼠源性抗体人用产生抗抗体的问题；同时由于在人源化抗体技术和人抗体中采用人的Fc片段(可结晶的片段，是指用木瓜酶消化免疫球蛋白所得的片段，其分子量大约为50 000)，在人体内的半衰期从鼠源性抗体小于20小时到人源化抗体和人抗体的半衰期为数天、甚至到21天之久；另外在人的Fc片段的改造可进一步提高对肿瘤的杀伤。2.抗体库的建立和筛选以及多价重组抗体制备技术的发展使人们能够直接获得特异性强和亲和力高的单克隆抗体，如SLAM法(Selected Lymphocyte Antibody Method)制备的抗体的亲和力比杂交瘤技术制备的提高1000倍。抗体技术的发展终于使导向治疗研究走出低谷，并在近几年取得了突破性进展，应用抗体治疗肿瘤初显曙光。

但目前对于抗体治疗实体瘤仍存在着两个难题：1.由于实体肿瘤的细胞被致密的基质包裹，抗体难以穿透这一屏障而到达肿瘤细胞；大多数实体肿瘤有淋巴回流障碍，导致间质内压力升高，因而阻止了抗体由血液中进入肿瘤实质；小部分进入肿瘤内部的抗体，首先遇到血管周围的肿瘤细胞而被结合，使得抗体无法到达距离血管较远的肿瘤细胞。2.由于治疗肿瘤的抗体需要量极多，目前的生物工程生产比较困难；同时由于需要量极多，要求其产品纯度极高，因此价格非常昂贵。故目前应用抗体治疗大体积的实体肿瘤的疗效仍不理想，很多研究建议对于实体肿瘤的抗体治疗主要应用于肿瘤的微小残留或微转移灶中，但这种疾病的治疗需要长时间及大规模的多中心临床试验才能评估其疗效，这也使抗体在实体瘤的临床应用及推广产生一定的限制作用。

众所周知，长期以来，肿瘤基因治疗的方法存在着基因的转染有效率和抗癌基因的表达量均较低的缺陷。而肿瘤特异性增殖病毒的治疗方法是利用该类病毒只能特异性地在肿瘤细胞内复制和增殖的性质，随着病毒在肿瘤细胞内的复制和增殖导致肿瘤细胞裂解，释放出病毒颗粒，再次感染其它肿瘤细胞，再次增殖、裂解，如此产生放大效应，使得病毒弥散到全身各个组织及脏器，感染所有组织及脏器，因而能感染所有肿瘤细胞，从而杀灭局部及转移的肿瘤。由于肿瘤增殖病毒基本上不能在正常细胞中增殖，所以不影响肿瘤细胞周围的正常细胞。

但单独应用肿瘤增殖病毒治疗仍有局限性，首先，肿瘤形成的机制非常复杂，异质性非常强，病人与病人之间，肿瘤与肿瘤之间，同一肿瘤不同肿瘤细胞之间均存在明显差异，就P53基因突变而言，某一肿瘤病人的肿瘤细胞P53基因突变，这并不意味着该病人的所有肿瘤细胞P53基因都发生突变，因此利用某一肿瘤机制而增殖的病毒不足以杀灭所有肿瘤细胞。其次，肿瘤组织中的物理因素如纤维化、混入正常细胞以及坏死区域也可能限制病毒扩散。再次，某此肿瘤的病毒受体(如柯萨奇病毒受体)表达不充分限制病毒对其感染。第四，病人的免疫反应限制病毒增殖和播散。目前，美国ONYX药物公司尝试单独应用Elb 55kDa蛋白缺失型病毒(ONYX-015)治疗肿瘤，其临床有效率只有15-20％(Nemunaitis，J.等人，癌症研究(Cancer Res.)，2000，60(22)：6359；US 5677178；US 5801029)。

本发明人创造性地将肿瘤的抗体治疗与肿瘤特异性增殖病毒治疗方法相结合，首次提出了肿瘤的抗体-病毒治疗方法，即：采用肿瘤增殖特异性病毒携带治疗肿瘤的抗体或抗体片段基因，成功实现了在肿瘤细胞内特异性病毒复制和增殖，形成高浓度病毒，直接破坏肿瘤细胞，同时在肿瘤细胞内随病毒复制而实现所携带的治疗肿瘤的抗体或抗体片段基因大量表达，产生协同作用。本发明所述抗体-病毒治疗方法，由于携带治疗肿瘤的抗体或抗体片段基因的肿瘤增殖特异性病毒在肿瘤组织中特异性复制及增殖，其高效表达肿瘤的抗体或抗体片段是在肿瘤组织内部产生，因此克服了治疗肿瘤的抗体或抗体片段难以进入实体瘤组织的困难；同时携带治疗肿瘤的抗体或抗体片段基因的肿瘤增殖特异性病毒生产成本低廉，从而解决了治疗肿瘤的抗体或抗体片段大量生产成本高的难题，因而从疗效及经济上均优于肿瘤的抗体治疗法。同时也比单纯采用肿瘤特异性增殖病毒方法进行治疗更为有效。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒。

其中该病毒基因组中包含一种编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列，该病毒选自：

1)在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；

2)病毒增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件有效控制之重组病毒；

3)包含至少一种增殖必需区蛋白功能缺失且能在肿瘤细胞内特异性增殖的重组病毒。

本发明的另一个目的在于提供一种利用本发明的病毒用于治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其包括如下步骤：1)将该病毒体外或体内感染肿瘤细胞，2)使病毒基本上限于肿瘤细胞内选择性复制及增殖，导致在肿瘤细胞内编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加及治疗肿瘤的抗体或抗体片段表达量增加；由此抑制肿瘤形成、生长及转移。适当地，本发明所述方法还包括在本发明所述病毒感染肿瘤细胞之前、同时和/或之后施用化学抗肿瘤药物。

本发明的又一目的在于提供了一种本发明所述的病毒用于抑制肿瘤细胞的生长的用途。

本发明提供一类重组病毒，将编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域，该病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖，通过病毒在肿瘤细胞内复制增殖，导致编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加，从而治疗肿瘤的抗体或抗体片段基因表达量增加，该病毒选自：

1)在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；

本发明中可以选用多种野生型病毒，只要它们在一种或多种肿瘤细胞中可特异性增殖。优选腺病毒、单纯疱疹病毒。

本发明所述病毒增殖必需区依所采用的病毒不同而不同，但容易为本领域技术人员知晓。本发明所述所述“病毒增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制”是指病毒增殖必需基因与肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的在病毒基因组中的相对位置依所用病毒的不同可以是多种多样的，只要该增殖必需基因的转录能够受到肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件有效控制。在一个实施方案中，本发明所述病毒中包含的肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件可以在病毒增殖必需基因的转录起始位点之前适当的位置。在本发明的另一个实施方案中，肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件可以替代病毒自身的启动子。在本发明的另一个实施方案中，本发明所述病毒还可以是在病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间区域包含至少一种肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的重组病毒。其中所述顺式作用元件可选自：端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子，缺氧反应元件，细胞S期特异性启动子(E2F启动子)，甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增强子，EB病毒BamHI C-启动子。

