RU2814581C1 - Генетический вектор Ad6/3-hTERT-GMCSF, содержащий геномные последовательности рекомбинантного аденовируса 6 серотипа, промотор теломеразы человека, ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, а также ген белка файбер со встройкой домена fiber knob аденовируса 3 серотипа, обладающий повышенной трансдукцией в опухолевые клетки - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Описан рекомбинантный аденовирусный вектор Ad6/3-hTERT-GMCSF, обладающий противоопухолевой специфичностью. Вектор содержит нуклеотидные последовательности, экспрессирующие модифицированный белок файбер 6 серотипа аденовируса, в котором домен knob заменен на аналогичный домен аденовируса 3-го серотипа. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения онкологических заболеваний как в формате монотерапии, так и в комбинации с другими терапевтическими подходами, такими как иммунотерапия, химиотерапия, радиотерапия. 6 ил., 2 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к генной терапии злокачественных опухолей, к онколитическим аденовирусным векторам и фармацевтическим композициям, содержащим такие векторы, а также к применению указанных векторов в производстве лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей. Особенностью полученного генетического вектора, которая приводит к увеличению эффективности трансдукции вирусных частиц в опухолевую клетку, является наличие модифицированного капсидного белка файбер.

Уровень техники

Онколитические вирусы на данный момент рассматриваются в качестве перспективного метода терапии онкологических заболеваний. Основными механизмами действия онколитических вирусов, с помощью которых обеспечивается противоопухолевый эффект, является прямой лизис клеток в результате размножения вирусных частиц и активация противоопухолевого иммунитета [1]. Репликация вируса в опухолевой клетке приводит к ее гибели и выходу вирусных частиц в межклеточное пространство. Далее цикл повторяется, вследствие чего происходит заражение соседних клеток и их последующий лизис [2]. Кроме этого, онколитические вирусы могут оказывать косвенное воздействие на опухолевый очаг за счет нарушения обменных процессов при лизисе клеток. Другим механизмом действия онколитических вирусов является усиление иммунного ответа. Инфицирование опухолевых клеток, клеточная смерть и выход ассоциированных с опухолью антигенов вызывает активацию клеток иммунной системы, что приводит к уничтожению неинфицированных опухолевых клеток. Лизис опухолевых клеток приводит к освобождению цитокинов IF1, IFγ, TNFα, IL12, вирусных патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (РАМР), а также дистресс-ассоциированных молекулярных паттернов (DAMP), что вызывает дополнительную активацию компонентов клеточного иммунитета [3] [4].

С развитием методов молекулярной биологии и генной инженерии стало возможным вводить в вирусный геном модификации с целью повышения селективности к опухолевым клеткам и снижения токсического воздействия на здоровые клетки. Согласно ресурсу https://www.clinicaltrials.gov/, в настоящий момент в клинических испытаниях наиболее часто используются вирус герпеса 1 типа [5], вирус везикулярного стоматита [6], реовирусы [7], а также аденовирусы различных серотипов [8]. При этом большинство исследуемых в клинике онколитических вирусов являются рекомбинантными и содержат в своем геноме различные генетические модификации [9].

Аденовирусы обычно инфицируют опухолевые клетки через взаимодействие капсидного белка файбер с рецепторами на поверхности клеток. Так, аденовирус 5 серотипа связывается преимущественно с CAR/CXADR рецепторами [10], как и близкородственный аденовирус серотипа 6, при этом для опухолевых клеток характерен низкий уровень экспрессии этих рецепторов, что затрудняет трансдукцию вируса в клетку. В то же время аденовирус 3 серотипа взаимодействует с более распространенным на поверхности раковых клеток рецептором десмоглеином-2 [11], а также с рецепторами CD46, CD80, CD86 [12].

Первой стратегией для повышения трансдукции является создание химерного белка файбер, в котором связывающий домен knob белка файбер заменен на аналогичный домен другого серотипа аденовируса [13]. Было показано, что аденовирусы с химерным доменом knob белка файбер Ad5/3 могут избегать нейтрализации в кровотоке предсуществующими антителами [14]. Кроме того, известно, что химерный аденовирусный вектор, несущий белок файбер серотипов 5 и 35, обладает повышенной эффективностью в заражении клеток рака желудка [15], гепатокарциномы [16] и рака мочевого пузыря [17]. Химерные аденовирусы Ad5/37 и Ad3/11p также показали свою эффективность в клинических испытаниях [18]. Создание химерных штаммов, помимо повышения противоопухолевой селективности, позволяет избежать действия предсуществующего иммунитета к определенным штаммам аденовируса [19].

Другой стратегией может быть модификация белковой структуры белка файбер. Так, введение аминокислотной последовательности Arg-Gly-Asp (RGD) в H1 петлю капсидного белка аденовируса усиливает тропность аденовирусного штамма к опухолевым клеткам [20]. Подобный подход был использован при создании рекомбинантного аденовируса Delta-24-RGD, который оказался способен проникать в клетки через взаимодействие с интегринами [21]. В клинических испытаниях данного рекомбинантного вируса удалось добиться пролонгированного иммунного ответа у 20% пациентов с глиомой и, следовательно, общего увеличения выживаемости онкологических больных [22].

Еще одним подходом может быть введение в белок файбер доменов других поверхностных белков, например, области тримеризации бактериофага Т4 или белка α1 реовируса [23].

Другой важной задачей является повышение селективности онколитических аденовирусов. Одним из способов является введение в геном опухоль-специфичных промоторов. Так, введение в вирусный геном промотора гена теломеразы человека hTERT приводит к тому, что такой модифицированный аденовирус реплицируется только в клетках с высокой теломеразной активностью [8] [16]. Помимо промотора теломеразы используют и другие опухоль-специфичные промоторы, такие как промотор гена E2F1 [25], промотор гена р53 [11], промотор циклооксигеназы-2 (СОХ-2) [26], а также промотор α-фетопротеина [27].

Повышение противоопухолевого иммунитета с помощью онколитических вирусов достигается за счет встраивания в их геном различных трансгенов-иммуномодуляторов. Например, были разработаны онколитические вирусы с такими трансгенами, как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, GM-CSF) [25][28], интерлейкины, например, IL2[29], IL12[30], IL24[31], белки теплового шока [33], а также мембранно-связанные костимулирующие молекулы, такие как CD40 и CD80 [34]. Одним из самых эффективных подходов к увеличению иммунного ответа является введение в вирусный вектор гена GM-CSF (ГМ-КСФ), который способен во много раз повысить цитотоксические иммунные реакции [35]. Кодируемый данным геном гликопротеин активирует TLR2 рецепторы на поверхности опухолевых клеток и за счет этого облегчает их распознавание иммунными клетками [36]. Примером успешного онколитического аденовируса является препарат ONCOS-102, показавший свою эффективность как в монотерапии, так и в комбинации с химио- и иммунотерапевтическими препаратами [37].

Наиболее близким аналогом предлагаемому генетическому вектору является рекомбинантный штамм Ad6-hTERT-GMCSF, защищенный патентом РФ №2 753 742 С1. Рекомбинантный штамм Ad6-hTERT-GMCSF сконструирован на основе штамма аденовируса серотипа 6 и содержит встройку промотора теломеразы человека (hTERT), а также гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека в месте удаленных генов Е3-6.7к и E3-gp19k, проявляет избирательную цитотоксичность в отношении теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирует активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирущий фактор (ГМ-КСФ).

Описанный аналог обладает сниженной трансдукцией в опухолевые клетки по сравнению с предлагаемым вектором.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание генетического вектора, содержащего геномные последовательности рекомбинантного аденовируса 6 серотипа, обладающего пониженной серопревалентностью, противоопухолевой специфичностью и повышенной способностью к трансдукции в опухолевые клетки за счет модификации белка файбер, предназначенного для лечения злокачественных опухолей.

Раскрытие изобретения Краткое описание поясняющих иллюстраций:

Фиг. 1 - Схема получения полногеномной плазмиды, содержащей геном рекомбинантного аденовируса Ad6/3-hTERT-GMCSF.

Фиг. 2 - Электрофореграмма гидролизованной плазмиды pBRAd5: 1-3 -теоретическая картина, 5-7 практическая картина гидролиза, М - маркер 50 кб, 1, 4 - обработка эндонуклеазой рестрикции SwaI, 2, 6 - обработка эндонуклеазой рестрикции HpaI, 3,5- обработка эндонуклеазой рестрикции ZrmI.

Фиг. 3 - Электрофореграмма гидролизованной плазмиды pAd6/3-hTERT-GMCSF. 1-2 - теоретическая картина гидролиза; 3-4 - практическая картина гидролиза; М -маркер 50 кб; 1, 3 - обработка эндонуклеазой рестрикции EcoRI; 2, 4 - обработка эндонуклеазой рестрикции BamHI; 5 - интактная плазмида.

Фиг. 4 - Выравнивание последовательностей, полученных при помощи секвенирования по Сэнгеру на теоретическую последовательность: А - с праймера pBRAd4_hTERT_rev, Б - с праймера pBRAd4_GMCSF_for, В - с праймера 133_2_check_rev.

Фиг. 5 - Динамика выживаемости самок мышей Balb/c Nude с ксенографтами карциномы мочевого пузыря 5637 после трехкратного интратуморального введения Ad6/3-hTERT-GMCSF.

Фиг.6 - Динамика выживаемости самок мышей Balb/c Nude (пи/пи) с ксенографтами протоковой аденокарциномы молочной железы ВТ-474 после трехкратного интратуморального введения Ad6/3-hTERT-GMCSF.

Результат достигается путем создания генетического вектора Ad6/3-hTERT-GMCSF, содержащего геномные последовательности аденовируса серотипа 6, содержащего встройку промотора теломеразы человека (hTERT), структура которого соответствует коровому промотору гена теломеразы человека, депонированного в GenBank (Accession АН007699) в позиции 10854-11273 в месте удаленного промотора гена Е1А между позициями, соответствующими позициям нуклеотидов 357-558 штамма Ад6 Tonsil99, депонированного в GenBank (Accession HQ413315). Кроме того, патентуемый рекомбинантный генетический вектор содержит ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, структура которого соответствует кодирующей последовательности мРНК человеческого ГМ-КСФ, депонированного в GenBank (Accession NM 000758), позиции 36-469 - вместо удаленных генов Е3-6.7к и Е3-gp19k между позициями 28608 и 29270. Особенностью созданного генетического вектора является наличие химерного белка файбер, в котором участок гена файбер, кодирующий домен fiber knob аденовируса 6 серотипа Tonsil99 (Accession HQ413315) между позициями нуклеотидов 32080 и 32626, был заменен на последовательность домена fiber knob аденовируса серотипа 3, депонированную в GenBank (Accession ХО 1998.1), в позиции между 643 и 1207.

Получаемый на основе патентуемого вектора штамм аденовируса обладает повышенной способностью к трансдукции в опухолевые клетки (за счет модификации белка файбер) и способностью к избирательной экспрессии в клетках с высоким уровнем активности теломеразы, а также экспрессирует ГМ-КСФ, за счет чего достигается дополнительное иммуностимулирующее действие.

