CN100500222C - 肿瘤靶向双基因-病毒、其构建方法及应用 - Google Patents
肿瘤靶向双基因-病毒、其构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种靶向肿瘤的双基因-病毒，其构建方法及其在治疗肿瘤上的应用，其主要是将两个不同的肿瘤靶向基因克隆进质粒的多克隆位点，两基因以连接物连接后用限制性内切酶切出双基因表达框，然后插入肿瘤特异性病毒载体中，再将病毒载体转染细胞后得到双基因-病毒。或者是将两个肿瘤治疗基因的表达框分别插入改造好的含有肿瘤特异性启动子的肿瘤特异性增殖病毒载体的不同位点中；再将两个质粒共转染细胞，通过同源重组产生双基因-病毒。本发明的肿瘤靶向双基因-病毒由于携带两个抗癌基因，且两个基因具有互补或协同的功效，因此可大大增强抗癌能力，能够达到全部消灭肿瘤的作用，可以用于治疗肿瘤。
Description
技术领域
本发明属于基因治疗领域，具体地说，是关于一种肿瘤靶向双基因-病毒、其构建方法及应用。
背景技术
基因治疗是近十多年兴起的一种生物高技术方案，在整个基因治疗方案中，肿瘤基因治疗方案占60％以上，基因治疗曾被认为是人类最终征服肿瘤的希望。目前作为基因治疗的载体分为病毒型和非病毒型两大类。病毒载体包括：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、和疱疹病毒等。病毒载体转染率高，表达时间长，但免疫原性强，有一定危险性。非病毒载体包括：裸露DNA、脂质体和其它物质包裹的DNA。非病毒载体则免疫原性小及安全性好，但转染率低，基因稳定性差，表达时间短。目前使用最多还是病毒载体。病毒载体又有两类：一类可以整合到染色体：如逆转录病毒、腺相关病毒、慢病毒。另一类则不能整合到染色体，如腺病毒、单纯疱疹病毒及EB病毒。在病毒载体中使用最多的还是腺病毒(Adv)载体，Adv有A、B、C、D、E、F等6大类，49个血清型，其中C类血清型2合5用得最多，腺病毒基因组全长36Kb，分早期基因(E)和晚期基因(L)，如果将早期基因E1区(约4Kb)缺失掉(有时还加上E3区3.6Kb的部分缺失)，则称为第一代基因治疗载体，这是常用的载体。第二代Adv除E1区等缺失外，还有E4、E2A区缺失以降低其免疫原性，但现在很少有人用。第三代无肠腺病毒Gutless Adv(简称为GL-Adv)载体则是将Adv的所有基因全部去除，仅保留两端的反向末端重复顺序(ITR)及装配基因，它没有抗原性，不会被抗体清除掉，故有长期疗效。腺相关病毒(AAV)是一种免疫原性极小的单链DNA病毒，它可以定点插入到染色体上，在目前使用中未发现任何毒付作用和致癌性。逆转录病毒(RTV)、慢病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、EB病毒也是较为常用的病毒载体。
基因治疗的载体是将基因送到目的处，以发挥治疗(如抗癌)作用。基因治疗载体是关键，另一要素是基因，有关肿瘤治疗基因可以是抑癌基因、细胞因子基因等。
临床上肿瘤的基因治疗方案有几百种，但没有重大进展，而肿瘤的病毒治疗却取得重大突破。没有ONYX医药公司研制出的突变腺病毒(ONYX-015，也叫d11520)，乃将腺病毒基因组的E1b55K蛋白基因缺失，使得该突变的腺病毒能在p53缺失的肿瘤细胞内进行大量复制，而在正常细胞内不能复制。应用ONYX-015，联合常规的化学疗法治疗头颈癌患者，总有效率达63％(Nature Medicine，6：879，2000)。但单独使用ONYX-015(不与化疗结合)，疗效只有15-20％。为了克服单独使用ONYX-015疗效不理想的缺点，刘新垣院士于2000年就提出了肿瘤的基因-病毒治疗策略：肿瘤的基因治疗与病毒治疗相结合的策略(中国肿瘤生物治疗杂志，8(1)：1，2001)。即我们首先构建E1B55Kda基因缺失的腺病毒载体ZD55，它与ONYX-015相似，只将基因靶向导入p53缺失的肿瘤细胞，而不进入正常组织细胞，但ZD55含有克隆位点，可以插入外源基因，故比ONYX-015好，我们将不同抗癌杀伤基因装入ZD55载体中构成ZD55-gene，用它进行治疗称之为基因-病毒治疗(Gene-ViroTherapy)。基因-病毒治疗策略已经获得了很好效果，相关内容已经申请了专利。应用此基因-病毒策略时，只用一个基因，但实践证明一个基因还不足以全部消灭肿瘤。
发明目的
本发明的目的就在于将肿瘤的基因治疗与病毒治疗二者的优势结合起来，从而提供一类具有肿瘤靶向，同时又能有效表达两个抗癌基因的重组双基因-病毒。
本发明的另一个目的在于提供一种肿瘤靶向双基因-病毒的构建方法。
本发明的另一个目的在于提供一种肿瘤靶向双基因-病毒用于治疗肿瘤的用途。
发明概要
为达到上述目的，本发明提供了一种抗癌靶向双基因-病毒，该双基因病毒携带有两个肿瘤治疗基因，且两个肿瘤治疗基因在功能上互补或具有协同效应。
本发明并提供了抗癌靶向双基因-病毒的构建方法，其步骤包括：(1)将两个肿瘤治疗基因克隆进质粒的多克隆位点，两基因之间以连接物(核糖体进入位点(IRES)或细胞内源性酶切位点序列(IETD))连接；然后用限制性内切酶切出双基因表达框，该表达框包含CMV启动子、抗癌基因、SV40 poly A尾巴，插入改造好的肿瘤特异性增殖病毒载体中；(2)将改造好的携带肿瘤靶向双基因的病毒载体转染细胞以产生双基因-病毒。