当所用其中所述病毒为腺病毒时，其增殖必需基因为病毒早期基因，该腺病毒增殖必需基因为以下腺病毒的早期表达基因之一：E1A、E1B、E2或E4。

本发明所述的病毒还可以是增殖必需区包含至少一种蛋白功能缺失且能在肿瘤细胞内特异性增殖的重组病毒。其中所述蛋白功能缺失可以是通过对编码基因的点突变、删除、插入突变，从而使所述蛋白的功能缺失。在本发明的一个实施方案中，所述病毒一种重组腺病毒，其中该腺病毒E1B55Kda基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致E1B55Kda蛋白质功能异常。在本发明的一个实施方案中，所述病毒一种重组腺病毒，其中该腺病毒E1B19kDa基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致E1B 19kDa蛋白质功能异常。在本发明的一个实施方案中，所述病毒一种重组腺病毒，其中该腺病毒E1A基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致E1A蛋白质功能异常。

在本发明的一个实施方案中，所述病毒重组单纯疱疹病毒，其中该单纯疱疹病毒ICP6基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致ICP6蛋白质功能异常。在本发明的一个实施方案中，所述病毒是重组单纯疱疹病毒，其中该单纯疱疹病毒双拷贝ICP34.5基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致双拷贝ICP34.5蛋白质功能异常。

本发明所述的病毒中，编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有治疗肿瘤作用的抗体或抗体片段蛋白，均可被用于本发明。

此外，在本发明所述的病毒中，所述编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列还优选地受启动子控制。所述启动子包括，但不限于SV40启动子、RSV LTR启动子、人巨细胞病毒IE启动子和/或肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件，其中所述顺式作用元件可选自：端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子，缺氧反应元件，细胞S期特异性启动子(E2F启动子)，甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒0rip中的FR增强子，EB病毒BamHI C-启动子。任何能有效指导本发明所述治疗肿瘤的抗体或抗体片段表达的启动子，无论同源还是异源，均能用于本发明。

本发明中，构建肿瘤特异性病毒，使得病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复制，而在正常细胞不增殖及复制，主要通过以下方法实现：

(1)选择性对病毒增殖必需基因的控制：基因转录激活的调节受反式作用因子(如转录因子)与顺式作用元件相互作用的影响。当缺乏或出现某些转录因子会影响基因的转录水平。本发明应用肿瘤组织特异性激活顺式作用元件(包括启动子或增强子)控制目的基因，使该目的基因特异性在肿瘤细胞内表达，而在正常的细胞内不表达或低水平表达。应用控制肿瘤组织特异性启动子或增强子病毒增殖及复制的必需基因，从而使病毒增殖必需基因只能在肿瘤的细胞中表达，导致病毒只能在肿瘤的细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖。

本发明采用的细胞专一的反应元件由肿瘤细胞特异性激活顺式作用元件组成，其顺式作用元件可以是下述任何一种：端粒酶催化亚基(TERT)启动子及端粒酶RNA组份基因启动子。

大约90％肿瘤细胞具有端粒酶活性，而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，这表明端粒酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记，到目前为止，人的端粒酶由三个部分组成，1.RNA组份(hTERC)，它作为端粒重复合成的内源性模板；2.端粒酶结合蛋白(TEP1)；3.端粒酶催化亚基(telomerase catalytic subunit，简写TERT)，也有人称为端粒酶逆转录酶基因(telomerase reverse transcriptase gene)。RNA组份和端粒酶催化亚基是端粒酶活性所必需的成份。最近研究表明端粒酶催化亚基(hTERT)在端粒酶活性中起决定作用，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞株中端粒酶催化亚基呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达。因此端粒酶催化亚基启动子及端粒酶RNA组份基因启动子在极大多肿瘤细胞内呈激活状态。

人与鼠的TERT基因的顺式作用元件最近均已被克隆出来，其序列GC含量高，缺少TATA和CAAT盒，但含有多个转录因子的结合位点，包括转录激活因子Myc、SP1和转录抑制因子Mad1、p53、MZF2等结合位点。通过对人的TERT基因(hTERT)启动子5’端进行截短，构建不同长度的启动子缺失突变体，来研究该启动子的活性，结果发现，在转录起始位点上游存在一个至少181bp的启动子核心区域，这个区域对保持该启动子的活性很重要。hTERT基因启动子核心区域内含有E-box(CACGTG)和SP1结合位点。虽然SP1转录因子在端粒酶阴性的体细胞中表达上调，它与其结合位点的结合对hTERT基因转录的起始有促进作用，但相比之下，调节hTERT基因转录表达的主要决定因素是与E-盒(E-box)结合的因子，如Myc、Mad1等。Myc蛋白的高表达，可以明显提高hTERT基因启动子的活性，从而促进基因转录和增强端粒酶活性。除转录起始位点上游的E-box(-187bp～-182bp)以外，在hTERT基因转录起始位点下游、翻译起始位点之前还存在一个E-box(+22bp～+27bp)，这个下游的E-box可以被Myc和Mad1结合，分别发挥激活和抑制hTERT基因转录活性的作用。最新的研究认为，hTERT基因启动子转录起始位点下游的E-box序列，是端粒酶阴性细胞负向调节机制的靶向位点，我们在转录起始位点下游添加E-box序列拷贝数，可以明显抑制端粒酶阴性细胞的hTERT基因启动子活性，而在端粒酶阳性的细胞中，E-box序列即有可能转变为能被激活因子如Myc家族成员USF(Upstream stimulatory factor)结合、并激活hTERT基因转录的正向调节位点。同样通过启动子5’端序列截短构建不同的缺失突变体的实验还发现：在hTERT基因启动子核心序列上游还存在一个沉默子(Silencer)，约400bp(-776bp～-378bp)，其间含有多个MZF2(Myeloid-specific zinc finger protein 2)结合单元(Motif)。对这些位点引入突变，结果引起hTERT基因转录的激活，而MZF2的过度表达及与其结合单元的相互作用则可以引起hTERT基因转录的下调和端粒酶活性的降低。实验证明hTERT基因启动子核心序列上游存在的沉默子是hTERT基因的负向调节区，MZF2是hTERT基因的负向调节因子。MZF2不仅在骨髓细胞中表达，在不同组织来源的细胞系中也有表达，表示MZF2对hTERT基因的负向调节功能具有普遍性。这样看来，hTERT基因的表达和端粒酶的活性被多种因素包括激活因子和抑制因子所牢牢控制，其调控的主要部位位于hTERT基因转录的启动子结构区。缺氧反应元件(HRE)

肿瘤细胞不断增殖，其不断增多的肿瘤细胞数导致细胞耗氧量不断增加，因此在实体瘤中普遍存在着缺氧状态，极大多数实体瘤细胞均高效表达转录因子-缺氧诱导因子1α(HIF-1α)，该转录因子可与缺氧反应元件(hypoxia-response element，HRE)结合，促进其转录，因此在实体瘤中缺氧反应元件(HRE)可激活其转录水平，HRE可来源于血管生长因子基因的启动子、促红细胞生成素基因的启动子、葡萄糖载体蛋白1基因的启动子、血红素加氧酶基因的启动子和诱导型一氧化氧合酶基因的启动子等。细胞S期特异性启动子(E2F-1启动子)，

E2F-1基因的表达同细胞周期相关，它是广泛表达的生长调控基因，在细胞S期呈现出峰值转录活性。RB蛋白及RB家族的其它成员，可与E2F-1组成特异性复合体，遇制其激活转录的能力。因而，E2F-1受到RB的下调控。在多种肿瘤细胞中，由于Rb/P16INK4α/cyclin D信号转导途径异常，从而导致E2F-1基因高表达，因此E2F-1顺式作用元件在极大多数肿瘤细胞处于激活状态。甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子