Осуществление изобретения

Для создания рекомбинантного генетического вектора Ad6/3-hTERT-GMCSF участок шаттл-плазмиды pBRAd4 был амплифицирован с помощью ПЦР со специфичными праймерами. Схема получения плазмиды pAd6/3-hTERT-GMCSF приведена на Фиг. 1.

Полученный ампликон, содержащий полную последовательность белка файбер аденовируса, был гидролизован по сайтам рестрикции MfeI и XhoI и встроен с помощью лигазной реакции в вектор pcDNA3.1 стандартным методом рестрикции-лигирования, в результате чего была получена плазмида pcDNA-fibAd6. Далее для введения модификации в ген файбер полученную плазмиду линеаризовали с помощью праймеров, фланкирующих домен fiber knob. Последовательность домена fiber knob аденовируса 3 серотипа длиной 582 п. н. была получена в ходе полимеразной цепной сборки (Polymerase Cycling Assembly) с использованием 18 олигонуклеотидов. Плазмиду pcDNA-fibAd6/3 с модифицированным белком файбер собирали в ходе реакции рекомбинации in vitro между синтетической последовательностью fiber knob аденовируса 3 серотипа и линеаризованной pcDNA-fibAd6 при помощи набора In-Fusion (Takara Bio, Япония). Наличие встройки в полученной плазмиде pcDNA-fibAd6/3 подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием по Сэнгеру.

Результат проверки с использованием рестрикционного анализа представлен на Фиг. 2.

Для встройки модифицированного гена белка файбер в шаттл-плазмиду проводили амплификацию участка генома аденовируса при помощи специфичных праймеров. Полученный фрагмент затем рекомбинировали с линеаризованным по сайтам рестрикции XhoI и MfeI вектором pBRAd4 набором In-Fusion. Реакционной смесью трансформировали клетки Е. coli штамма Stellar. В результате была получена плазмида pBRAd5.

Для получения полногеномной плазмиды вектор pBRAd5 линеаризовали с использованием ПЦР. Геномную ДНК аденовируса серотипа 6 дикого типа гидролизовали по сайтам рестрикции ClaI и PacI. Восстановление полного генома с модификациями производилось путем рекомбинации полученных фрагментов при помощи набора In-Fusion. Реакционной смесью трансформировали клетки Е. coli штамма Stellar. В результате была получена плазмида pAd6/3-hTERT-GMCSF, содержащая все необходимые модификации. Встройку подтверждали секвенированием по Сэнгеру.

Для получения живых вирусных частиц вектора Ad6/3-hTERT-GMCSF полногеномную плазмиду pAd6/3-hTERT-GMCSF обрабатывали рестриктазой AsiSI. Полученной копией генома в количестве 250 нг ДНК на лунку трансфицировали клетки линии Ad293 с липофектамином LTX (Thermo Fisher Sci., США) согласно инструкции производителя.

«Оживленный» таким образом геном аденовируса с модификациями титровали в 96-луночном планшете на клетках линии А549 для получения отдельных клонов вирусных частиц. Для подтверждения наличия встроек в вирусный геном геномную ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции EcoRT и HindIII (Фиг. 3).

Нуклеотидную последовательность трансгенов, а также контаминацию препарата вирусом дикого типа проверяли секвенированием по Сэнгеру (Фиг. 4).

Кроме того, для подтверждения целостности всего генома было проведено массовое параллельное секвенирование полученного рекомбинанта.

Модифицированный геном аденовируса химерного серотипа 6/3 содержит:

- левый ITR,

- промотор hTERT,

- последовательность аденовируса, включающую гены от Е1А до Е3-12.5К,

- ген человеческого GMCSF,

- последовательность генома аденовируса, содержащую гены от Е3-RIDα до модифицированного домена fiber knob,

- модифицированный белок файбер, содержащий последовательность fiber knob аденовируса 3 серотипа,

- участок генома аденовируса после гена белка файбер до правого ITR. Полученная генетическая конструкция (SEQ. ID №1), содержащая последовательности генома аденовируса, обладает следующими признаками.

Генетические признаки

Генетический вектор Ad6/3-hTERT-GMCSF содержит геном длиной 35796 п. н. Наличие в его геноме встроек промотора hTERT, ГМ-КСФ и домена fiber knob аденовируса 3 серотипа было подтверждено секвенированием по Сэнгеру. Противоопухолевое действие вируса было подтверждено в in vivo исследованиях на модели ксенографтов протоковой аденокарциномы молочной железы с использованием линии ВТ474 и ксенографтов карциномы мочевого пузыря с использованием линии 5637. Заявляемый генетический вектор на основе рекомбинантного аденовируса как платформа для конструирования противоопухолевых и вакцинных препаратов обладает целым рядом преимуществ. Вирусные частицы реплицируются в цитоплазме инфицированных клеток в автономных образованиях - вирусных фабриках, не контактируют с клеточным генетическим материалом, не встраиваются в хромосомы и не имеют онкогенного потенциала.

Морфологические признаки.

Генетическая конструкция содержит нуклеотидные последовательности аденовируса 6 серотипа, который относится к семейству Adenoviridae рода Mastadenovirus и обладает признаками, характерными для аденовирусов вида С (икосаэдрический вирион), однако отличается дополнительной экспрессией ГМ-КСФ, hTERT-зависимой репликацией, а также имеет модификацию белка файбер, в котором домен fiber knob аденовируса 6 серотипа заменен на аналогичный домен аденовируса 3 серотипа.

Преимуществом данной генетической конструкции является повышенная способность к трансдукции в опухолевые клетки за счет введения модификации в белок файбер, что усиливает ее онколитические свойства.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1. Способ получения генетического вектора Ad6/3-hTERT- GMCSF

На первом этапе получали плазмиду pAd6/3-hTERT-GMCSF, для этого проводили рекомбинацию при помощи набора In-Fusion (Takara Bio, Япония) между линеаризованной плазмидой pBRAd5 и геномной ДНК аденовируса 6 серотипа штамма ЛМВ, гидролизованной при помощи эндонуклеаз рестрикции ClaI и PacI. Линеаризация плазмиды pBRAd5 проводилась с использованием праймеров Inf hTERT for2 (SEQ. ID №2) и Inf GM w/oCMV (SEQ. ID №3).

Продуктами рекомбинации трансформировали клетки Е. coli штамма HST08. Далее полученная плазмида была наработана в препаративных количествах в 250 мл среды Лурия-Бертани и выделена с использованием набора реагентов Plasmid DNA Maxiprep Kit фирмы Qiagen (Нидерланды).

Наличие необходимых модификаций в плазмиде подтверждали в ходе рестрикционного анализа с эндонуклеазами EcoRI и BamHI. Теоретическая и экспериментальная картина гидролиза плазмиды представлены на Фиг. 3. Для получения вирусных частиц плазмиду pAd6/3-hTERT-GMCSF линеаризовали эндонуклеазой рестрикции AsiSI. Продукт гидролиза очищали осаждением в этаноле. Для проведения трансфекции реагент Lipofectamine™ LTX в количестве 0,1 мкл добавляли к 100 нг гидролизованной плазмиды в 50 мкл среды Opti-MEM (Invitrogen). Трансфекцию проводили на 90% монослое клеток НЕК Ad293, выращенном в 96-луночных планшетах (Greiner). Клетки инкубировали в течение 1 часа при 37°С в атмосфере 5% СО₂, после чего добавляли 100 мкл среды DMEM (Invitrogen) и инкубировали еще 48 часов при 37°С в атмосфере 5% СО₂ до развития цитопатического эффекта. Далее клеточную суспензию трижды подвергали обработке замораживанием-оттаиванием для высвобождения вирусных частиц.

Вирус клонировали методом серийного разведения на клетках линии А549. Далее вирусную ДНК выделяли с помощью обработки суспензии вирусных частиц протеиназой К. Наличие необходимых встроек подтверждали секвенированием по Сэнгеру с праймером pBRAd4_hTERT_rev (SEQ. ID №4) для проверки правильности сиквенса промотора hTERT, праймером pBRAd4_GMCSF_for (SEQ. ID №5) для проверки правильности сиквенса гена GMCSF и с праймером 133_2_check_rev (SEQ. ID №6) для подтверждения замены knob домена в белке файбер.

Полученные в результате последовательности ДНК представлены на Фиг. 3.

Пример 2. Оценка цитотоксического эффекта на модели опухолевых ксенографтов у мышей BalbC nu/nu (Nude)

Чтобы определить противоопухолевую активность созданного генетического вектора Ad6/3-hTERT-GMCSF, были проведены in vivo исследования эффективности на моделях опухолевых ксенографтов протоковой аденокарциномы молочной железы ВТ474, а также карциномы мочевого пузыря 5637, привитых иммунодефицитным мышами линии BalbC nu/nu (Nude).

Терапия вирусным препаратом Ad6/3-hTERT-GMCSF у животных с протоковой карциномой молочной железы ВТ-474 приводила к выраженному противоопухолевому эффекту - как в дозе 1 × 10⁷ Вч/опухоль, так и в дозе 1 × 10⁹ Вч/опухоль. Тем не менее, наиболее выраженный противоопухолевый эффект наблюдался при использовании вируса в дозе 1 × 10⁹ Вч/опухоль - у 75% животных продолжительность жизни превысила 60 суток (Фиг. 5).

Увеличение продолжительности жизни в группе мышей с ксенографтами карциномы мочевого пузыря по сравнению с контрольной группой составило 51%, а в группе с ксенографтами протоковой аденокарциномы молочной железы - 65%. По данному критерию наиболее высокий противоопухолевый эффект наблюдался также при введении вируса в дозе 1 × 10⁹ Вч/опухоль: у 75% животных продолжительность жизни превысила 60 суток (Фиг. 6).

Выраженный противоопухолевый эффект также был получен при лечении мышей с ксенографтами глиобластомы U-87 MG: торможение роста опухоли на 12 сутки после лечения составило 63% в группе 1 (суммарная доза 3 × 10⁷ Вч/опухоль) и 71% (суммарная доза 3 × 10⁹ Вч/опухоль) в группе 2, далее противоопухолевый эффект нарастал, на 25 сутки после лечения ТРО составило 66% и 77% соответственно. Продолжительность жизни животных в опытных группах 1 и 2 была выше, чем в контрольной на 35% и 45% соответственно.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Robilotti Е. V. et al. Viral oncolytic immunotherapy in the war on cancer: Infection control considerations // Infect. Control Hosp.Epidemiol. Cambridge University Press, 2019. Vol.40, №3. P. 350-354.

2. Jung M.Y. et al. In vivo estimation of oncolytic virus populations within tumors // Cancer Res. American Association for Cancer Research Inc., 2018. Vol.78, №20. P. 5992-6000.

3. Kohlhapp F.J., Kaufman H.L. Molecular pathways: Mechanism of action for talimogene laherparepvec, a new oncolytic virus immunotherapy // Clin. Cancer Res. American Association for Cancer Research Inc., 2016. Vol.22, №5. P. 1048-1054.