本发明的抗癌靶向双基因-病毒也可以通过以下方法构建：(1)将两个肿瘤治疗基因分别克隆进质粒的多克隆位点，分别以限制性内切酶切出基因表达框，插入改造好的肿瘤特异性增殖病毒载体的不同位点中；(2)将两个质粒共转染细胞，通过同源重组产生含有两个外源基因的双基因-病毒。
其中，所述肿瘤治疗基因包括但不限于：肿瘤坏死因子超家族中的TRAIL基因，抑癌基因，细胞因子基因，促细胞凋亡基因，血管抑制基因，自杀基因和其它基因。
其中，(1)肿瘤坏死因子基因：肿瘤坏死因子超家族中的一员TRAIL，与细胞表面受体结合后，启动细胞凋亡途径，并选择性的促使肿瘤细胞凋亡；
(2)抑癌基因：抑癌基因包括p53、PTEN、Rb、NF1、VHL、APC，抑癌基因能够抑制肿瘤细胞的生长；
(3)细胞因子基因：白细胞介素-2、-12、-24，粒-单集落刺激因子，干扰素-α、-β、-γ；细胞因子具有杀伤肿瘤细胞，激活免疫细胞，增加造血功能等；
(4)促细胞凋亡基因：TRAIL、Bax、Caspase以及Smac等；细胞凋亡是多细胞生物生命活动的重要途径，细胞凋亡途径的异常是机体肿瘤发生的一个重要机制；抑制了细胞凋亡，肿瘤势必要发生；促细胞凋亡基因可加速肿瘤细胞的凋亡，是基因治疗肿瘤的有效基因；
(5)血管抑制基因：血管生成抑素基因(angiostatin)，k5、sflt-1、血管内皮抑素基因(endostatin)；血管抑制基因能干涉新生血管形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，肿瘤因营养不足而萎缩、死亡；
(6)自杀基因：包括大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(cd)，单纯疱疹病毒的脱氧胸腺嘧啶核苷激酶基因(HSV-tk)；
(7)其它基因：血管内皮生长因子可溶性受体sflt-1基因，可竞争性抑制血管内皮生长因子发挥作用。
肿瘤组织特异性启动子包括但不限于：端粒酶逆转录酶催化亚基基团(hTERT)启动子，甲胎蛋白(ATP)启动子，癌胚抗原(CEA)启动子，前列腺特异性抗原启动子和乳腺癌组织特异性启动子。肿瘤组织特异性启动子的使用，使抗癌基因的表达或病毒的复制特异性地在肿瘤细胞中进行而不在正常细胞内进行。
肿瘤特异性增殖病毒载体包括但不限于：肿瘤特异性增殖腺病毒(包括肿瘤特异性启动子调控的腺病毒hTERT-Adv以及ZD55)、AAV、或者GL-Adv等。
本发明的构建双基因-病毒的方法，可以用于开发有效治疗肿瘤的抗癌新药，也可以与其它化合物组成药用组合物，所述化合物可以是：化学治疗药物；生物毒素；免疫抑制化合物，单克隆抗体等。
本发明的有益效果：
1、本发明提供携带两种抗癌基因的重组病毒，经细胞实验证明，抗癌基因可以特异性地在肿瘤细胞中表达，而不在正常细胞中表达。经动物试验证明，可以用于治疗多种肿瘤；
2、本发明提供了携带两种抗癌基因的病毒构建方法，该方法易于掌握；
3、本发明构建的病毒载体，能够非常方便的装入两种外源抗癌基因；使用这个载体能够构建多种携带抗癌基因的双基因-病毒，为肿瘤的基因-病毒治疗提供良好的基础；
4、本发明构建的基因-病毒，是一种肿瘤特异性病毒，能选择性地在肿瘤细胞内复制、增殖和表达所携带的双基因，故该双基因-病毒具有很高的靶向抗癌作用；
5、本发明构建的多种基因病毒经动物试验证明能选择性的杀死瘤细胞，而不影响正常细胞；基因-病毒表达的抗癌基因能加强病毒的抗肿瘤效果；这种新型的双基因-病毒靶向治疗，能基本上全部消除肿瘤，为今后用于人类肿瘤治疗打下了良好基础。
附图说明
图1为本发明的双基因-病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac的构建示意图。
图2为质粒pZhTERT的构建示意图。
图3为双基因病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac在正常细胞或肿瘤细胞中复制能力的示意图。
图4为双基因病毒Ad-hTERT-TRAIL-K5在正常细胞或肿瘤细胞中复制能力的示意图。
图5A、5B为MTT法检测肿瘤细胞(5A)和正常细胞(5B)经不同滴度(MOI)的病毒处理后3天的存活率示意图。
图6A、6B为MTT法检测肿瘤细胞(6A)和正常细胞(6B)经不同滴度(MOI)的病毒处理后3天的存活率示意图。
图7为双基因病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac在裸鼠体内治疗肿瘤细胞移植瘤的结果示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
实施例1、双基因-病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac的构建
TRAIL蛋白可介导肿瘤细胞凋亡，特异性地杀伤肿瘤细胞(Griffith et al.2001，Mol.Ther.4：257-266)。但部分肿瘤细胞对TRAIL蛋白介导的细胞凋亡存在相当高的抗性，相关研究表明，IAP蛋白的高表达是引起诸多肿瘤细胞对TRAIL蛋白不敏感的原因之一。而Smac蛋白可与IAP蛋白结合，从而解除IAP蛋白的抑制性(Du C.et al.2000，Cell102：33-42.)。采用融瘤病毒介导Smac以及TRAIL两种基因，可发挥其协同作用，大大提高对肿瘤的治愈率。