甲胎蛋白是一癌胚蛋白，它主要限于内胚层起源的分化组织(如卵黄囊、胎肝、内脏等)。它的表达水平随组织及发育阶段而有较大的变化。AFP在临床受到关注的原因是因为在大多数肝癌病人AFP血浆浓度增高，一些疾病晚期的病人AFP血浆浓度也升高。病人血浆中AFP增高是由肝细胞癌的AFP表达引起的，在肝癌周围的正常组织未出现AFP的表达。因此，表达AFP基因是肝癌细胞的特性。

据已出版的报道，AFP转录顺式作用元件对产生AFP的细胞相关的细胞蛋白(如转录因子及共同因子)敏感，例如AFP结合蛋白。转录顺式作用元件中至少需包含一个AFP启动子和一个AFP增强子。源自AFP基因的细胞特异性转录顺式作用元件已被鉴定。在5’端距转录起始点上游近的序列中含有AFP调控区(包括启动子、假定沉默子及增强子)。

在AFP调控区中，人AFP增强子位于-3954到-3335之间，人AFP启动子位于-174到+29(均相对于转录起始点)。并置这两种元件可产生一有全面功能的AFP转录顺式作用元件。Ido等描述了在肝癌细胞中特异表达的一长约259bp启动子片段。(nt-230到+29)。AFP增强子位于-3954到-3335之间，包含两个区，分别命名为A和B。启动子区包含了典型的TATA盒和CAAT盒。AFP转录调控元件最好要包含一个增强子区。当然，AFP的转录顺式作用元件含有两个增强子就更好。

关于AFP的转录顺式作用元件可以包含任何数目的结构元件，而不是限于一个启动子，一个增强子；它可以是一个AFP增强子同AFP启动子；或一个AFP启动子同一个异种增强子；或异种启动子同AFP增强子；或前述元件的多重组合。AFP的转录顺式作用元件中的启动子和增强子同编码利益基因的序列可以以任何方向及距离存在，只要元件内AFP细胞特异性转录活性存在。目前构建的腺病毒载体还可包含一个AFP的转录调控元件内源性沉默子，该元件亦可删除。癌胚抗原(CEA)增强子及启动子

CEA是一大小为18000道尔顿、与肿瘤相关的糖蛋白抗原，主要出现在胃肠道内胚层生发的肿瘤，如结直肠癌、胃癌、胰腺癌，在一些其他腺癌如乳腺癌、肺癌亦有表现。由于在大多数CEA阳性肿瘤的病人循环中可以检测到CEA，因而CEA在临床上受到关注。在肺癌，约50％的病例可在循环中检测到CEA，在腺癌CEA的浓度超过20ng/L，近50％的胃癌患者血清CEA阳性。

CEA的5’端序列中呈现出细胞特异性活性。CEA启动子区，位于该基因5’端距转录起点上游的头424个核苷酸，通过在产生CEA细胞比非产生CEA的Hela细胞株表现出更高的启动子活性而展示出它的细胞特异性。另外，细胞特异性增强子区也被发现，可参阅PCT/GB/02456。CEA启动子、假定沉默子及增强子元件似乎包含在距起始转录点14.5Kb的区域中。对CEA基因5’端区域进一步研究发现，距转录起始点上游的两个区(-13.6到-10.7Kb，-6.1KbA到-4.0Kb)，当它们同多聚体化启动子相连时，可使报告基因在产生CEA的Lovo及SW1463细胞株的表达增高且具特异性。Richard等也将启动子定位于距转录起始点-90bp到+69bp之间的区域，其中-41bp到-18bp之间的序列对表达来说是必需的。PCT/GB/02546描述了一系列5’端呈现细胞特异性的片段，包括如下序列：nt-299到nt+69；nt-90到nt+69；nt-13600到-nt10600，nt-6100到nt-3800(均相对于转录起始点而言)。另外，通过CEA基因中的-402到+69的片段也可使相连基因具有组织特异性转录活性。

这里所提及的用到载体上的CEA的顺式作用元件来自哺乳动物细胞，包括但不局限于人类细胞。因此，只要载体中必需功能区存在，任何一种CEA的顺式作用元件皆可被利用。酪氨酸酶增强子及启动子

人酪氨酸酶基因在黑色素细胞特异性表达的顺式作用元件。该元件含有一长约20bp名为酪氨酸酶远端元件(TDE)的序列，包含-CATGTG序列，位于距转录起始点的-1874到-1835之间。一包含人酪氨酸酶基因从-209到+61间序列的启动子，被发现可以引导基因在黑色素细胞的特异性表达。与此相似，小鼠酪氨酸酶5’端也有类似的一段序列登录基因库。小鼠的TRP-1基因的最小启动子已被识别，包括对于转录起始点-44到+107之间的序列。

在一些实例中，来自人酪氨酸酶基因5’端的序列的黑色素细胞特异性的转录调控元件包含了相对于转录起始点-231到+65，或含有-1956到-1716之间的序列。黑色素细胞特异性的转录调控元件还可以包括以上两个并置的序列。据报道，距人酪氨酸酶转录起始点-1956到-1716间的序列能协同同种或异种启动子所启动的可操作连接报告基因在黑色素细胞特异性表达。因而，在一些实例中，黑色素细胞特异性的转录调控元件包含了异种启动子及通过操作与之相连的从-1956到-1716间的序列。尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)增强子及启动子

uPA蛋白及其受体uPAR，在大多数常见肿瘤中有表达，且在肿瘤的转移过程中发挥着重要的作用。它们涉及乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、子宫癌。有关uPA及uPAR的转录顺式作用元件的序列已得到广泛的研究。ErbB2增强子及启动子

其为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。C-erbB2/neu基因为一转化基因，它编码-185KD的同上皮生长因子受体相关的跨膜蛋白。在人类，C-erbB2/neu蛋白在胎儿发育过程中表达；在成人，这种蛋白用免疫组化的方法在许多正常组织上皮难以检测到。C-erbB2/neu基因的扩增及过度表达，同人类的许多肿瘤相关，如乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、胃癌及肺癌。在乳腺癌及卵巢癌，C-erbB2/neu蛋白过度表达的后果已得到充分的研究。C-erbB2/neu蛋白在20∽40％的乳腺癌及30％的卵巢癌中过度表达，它同这两种类型疾病较差的预后相关。

人、大鼠、小鼠的C-erbB2/neuTREs已被识别且表现出针对表达C-erbB2/neu细胞的特异性转录活性。

ErbB3增强子及启动子，其为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。

ErbB4增强子及启动子，其为乳腺癌及胃癌细胞特异性激活增强子及启动子。DF3乳腺癌相关抗原(MUC1)增强子

其为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。MUC1基因的蛋白产物(已知的有粘蛋白、MUC1蛋白、表皮涎素、多形表皮粘蛋白或PEM；EMA；DF3抗原；NPGP；PAS-O或CA15.3抗原)通常在胃、胰腺、肺、气管、肾脏、子宫、唾液腺、乳腺的腺体及管道的上皮细胞的顶端表达。在人类约75∽90％的乳腺癌中可发现粘蛋白的过度表达。粘蛋白的表达调控同乳腺癌的分化程度有一定关系。

MUCI基因在人乳腺癌细胞株MCF-7和2R-75-的过度表达似乎发生在转录水平上。MUCI基因的调控序列，包括距离转录起始点上游0.9Kb的序列已被克隆，其中包含的一顺式作用元件似乎同细胞特异性转录相关。