4. Bourgeois-Daigneault M.C. et al. Neoadjuvant oncolytic virotherapy before surgery sensitizes triple-negative breast cancer to immune checkpoint therapy // Sci. Transl. Med. American Association for the Advancement of Science, 2018. Vol.10, №422.

5. Malvehy J. et al. Talimogene laherparepvec upregulates immune-cell populations in non-injected lesions: Findings from a phase II, multicenter, open-label study in patients with stage IIIB-IVM1c melanoma // J. Immunother. Cancer. BMJ Publishing Group, 2021. Vol.9, №3.

6. Kleinliitzum D. et al. Enhancing the Oncolytic Activity of CD133-Targeted Measles Virus: Receptor Extension or Chimerism with Vesicular Stomatitis Virus Are Most Effective // Front. Oncol. Front Oncol, 2017. Vol.7, №JUN.

7. Harryvan T.J. et al. Gastrointestinal cancer-associated fibroblasts expressing Junctional Adhesion Molecule-A are amenable to infection by oncolytic reovirus // Cancer Gene Ther. Cancer Gene Ther, 2022. Vol.29, №12.

8. Hemminki O. et al. Ad3-hTERT-E1A, a fully serotype 3 oncolytic adenovirus, in patients with chemotherapy refractory cancer // Mol. Ther. Nature Publishing Group, 2012. Vol.20, №9. P. 1821-1830.

9. Ylosmaki E., Cerullo V. Design and application of oncolytic viruses for cancer immunotherapy // Curr. Opin. Biotechnol. Elsevier Ltd, 2020. Vol.65. P. 25-36.

10. Lopez-Gordo E. et al. Defining a Novel Role for the Coxsackievirus and Adenovirus Receptor in Human Adenovirus Serotype 5 Transduction In Vitro in the Presence of Mouse Serum // J. Virol. American Society for Microbiology, 2017. Vol.91, №12.

11. Wang H. et al. Desmoglein 2 is a receptor for adenovirus serotypes 3,7, 11, and 14 // Nat. Med. NIH Public Access, 2011. Vol.17, №1. P. 96.

12. Baker A.T. et al. Diversity within the adenovirus fiber knob hypervariable loops influences primary receptor interactions // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2019. Vol.10, №1.

13. Kim K.H. et al. A new generation of serotype chimeric infectivity-enhanced conditionally replicative adenovirals: The safety profile of Ad5/3-A24 in advance of a phase i clinical trial in ovarian cancer patients // Hum. Gene Ther. 2011. Vol.22, №7. P. 821-828.

14. Zafar S. et al. Ad5/3 is able to avoid neutralization by binding to erythrocytes and lymphocytes // Cancer Gene Ther. Cancer Gene Ther, 2021. Vol.28, №5. P. 442-454.

15. Wang B. et al. Chimeric 5/35 adenovirus-mediated Dickkopf-1 overexpression suppressed tumorigenicity of CD44⁺ gastric cancer cells via attenuating Wnt signaling // J. Gastroenterol. J Gastroenterol, 2013. Vol.48, №7. P. 798-808.

16. Chen W. et al. Enhanced antitumor efficacy of a novel fiber chimeric oncolytic adenovirus expressing p53 on hepatocellular carcinoma // Cancer Lett. 2011. Vol.307, №1. P. 93-103.

17. Do M.H. et al. Targeting CD46 enhances anti-tumoral activity of adenovirus type 5 for bladder cancer // Int. J. Mol. Sci. MDPI AG, 2018. Vol.19, №9.

18. Gao J. et al. Transient Chimeric Ad5/37 Fiber Enhances NK-92 Carrier Cell-Mediated Delivery of Oncolytic Adenovirus Type 5 to Tumor Cells // Mol. Ther. - Methods Clin. Dev. Cell Press, 2020. Vol.18. P. 376-389.

19. Naumenko V.A. et al. Infection of non-cancer cells: A barrier or support for oncolytic virotherapy? // Mol. Ther. - Oncolytics. Cell Press, 2022. Vol.24. P. 663-682.

20. Rodriguez-Garcia A. et al. Safely and efficacy of VCN-01, an oncolytic adenovirus combining fiber HSG-binding domain replacement with RGD and hyaluronidase expression // Clin. Cancer Res. American Association for Cancer Research Inc., 2015. Vol.21, №6. P. 1406-1418.

21. Jiang H. et al. Localized treatment with oncolytic adenovirus delta-24-RGDOX induces systemic immunity against disseminated subcutaneous and intracranial melanomas // Clin. Cancer Res. American Association for Cancer Research Inc., 2019. Vol.25, №22. P. 6801-6814.

22. Lang F.F. et al. Phase I study of DNX-2401 (delta-24-RGD) oncolytic adenovirus: replication and immunotherapeutic effects in recurrent malignant glioma // J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 2018. Vol.36, №14. P. 1419-1427.

23. Stepanenko A.A., Chekhonin V.P. Tropism and transduction of oncolytic adenovirus 5 vectors in cancer therapy: Focus on fiber chimerism and mosaicism, hexon and pIX // Virus Res. Virus Res, 2018. Vol.257. P. 40-51.

24. Huang P. et al. Direct and distant antitumor effects of a telomerase-selective oncolytic adenoviral agent, OBP-301, in a mouse prostate cancer model // Cancer Gene Ther. 2008. Vol.15, №5. P. 315-322.

25. Hemminki O. et al. Immunological data from cancer patients treated with Ad5/3-E2F-A24-GMCSF suggests utility for tumor immunotherapy // Oncotarget. Impact Journals LLC, 2015. Vol.6, №6. P. 4467-4481.

26. Bauerschmitz G.J. et al. Triple-Targeted Oncolytic Adenoviruses Featuring the Cox2 Promoter, E1A Transcomplementation, and Serotype Chimerism for Enhanced Selectivity for Ovarian Cancer Cells // Mol. Ther. 2006. Vol.14, №2. P. 164-174.

27. Kwon O.J. et al. A hypoxia- and {alpha}-fetoprotein-dependent oncolytic adenovirus exhibits specific killing of hepatocellular carcinomas // Clin. Cancer Res. Clin Cancer Res, 2010. Vol.16, №24. P. 6071-6082.

28. Bramante S. et al. Treatment of melanoma with a serotype 5/3 chimeric oncolytic adenovirus coding for GM-CSF: Results in vitro, in rodents and in humans // Int. J. Cancer. Wiley-Liss Inc., 2015. Vol.137, №7. P. 1775-1783.

29. Quixabeira D.C.A. et al. Oncolytic Adenovirus Coding for a Variant Interleukin 2 (vIL-2) Cytokine Re-Programs the Tumor Microenvironment and Confers Enhanced Tumor Control // Front. Immunol. Frontiers Media S.A., 2021. Vol.12.

30. Chiocca E.A. et al. Regulatable interleukin-12 gene therapy in patients with recurrent high-grade glioma: Results of a phase 1 trial // Sci. Transl. Med. Sci Transl Med, 2019. Vol.11, №505.

31. Zhong S. et al. An armed oncolytic adenovirus ZD55-IL-24 combined with ADM or DDP demonstrated enhanced antitumor effect in lung cancer // Acta Oncol. Acta Oncol, 2010. Vol.49, №1.P. 91-99.

32. Havunen R. et al. Oncolytic Adenoviruses Armed with Tumor Necrosis Factor Alpha and Interleukin-2 Enable Successful Adoptive Cell Therapy // Mol. Ther. - Oncolytics. American Society of Gene and Cell Therapy, 2017. Vol.4. P. 77-86.

33. Haviv Y.S. et al. Heat shock and heat shock protein 70i enhance the oncolytic effect of replicative adenovirus // Cancer Res. Cancer Res, 2001. Vol.61, №23. P. 8361-8365.

34. Tahtinen S. et al. Exploiting preexisting immunity to enhance oncolytic cancer immunotherapy // Cancer Res. American Association for Cancer Research Inc., 2020. Vol.80, №12. P. 2575-2585.

35. Burke J.M. et al. A first in human phase 1 study of CG0070, a GM-CSF expressing oncolytic adenovirus, for the treatment of nonmuscle invasive bladder cancer // J. Urol. 2012. Vol.188, №6. P. 2391-2397.

36. Kuryk L. et al. Toxicological and bio-distribution profile of a GM-CSF-expressing, double-targeted, chimeric oncolytic adenovirus ONCOS-102 - Support for clinical studies on advanced cancer treatment // PLoS One. Public Library of Science, 2017. Vol.12, №8.

37. Kuryk L., MiØHer A.S.W., Jaderberg M. Combination of immunogenic oncolytic adenovirus ONCOS-102 with anti-PD-1 pembrolizumab exhibits synergistic antitumor effect in humanized A2058 melanoma huNOG mouse model // Oncoimmunology. Taylor and Francis Inc., 2019. Vol.8, №2.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Генетический

вектор.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-05-23">

<ApplicantFileReference>202312356978</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение &quot;Центр стратегического планировния и

управления медико-биологическими рисками здоровью&quot; Федерального

медико-биологического агентства</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Institution &quot;Center

for Strategic Planning and Management of Biomedical Health

Risks&quot; of the Federal Medical Biological

Agency</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Генетический вектор

Ad6/3-hTERT-GMCSF, содержащий геномные последовательности

рекомбинантного аденовируса 6 серотипа, промотор теломеразы человека,

ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора

человека, а также ген белка файбер со встройкой домена fiber knob

аденовируса 3 серотипа, обладающий повышенной трансдукцией в

опухолевые клетки.</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35796</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35796</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catcatcaataatataccttattttggattgaagccaatatgataatga

gggggtggagtttgtgacgtggcgcggggcgtgggaacggggcgggtgacgtagtagtgtggcggaagtg

tgatgttgtaagtgtggcggaacacatgtaagcgccggatgtggtaaaagtgacgtttttggtgtgcgcc

ggtgtacacgggaagtgacaattttcgcgcggttttaggcggatgttgtagtaaatttgggcgtaaccaa

gtaatatttggccattttcgcgggaaaactgaataagaggaagtgaaatctgaataattctgtgttactc

atagcgcgtaatatttgtctagggccgcggatccgattcgacctctctccgctggggccctcgctggcgt

ccctgcaccctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggcccagacccccgggtccgcccgga

gcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccgcgctc

cccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctcc

gcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccc

tccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcg

cacgtgggaagccctggccccggccacccccgcgctgcaggccaccatgagacatattatctgccacgga

ggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatc

ttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccga

agatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgagtctgtaatgttggcggtgcaggaagggatt

gacttattcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagc

cggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtgccggaggtgatcgatcttacctgcca

cgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggag

caccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgtt

cgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaaattatgggcagtgggtgata

gagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtatt

gtgattttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacc

tacccggcgtcctaaattggtgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaat

agtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgt

gccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgct

taacgagtctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattg

cgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgttta

acttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttac

atctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagc

tctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcctcccaggcaaagttagtctgcagaatta

aggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatct

gggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcg

gctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacc

tgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggtggtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtc

ttccgtccgcccggcaataataccgacggaggagcaacagcaggaggaagccaggcggcggcggcggcag

gagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatgaatgttgtacaggtggctgaact

gtttccagaactgagacgcattttaaccattaacgaggatgggcaggggctaaagggggtaaagagggag

cggggggcttctgaggctacagaggaggctaggaatctaacttttagcttaatgaccagacaccgtcctg

agtgtgttacttttcagcagattaaggataattgcgctaatgagcttgatctgctggcgcagaagtattc

catagagcagctgaccacttactggctgcagccaggggatgattttgaggaggctattagggtatatgca

aaggtggcacttaggccagattgcaagtacaagattagcaaacttgtaaatatcaggaattgttgctaca

tttctgggaacggggccgaggtggagatagatacggaggatagggtggcctttagatgtagcatgataaa

tatgtggccgggggtgcttggcatggacggggtggttattatgaatgtgaggtttactggtcccaatttt

agcggtacggttttcctggccaataccaatcttatcctacacggtgtaagcttctatgggtttaacaata

cctgtgtggaagcctggaccgatgtaagggttcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggt

gtgtcgccccaaaagcagggcttcaattaagaaatgcctgtttgaaaggtgtaccttgggtatcctgtct

gagggtaactccagggtgcgccacaatgtggcctccgactgtggttgctttatgctagtgaaaagcgtgg

ctgtgattaagcataacatggtgtgtggcaactgcgaggacagggcctctcagatgctgacctgctcgga

cggcaactgtcacttgctgaagaccattcacgtagccagccactctcgcaaggcctggccagtgtttgag

cacaacatactgacccgctgttccttgcatttgggtaacaggaggggggtgttcctaccttaccaatgca

atttgagtcacactaagatattgcttgagcccgagagcatgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttga

catgaccatgaagatctggaaggtgctgaggtacgatgagacccgcaccaggtgcagaccctgcgagtgt

ggcggtaaacatattaggaaccagcctgtgatgctggatgtgaccgaggagctgaggcccgatcacttgg

tgctggcctgcacccgcgctgagtttggctctagcgatgaagatacagattgaggtactgaaatgtgtgg

gcgtggcttaagggtgggaaagaatatataaggtgggggtctcatgtagttttgtatctgttttgcagca

gccgccgccatgagcgccaactcgtttgatggaagcattgtgagctcatatttgacaacgcgcatgcccc

catgggccggggtgcgtcagaatgtgatgggctccagcattgatggtcgccccgtcctgcccgcaaactc

tactaccttgacctacgagaccgtgtctggaacgccgttggagactgcagcctccgccgccgcttcagcc

gctgcagccaccgcccgcgggattgtgactgactttgctttcctgagcccgcttgcaagcagtgcagctt

cccgttcatccgcccgcgatgacaagttgacggctcttttggcacaattggattctttgacccgggaact

taatgtcgtttctcagcagctgttggatctgcgccagcaggtttctgccctgaaggcttcctcccctccc

aatgcggtttaaaacataaataaaaaccagactctgtttggatttggatcaagcaagtgtcttgctgtct

ttatttaggggttttgcgcgcgcggtaggcccgggaccagcggtctcggtcgttgagggtcctgtgtatt

ttttccaggacgtggtaaaggtgactctggatgttcagatacatgggcataagcccgtctctggggtgga

ggtagcaccactgcagagcttcatgctgcggggtggtgttgtagatgatccagtcgtagcaggagcgctg

ggcgtggtgcctaaaaatgtctttcagtagcaagctgattgccaggggcaggcccttggtgtaagtgttt

acaaagcggttaagctgggatgggtgcatacgtggggatatgagatgcatcttggactgtatttttaggt

tggctatgttcccagccatatccctccggggattcatgttgtgcagaaccaccagcacagtgtatccggt

gcacttgggaaatttgtcatgtagcttagaaggaaatgcgtggaagaacttggagacgcccttgtgacct

ccaagattttccatgcattcgtccataatgatggcaatgggcccacgggcggcggcctgggcgaagatat

ttctgggatcactaacgtcatagttgtgttccaggatgagatcgtcataggccatttttacaaagcgcgg

gcggagggtgccagactgcggtataatggttccatccggcccaggggcgtagttaccctcacagatttgc

atttcccacgctttgagttcagatggggggatcatgtctacctgcggggcgatgaagaaaaccgtttccg

gggtaggggagatcagctgggaagaaagcaggttcctaagcagctgcgacttaccgcagccggtgggccc

gtaaatcacacctattaccggctgcaactggtagttaagagagctgcagctgccgtcatccctgagcagg

ggggccacttcgttaagcatgtccctgacttgcatgttttccctgaccaaatccgccagaaggcgctcgc

cgcccagcgatagcagttcttgcaaggaagcaaagtttttcaacggtttgaggccgtccgccgtaggcat

gcttttgagcgtttgaccaagcagttccaggcggtcccacagctcggtcacgtgctctacggcatctcga

tccagcatatctcctcgtttcgcgggttggggcggctttcgctgtacggcagtagtcggtgctcgtccag

acgggccagggtcatgtctttccacgggcgcagggtcctcgtcagcgtagtctgggtcacggtgaagggg

tgcgctccgggttgcgcgctggccagggtgcgcttgaggctggtcctgctggtgctgaagcgctgccggt

cttcgccctgcgcgtcggccaggtagcatttgaccatggtgtcatagtccagcccctccgcggcgtggcc

cttggcgcgcagcttgcccttggaggaggcgccgcacgaggggcagtgcagacttttaagggcgtagagc

ttgggcgcgagaaataccgattccggggagtaggcatccgcgccgcaggccccgcagacggtctcgcatt

ccacgagccaggtgagctctggccgttcggggtcaaaaaccaggtttcccccatgctttttgatgcgttt

cttacctctggtttccatgagccggtgtccacgctcggtgacgaaaaggctgtccgtgtccccgtataca

gacttgagaggcctgtcctcgagcggtgttccgcggtcctcctcgtatagaaactcggaccactctgaga

cgaaggctcgcgtccaggccagcacgaaggaggctaagtgggaggggtagcggtcgttgtccactagggg

gtccactcgctccagggtgtgaagacacatgtcgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttatag

gtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctcac

tctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgac

ttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgcggtgatgcct

ttgagggtggccgcgtccatctggtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagcttggtggcaaacgacc

cgtagagggcgttggacagcaacttggcgatggagcgcagggtttggtttttgtcgcgatcggcgcgctc

cttggccgcgatgtttagctgcacgtattcgcgcgcaacgcaccgccattcgggaaagacggtggtgcgc

tcgtcgggcactaggtgcacgcgccaaccgcggttgtgcagggtgacaaggtcaacgctggtggctacct

ctccgcgtaggcgctcgttggtccagcagaggcggccgcccttgcgcgagcagaatggcggtagtgggtc

tagctgcgtctcgtccggggggtctgcgtccacggtaaagaccccgggcagcaggcgcgcgtcgaagtag

tctatcttgcatccttgcaagtctagcgcctgctgccatgcgcgggcggcaagcgcgcgctcgtatgggt

tgagtgggggaccccatggcatggggtgggtgagcgcggaggcgtacatgccgcaaatgtcgtaaacgta

gaggggctctctgagtattccaagatatgtagggtagcatcttccaccgcggatgctggcgcgcacgtaa

tcgtatagttcgtgcgagggagcgaggaggtcgggaccgaggttgctacgggcgggctgctctgctcgga

agactatctgcctgaagatggcatgtgagttggatgatatggttggacgctggaagacgttgaagctggc

gtctgtgagacctaccgcgtcacgcacgaaggaggcgtaggagtcgcgcagcttgttgaccagctcggcg

gtgacctgcacgtctagggcgcagtagtccagggtttccttgatgatgtcatacttatcctgtccctttt

ttttccacagctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtc

ggcctccgaacggtaagagcctagcatgtagaactggttgacggcctggtaggcgcagcatcccttttct

acgggtagcgcgtatgcctgcgcggccttccggagcgaggtgtgggtgagcgcaaaggtgtccctaacca

tgactttgaggtactggtatttgaagtcagtgtcgtcgcatccgccctgctcccagagcaaaaagtccgt

gcgctttttggaacgcgggtttggcagggcgaaggtgacatcgttgaagagtatctttcccgcgcgaggc

ataaagttgcgtgtgatgcggaagggtcccggcacctcggaacggttgttaattacctgggcggcgagca

cgatctcgtcaaagccgttgatgttgtggcccacaatgtaaagttccaagaagcgcgggatgcccttgat

ggaaggcaattttttaagttcctcgtaggtgagctcttcaggggagctgagcccgtgctctgaaagggcc

cagtctgcaagatgagggttggaagcgacgaatgagctccacaggtcacgggccattagcatttgcaggt

ggtcgcgaaaggtcctaaactggcgacctatggccattttttctggggtgatgcagtagaaggtaagcgg

gtcttgttcccagcggtcccatccaaggtccgcggctaggtctcgcgcggcggtcactagaggctcatct

ccgccgaacttcatgaccagcatgaagggcacgagctgcttcccaaaggcccccatccaagtataggtct

ctacatcgtaggtgacaaagagacgctcggtgcgaggatgcgagccgatcgggaagaactggatctcccg

ccaccagttggaggagtggctgttgatgtggtgaaagtagaagtccctgcgacgggccgaacactcgtgc

tggcttttgtaaaaacgtgcgcagtactggcagcggtgcacgggctgtacatcctgcacgaggttgacct

gacgaccgcgcacaaggaagcagagtgggaatttgagcccctcgcctggcgggtttggctggtggtcttc

tacttcggctgcttgtccttgaccgtctggctgctcgaggggagttacggtggatcggaccaccacgccg

cgcgagcccaaagtccagatgtccgcgcgcggcggtcggagcttgatgacaacatcgcgcagatgggagc

tgtccatggtctggagctcccgcggcgtcaggtcaggcgggagctcctgcaggtttacctcgcatagccg

ggtcagggcgcgggctaggtccaggtgatacctgatttccaggggctggttggtggcggcgtcgatggct

tgcaagaggccgcatccccgcggcgcgactacggtaccgcgcggcgggcggtgggccgcgggggtgtcct

tggatgatgcatctaaaagcggtgacgcgggcgggcccccggaggtagggggggctcgggacccgccggg

agagggggcaggggcacgtcggcgccgcgcgcgggcaggagctggtgctgcgcgcggaggttgctggcga

acgcgacgacgcggcggttgatctcctgaatctggcgcctctgcgtgaagacgacgggcccggtgagctt

gaacctgaaagagagttcgacagaatcaatttcggtgtcgttgacggcggcctggcgcaaaatctcctgc

acgtctcctgagttgtcttgataggcgatctcggccatgaactgctcgatctcttcctcctggagatctc

cgcgtccggctcgctccacggtggcggcgaggtcgttggagatgcgggccatgagctgcgagaaggcgtt

gaggcctccctcgttccagacgcggctgtagaccacgcccccttcggcatcgcgggcgcgcatgaccacc

tgcgcgagattgagctccacgtgccgggcgaagacggcgtagtttcgcaggcgctgaaagaggtagttga

gggtggtggcggtgtgttctgccacgaagaagtacataacccagcgccgcaacgtggattcgttgatatc

ccccaaggcctcaaggcgctccatggcctcgtagaagtccacggcgaagttgaaaaactgggagttgcgc

gccgacacggttaactcctcctccagaagacggatgagctcggcgacagtgtcgcgcacctcgcgctcaa

aggctacaggggcctcttcttcttcttcaatctcctcttccataagggcctccccttcttcttcttctgg

cggcggtgggggaggggggacacggcggcgacgacggcgcaccgggaggcggtcgacaaagcgctcgatc

atctccccgcggcgacggcgcatggtctcggtgacggcgcggccgttctcgcgggggcgcagttggaaga

cgccgcccgtcatgtcccggttatgggttggcggggggctgccgtgcggcagggatacggcgctaacgat

gcatctcaacaattgttgtgtaggtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcg

gaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggca

gcgggcggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgag

acggcggatggtcgacagaagcaccatgtccttgggtccggcctgctgaatgcgcaggcggtcggccatg

ccccaggcttcgttttgacatcggcgcaggtctttgtagtagtcttgcatgagcctttctaccggcactt

cttcttctccttcctcttgtcctgcatctcttgcatctatcgctgcggcggcggcggagtttggccgtag

gtggcgccctcttcctcccatgcgtgtgaccccgaagcccctcatcggctgaagcagggccaggtcggcg

acaacgcgctcggctaatatggcctgctgcacctgcgtgagggtagactggaagtcgtccatgtccacaa

agcggtggtatgcgcccgtgttgatggtgtaagtgcagttggccataacggaccagttaacggtctggtg

acccggctgcgagagctcggtgtacctgagacgcgagtaagcccttgagtcaaagacgtagtcgttgcaa

gtccgcaccaggtactggtatcccaccaaaaagtgcggcggcggctggcggtagaggggccagcgtaggg

tggccggggctccgggggcgaggtcttccaacataaggcgatgatatccgtagatgtacctggacatcca

ggtgatgccggcggcggtggtggaggcgcgcggaaagtcacggacgcggttccagatgttgcgcagcggc

aaaaagtgctccatggtcgggacgctctggccggtcaggcgcgcgcagtcgttgacgctctagaccgtgc

aaaaggagagcctgtaagcgggcactcttccgtggtctggtggataaattcgcaagggtatcatggcgga

cgaccggggttcgaaccccggatccggccgtccgccgtgatccatgcggttaccgcccgcgtgtcgaacc

caggtgtgcgacgtcagacaacgggggagcgctccttttggcttccttccaggcgcggcggatgctgcgc

tagcttttttggccactggccgcgcgcggcgtaagcggttaggctggaaagcgaaagcattaagtggctc

gctccctgtagccggagggttattttccaagggttgagtcgcgggacccccggttcgagtctcgggccgg

ccggactgcggcgaacgggggtttgcctccccgtcatgcaagaccccgcttgcaaattcctccggaaaca

gggacgagccccttttttgcttttcccagatgcatccggtgctgcggcagatgcgcccccctcctcagca

gcggcaagagcaagagcagcggcagacatgcagggcaccctccccttctcctaccgcgtcaggaggggca

acatccgcggctgacgcggcggcagatggtgattacgaacccccgcggcgccggacccggcactacttgg

acttggaggagggcgagggcctggcgcggctaggagcgccctctcctgagcgacacccaagggtgcagct

gaagcgtgacacgcgcgaggcgtacgtgccgcggcagaacctgtttcgcgaccgcgagggagaggagccc

gaggagatgcgggatcgaaagttccatgcagggcgcgagttgcggcatggcctgaaccgcgagcggttgc

tgcgcgaggaggactttgagcccgacgcgcggaccgggattagtcccgcgcgcgcacacgtggcggccgc

cgacctggtaaccgcgtacgagcagacggtgaaccaggagattaactttcaaaaaagctttaacaaccac

gtgcgcacgcttgtggcgcgcgaggaggtggctataggactgatgcatctgtgggactttgtaagcgcgc

tggagcaaaacccaaatagcaagccgctcatggcgcagctgttccttatagtgcagcacagcagggacaa

cgaggcattcagggatgcgctgctaaacatagtagagcccgagggccgctggctgctcgatttgataaac

attctgcagagcatagtggtgcaggagcgcagcttgagcctggctgacaaggtggccgccattaactatt

ccatgctcagtctgggcaagttttacgcccgcaagatataccataccccttacgttcccatagacaagga

ggtaaagatcgaggggttctacatgcgcatggcgctgaaggtgcttaccttgagcgacgacctgggcgtt

tatcgcaacgagcgcatccacaaggccgtgagcgtgagccggcggcgcgagctcagcgaccgcgagctga

tgcacagcctgcaaagggccctggctggcacgggcagcggcgatagagaggccgagtcctactttgacgc

gggcgctgacctgcgctgggccccaagccgacgcgccctggaggcagctggggccggacctgggctggcg

gtggcacccgcgcgcgctggcaacgtcggcggcgtggaggaatatgacgaggacgatgagtacgagccag

aggacggcgagtactaagcggtgatgtttctgatcagatgatgcaagacgcaacggacccggcggtgcgg

gcggcgctgcagagccagccgtccggccttaactccacggacgactggcgccaggtcatggaccgcatca

tgtcgctgactgcgcgcaaccctgacgcgttccggcagcagccgcaggccaaccggctctccgcaattct

ggaagcggtggtcccggcgcgcgcaaaccccacgcacgagaaggtgctggcgatcgtaaacgcgctggcc

gaaaacagggccatccggcccgatgaggccggcctggtctacgacgcgctgcttcagcgcgtggctcgtt

acaacagcagcaacgtgcagaccaacctggaccggctggtgggggatgtgcgcgaggccgtggcgcagcg

tgagcgcgcgcagcagcagggcaacctgggctccatggttgcactaaacgccttcctgagtacacagccc

gccaacgtgccgcggggacaggaggactacaccaactttgtgagcgcactgcggctaatggtgactgaga

caccgcaaagtgaggtgtatcagtccgggccagactattttttccagaccagtagacaaggcctgcagac

cgtaaacctgagccaggctttcaagaacttgcaggggctgtggggggtgcgggctcccacaggcgaccgc

gcgaccgtgtctagcttgctgacgcccaactcgcgcctgttgctgctgctaatagcgcccttcacggaca

gtggcagcgtgtcccgggacacatacctaggtcacttgctgacactgtaccgcgaggccataggtcaggc

gcatgtggacgagcatactttccaggagattacaagtgttagccgcgcgctggggcaggaggacacgggc

agcctggaggcaaccctgaactacctgctgaccaaccggcggcaaaaaatcccctcgttgcacagtttaa

acagcgaggaggagcgcattttgcgctatgtgcagcagagcgtgagccttaacctgatgcgcgacggggt

aacgcccagcgtggcgctggacatgaccgcgcgcaacatggaaccgggcatgtatgcctcaaaccggccg

tttatcaatcgcctaatggactacttgcatcgcgcggccgccgtgaaccccgagtatttcaccaatgcca

tcttgaacccgcactggctaccgccccctggtttctacaccgggggattcgaggtgcccgagggtaacga

tggattcctctgggacgacatagacgacagcgtgttttccccgcaaccgcagaccctgctagagttgcaa

caacgcgagcaggcagaggcggcgctgcgaaaggaaagcttccgcaggccaagcagcttgtccgatctag

gcgctgcggccccgcggtcagatgctagtagcccatttccaagcttgatagggtctcttaccagcactcg