A、肿瘤靶向载体质粒pZD55的构建：
先设计如下引物：
Xba I A引物：5’GCC GAC ATC ACC TGT G TCT AGA GAA TG 3’；
Xba I B引物：5’TCA GAT GGG TTT CTT CAC TCC ATT TAT CCT 3’；
Bgl II A引物：5’ATA AAG GAT AAA TGG AGT GAA GAA ACC CAT CTG AG 3’；
(55KDa基因第三个密码子突变成终止密码子，C2024T)
BglII B引物：5’GA AGA TCT ATA CAG TTA AGC CAC CTA TAC AAC A 3’；
(E1B 55Kda基因读码框突变，C2252T，G2261T加入了两个终止密码子)
pXC1质粒购自加拿大Microbix Biosystem Inc，Toronto。pXC1质粒含有人腺病毒5型(Ad5)从22bp—5790bp(0-16.1mu)的基因序列。
以pXC1质粒为PCR反应的模板，引物Xba I A与Xba I B进行第一次PCR反应(详见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rded.，Joseph Sambrook and David W.Russell)，跑电泳回收719bp片段，得到第一次PCR产物Z1。引物BglIIA与引物BglIIB进行第二次PCR反应(详见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rded.，Joseph Sambrook andDavid W.Russell)，跑电泳回收270bp片段，得到第二次PCR产物Z2。两次PCR反应的产物有34bp的配对序列。
以两次PCR产物混合作为模板，以引物Xba I A与引物Bgl II B进行第三次PCR反应(详见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rded.，Joseph Sambrook and David W.Russell)，跑电泳回收955bp片段，得到第三次PCR产物Z3。
以Xba I+Bgl II酶切第三次PCR产物Z3，克隆进Xba I+Bgl II酶切过的pXC1质粒，得到的新质粒命名为pXC1-D55。
pCA13质粒(购自加拿大Microbix Biosystem Inc，Toronto)含有SV40 poly A加尾信号，以BamH I+Bgl II酶切PCA13载体，跑电泳回收160bp片段，即回收SV40polyA尾巴，将此片段克隆进Bgl II酶切过的pXC1-D55，酶切鉴定，将正向克隆的质粒命名为pZD55。pZD55含有从2268bp-3328bp的缺失突变，缺失E1B55KDa基因。
B、质粒pZD55-TRAIL-IETD-Smac的构建
先设计如下引物：
Smacl：5’CCCAAGCTTATTGAGACAGACGCGGTTCCTATTGCACAGAAA 3’；
HindIII
Smac2：5’AAACTCGAGTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCCTC 3’；
Xho I
TRAIL1：5’ACGCGTCGACATGGCTATGATGGAGGTC 3’；
Sal I
TRAIL2：5’CCCAAGCTTGCCAACTAAAAAGGCCCC 3’；
HindIII
pCA13载体在CMV启动子与加尾信号之间含有多克隆位点，Sal I、Hind III、EcoRI、EcoR V、Xba I、Xho I、BamH I。将肿瘤治疗基因，通过基因操作的方法顺向插入到pCA13的多克隆位点，构建成质粒pCA13-gene(具体操作步骤详见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rded.，Joseph Sambrook and DavidW.Russell)。用Bgl II酶切质粒pCA13-gene，切出该gene的表达框。这个表达框包含CMV启动子、治疗基因及SV40 polyA尾巴。而后将此表达框克隆进Bgl II单酶切并去磷的pZD55质粒，构建成质粒pZD55-gene。
质粒pZD55-TRAIL-IETD-Smac的具体构建步骤如下：
以pCDNA3-Smac质粒(购自武汉三鹰生物技术公司，武汉)为PCR反应的模板，引物Smac1与Smac2进行第一次PCR反应(详见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rded.，Joseph Sambrook and David W.Russell)，跑电泳回收736bp片段。以Hind III+XhoI酶切PCR产物，克隆进Hind III+Xho I酶切过的pCA13质粒，命名为pCA13-Smac质粒。