MUC1-的转录顺式作用元件从哺乳动物细胞取得，包括但不限于人类细胞，当然优先在人类细胞表达。MUC1的转录顺式作用元件包含MUCI基因5’端的全部0.9Kb的序列。MUCI的转录顺式作用元件也可包含了同启动子相连的如下序列(均相对于MUCI转录起始点而言)：-725到+31，nt-743到nt+33，nt-750到nt+33及nt-598到+485等。前列腺素特异性抗原增强子及启动子

该前列腺素特异性抗原增强子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的nt-5322～nt-3739，启动子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的nt-540～nt+12，该增强子与启动子特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。腺血管舒缓素增强子及启动子

其可被特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。

爱泼斯坦氏-巴尔氏病毒(Epstein-Barr virus，按常规简称为EB病毒)中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子、在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。

本发明提供了一类能特异性杀灭肿瘤细胞的增殖型重组病毒，它至少有一个病毒增殖必需基因的转录受肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件有效控制，其中在病毒增殖必需基因的转录起始位点与编码起始位点之间区域插入所述顺式作用元件。该顺式作用元件特异性在肿瘤细胞内激活，产生转录活性，而在正常细胞内不激活，不能产生转录活性。该顺式作用元件可以是下述顺序之一：端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子，缺氧反应元件，细胞S期特异性启动子(E2F启动子)，甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增强子，EB病毒BamHI C-启动子。上述病毒增殖所必需的为病毒早期表达基因。在本发明的一个实施方案中，使用单纯疱疹病毒，其病毒增殖必需基因含有早早期表达基因ICP4。在本发明又一实施方案中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因至少含有以下一个腺病毒的早期表达基因：E1A、E1B、E2、E4。

(2).病毒在正常细胞复制必需而在肿瘤细胞中非必需的基因编码的蛋白功能选择性地缺失：

正常细胞与肿瘤存在着某些基因表达上的差异，某些病毒在正常细胞内复制所必需的基因，在肿瘤细胞内并不需要，因此，去除这些基因编码的蛋白功能有望使在肿瘤细胞内特异性复制，而不能在正常细胞中复制。

病毒蛋白功能缺失可以是以下任何一种：腺病毒E1B 55kDa的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1B 55kDa蛋白质功能异常。腺病毒E1B 19kDa的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1B 19kDa蛋白质功能异常。腺病毒E1A的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1A蛋白质功能异常。单纯疱疹病毒ICP6基因点突变、缺失突变、插入突变导致ICP6的蛋白质功能异常。单纯疱疹病毒ICP34.5基因点突变、缺失突变、插入突变导致ICP34.5的蛋白质功能异常。

(3).依赖于肿瘤细胞某个信号转导途径异常而产生的病毒复制：

呼吸道肠道过滤性病毒(Reovirus)感染后其早期病毒基因转录可激活双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)，而该激酶可抑制该病毒的其它基因的转录，从而使病毒不能有效复制，当细胞中Ras处于激活状态则可抑制该激酶，从而使该病毒活跃复制。Ras基因是一个癌基因，当它被不正常激活时，即可能发生癌变。呼吸道肠道过滤性病毒复制及增殖依赖于Ras异常激活的信号途径，即在Ras高表达的肿瘤细胞内复制及增殖。

(4).选择性进入肿瘤细胞：

改变它们表面的结合蛋白可使其与某些特定的肿瘤组织结合，从而使病毒只能感染特定的肿瘤组织。目前这方面改造主要集中于腺病毒外壳蛋白--纤维蛋白(Fiber)、五邻体(penton)及六邻体蛋白(hexon)，尤其在纤维蛋白中头部HI环中或C末端最常见，包括插入肿瘤膜表面具有高亲和力的某种配体、短肽及治疗肿瘤的抗体或抗体片段Fab区域。

本发明提供一类重组病毒，本发明所述的病毒中，编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有治疗肿瘤作用的抗体或抗体片段蛋白，均可被用于本发明。其编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：编码抗新生血管生成的抗体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞生长因子受体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞膜抗原的抗体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列。

抗体(Ab)是一种对特异抗原的结合特异性的糖蛋白。天然抗体约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链与重链通过一个共价二硫键与相连。每条重链是由一个可变区(VH)和多个恒定区组成。每条轻链是由一个可变区(VL)和一个恒定区组成；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。

抗体的可变区中较为保守的区域称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，在4个框架区中间夹了3个高变区，它们大致上成β-折叠构型，由三个高变区相连。每条链中的高变区通过FR区紧密的靠在一起并与另一链的高变区一起形成了抗体的抗原结合部位。

抗体的高变区(CDR)指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”即“CDR”的氨基酸残基。

恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应子功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段有单个抗原结合位点)以及一个残余的“Fc”片段(该名称反映了其容易结晶的能力)。用胃蛋白酶处理产生了一个F(ab’)₂片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联。

“Fv”是最小的抗体片段，它含有全部抗原识别和结合位点。该区域由非共价地紧密结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚物组成。在该构型中，各可变区中的三个高变区相互作用，在VH-VL二聚物表面上界定了抗原结合位点。6个高变区共同组成抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv的一半，它只包含对抗原有特异性三个可变区)，也能识别并结合抗原，只是其亲和力比完整的结合位点低。

Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1区的羧基端多几个残基(包括来自铰链区的一个或多个半胱氨酸)。Fab’-SH在本文表示恒定区的半胱氨酸残基携带了游离巯基的Fab’。F(ab’)₂抗体片段最初是以Fab’片段对的形式产生的，在其间有铰链半胱氨酸。

抗体片段包括完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本发明提供一类重组病毒，其特征在于所述治疗肿瘤的抗体或抗体片段为编码抗新生血管生成的抗体或抗体片段的核苷酸序列，本发明所述的病毒中，编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗新生血管生成的抗体或抗体片段蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗新生血管生成的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：抗血管内皮生长因子的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗血管内皮生长因子受体2的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗整合素的αvβ3的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抑制新生血管内皮生成的抗体或抗体片段的核苷酸序列。

血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中起关键作用，它通过促进血管生成从而在肿瘤生成及转移中发挥重要作用。抗血管内管生长因子的抗体及抗体片段可阻断血管内皮生长因子与其受体(特别血管内皮生长因子受体2)结合，抑制肿瘤新生血管的生成，从而抑制肿瘤的生长及转移。美国Genentech公司的抗血管内皮生长因子的嵌合性抗体(Avastin，另一个名称为Bevacizumab)已处于晚期实体瘤的III期临床试验阶段。美国ImClone Systems公司的针对抗血管内皮生长因子受体2(KDR)的抗体IMC-1C11已进入肿瘤的I期临床试验。整合素的αvβ3通过细胞间基质与内皮细胞之间信号传递从而参予新生血管的生成，抗整合素的αvβ3的抗体可抑制新生血管生成，从而抑制肿瘤的形成。

本发明提供一类重组病毒，其特征在于所述治疗肿瘤的抗体或抗体片段为编码抗肿瘤细胞生长因子受体的抗体或抗体片段的核苷酸序列，本发明所述的病毒中，编码抗肿瘤细胞生长因子受体的抗体或抗体片段的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗肿瘤细胞生长因子受体的抗体或抗体片段蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗肿瘤细胞生长因子受体的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：抗表皮生长因子受体1的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗表皮生长因子受体2的抗体或抗体片段的核苷酸序列。