caccacccgcccgcgcctgctgggcgaggaggagtacctaaacaactcgctgctgcagccgcagcgcgaa

aagaacctgcctccggcgtttcccaacaacgggatagagagcctagtggacaagatgagtagatggaaga

cgtatgcgcaggagcacagggatgtgcccggcccgcgcccgcccacccgtcgtcaaaggcacgaccgtca

gcggggtctggtgtgggaggacgatgactcggcagacgacagcagcgtcttggatttgggagggagtggc

aacccgtttgcacaccttcgccccaggctggggagaatgttttaaaaaaagcatgatgcaaaataaaaaa

ctcaccaaggccatggcaccgagcgttggttttcttgtattccccttagtatgcggcgcgcggcgatgta

tgaggaaggtcctcctccctcctacgagagcgtggtgagcgcggcgccagtggcggcggcgctgggttca

cccttcgatgctcccctggacccgccgttcgtgcctccgcggtacctgcggcctaccggggggagaaaca

gcatccgttactctgagttggcacccctattcgacaccacccgtgtgtaccttgtggacaacaagtcaac

ggatgtggcatccctgaactaccagaacgaccacagcaactttctaaccacggtcattcaaaacaatgac

tacagcccgggggaggcaagcacacagaccatcaatcttgacgaccggtcgcactggggcggcgacctga

aaaccatcctgcataccaacatgccaaatgtgaacgagttcatgtttaccaataagtttaaggcgcgggt

gatggtgtcgcgctcgcttactaaggacaaacaggtggagctgaaatacgagtgggtggagttcacgctg

cccgagggcaactactccgagaccatgaccatagaccttatgaacaacgcgatcgtggagcactacttga

aagtgggcaggcagaacggggttctggaaagcgacatcggggtaaagtttgacacccgcaacttcagact

ggggtttgacccagtcactggtcttgtcatgcctggggtatatacaaacgaagccttccatccagacatc

attttgctgccaggatgcggggtggacttcacccacagccgcctgagcaacttgttgggcatccgcaagc

ggcaacccttccaggagggctttaggatcacctacgatgacctggagggtggtaacattcccgcactgtt

ggatgtggacgcctaccaggcaagcttgaaagatgacaccgaacagggcgggggtggcgcaggcggcggc

aacaacagtggcagcggcgcggaagagaactccaacgcggcagctgcggcaatgcagccggtggaggaca

tgaacgatcatgccattcgcggcgacacctttgccacacgggcggaggagaagcgcgctgaggccgaggc

agcggccgaagctgccgcccccgctgcggaggctgcacaacccgaggtcgagaagcctcagaagaaaccg

gtgattaaacccctgacagaggacagcaagaaacgcagttacaacctaataagcaatgacagcaccttca

cccagtaccgcagctggtaccttgcatacaactacggcgaccctcaggccgggatccgctcatggaccct

gctttgcactcctgacgtaacctgcggctcggagcaggtatactggtcgttgcccgacatgatgcaagac

cccgtgaccttccgctccacgcgccagatcagcaactttccggtggtgggcgccgagctgttgcccgtgc

actccaagagcttctacaacgaccaggccgtctactcccagctcatccgccagtttacctctctgaccca

cgtgttcaatcgctttcccgagaaccagattttggcgcgcccgccagcccccaccatcaccaccgtcagt

gaaaacgttcctgctctcacagatcacgggacgctaccgctgcgcaacagcatcggaggagtccagcgag

tgaccattactgacgccagacgccgcacctgcccctacgtttacaaggccctgggcatagtctcgccgcg

cgtcctatcgagccgcactttttgagcaagcatgtccatccttatatcgcccagcaataacacaggctgg

ggcctgcgcttcccaagcaagatgtttggcggggccaagaagcgctccgaccaacacccagtgcgcgtgc

gcgggcactaccgcgcgccctggggcgcgcacaaacgcggccgcactgggcgcaccaccgtcgatgacgc

catcgacgcggtggtggaggaggcgcgcaactacacgcccacgccgccgccagtgtccaccgtggacgcg

gccattcagaccgtggtgcgcggagcccggcgctacgctaaaatgaagagacggcggaggcgcgtagcac

gtcgccaccgccgccgacccggcactgccgcccaacgcgcggcggcggccctgcttaaccgcgcacgtcg

caccggccgacgggcggccatgcgagccgctcgaaggctggccgcgggtattgtcactgtgccccccagg

tccaggcgacgagcggccgccgcagcagccgcggccattagtgctatgactcagggtcgcaggggcaacg

tgtactgggtgcgcgactcggttagcggcctgcgcgtgcccgtgcgcacccgccccccgcgcaactagat

tgcaataaaaaactacttagactcgtactgttgtatgtatccagcggcggcggcgcgcatcgaagctatg

tccaagcgcaaaatcaaagaagagatgctccaggtcatcgcgccggagatctatggccccccgaagaagg

aagagcaggattacaagccccgaaagctaaagcgggtcaaaaagaaaaagaaagatgatgatgatgatga

acttgacgacgaggtggaactgttgcacgcgaccgcgcccaggcgacgggtacagtggaaaggtcgacgc

gtaagacgtgttttgcgacccggcaccaccgtagtctttacgcccggtgagcgctccacccgcacctaca

agcgcgtgtatgatgaggtgtacggcgacgaggacctgcttgagcaggccaacgagcgcctcggggagtt

tgcctacggaaagcggcataaggacatgctggcgttgccgctggacgagggcaacccaacacctagccta

aagcccgtgacactgcagcaggtgctgcccgcgcttgcaccgtccgaagaaaagcgcggcctaaagcgcg

agtctggtgacttggcacccaccgtgcagctgatggtacccaagcgtcagcgactggaagatgtcttgga

aaaaatgaccgtggagcctgggctggagcccgaggtccgcgtgcggccaatcaagcaggtggcaccggga

ctgggcgtgcagaccgtggacgttcagatacccaccaccagtagcactagtattgccactgccacagagg

gcatggagacacaaacgtccccggttgcctcggcggtggcagatgccgcggtgcaggcggccgctgcggc

cgcgtccaagacctctacggaggtgcaaacggacccgtggatgtttcgtgtttcagccccccggcgtccg

cgccgttcaaggaagtacggcgccgccagcgcgctactgcccgaatatgccctacatccttccatcgcgc

ctacccccggctatcgtggctacacctaccgccccagaagacgagcaactacccgacgccgaaccaccac

tggaacccgccgccgccgtcgccgtcgccagcccgtgctggccccgatttccgtgcgcagggtggctcgc

gaaggaggcaggaccctggtgctgccaacagcgcgctaccaccccagcatcgtttaaaagccggtctttg

tggttcttgcagatatggccctcacctgccgcctccgtttcccggtgccgggattccgaggaagaatgca

ccgtaggaggggcatggccggccacggcctgacgggcggcatgcgtcgtgcgcaccaccggcggcggcgc

gcgtcgcaccgtcgcatgcgcggcggtatcctgcccctccttattccactgatcgccgcggcgattggcg

ccgtgcccggaattgcatccgtggccttgcaggcgcagagacactgattaaaaacaagttacatgtggaa

aaatcaaaataaaagtctggactctcacgctcgcttggtcctgtaactattttgtagaatggaagacatc

aactttgcgtcactggccccgcgacacggctcgcgcccgttcatgggaaactggcaagatatcggcacca

gcaatatgagcggtggcgccttcagctggggctcgctgtggagcggcattaaaaatttcggttccgccgt

taagaactatggcagcaaagcctggaacagcagcacaggccagatgctgagggacaagttgaaagagcaa

aatttccaacaaaaggtggtagatggcctggcctctggcattagcggggtggtggacctggccaaccagg

cagtgcaaaataagattaacagtaagcttgatccccgccctcccgtagaggagcctccaccggccgtgga

gacagtgtctccagaggggcgtggcgaaaagcgtccgcgacccgacagggaagaaactctggtgacgcaa

atagacgagcctccctcgtacgaggaggcactaaagcaaggcctgcccaccacccgtcccatcgcgccca

tggctaccggagtgctgggccagcacacacccgtaacgctggacctgcctccccccgccgacacccagca

gaaacctgtgctgccaggcccgtccgccgttgttgtaacccgtcctagccgcgcgtccctgcgccgcgcc

gccagcggtccgcgatcgttgcggcccgtagccagtggcaactggcaaagcacactgaacagcatcgtgg

gtttgggggtgcaatccctgaagcgccgacgatgcttctgatagctaacgtgtcgtatgtgtgtcatgta

tgcgtccatgtcgccgccagaggagctgctgagccgccgcgcgcccgctttccaagatggctaccccttc

gatgatgccgcagtggtcttacatgcacatctcgggccaggacgcctcggagtacctgagccccgggctg

gtgcagttcgcccgcgccaccgagacgtacttcagcctgaataacaagtttagaaaccccacggtggcgc

ctacgcacgacgtgaccacagaccggtctcagcgtttgacgctgcggttcatccccgtggaccgcgagga

tactgcgtactcgtacaaggcgcggttcaccctagctgtgggtgataaccgtgtgctagacatggcttcc

acgtactttgacatccgcggcgtgctggacaggggccctacttttaagccctactctggcactgcctaca

acgcactggcccccaagggtgcccccaactcgtgcgagtgggaacaaaatgaaactgcacaagtggatgc

tcaagaacttgacgaagaggagaatgaagccaatgaagctcaggcgcgagaacaggaacaagctaagaaa

acccatgtatatgcccaggctccactgtccggaataaaaataactaaagaaggtctacaaataggaactg

ccgacgccacagtagcaggtgccggcaaagaaattttcgcagacaaaacttttcaacctgaaccacaagt

aggagaatctcaatggaacgaagcggatgccacagcagctggtggaagggttcttaaaaagacaactccc

atgaaaccctgctatggctcatacgctagacccaccaattccaacggcggacagggcgttatggttgaac

aaaatggtaaattggaaagtcaagtcgaaatgcaatttttttccacatccacaaatgccacaaatgaagt

taacaatatacaaccaacagttgtattgtacagcgaagatgtaaacatggaaactccagatactcatctt

tcttataaacctaaaatgggggataaaaatgccaaagtcatgcttggacaacaagcaatgccaaacagac

caaattacattgcttttagagacaattttattggtctcatgtattacaacagcacaggtaacatgggtgt

ccttgctggtcaggcatcgcagttgaacgctgttgtagatttgcaagacagaaacacagagctgtcctac

cagcttttgcttgattcaattggcgacagaacaagatacttttcaatgtggaatcaagctgttgacagct

atgatccagatgtcagaattattgagaaccatggaactgaggatgagttgccaaattattgctttcctct

tggtggaattgggattactgacacttttcaagctgttaaaacaactgctgctaacggggaccaaggcaat

actacctggcaaaaagattcaacatttgcagaacgcaatgaaataggggtgggaaataactttgccatgg

aaattaacctgaatgccaacctatggagaaatttcctttactccaatattgcgctgtacctgccagacaa

gctaaaatacaaccccaccaatgtggaaatatctgacaaccccaacacctacgactacatgaacaagcga

gtggtggctcctgggcttgtagactgctacattaaccttggggcgcgctggtctctggactacatggaca

acgttaatccctttaaccaccaccgcaatgcgggcctgcgttaccgctccatgttgttgggaaacggccg

ctacgtgccctttcacattcaggtgccccaaaagttttttgccattaaaaacctcctcctcctgccaggc

tcatacacatatgaatggaacttcaggaaggatgttaacatggttctgcagagctctctgggaaacgacc

ttagagttgacggggctagcattaagtttgacagcatttgtctttacgccaccttcttccccatggccca

caacacggcctccacgctggaagccatgctcagaaatgacaccaacgaccagtcctttaatgactacctt

tccgccgccaacatgctatatcccatacccgccaacgccaccaacgtgcccatctccatcccatcgcgca

actgggcagcatttcgcggttgggccttcacacgcttgaagacaaaggaaaccccttccctgggatcagg

ctacgacccttactacacctactctggctccataccataccttgacggaaccttctatcttaatcacacc

tttaagaaggtggccattacttttgactcttctgttagctggccgggcaacgaccgcctgcttactccca

atgagtttgagattaagcgctcagttgacggggagggctataacgtagctcagtgcaacatgacaaagga

ctggttcctagtgcagatgttggccaactacaatattggctaccagggcttctacattccagaaagctac