以pCDNA3-TRAIL质粒(购自武汉三鹰生物技术公司，武汉)为PCR反应的模板，引物TRAIL1与TRAIL2进行第二次PCR反应(详见Molecular Cloning：A LaboratoryManual，3rded.，Joseph Sambrook and David W.Russell)，跑电泳回收866bp片段。以Sal I+Hind III酶切PCR产物，克隆进Sal I+Hind III酶切过的pCA13-Smac质粒，命名为pCA13-TRAIL-IETD-Smac质粒。用Bgl II酶切质粒pCA13-TRAIL-IETD-Smac质粒，切出gene的表达框。这个表达框包含CMV启动子、治疗基因TRAIL和Smac及SV40polyA尾巴。而后将此表达框克隆进Bgl II单酶切并去磷的pZD55质粒，构建成质粒pZD55-TRAIL-IETD-Smac。
用类似方法构建的质粒还有pZD55-TRAIL-IETD-k5、pZD55-TRAIL-IETD-IL-24、pZD55-TRAIL-IETD-IL-12、pZD55-TRAIL-IETD-Omi、pZD55-TRAIL-IETD-Eorf4等。
C.双基因-病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac的构建
质粒pBHG-E3及293细胞购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)。质粒pBHG-E3含有Ad5基因系列但缺失E1区188bp-1339bp系列。293细胞(加拿大MicrobixBiosystem Inc.(Toronto))是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成。它含有表达5型腺病毒的E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。
将pZD55-TRAIL-IETD-Smac(它含有与腺病毒同源重组的左臂序列)与含有腺病毒骨架DNA的质粒pBHG-E3共转染293细胞株，通过同源重组产生具有感染性的含二外源基因的重组腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac(见图1)。具体方法参见Qiagen公司的操作说明。7-14天出现病毒空斑，经过2次病毒空斑纯化，进行扩增，提取重组腺病毒的DNA，进行DNA酶切分析，PCR分析，确定重组正确的腺病毒株。
病毒空斑纯化、扩增、鉴定：293细胞铺于6孔板，24h后细胞接近长满，加入含不同稀释度的病毒，感染2小时后，每孔铺3ml低熔点胶(10％FBS，1.25％Agarose)9天左右就可见空斑。挑取单个空斑，加入接近长满293细胞的24孔板中小量扩增病毒。病毒DNA用Qiagen Blood Kit获得，利用PCR技术，鉴定基因病毒Ad5-ZD55-gene。鉴定所用引物由上海生工合成。(注：序列右侧注明引物与pXC1质粒配对的序列)。
Zd55sense引物：
5’AGA GCC CAT GGA ACC CGA GA 3’； bp2200-2219
Zd55 antisense引物：
5’CAT CGT ACC TCA GCA CCT TCC A 3’； bp3353-3332
以Qiagen Blood Kit抽提所得的病毒DNA作为模板，同时以野生型病毒DNA作为对照，Zd55sense引物与Zd55antisense引物进行PCR反应。PCR条件：94℃×1min，55℃×1min，72℃×2min15s。如PCR产物只含gene，不含1113bp野生型腺病毒DNA，空斑纯化成功。重复此过程一次，得到重组正确的腺病毒。
腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心纯化病毒。具体操作方法见Microbix Biosystem Inc.的操作说明。
用类似方法构建的重组腺病毒还有ZD55-TRAIL-IETD-k5、ZD55-TRAIL-IETD-IL-24、ZD55-TRAIL-IETD-IL-12、ZD55-TRAIL-IETD-Omi、ZD55-TRAIL-IETD-Eorf4等。
实施例2、双基因-病毒ZD55-IL-24-IRES-TRAIL的构建
A、质粒pZD55-IL-24-IRES-TRAIL的构建
先设计如下引物：
IL-24引物：
上游：5‘CGTCGACATGAATTTTCAACAGAGGCTGC 3’；
SalI
下游：5‘GATCTAGACTAGACATTCAGAGCTTGTAG 3’；
XbaI
IRES引物：
上游：5‘AGTCTAGAGCATCTAGGGCGGCCAATTC 3’；
XbaI
下游：5‘TCTCTCGAGCAGATCAGATCCCATACAAT 3’；
XhoI
Trail引物：
上游：5‘CTCAGCTCGAGCATGGCTATGATGGAGGTC 3’；
XhoI
下游：5‘CATGGGATCCCAGGTCAGTTAGCCAACTA 3’
BamHI