人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor)在多种恶性肿瘤细胞转化上起关键作用，它在多种肿瘤细胞中过表达。人表皮生长因子受体也被称为ErbB受体，目前已有四个成员被识别，分别表皮生长因子受体1(HER1，又称为ErbB1或EGFR)、表皮生长因子受体2(HER2，又称为ErbB1或Neu)、表皮生长因子受体31(HER3，又称为ErbB3)及表皮生长因子受体4(HER4，又称为ErbB4)。阻断表皮生长因子受体信号传导可抑制肿瘤细胞生长。美国ImClone Systems公司的针对表皮生长因子受体1嵌合抗体IMC-C225对多种晚期肿瘤有明显的治疗作用，目前该抗体已在III及IV期临床试验。美国Genentech公司的针对表皮生长因子受体1的人源化抗体Herceptin(又称为Trastuzumab)已于1998年美国FDA批准进行临床应用，它与化疗联合产生明显的临床疗效。该公司的另一个针对表皮生长因子受体2的人源化抗体2C4亦已进入I期临床试验。

本发明提供一类重组病毒，其特征在于所述治疗肿瘤的抗体或抗体片段为编码抗肿瘤细胞膜抗原的抗体或抗体片段的核苷酸序列，本发明所述的病毒中，编码抗肿瘤细胞膜抗原的抗体或抗体片段的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗肿瘤细胞膜抗原的抗体或抗体片段蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗肿瘤细胞膜抗原的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：抗CD20的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗MUC1的抗体或抗体片段的核苷酸序列。

美国Genentech公司的抗CD20的嵌合抗体Rituxan(又称为Rituximab)用于治疗B-细胞淋巴瘤，已于1997年批准临床正式应用。MUC1广泛存于多种肿瘤中，美国Antisoma公司抗MUC1人源化抗体已进入临床试验。

本发明提供一类重组病毒，其特征在于所述治疗肿瘤的抗体或抗体片段为编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列，本发明所述的病毒中，编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗肿瘤抗原的独特型单克隆抗体或抗体片段的蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：抗17-1A的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗癌胚抗原的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗GD3的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗MUC1的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列。

抗独特型单克隆抗体(anti-idiotypic mAb，也可用Ab2表示)又称之抗个体基因型抗体，它模拟肿瘤细胞表面的抗原，可引起细胞毒T细胞和辅助T细胞反应，从而达到治疗肿瘤的目的。17-1A在上皮来源的肿瘤细胞内高表达，德国于1997年已批准由GlaxoWellcome/Centocor公司生产的抗17-1A独特型单克隆抗体(Panorex)用于治疗结肠癌。美国ImClone Systems公司的针对抗的GD3的独特型单克隆抗体BEC2抗体IMC-1C11已进入肿瘤的III期临床试验。

本发明提供一类的重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：Ig G的核苷酸序列或Ig M的核苷酸序列。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同两类(称为kappa(κ)和lambda(λ)中一类。

根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgGT和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-1和IgA-2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区称为α、β、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

本发明提供一类重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：单链抗体的核苷酸序列，Fv的核苷酸序列，Fab’的核苷酸序列，Fab的核苷酸序列，单链抗体的核苷酸序列或F(ab’)₂抗体中抗原结合区的核苷酸序列，二体抗体的核苷酸序列，线性抗体的核苷酸序列。

Fab片段亦包括轻链的恒定区和重链的第一恒定区域(CH1)。Fab’和Fab片段的不同在于重链CH1区的羧基末端多了一些氨基酸残基，这其中包括来自铰链区的一个或几个半胱氨酸。F(ab’)₂抗体片段最初来自于由铰链区半胱氨酸相连的成对Fab’片段。

Fv片段是包含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段，它是由一个重链可变区和一个轻链可变区通过紧密、共价结合形成的二聚体。在它构像中每一个可变区的三个超变区相互作用从而决定位于VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。因此，六个超变区共同决定其与抗原结合的特异性。然而，即使是单个可变区(或者包含有与抗原特异的三个超变区的Fv片段的一半)也有识别和结合抗原的能力，尽管它的亲和力比整个结合位点来得低。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL区，它们结合成单个多肽链的形式。一般来说，该Fv多肽链还包含VH和VL之间的多肽连接物，以使sFv形成能与抗原结合的理想构形。

二体(Diabodies)是包括两个抗原结合位点的抗体小片段。重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接成同一条多肽链，所用的连接物非常短，使得同一条链上的两个可变区不能相互配对。这样，一条链上的可变区只得与另一条链上的互补区配对结合，从而形成两个抗原结合位点。

线性抗体(Linear antibody)可以是双特异性或单特异性＿，是由首尾相连的一对Fd片VH-CH1-VH-CH1)构成，从而形成一对抗原结合位区。线性抗体可以是双特异性或单特异性。

本发明提供一类重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：人的抗体的核苷酸序列，人源化的抗体的核苷酸序列，嵌合抗体的核苷酸序列。

本发明提供一类重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列可与抗癌基因的核苷酸序列产生融合基因的核苷酸序列，该抗癌基因为血管抑制基因、细胞因子基因、前药转换酶基因及细胞毒性基因之一种。

其抗癌基因可以是血管抑制基因，血管抑制基因抑制肿瘤新生血管形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，从而导致肿瘤细胞因营养不足而死亡，肿瘤明显萎缩乃至完全消褪。同时抑制肿瘤新生血管的形成，也达到阻断肿瘤转移的通路的目的。其中所述的血管抑制基因可以是：内皮抑素基因，血管生成抑素基因，血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构、Kringle1-5结构、Kringle1-3结构、Kringle1-3加上Kringle5结构、血小板反应蛋白基因、血小板因子4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因及纤维结合素基因。

其抗癌基因可以是细胞因子基因，细胞因子基因具有激活免疫细胞，增加造血功能等，细胞因子基因选自：白细胞介素2、白细胞介素12、粒-单集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、Light及Flt3配体。

其抗癌基因可以是前药转换酶基因，前药转换酶基因可使无毒性药物转变成毒性药物，从而增强对肿瘤细胞的杀伤。所述的前药转换酶基因可以是：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶、细菌β-内酰胺酶及大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶；

其抗癌基因可以是细胞毒性基因，可以是：绿脓杆菌外毒片段。

本发明提供一类重组病毒，其中编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列受启动子控制。该启动子可以为以下启动子之一：猴病毒40(Simian virus40，按常规简称为SV40)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，按常规简称为RSV)LTR启动子及人巨细胞病毒(按常规简称为HCMV)IE启动子等。

本发明在上述这种修饰病毒基因组中非增殖必需区域插入编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列，本发明所述的编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列为编码抗新生血管生成的抗体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞生长因子受体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞膜抗原的抗体或抗体片段的核苷酸序列。随着病毒在肿瘤细胞内复制，使编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加，使肿瘤细胞高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段，从而抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤形成、生长及转移。同时，这种修饰后的病毒载体可被用于在某些细胞混合物中杀灭某种特殊靶细胞，通过给予修饰后的病毒能选择性地在该种靶细胞中增殖，从而使这种靶细胞被增殖的病毒选择性的杀灭；在体外培养或在动物体内通过将修饰后的病毒与细胞复合物混合，病毒只能在靶细胞增殖，也就是说除了靶细胞，其它细胞不能被这种病毒杀死。由于病毒在靶细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中的该靶细胞被杀灭，一旦靶细胞被破坏，病毒不能够再增殖。