以pCDNA3-IL-24质粒(购自武汉三鹰生物技术公司，武汉)为PCR反应的模板，IL-24上游引物与IL-24下游引物进行第一次PCR反应(详见Molecular Cloning：A LaboratoryManual，3rded.，Joseph Sambrook and David W.Russell)，跑电泳回收628bp片段。以SalI+XbaI酶切PCR产物，克隆进SalI+XbaI酶切过的pCA13质粒，命名为pCA13-IL-24质粒。
以pIRESPROU质粒(购自加拿大Microbix Biosystem Inc，Toronto)为PCR反应的模板，IRES上游引物与IRES下游引物进行第二次PCR反应(详见Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rded.，Joseph Sambrook and David W.Russell)，跑电泳回收585bp片段。以XbaI+XhoI酶切PCR产物，克隆进XbaI+XhoI酶切过的pCA13-IL-24质粒中，命名为pCA13-IL-24-IRES质粒。
以pCDNA3-TRAIL质粒为PCR反应的模板，TRAIL上游引物与TRAIL下游引物进行第三次PCR反应(详见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rded.，Joseph Sambrookand David W.Russell)，跑电泳回收866bp片段。以XhoI+BamHI酶切PCR产物，克隆进XhoI+BamHI酶切过的pCA13-IL-24-IRES质粒，命名为pCA13-IL-24-IRES-TRAIL质粒。
用Bgl II酶切质粒pCA13-IL-24-IRES-TRAIL质粒，切出gene的表达框。这个表达框包含CMV启动子、治疗基因IL-24和TRAIL及SV40polyA尾巴。而后将此表达框克隆进Bgl II单酶切并去磷的pZD55质粒，构建成质粒pZD55-IL-24-IRES-TRAIL。
用类似方法构建的质粒还有pZD55-TRAIL-IRES-Smac、pZD55-Smac-IRES-TRAIL、pZD55-k5-IRES-TRAIL、pZD55-TRAIL-IRES-k5、pZD55-sflt1-IRES-k5、pZD55-k5-IRES-sflt1、pZD55-TRAIL-IRES-IL-24、pZD55-IL-24-IRES-TRAIL、pZD55-TRAIL-IRES-IL-12、pZD55-IL-12-IRES-TRAIL、pZD55-TRAIL-IRES-Omi、pZD55-Omi-IRES-TRAIL、pZD55-IL-IRES-12-IL24、pZD55-IL24-IRES-IL-12、pZD55-TRAIL-IRES-Eorf4、pZD55-Eorf4-IRES-TRAIL等。
B、双基因-病毒ZD55-IL-24-IRES-TRAIL的构建
将pZD55-IL-24-IRES-TRAIL(它含有与腺病毒同源重组的左臂序列)与含有腺病毒骨架DNA的质粒pBHG-E3共转染293细胞株，通过同源重组产生具有感染性的含二外源基因的重组腺病毒ZD55-IL-24-IRES-TRAIL。7-14天出现病毒空斑，经过2次病毒空斑纯化，进行扩增，提取重组腺病毒的DNA，进行DNA酶切分析，PCR分析，确定重组正确的腺病毒株。具体步骤见实施例1。
用类似方法构建的重组腺病毒还有ZD55-TRAIL-IRES-Smac、ZD55-Smac-IRES-TRAIL、ZD55-k5-IRES-TRAIL、ZD55-TRAIL-IRES-k5、ZD55-sflt1-IRES-k5、ZD55-k5-IRES-sflt1、ZD55-TRAIL-IRES-IL-24、ZD55-IL-24-IRES-TRAIL、ZD55-TRAIL-IRES-IL-12、ZD55-IL-12-IRES-TRAIL、ZD55-TRAIL-IRES-Omi、ZD55-Omi-IRES-TRAIL、ZD55-IL-IRES-12-IL24、ZD55-IL24-IRES-IL-12、ZD55-TRAIL-IRES-Eorf4、ZD55-Eorf4-IRES-TRAIL等。
实施例3、双基因-病毒Ad-hTERT-TRAIL-K5的构建
肿瘤细胞的特征之一是能无限的增殖，而TRAIL蛋白可介导肿瘤细胞凋亡，特异性地杀伤肿瘤细胞。另一方面，肿瘤的生长需要通过丰富的血管供应养分，K5是血纤维蛋白溶酶原kringle的第5个结构域，它可通过调控内源性血管形成因子途径特异性地抑制内皮细胞的分裂增殖，具有比angiostatin血管抑素更高的抗血管形成效应和显著的抗肿瘤效应(Chun-xia Luo et al.China J.Cancer Biother，2003，10(1)：9-12，)。TRAIL蛋白和K5蛋白通过不同的机制发挥抗肿瘤作用，采用融瘤病毒介导TRAIL以及K5两种基因，可发挥其互补作用。
A.肿瘤靶向载体质粒pZhTERT的构建
为了改造E1A基因的启动子，以pXC1为模板，用定点突变双次PCR技术，缺失E1A基因的启动子，代之以三个单酶切位点。引物由上海生工合成。(注：序列右侧注明引物与pXC1质粒配对的序列，下划线标出内切酶位点)
Bam5’引物：
5’TCC TGT GGA TCC GGG CCC CCA TTT C 3’； bp9876-9901；
Bam3’引物：
5’TTCAG TAC GTA GTC GAC CTC GAG ATA TTA CGC GCT ATG AGT AAC AC3’； bp342-319；
Xba5’引物：
5’TAT CTC GAG GTC GAC TAC GTA CTG AAA ATG AGA CAT ATT ATC 3’；
bp552-573；
Xba3’引物：
5’TACT ACT ATT GCA TTC TCT AGA CAC A 3’； bp1359-1334；
以pXC1质粒为PCR反应的模板，引物Bam5’与Bam3’进行第一次PCR反应(详见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，Joseph Sambrook and David W.Russell)，跑电泳回收394bp片段。
以pXC1质粒为PCR反应的模板，引物Xba5’与引物Xba3’进行第二次PCR反应(详见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，Joseph Sambrook and David W.Russell)，跑电泳回收830bp片段。
两次PCR反应的产物有26bp配对的序列，以两次PCR产物混合作为模板，以引物Bam5’与引物Xba3’进行第三次PCR反应(详见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rded.，Joseph Sambrook and David W.Russell)，跑电泳回收1198bp片段。以BamH I+Xba I酶切1198bp的PCR产物，克隆进BamH I+Xba I酶切过的pXC1质粒，命名为pZXC2。
用PCR拉出hTERT启动子，产生合适的酶切位点，然后酶切克隆进E1A启动子缺失的质粒pZXC2中，具体如下：
hTERT 5’引物：
5’TCTT CTC GAG TGG CCC CTC CCT CGG GTT AC 3’；Xho I；
hTERT 5’引物：
5’GTA GGG CGG GGC CGC GGA AAG GA 3’；
以质粒pAd/TERT为模板，hTERT 5’引物与hTERT 3’引物进行PCR反应(详见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rded.，Joseph Sambrook and David W.Russell)，跑电泳回收460bp片段。以Xho I酶切PCR产物，克隆进Xho I+SnaB I酶切过的pZXC2质粒，命名为pZhTERT。此质粒缺失了内源性E1A启动子，而由hTERT启动子取代，并含有克隆位点Xho I，可插入外源基因表达框(见图2)。
B、质粒pZhTERT-TRAIL的构建
TRAIL基因克隆至pCA13质粒，用Bgl II酶切出基因表达框(含CMV启动子，TRAIL基因，Poly A信号)，克隆进XhoI酶切过的pZhTERT质粒。克隆中使用部分补平的方法。质粒命名为pZhTERT-TRAIL。
C、质粒pBHG10-K5的构建
pABS.4及pBHG10质粒均购自Microbix公司。pBHG10质粒是由质粒pBHG-E3缺失E3区28133bp-30818bp系列而得到，在其缺失部位有pacI克隆位点。K5基因克隆至pCA13质粒(具体步骤见Chun-xia Luo et al.Recombinant Kringle 5 of Human Plasminogen forMammary Cancer Gene Therapy Mediated by Adenovirus.China J.Cancer Biother，2003，10(1)：9-12，)，用Bgl II酶切出基因表达框(含CMV启动子，K5基因，Poly A信号)，克隆进Bgl II+BamH I酶切过的pABS.4质粒，得到pABS.4-K5质粒。再用pacI酶切出基因表达框，克隆进pacI酶切过的pBHG10质粒，得到质粒pBHG10-K5。
D、双基因-病毒Ad-hTERT-TRAIL-K5的构建
将质粒pZhTERT-TRAIL(它含有与腺病毒同源重组的左臂序列)与含有腺病毒骨架DNA的质粒pBHG10-K5共转染293细胞株，通过同源重组产生具有感染性的含二外源基因的重组腺病毒Ad-hTERT-TRAIL-K5。7-14天出现病毒空斑，经过2次病毒空斑纯化，进行扩增，提取重组腺病毒的DNA，进行DNA酶切分析，PCR分析，确定重组正确的腺病毒株。具体步骤见实施例1。
用类似方法构建的重组腺病毒还有Ad-hTERT-TRAIL-Smac、Ad-hTERT-TRAIL-sflt1、、Ad-hTERT-TRAIL-IL-24、Ad-hTERT-TRAIL-IL-12、Ad-hTERT-TRAIL-Omi、Ad-hTERT-TRAIL-Eorf4、Ad-hTERT-IL-24-Omi、Ad-hTERT-IL-24-IL-12、Ad-hTERT-IL-24--Eorf4、Ad-hTERT-IL-24-K5等。
实施例4、腺相关病毒(AAV)