本发明的又一方面，提供了一种利用本发明的病毒治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其包括如下步骤：1)将该病毒体外或体内感染肿瘤细胞，2)使病毒基本上限于肿瘤细胞内选择性复制及增殖，导致在肿瘤细胞内编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加及治疗肿瘤的抗体或抗体片段表达量增加；由此抑制肿瘤血管的形成，特异性直接杀灭肿瘤细胞，抑制肿瘤形成、生长及转移。本发明中所述的哺乳动物包括但不限于人，猴，牛，羊，猪，犬，猫等等。

在本发明的又一方面，还提供了一种利用本发明的病毒治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其中还包括在本发明所述病毒感染肿瘤细胞之前、同时和/或之后施用化学抗肿瘤药物。

为了进一步提高治疗效果，本发明提出的高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒可以与常规化疗药物(如顺铂、5-氟脲嘧啶丝裂霉素C等)、生物毒素(如蛇毒素)、单克隆治疗肿瘤的抗体或抗体片段一起用于治疗肿瘤，其作为抗肿瘤药物效果更好。在本发明的又一实施方案中，本发明的病毒与X-线联合应用，可产生更为有效的抗肿瘤效应。

本发明提供一类重组病毒，所述病毒本身通过在肿瘤细胞中的复制和增殖，可以特异性抑制肿瘤细胞的生长。

本发明提供一类重组病毒，用于体外感染肿瘤细胞，病毒在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加及治疗肿瘤的抗体或抗体片段表达量增加。

本发明提供一类重组病毒，可用于体内选择性地在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加及其表达量增加，抑制肿瘤形成、生长及转移。同时该病毒能在而且仅限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。

本发明再一方面，提供了本发明所述的病毒用于抑制肿瘤细胞的生长的用途。

重组病毒向靶细胞的送递有多种方式，包括但不限于脂质体，本领域熟知的常规转染方法(如磷酸钙沉淀或电穿孔)，直接注射，及静脉内灌注。送递方法主要取决于特定重组病毒(包括其形态)以及靶细胞的类型和位置(即细胞在体外还是在体内)。

若使用包装的重组病毒，则其可在适当的生理学上可接受载体中以剂量约10⁴至约10¹⁴给予。感染复数通常范围是约0.001至100。若所给予的是多核苷酸(即未包装成病毒)，则其剂量可以是约0.01μg至约1000μg。具体的给药量可根据该病毒的有关常识(可方便地得自如已公布的文献)而定，亦可凭经验确定。重组病毒的给予可以是一次，也可以是多次，这取决于其目的用途和宿主的免疫应答能力，还可多重地同时注射给药。若不期望产生免疫应答，则可用各种免疫抑制剂减少免疫应答，以便能重复给药而不产生强免疫应答。

本发明还包括内含本文所述重组病毒的组合物，如药物组合物。这类组合物可体内给药。优选地，这些组合物更进一步包含药物学上可接受的赋形剂。这些可包含有效量的本发明重组病毒于药物学上可接受的赋形剂中的组合物适于以单位剂量形式、无菌的胃肠道外溶液或悬浮液、无菌的非胃肠道外溶液或口服液或悬浮液，水包油或油包水乳液等全身性给药于个体。非胃肠道外和胃肠道外药物送递配方为本领域已知，可参见Remington’s药物科学，18版，Mack Publishing(1990)。药物组合物还包括本发明重组病毒的冻干形式和/或重建形式(包括包装成病毒的那些)。

本发明还提供治疗方法，其中将有效量的本文所述重组病毒施用于个体。应用重组病毒的治疗方法可用于肿瘤(如肝细胞癌)患者。还可用于肿瘤高危人群，如那些有此类病的家族史和/或有已切除或以其它形式(如化疗)治疗过的疾病的个体。决定是否适于施用本发明的重组病毒将特别依据可评估的临床参数，如血清学指标及组织活检样品的组织学检查。通常施用含重组病毒的药物组合物。药物组合物如上述。

重组病毒的用量取决于多种因素，如具体的重组病毒类型，给药途径，个体的身体状况，疾病发展程度，所用的具体肿瘤治疗基因。

若施用包装的重组病毒，则用量为约10⁴至约10¹⁴，优选约10⁴至约10¹²，更优选约10⁴至约10¹⁰。若施用多核苷酸，则用量为约0.01μg至约100μg，优选0.1μg至约500μg，更优选约0.5μg至约200μg。可同时或先后施用不止一种重组病毒。通常是周期性给药，同时监控任何反应。可经如肿瘤内、静脉内或腹膜内给药。

与现有的肿瘤治疗方法相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供一类治疗肿瘤的重组病毒，动物实验证明，这种重组病毒可用于治疗肿瘤。

本发明提供一类高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的构建方法。该方法通常易行可用于构建高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒。

本发明提供一种在体内及体外杀灭肿瘤细胞、而基本上不影响正常细胞，并在体内及体外肿瘤细胞内高效表达治疗肿瘤的抗体或抗体片段，与化学抗肿瘤药物结合，更有效地杀灭肿瘤细胞，达到高效低毒应用于治疗肿瘤的目的。

人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本发明以腺病毒C亚属中的5型(Ad5)作为例证，对本发明加以进一步具体说明，本发明构建手段均是现有技术人员能够实现。

具体实施方式

例1：携带端粒酶催化亚基基因启动子的克隆载体的构建。

自新鲜的正常人肝组织中抽提基因组DNA，应用巢式多聚酶链反应(PCR)技术扩增端粒酶催化亚基基因启动子(方法参见PCR Protools Current Methods and Applications，WhiteBA主编，Humana Press Inc.1993年出版-文献1)，在启动子5’端入EcoR I、Not I及Bgl I三个酶切位点，在启动子3’端加入Xho I、BamH I两个酶切位点。

引物1：CGG GCT CCC AGT GGA TTC

引物2：AAC GTG GCC AGC GGC AGC ACC TC

引物3：GGA ATT CGC GGC CGC AGA TCT CAC AGA CGC CCA GGA ACC

引物4：CGG GAT CCTG CT CGA GTG GCC GGG GCC AGG GCT TC

引物1与引物2进行第一次PCR扩增，回收370bp片段，再用引物3与引物4对370片段进行第二次PCR扩增，回收270bp片段，应用EcoR I+BamH I对酶切，将该基因插入pUC19载体(购于美国ATCC公司)，将其命名为pUC-hTERTp。

合成含有3×E-box的连接头

引物5：TCG AGG ACG CAC GTG GGC GCA CGT GGG CGC ACG TGG GAT TTA AAT A

引物6：AGC TTA TTT AAA TCC CAC GTG CGC CCA CGT GCG CCC ACG TGC GCC T

将引物5与引物6进行变性，复性，应用磷酸激酶进行磷酸化，将其插入pUC-hTERTp中Xho I与Hind III酶切位点(方法参见分子克隆实验指南第二版，J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社.1996年出版-文献2)。将该质粒进行测序，其测序结果见下：gaattcgcgg ccgcagatct cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgt ggcggaggga ctggggacccgggcacccgt cctgcccctt caccttccag ctccgcctcc tccgcgcgga ccccgccccg tcccgacccctcccgggtcc ccggcccagc cccctccggg ccctcccagc ccctcccctt cctttccgcg gccccgccctctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgct gcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccactcgacgcacg tgggcgcacg tgggcgcacg tgggatttaa ataagct

结果表明端粒酶催化亚基基因启动子正确，将其命名为pUC-hTERT-Ep，该端粒酶催化亚基基因启动子含有人端粒酶催化亚基基因启动子中nt-213至nt+47以及在其下游加入了3个E-box序列，并在整个启动子的上游序列中加入了Not I与Bgl II酶切位点，在整个启动子的下游序列中加入了Swa I酶切位点。

例2：可携带抗癌基因的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的减毒增殖腺病毒载体的构建。

pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在该载体中552bp处创立7个新的、唯一的酶切位点，分别为Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、Xho I和Swa I，该位点位于E1A起始密码前12bp，其方法采用定位突变双次PCR技术(方法参见前述文献1)。其引物分别为

引物7：5’-引物(含有EcoR I酶切位点)TTC AAG AAT TCT CAT GTT TG

引物8：3’-引物(在5’端加入ATT TAA ATC TCG AGT CGA CAC TAG TGC GGC CGC

TTC GAA CCG GT)ATT TAA ATC TCG AGT CGA CAC TAG TGC GGC CGC TTC GAA

CCG GTG TCG GAG CGG CTC GGA

引物9：5’-引物(在5’端加入ACC GGT TCG AAG CGG CCG CAC TAG TGT CGA CTC

GAG ATT TAA ATC CGG)ACC GGT TCG AAG CGG CCG CAC TAG TGT CGA CTC GAG

ATT TAA ATC CGG TGA CTG AAA ATG AGA CAT ATT A

引物10：3’-引物(含有Xba I酶切位点)TTC TCT AGA CAC AGG TGA TG

采用定位突变双次PCR技术，PCR产物片段插入pGEM-T-easy载体中(方法参见Promega公司操作说明书)，命名为pGEM-T-E1a。将该片段进行DNA测序，其测序结果显示：在pXC.1质粒bp552位点中插入TTC GAA GCG GCC GCA CTA GTG TCG ACT CGA GAT TTA AAT CCG GT，从而产生7个新的Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、Xho I和Swa I酶切位点，其它序列与pXC.1相同。应用EcoR I与Xba I双酶切pGEM-T-E1A及pXC.1质粒，将pGEM-T-E1A中切出片段插入pXC.1质粒中EcoR I及Xba I位点中，使pXC.1中552插入一个TTC GAA GCGGCC GCA CTA GTG TCG ACT CGA GAT TTA AAT CCG GT，从而产生7个Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、Xho I和Swa I酶切位点，该位点位于E1A起始密码前12bp，将该质粒命名为pQW。

pUC-hTERT-Ep分别用Not I+Swa I酶切，其酶切片段分别插入pQW质粒中Not I+Swa I酶切位点中，分别应用引物4及7进行PCR扩增，扩出1310bp，这表明端粒酶催化亚基基因启动子已正向插入pQW质粒Not I+Swa I位点，即腺病毒5型E1A起始密码子上游区12bp处，命名为pQW-hTERT-Ep。

例3.携带抗人表皮生长因子受体1的嵌合抗体YQ100基因的E1区缺失的腺载体的构建

pCA13载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信号。抗人表皮生长因子受体1的嵌合抗体YQ100由上海申能博彩生物科技有限公司进行全长基因合成，其轻链基因与重链基因的可变区与美国ImClone.Systems公司的针对表皮生长因子受体1嵌合抗体IMC-C225的轻链基因与重链基因的可变区相同。含有YQ100重链基因并在重链上游区引入EcoR I+Spe I酶切位点和重链下游区引入BamH I酶切位点的pUC19质粒命名为pUC-YQ100H。含有YQ100轻链基因并在轻链上游区引入EcoR I和轻链下游区引入Spe I及Xba I两个酶切位点的pUC19质粒为pUC-YQ100L。YQ100的重链基因的核苷酸序列ACCATGGCTGTCTTGGCGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTCCTATCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTACTATGATTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGATACCCTTATGATTTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCTGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGATAAYQ100的轻链基因的核苷酸序列ACCATGAGGGCCCCTGCTCAGTTTCTTGGCTTCTTGCTTTTCTGGATTCCAGCCTCCAGAAGTGACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGTCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACAAACATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAATAATAACTGGCCAACCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTGAGTGGATCCTTCTAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAA

应用EcoR I+Xba I将pUC-YQ100H切下，定向插入pCA13载体EcoR I+Xba I中，命名为pCA13-YQ100H。应用EcoR I+Spe I将pUC-YQ100H切下，定向插入pCA13-YQ100H载体EcoR I+Spe I中，命名为pCA13-YQ100HL。

应用PCR技术扩增脑心肌炎病毒(EMCV)的多顺反子(IRES)，其脑心肌炎病毒病毒(EMCV)的多顺反子(IRES)来源于质粒pIRES-EYFP，该质粒购于美国Clontech公司，

用来扩增EMCV病毒IRES中的引物如下：

引物11：CCG GAA TTC ACT AGT GAT GAA TTG CCC CTC TCC CTC

引物12：CGC GGA TCC ACT AGT TTA ATC ATC GTG TTT TTC AAA GGA

应用PCR技术扩增，其PCR产物经EcoR I+BamH I双酶切，插入pUC19质粒中，经测序完全正确，命名为pUC-IRES。

再将含有脑心肌炎病毒的多顺反子的pUC-IRES用Spe I酶切，插入pCA13-YQ100H+L载体的Spe I酶切位点中，应用PCR验证其正反方向。

引物13：TTA TCA ACA CTC TCC CCT GTT G

应用引物11与引物13进行PCR，能扩增出长度为1300bp，表明脑心肌炎病毒的多顺反子(IRES)已正向插入pCA13-YQ100H+L，命各为pCA13-YQ100

例4：携带抗人表皮生长因子受体1的嵌合抗体YQ100基因的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒载体的构建：

应用Bgl II分别酶切pCA13-YQ100，回收3445bp(含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有抗人表皮生长因子受体1的嵌合抗体YQ100的轻链及重链基因及脑心肌炎病毒多顺反子、SV40 poly A加尾信号)，将其插入pUC-hTERT-Ep中Bgl II酶切位点，应用PCR技术分别验证其插入的反方向，应用引物11与引物4能扩增到1600bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有抗人表皮生长因子受体1的嵌合抗体YQ100的轻链及重链基因及脑心肌炎病毒多顺反子、SV40 poly A加尾信号反向插入pUC-hTERT-Ep Bgl II酶切位点。命名为pUC-hTERT-Ep-YQ100。

应用Not I和Swa I双酶切pUC-hTERT-Ep-YQ100，回收片段，分别插入pQW-hTERT-Ep中Not I和Swa I酶切位点，分别命名为pQW-hTERT-Ep-YQ100。

例5：携带抗人表皮生长因子受体1的嵌合抗体YQ100基因的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒的重组。

293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pQW-hTERT-Ep-YQ100与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHG10通过Lipofectamine共转染至293细株。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得E1A受端粒酶催化亚基基因启动子控制的腺病毒，并携带人内皮抑素或血管生成抑素，分别命名为Adv-hTERT-Ep E1a-YQ100，分别记为QW-YQ100。