用肿瘤特异性启动子hTERT替换双基因TRAIL-IETD-Smac等表达框的HCMV启动子，使双基因的表达仅限于肿瘤组织或细胞，其它靶向AAV双基因-病毒以此类推。经过包装滴度可达1012pfu/ml。
实施例5、无肠腺病毒载体
将肿瘤特异性的双基因hTERT-TRAIL-IETD-Smac等表达框或其它hTERT-双基因表达框插入无肠腺病毒载体中，包装成无肠腺病毒。其它靶向双基因的无肠腺病毒以此类推。
实施例6、肿瘤特异性启动子调控的腺病毒
病毒的复制可受肿瘤特异性启动子的调控。双基因TRAIL-IETD-Smac表达框插入到该病毒的基因组中后，双基因的功能的发挥仅限于某特异性肿瘤组织中。
实施例7、双基因病毒Ad-hTERT-TRAIL-K5在正常细胞或肿瘤细胞中复制能力分析
将3×105的正常细胞或肿瘤细胞铺于6孔板，24h后，加入104PFU的Ad.TERT、Ad-hTERT-TRAIL-K5、野生型5型腺病毒Ad5分别感染293细胞，肝癌细胞株BEL7404细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库)，大肠癌细胞株SW620(购自ATCC)及正常人胚肺细胞株MRC5和NHLF(购自ATCC)。48h后，收集细胞上清与细胞，在-20℃与37℃反复冻融3次以释放病毒。将病毒稀释，检测病毒滴度。293细胞铺于60mm dish，24h后细胞接近长满，加入含不同稀释度的病毒，37℃感染2小时后，铺8ml低熔点胶(5％FBS，1.25％Agarose)。9天左右记数。计算每PFU病毒产生的病毒数目。结果如图4所示，由图4可见，在肿瘤细胞中，Ad.TERT、Ad-hTERT-TRAIL-K5的复制能力与野生型病毒相比略有下降。而在正常细胞中，Ad.TERT、Ad-hTERT-TRAIL-K5的复制能力显著降低，在MRC5细胞中，与野生型5型腺病毒相比下降近1600倍，而在NHLF细胞中下降1200倍。野生型腺病毒在肿瘤细胞和正常细胞都有很强的复制能力，没有选择性；而Ad.TERT、Ad-hTERT-TRAIL-K5能选择性地在肿瘤细胞中复制。
实施例8、双基因病毒Ad-hTERT-TRAIL-K5在体外对肿瘤细胞的杀伤能力检测
细胞经病毒处理后的存活率由MTT法检测(Cancer Research，1989，49(17)：4785-90)。步骤如下：将大肠癌细胞株SW620及正常人胚肺细胞NHLF以5000每孔的量铺入96孔板，培养24小时后加入不同滴度(MOI)的病毒，作用3天，然后将含病毒的培养液移去，换成含5mg/ml MTT的正常培养液，培养4小时后将含MTT的培养液移去，以裂解液裂解4小时，然后以655nm处吸光度为参比测定595nm处吸光度。细胞存活率(％)＝A595(样品)/A595(对照)×100％。结果如图5A、5B所示，由图5A、5B可知，病毒Ad.TERT、Ad-hTERT-TRAIL-K5对肿瘤细胞有很明显的杀伤作用，而对正常细胞毒性很小，具有肿瘤选择性。野生型腺病毒对肿瘤细胞和正常细胞都有很强的杀伤作用，没有选择性。
实施例9、双基因病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac在正常细胞或肿瘤细胞中复制能力分析
将3×105的正常细胞或肿瘤细胞铺于6孔板，24h后，加入104PFU的ZD55-TRAIL-IETD-Smac、ONYX-015、野生型5型腺病毒Ad5分别感染293细胞，肝癌细胞株BEL7404细胞，大肠癌细胞株SW620及正常人胚肺细胞。48h后，收集细胞上清与细胞，在-20℃与37℃反复冻融3次以释放病毒。将病毒稀释，检测病毒滴度。293细胞铺于60mm dish，24h后细胞接近长满，加入含不同稀释度的病毒，37℃感染2小时后，铺8ml低熔点胶(5％FBS，1.25％Agarose)。9天左右记数。计算每PFU病毒产生的病毒数目。结果如图3所示，由图3可见，在肿瘤细胞中，ZD55-TRAIL-IETD-Smac的复制能力与野生型病毒相比有所下降。而在正常细胞中，ZD55-TRAIL-IETD-Smac的复制能力显著降低，在MRC5细胞中，与野生型5型腺病毒相比下降近1500倍，而在NHLF细胞中下降1300倍(图3)。野生型腺病毒在肿瘤细胞和正常细胞都有很强的复制能力，没有选择性；而ZD55-TRAIL-IETD-Smac能选择性地在肿瘤细胞中复制。
实施例10、双基因病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac在体外对肿瘤细胞的杀伤能力检测
细胞经病毒处理后的存活率由MTT法检测。步骤如下：将肝癌细胞株BEL7404及正常人胚肺细胞NHLF以5000每孔的量铺入96孔板，培养24小时后加入不同滴度(MOI)的病毒，作用3天，然后将含病毒的培养液移去，换成含5mg/ml MTT的正常培养液，培养4小时后将含MTT的培养液移去，以裂解液裂解4小时，然后以655nm处吸光度为参比测定595nm处吸光度。细胞存活率(％)＝A595(样品)/A595(对照)×100％。结果如图6A、6B所示，由图6A、6B可知，病毒ZD55-TRAIL、病毒ZD55-Smac及双基因病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac对肿瘤细胞有很明显的杀伤作用，而对正常细胞毒性很小，具有肿瘤选择性。野生型腺病毒对肿瘤细胞和正常细胞都有很强的杀伤作用，没有选择性。