由上述方法构建的重组病毒的列表如下：

病毒名称含Ad5左臂质粒含Ad5右臂

质粒

Adv-hTERT-Ep

QY100 pQW-hTERT-Ep-YQ100 PBHG10

E1a-YQ100

腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见前述文献2出版)。Adv-hTERT-Ep E1a-YQ100(QY100)为5型腺病毒，在E1A转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒酶催化亚基基因启动子，并在端粒酶催化亚基基因启动子上游区新建一个Bgl II酶切位点，在该酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有抗人表皮生长因子受体1的嵌合抗体YQ100的轻链及重链基因及脑心肌炎病毒多顺反子、SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。

例7：携带抗人表皮生长因子受体1的嵌合抗体YQ100基因的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒的的体外在具有端粒酶活性的肿瘤细胞增殖、复制及高效表达人源化抗体YQ100基因并特异性杀灭肿瘤细胞。

将QY100分别感染具有端粒酶活性的结肠癌细胞株HT29、293及正常人成纤维细胞，细胞按2×105/孔接种6孔板，分别感染重组腺病毒QY100及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小时后应用293细胞株测定其病毒滴度，具体方法参见前述文献2，结果为：

293 Hep 3B 正常成纤维细胞野生型5型腺病毒 1×10⁵ 6×10⁴ 4×10⁴

QY100 1×10⁵ 3×10⁵ 5×10

将感染的肿瘤细胞株Hep 3B及正常人成纤维细胞分别感染重组腺病毒QW-YQ100，MOI为1，37℃孵育1小时，感染后7天收集细胞，应用QIAamp DNA Blood mini kit(德国QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法参见QIAGEN公司操作说明。将上述QW-YQ100提取的DNA分别应用Bgl II酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人内皮抑素cDNA片段(EcoR I与Xba I双酶切pCA13-YQ100，回收637bp)作为探针，进行souther blot杂交，以pCA13-YQ100作为病毒拷贝数对照(方法参见文献2)，QW-YQ100在结肠癌细胞株HT29及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为2×10⁴及＜10。

例8：携带抗人表皮生长因子受体1的嵌合抗体YQ100基因的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒在裸鼠体内治疗移植肿瘤

将4-5周龄的裸鼠皮下接种结肠癌细胞株HT29细胞1×10⁷，两周后给予每次2×10⁸pfu，共5次，增殖型重组腺病毒QY100治疗或用相同剂量的对照腺病毒Ad5-Lac Z，其未治疗组及对照腺病毒治疗组4周后肿瘤体增加3倍以上，而治疗组则肿瘤增大不明显。

Claims

1.一种高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于该病毒基因组中包含一种编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列，该病毒选自：

1)在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；

2.根据权利要求1所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述病毒增殖必需基因的转录受至少一种肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件的有效控制，其中所述顺式作用元件选自下述中的任一种：端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子，缺氧反应元件，细胞S期特异性启动子，甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增强子，EB病毒BamHI C-启动子。

3.根据权利要求2所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述病毒为腺病毒，该腺病毒增殖必需基因为以下一个腺病毒的早期表达基因之一：E1A、E1B、E2或E4。

4.根据权利要求2所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述病毒为腺病毒，该腺病毒增殖必需基因为一个腺病毒的晚期表达基因。

5.根据权利要求1所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述病毒是一种重组腺病毒，其中该腺病毒E1B55Kda、E1B19Kda和/或E1A基因编码的相应蛋白功能缺失。

6.根据权利要求1所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述病毒是一种重组单纯疱疹病毒，该单纯疱疹病中ICP6、双拷贝ICP34.5基因编码的相应蛋白功能缺失。

7.根据权利要求1所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：编码抗新生血管生成的抗体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞生长因子受体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞膜抗原的抗体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述编码抗新生血管生成的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：抗血管内皮生长因子的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗血管内皮生因子受体2的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗整合素的αvβ3的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抑制新生血管内皮生成的抗体或抗体片段的核苷酸序列。

9.根据权利要求7所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述编码抗肿瘤细胞生长因子受体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：抗表皮生长因子受体1的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗表皮生长因子受体2的抗体或抗体片段的核苷酸序列。

10.根据权利要求7所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述编码抗肿瘤细胞膜抗原的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：抗17-1A的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗CD20的抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗MUC1的抗体或抗体片段的核苷酸序列。

11.根据权利要求7所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：抗17-1A的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗癌胚抗原的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗GD3的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列，抗MUC1的独特型单克隆抗体或抗体片段的核苷酸序列。

12.根据权利要求7所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：IgG的核苷酸序列或IgM的核苷酸序列。

13.根据权利要求7所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：单链抗体的核苷酸序列，Fv的核苷酸序列，Fab’的核苷酸序列，Fab的核苷酸序列，单链抗体的核苷酸序列或F(ab’)2抗体中抗原结合区的核苷酸序列，二体抗体的核苷酸序列，线性抗体的核苷酸序列。

14.根据权利要求7所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列可选自下述之一种：人的抗体的核苷酸序列，人源化的抗体的核苷酸序列，嵌合抗体的核苷酸序列。

15.根据权利要求7所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列可与抗癌基因的核苷酸序列产生融合基因的核苷酸序列，该抗癌基因为血管抑制基因、细胞因子基因、前药转换酶基因及细胞毒性基因之一种；其中所述的血管抑制基因可以是下述任一种：内皮抑素基因，血管生成抑素基因，血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构，Kringle1-5结构，Kringle1-3结构，Kringle1-3加上Kringle5结构，血小板反应蛋白基因，血小板因子4基因，纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因及纤维结合素基因；所述的细胞因子基因可以是下述任一种：白细胞介素2，白细胞介素12，粒-单集落刺激因子，肿瘤坏死因子，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，Light及Flt3配体；所述的前药转换酶基因可以是下述任一种：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶、细菌β-内酰胺酶及大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶；所述的细胞毒性基因可以是：绿脓杆菌外毒片段。

16.根据权利要求7所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列的表达还受启动子控制，所述启动子可选自下述之一种：SV40启动子，RSV LTR启动子，人巨细胞病毒IE启动子，肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件。

17.根据权利要求15所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于所述的肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件可选自下述任一种：端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子，缺氧反应元件，细胞S期特异性启动子，甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增强子，EB病毒BamHI C-启动子。

18.根据权利要求1-17任一项所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于将重组病毒体外感染的肿瘤细胞，从而在肿瘤细胞内增殖。

19.权利要求1-17任一项所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于将该重组病毒用于体外感染肿瘤细胞，导致肿瘤细胞毒性。

20.根据权利要求1-17任一项所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于该病毒用于治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其包括如下步骤：1)将该病毒体外或体内感染肿瘤细胞，2)使病毒基本上限于肿瘤细胞内选择性复制及增殖，导致在肿瘤细胞内编码治疗肿瘤的抗体或抗体片段的核苷酸序列拷贝数增加及治疗肿瘤的抗体或抗体片段的表达量增加；由此特异性直接杀灭肿瘤细胞，抑制肿瘤形成、生长及转移。

21.根据权利要求20所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于在权利要求1-18任一项所述重组病毒感染肿瘤细胞之前、同时和/或之后施用化学抗肿瘤药物的步骤。

22.根据权利要求1-17所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于该重组病毒应用于抑制肿瘤细胞的生长。

23.根据权利要求1-17所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于该重组病毒应用于制备治疗肿瘤的药物中的用途。

24.根据权利要求1所述的高效表达治疗肿瘤的抗体的重组病毒，其特征在于该重组病毒应用于与药学上可接受的载体组成药物组合物。