实施例11、双基因病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac在裸鼠体内治疗肿瘤细胞移植瘤
将4-5周龄的裸鼠皮下接种肝癌细胞株BEL7404，12天后进行动物分组。治疗组分别给予1×109pfu的基因病毒ZD55-TRAIL、ZD55-Smac及双基因病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac进行治疗，对照分2组：第1组是磷酸缓冲液(PBS)处理组，第2组用相同剂量的ONYX-015病毒。试验结果如图7所示，可见ZD55-TRAIL-IETD-Smac疗效最好，治疗9周后，肿瘤细胞移植瘤已完全消失，治疗效果比ONYX-015好很多很多。
Claims (14)
1、一种肿瘤靶向双基因-病毒，其特征在于，该双基因-病毒是含有肿瘤特异性启动子的肿瘤特异性增殖病毒，并携带有两个肿瘤治疗基因，所述肿瘤治疗基因选自抑癌基因，细胞因子基因，促细胞凋亡基因，血管抑制基因和自杀基因，所述肿瘤特异性增殖病毒为肿瘤特异性增殖腺病毒。
2、如权利要求1所述的双基因-病毒，其特征在于，所述两个肿瘤治疗基因为功能上互补或具有协同作用的基因。
3、如权利要求1所述的双基因-病毒，其特征在于，所述两个肿瘤治疗基因以连接物相连接。
4、如权利要求3所述的双基因-病毒，其特征在于，所述连接物为核糖体进入位点或细胞内源性酶切位点序列。
5、如权利要求1所述的双基因-病毒，其特征在于，所述肿瘤特异性启动子包括：端粒酶逆转录启动子，甲胎蛋白启动子，癌胚抗原启动子，前列腺特异性抗原启动子和乳腺癌组织特异性启动子。
6、如权利要求1所述的双基因-病毒，其特征在于所述抑癌基因为p53、PTEN、Rb、NF1、VHL或APC；所述细胞因子基因为IL-2、IL-12、IL-24，GM-CSF，INF-α、INF-β、INF-γ；所述促细胞凋亡基因为TRAIL、Smac、Omi、Bax、Caspase-3、Caspase-7或Eorf4；所述自杀基因为cd或tk；所述血管抑制基因为血管内皮抑素、血管生成抑素k1-4、血管生成抑素k1-3、血纤维蛋白溶酶原k5或sflt-1。
7、一种肿瘤靶向双基因-病毒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
a、将两个肿瘤治疗基因克隆进载体质粒的多克隆位点，两基因之间以连接物相连接，然后用Bg1项II酶切出包含启动子、两个肿瘤治疗基因以及polyA加尾信号的双基因表达框，插入含有肿瘤特异性启动子的肿瘤特异性增殖病毒载体中；所述肿瘤治疗基因选自抑癌基因，细胞因子基因，促细胞凋亡基因，血管抑制基因和自杀基因，所述肿瘤特异性增殖病毒为肿瘤特异性增殖腺病毒；
b、将改造好的携带肿瘤靶向双基因的病毒载体转染细胞以产生双基因-病毒。
8、如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述两基因之间的连接物为核糖体进入位点或细胞内源性酶切位点序列。
9、一种肿瘤靶向双基因-病毒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
a、将两个肿瘤治疗基因分别克隆进质粒的多克隆位点，得到两载体，分别以限制性内切酶切出两载体上的基因表达框，分别插入两个改造好的含有肿瘤特异性启动子的肿瘤特异性增殖病毒载体的不同位点中，得到两质粒；所述肿瘤治疗基因选自抑癌基因，细胞因子基因，促细胞凋亡基因，血管抑制基因和自杀基因，所述肿瘤特异性增殖病毒为肿瘤特异性增殖腺病毒；
b、将步骤a所得两个质粒共转染细胞，通过同源重组产生含有两个外源基因的双基因-病毒。
10、如权利要求7或9所述的肿瘤靶向双基因-病毒的构建方法，其特征在于所使用的两个基因在功能上互补或具有协同作用。
11、如权利要求7或9所述的肿瘤靶向双基因-病毒的构建方法，其特征在于所述抑癌基因为p53、PTEN、Rb、NF1、VHL或APC；所述细胞因子基因为IL-2、IL-12、IL-24，GM-CSF，INF-α、INF-β、INF-γ；所述促细胞凋亡基因为TRAIL、Smac、Omi、Bax、Caspase-3、Caspase-7或Eorf4；所述自杀基因为cd或tk；所述血管抑制基因为血管内皮抑素、血管生成抑素k1-4、血管生成抑素k1-3、血纤维蛋白溶酶原k5或sflt-1。
12、如权利要求7或9所述的肿瘤靶向双基因-病毒的构建方法，其特征在于肿瘤特异性启动子包括：端粒酶逆转录启动子，甲胎蛋白启动子，癌胚抗原启动子，前列腺特异性抗原启动子和乳腺癌组织特异性启动子。
13、如权利要求1-6中任一项所述的肿瘤靶向双基因-病毒用于制备治疗肿瘤的药物的用途。
14、如权利要求13所述的用途，其特征在于，与其他化合物组成药用组合物，所述其他化合物选自：化学治疗药物；生物毒素；免疫抑制化合物；单克隆抗体。
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