aaagaccgcatgtactcgttcttcagaaacttccagcccatgagccggcaagtggtggacgatactaaat

acaaagattatcagcaggttggaattatccaccagcataacaactcaggcttcgtaggctacctcgctcc

caccatgcgcgagggacaagcttaccccgctaatgttccctacccactaataggcaaaaccgcggttgat

agtattacccagaaaaagtttctttgcgaccgcaccctgtggcgcatccccttctccagtaactttatgt

ccatgggtgcgctcacagacctgggccaaaaccttctctacgcaaactccgcccacgcgctagacatgac

ctttgaggtggatcccatggacgagcccacccttctttatgttttgtttgaagtctttgacgtggtccgt

gtgcaccagccgcaccgcggcgtcatcgagaccgtgtacctgcgcacgcccttctcggccggcaacgcca

caacataaagaagcaagcaacatcaacaacagctgccgccatgggctccagtgagcaggaactgaaagcc

attgtcaaagatcttggttgtgggccatattttttgggcacctatgacaagcgcttcccaggctttgttt

ccccacacaagctcgcctgcgccatagttaacacggccggtcgcgagactgggggcgtacactggatggc

ctttgcctggaacccgcgctcaaaaacatgctacctctttgagccctttggcttttctgaccaacgtctc

aagcaggtttaccagtttgagtacgagtcactcctgcgccgtagcgccattgcctcttcccccgaccgct

gtataacgctggaaaagtccacccaaagcgtgcaggggcccaactcggccgcctgtggcctattctgctg

catgtttctccacgcctttgccaactggccccaaactcccatggatcacaaccccaccatgaaccttatt

accggggtacccaactccatgcttaacagtccccaggtacagcccaccctgcgccgcaaccaggaacagc

tctacagcttcctggagcgccactcgccctacttccgcagccacagtgcgcaaattaggagcgccacttc

tttttgtcacttgaaaaacatgtaaaaataatgtactaggagacactttcaataaaggcaaatgttttta

tttgtacactctcgggtgattatttacccccacccttgccgtctgcgccgtttaaaaatcaaaggggttc

tgccgcgcatcgctatgcgccactggcagggacacgttgcgatactggtgtttagtgctccacttaaact

caggcacaaccatccgcggcagctcggtgaagttttcactccacaggctgcgcaccatcaccaacgcgtt

tagcaggtcgggcgccgatatcttgaagtcgcagttggggcctccgccctgcgcgcgcgagttgcgatac

acagggttacagcactggaacactatcagcgccgggtggtgcacgctggccagcacgctcttgtcggaga

tcagatccgcgtccaggtcctccgcgttgctcagggcgaacggagtcaactttggtagctgccttcccaa

aaagggtgcatgcccaggctttgagttgcactcgcaccgtagtggcatcagaaggtgaccgtgcccagtc

tgggcgttaggatacagcgcctgcatgaaagccttgatctgcttaaaagccacctgagcctttgcgcctt

cagagaagaacatgccgcaagacttgccggaaaactgattggccggacaggccgcgtcatgcacgcagca

ccttgcgtcggtgttggagatctgcaccacatttcggccccaccggttcttcacgatcttggccttgcta

gactgctccttcagcgcgcgctgcccgttttcgctcgtcacatccatttcaatcacgtgctccttattta

tcataatgctcccgtgtagacacttaagctcgccttcgatctcagcgcagcggtgcagccacaacgcgca

gcccgtgggctcgtggtgcttgtaggttacctctgcaaacgactgcaggtacgcctgcaggaatcgcccc

atcatcgtcacaaaggtcttgttgctggtgaaggtcagctgcaacccgcggtgctcctcgtttagccagg

tcttgcatacggccgccagagcttccacttggtcaggcagtagcttgaagtttgcctttagatcgttatc

cacgtggtacttgtccatcaacgcgcgcgcagcctccatgcccttctcccacgcagacacgatcggcagg

ctcagcgggtttatcaccgtgctttcactttccgcttcactggactcttccttttcctcttgcatccgca

taccccgcgccactgggtcgtcttcattcagccgccgcaccgtgcgcttacctcccttgccgtgcttgat

tagcaccggtgggttgctgaaacccaccatttgtagcgccacatcttctctttcttcctcgctgtccacg

atcacctctggggatggcgggcgctcgggcttgggagaggggcgcttctttttctttttggacgcaatgg

ccaaatccgccgtcgaggtcgatggccgcgggctgggtgtgcgcggcaccagcgcatcttgtgacgagtc

ttcttcgtcctcggactcgagacgccgcctcagccgcttttttgggggcgcgcggggaggcggcggcgac

ggcgacggggacgagacgtcctccatggttggtggacgtcgcgccgcaccgcgtccgcgctcgggggtgg

tttcgcgctgctcctcttcccgactggccatttccttctcctataggcagaaaaagatcatggagtcagt

cgagaaggaggacagcctaaccgccccctttgagttcgccaccaccgcctccaccgatgccgccaacgcg

cctaccaccttccccgtcgaggcacccccgcttgaggaggaggaagtgattatcgagcaggacccaggtt

ttgtaagcgaagacgacgaagatcgctcagtaccaacagaggataaaaagcaagaccaggacgacgcaga

ggcaaacgaggaacaagtcgggcggggggaccaaaggcatggcgactacctagatgtgggagacgacgtg

ctgttgaagcatctgcagcgccagtgcgccattatctgcgacgcgttgcaagagcgcagcgatgtgcccc

tcgccatagcggatgtcagccttgcctacgaacgccacctgttctcaccgcgcgtaccccccaaacgcca

agaaaacggcacatgcgagcccaacccgcgcctcaacttctaccccgtatttgccgtgccagaggtgctt

gccacctatcacatctttttccaaaactgcaagatacccctatcctgccgtgccaaccgcagccgagcgg

acaagcagctggccttgcggcagggcgctgtcatacctgatatcgcctcgctcgacgaagtgccaaaaat

ctttgagggtcttggacgcgacgagaagcgcgcggcaaacgctctgcaacaagaaaacagcgaaaatgaa

agtcactgtggagtgctggtggaacttgagggtgacaacgcgcgcctagccgtgctgaaacgcagcatcg

aggtcacccactttgcctacccggcacttaacctaccccccaaggttatgagcacagtcatgagcgagct

gatcgtgcgccgtgcacgacccctggagagggatgcaaacttgcaagaacaaaccgaggagggcctaccc

gcagttggcgatgagcagctggcgcgctggcttgagacgcgcgagcctgccgacttggaggagcgacgca

agctaatgatggccgcagtgcttgttaccgtggagcttgagtgcatgcagcggttctttgctgacccgga

gatgcagcgcaagctagaggaaacgttgcactacacctttcgccagggctacgtgcgccaggcctgcaaa

atttccaacgtggagctctgcaacctggtctcctaccttggaattttgcacgaaaaccgccttgggcaaa

acgtgcttcattccacgctcaagggcgaggcgcgccgcgactacgtccgcgactgcgtttacttatttct

gtgctacacctggcaaacggccatgggcgtgtggcagcagtgcctggaggagcgcaacctgaaggagctg

cagaagctgctaaagcaaaacttgaaggacctatggacggccttcaacgagcgctccgtggccgcgcacc

tggcggacattatcttccccgaacgcctgcttaaaaccctgcaacagggtctgccagacttcaccagtca

aagcatgttgcaaaactttaggaactttatcctagagcgttcaggaattctgcccgccacctgctgtgcg

cttcctagcgactttgtgcccattaagtaccgtgaatgccctccgccgctttggggtcactgctaccttc

tgcagctagccaactaccttgcctaccactccgacatcatggaagacgtgagcggtgacggcctactgga

gtgtcactgtcgctgcaacctatgcaccccgcaccgctccctggtctgcaattcacaactgcttagcgaa

agtcaaattatcggtacctttgagctgcagggtccctcgcctgacgaaaagtccgcggctccggggttga

aactcactccggggctgtggacgtcggcttaccttcgcaaatttgtacctgaggactaccacgcccacga

gattaggttctacgaagaccaatcccgcccgccaaatgcggagcttaccgcctgcgtcattacccagggc

cacatccttggccaattgcaagccattaacaaagcccgccaagagtttctgctacgaaagggacgggggg

tttacttggacccccagtccggcgaggagctcaacccaatccccccgccgccgcagccctatcagcagcc

gcgggcccttgcttcccaggatggcacccaaaaagaagctgcagctgccgccgccgccacccacggacga

ggaggaatactgggacagtcaggcagaggaggttttggacgaggaggaggagatgatggaagactgggac

agcctagacgaggaagcttccgaggccgaagaggtgtcagacgaaacaccgtcaccctcggtcgcattcc

cctcgccggcgccccagaaatcggcaaccgttcccagcattgctacaacctccgctcctcaggcgccgcc

ggcactgcccgttcgccgacccaaccgtagatgggacaccactggaaccagggccggtaagtctaagcag

ccgccgccgttagcccaagagcaacaacagcgccaaggctaccgctcgtggcgcgtgcacaagaacgcca

tagttgcttgcttgcaagactgtgggggcaacatctccttcgcccgccgctttcttctctaccatcacgg

cgtggccttcccccgtaacatcctgcattactaccgtcatctctacagcccctactgcaccggcggcagc

ggcagcaacagcagcggccacgcagaagcaaaggcgaccggatagcaagactctgacaaagcccaagaaa

tccacagcggcggcagcagcaggaggaggagcactgcgtctggcgcccaacgaacccgtatcgacccgcg

agcttagaaacaggatttttcccactctgtatgctatatttcaacagagcaggggccaagaacaagagct

gaaaataaaaaacaggtctctgcgctccctcacccgcagctgcctgtatcacaaaagcgaagatcagctt

cggcgcacgctggaagacgcggaggctctcttcagcaaatactgcgcgctgactcttaaggactagtttc

gcgccctttctcaaatttaagcgcgaaaactacgtcatctccagcggccacacccggcgccagcacctgt

cgtcagcgccattatgagcaaggaaattcccacgccctacatgtggagttaccagccacaaatgggactt

gcggctggagctgcccaagactactcaacccgaataaactacatgagcgcgggaccccacatgatatccc

gggtcaacggaatccgcgcccaccgaaaccgaattctcctcgaacaggcggctattaccaccacacctcg

taataaccttaatccccgtagttggcccgctgccctggtgtaccaggaaagtcccgctcccaccactgtg

gtacttcccagagacgcccaggccgaagttcagatgactaactcaggggcgcagcttgcgggcggctttc

gtcacagggtgcggtcgcccgggcagggtataactcacctgaaaatcagagggcgaggtattcagctcaa

cgacgagtcggtgagctcctctcttggtctccgtccggacgggacatttcagatcggcggcgctggccgc

tcttcatttacgccccgtcaggcgatcctaactctgcagacctcgtcctcggagccgcgctccggaggca

ttggaactctacaatttattgaggagttcgtgccttcggtttacttcaaccccttttctggacctcccgg

ccactacccggaccagtttattcccaactttgacgcggtaaaagactcggcggacggctacgactgaatg

accagtggagaggcagagcaactgcgcctgacacacctcgaccactgccgccgccacaagtgctttgccc

gcggctccggtgagttttgttactttgaattgcccgaagagcatatcgagggcccggcgcacggcgtccg

gctcaccacccaggtagagcttacacgtagcctgattcgggagtttaccaagcgccccctgctagtggag

cgggagcggggtccctgtgttctgaccgtggtttgcaactgtcctaaccctggattacatcaagatcttt

gttgtcatctctgtgctgagtataataaatacagaaattagaatctactggggctcctgtcgccatcctg

tgaacgccaccgtttttacccacccaaagcagaccaaagcaaacctcacctccggtttgcacaagcgggc

caataagtaccttacctggtactttaacggctcttcatttgtaatttacaacagtttccagcgagacgaa

gtaagtttgccacacaaccttctcggcttcaactacaccgtcaagaaaaacaccaccaccaccctcctca

cctgccgggaacgtacgagtgcgtcaccggttgctgcgcccacacctacagcctgagcgtaaccagacat

tactcccattttcccaaaacaggaggtgagctcaactcccggaactcaggtcaaaaaagcattttgcggg

gtgctgggattttttaattaagtatatgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcctgcagc

atctctgcacccgcccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatccaggagg

cccggcgtctcctgaacctgagtagagacactgctgctgagatgaatgaaacagtagaagtcatctcaga

aatgtttgacctccaggagccgacctgcctacagacccgcctggagctgtacaagcagggcctgcggggc

agcctcaccaagctcaagggccccttgaccatgatggccagccactacaagcagcactgccctccaaccc

cggaaacttcctgtgcaacccagattatcacctttgaaagtttcaaagagaacctgaaggactttctgct

tgtcatcccctttgactgctgggagccagtccaggagtgaagctattttccgctcgcttgtattcccctg

gacaatttactctatgtgggatatgcgccaggcgggaaagattatacccacaaccttcaaatcaaacttt

cctggacgttagcgcctgacttctgccagcgcctgcactgcaaatttgatcaaacccagcttcagcttgc

ctgctccagagatgaccggctcaaccatcgcgcccacaacggactatcgcaacaccactgctaccggact

aaaatctgccctaaatttaccccaagttcatgcctttgtcaatgactgggcgagcttgggcatgtggtgg

ttttccatagcgcttatgtttgtttgccttattattatgtggcttatttgttgcctaaagcgcagacgcg

ccagaccccccatctataggcctatcattgtgctcaacccacacaatgaaaaaattcatagattggacgg

tctcaaaccatgttctcttcttttacagtatgattaaatgagacatgattcctcgagtccttatattatt

gacccttgttgcgcttttctgtgcgtgctctacattggctgcggtcgctcacatcgaagtagattgcatc

ccacctttcacagtttacctgctttacgkatttgtcacccttatcctcatctgcagcctcgtcactgtag

tcatcgccttcattcagttcattgactggatttgtgtgcgcattgcgtaccttaggcaccatccgcaata

cagagacaggactatagctgatcttctcagaattctttaattatgaaacggattgtcacttttgttttgc

tgattttctgcgccctacctgtgctttgctcccaaacctcagcgcctcccaaaagacatatttcctgcag

attcactcaaatatggaacattcccagctgctacaacaaacagagcgatttgtcagaagcctggttatac

gccatcatctctgtcatggttttttgcagtaccatttttgccctagccatatacccataccttgacattg

gttggaatgccatagatgccatgaaccaccctactttcccagcgcccaatgtcataccactgcaacaggt

tattgccccaatcaatcagcctcgccccccttctcccacccccactgagattagctactttaatttgaca

ggtggagatgactgaatctctagatctagaattggatggaattaacaccgaacagcgcctactagaaagg

cgcaaggcggcgtccgagcgagaacgcctaaaacaagaagttgaagacatggttaacctgcaccagtgta

aaagaggtatcttttgtgtggtcaagcaggccaaacttacctacgaaaaaaccactaccggcaaccgcct

tagctacaagctacccacccagcgccaaaaactggtgcttatggtgggagaaaaacctatcaccgtcacc

cagcactcggcagaaacagaaggctgcctgcacttcccctatcagggtccagaggacctctgcactctta

ttaaaaccatgtgtggcattagagatcttattccattcaactaacaataaacacacaataaattacttac

ttaaaatcagtcagcaaatctttgtccagcttattcagcatcacctcctttccctcctcccaactctggt

atttcagcagccttttagctgcgaactttctccaaagtctaaatgggatgtcaaattcctcatgttcttg

tccctccgcacccactatcttcatattgttgcagatgaaacgcgccagaccgtctgaagacaccttcaac

cctgtgtacccatatgacacggaaaccggccctccaactgtgcctttccttacccctccctttgtgtcgc

caaatgggttccaagaaagtccccccggagtgctttctttgcgtctttcagaacctttggttacctcaca

cggcatgcttgcgctaaaaatgggcagcggcctgtccctggatcaggcaggcaaccttacatcaaataca

atcactgtttctcaaccgctaaaaaaaacaaagtccaatataactttggaaacatccgcgccccttacag

tcagctcaggcgccctaaccatggccacaacttcgcctttggtggtctctgacaacactcttaccatgca

atcacaagcaccgctaaccgtgcaagactcaaaacttagcattgctaccaaagagccacttacagtgtta

gatggaaaactggccctgcagacatcagcccccctctctgccactgataacaacgccctcactatcactg

cctcacctcctcttactactgcaaatggtagtctggctgttaccatggaaaacccactttacaacaacaa

tggaaaacttgggctcaaaattggcggtcctttgcaagtggccaccgactcacatgcactaacactaggt

actggtcagggggttgcagttcataacaatttgctacatacaaaagttacaggcgcaatagggtttgata

catctggcaacatggaacttaaaactggagatggcctctatgtggatagcgccggtcctaaccaaaaact

acatattaatctaaataccacaaaaggccttgcttttgacaacaccgcaataacaattaacgctggaaaa

gggttggaatttgaaacagactcctcaaacggaaatcccataaaaacaaaaattggatcaggcatacaat

ataataccaatggagctatggttgcaaaacttggaacaggcctcagttttgacagctccggagccataac

aatgggcagcataaacaatgacagacttactctatggacaggtccaaaaccagaagccaactgcataatt

gaatacgggaaacaaaacccagatagcaaactaactttaatccttgtaaaaaatggaggaattgttaatg

gatatgtaacgctaatgggagcctcagactacgttaacaccttatttaaaaacaaaaatgtctccattaa

tgtagaactatactttgatgccactggtcatatattaccagactcatcttctcttaaaacagatctagaa

ctaaaatacaagcaaaccgctgactttagtgcaagaggttttatgccaagtactacagcgtatccatttg

tccttcctaatgcgggaacacataatgaaaattatatttttggtcaatgctactacaaagcaagcgatgg

tgccctttttccgttggaagttactgttatgcttaataaacgcctgccagatagtcgcacatcctatgtt

atgacttttttatggtccttgaatgctggtctagctccagaaactactcaggcaaccctcataacctccc

catttaccttttcctatattagagaagatgactaaagaatcgtgaacctgttgcatgttatgtttcaacg

tgtttatttttcaattgcagaaaatttcaagtcatttttcattcagtagtatagccccaccaccacatag

cttatactaatcaccgtaccttaatcaaactcacagaaccctagtattcaacctgccacctccctcccaa

cacacagagtacacagtcctttctccccggctggccttaaacagcatcatatcatgggtaacagacatat

tcttaggtgttatattccacacggtctcctgtcgagccaaacgctcatcagtgatgttaataaactcccc

gggcagctcgcttaagttcatgtcgctgtccagctgctgagccacaggctgctgtccaacttgcggttgc

tcaacgggcggcgaaggagaagtccacgcctacatgggggtagagtcataatcgtgcatcaggatagggc

ggtggtgctgcagcagcgcgcgaataaactgctgccgccgccgctccgtcctgcaggaatacaacatggc

agtggtctcctcagcgatgattcgcaccgcccgcagcataaggcgccttgtcctccgggcacagcagcgc

accctgatctcacttaagtcagcacagtaactgcagcacagtaccacaatattgtttaaaatcccacagt

gcaaggcgctgtatccaaagctcatggcggggaccacagaacccacgtggccatcataccacaagcgcag

gtagattaagtggcgacccctcataaacacgctggacataaacattacctcttttggcatgttgtaattc

accacctcccggtaccatataaacctctgattaaacatggcgccatccaccaccatcctaaaccagctgg

ccaaaacctgcccgccggctatgcactgcagggaaccgggactggaacaatgacagtggagagcccagga

ctcgtaaccatggatcatcatgctcgtcatgatatcaatgttggcacaacacaggcacacgtgcatacac

ttcctcaggattacaagctcctcccgcgtcagaaccatatcccagggaacaacccattcctgaatcagcg

taaatcccacactgcagggaagacctcgcacgtaactcacgttgtgcattgtcaaagtgttacattcggg

cagcagcggatgatcctccagtatggtagcgcgtgtctctgtctcaaaaggaggtaggcgatccctactg

tacggagtgcgccgagacaaccgagatcgtgttggtcgtagtgtcatgccaaatggaacgccggacgtag

tcatatttcctgaagcaaaaccaggtgcgggcgtgacaaacagatctgcgtctccggtctcgtcgcttag

ctcgctctgtgtagtagttgtagtatatccactctctcaaagcatccaggcgccccctggcttcgggttc

tatgtaaactccttcatgcgccgctgccctgataacatccaccaccgcagaataagccacacccagccaa

cctacacattcgttctgcgagtcacacacgggaggagcgggaagagctggaagaaccatgtttttttttt

ttattccaaaagattatccaaaacctcaaaatgaagatctattaagtgaacgcgctcccctccggtggcg

tggtcaaactctacagccaaagaacagataatggcatttgtaagatgttgcacaatggcttccaaaaggc

aaactgccctcacgtccaagtggacgtaaaggctaaacccttcagggtgaatctcctctataaacattcc

agcaccttcaaccatgcccaaataattttcatctcgccaccttatcaatatgtctctaagcaaatcccga

atattaagtccggccattgtaaaaatctgctccagagcgccctccaccttcagcctcaagcagcgaatca

tgattgcaaaaattcaggttcctcacagacctgtataagattcaaaagcggaacattaacaaaaataccg

cgatcccgtaggtcccttcgcagggccagctgaacataatcgtgcaggtctgcacggaccagcgcggcca

cttccccgccaggaaccatgacaaaagaacccacactgattatgacacgcatactcggagctatgctaac

cagcgtagccccgatgtaagcttgttgcatgggcggcgatataaaatgcaaggtactgctcaaaaaatca

ggcaaagcctcgcgcaaaaaagcaagcacatcgtagtcatgctcatgcagataaaggcaggtaagttccg

gaaccaccacagaaaaagacaccatttttctctcaaacatgtctgcgggttcctgcataaacacaaaata

aaataacaaaaaaaaaaaacatttaaacattagaagcctgtcttacaacaggaaaaacaacccttataag

cataagacggactacggccatgccggcgtgaccgtaaaaaaactggtcaccgtgattaaaaagcaccacc

gacagttcctcggtcatgtccggagtcataatgtaagactcggtaaacacatcaggttggttaacatcgg

tcagtgctaaaaagcgaccgaaatagcccgggggaatacatacccgcaggcgtagagacaacattacagc

ccccataggaggtataacaaaattaataggagagaaaaacacataaacacctgaaaaaccctcctgccta

ggcaaaatagcaccctcccgctccagaacaacatacagcgcttccacagcggcagccataacagtcagcc

ttaccagtaaaaaaacctattaaaaaacaccactcgacacggcaccagctcaatcagtcacagtgtaaaa

agggccaagtacagagcgagtatatataggactaaaaaatgacgtaacggttaaagtccacaaaaaccac

ccagaaaaccgcacgcgaacctacgcccagaaacgaaagccaaaaaacccacaacttcctcaaatcttca

cttccgttttcccacgatacgtcacttcccattttaaaaaaaaactacaattcccaatacatgcaagtta

ctccgccctaaaacctacgtcacccgccccgttcccacgccccgcgccacgtcacaaactccaccccctc

attatcatattggcttcaatccaaaataaggtatattattgatgatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggcaggtaagatcgatcacctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgctgggattttttaattaagtatatgtggctgcagagcc</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caagacctgcaaccgtg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acattactcccattttccca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgagtttgattaaggtacgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims (1)

1. Генетический вектор Ad6/3-hTERT-GMCSF, содержащий геномные последовательности рекомбинантного аденовируса 6 серотипа, промотор теломеразы человека, ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, а также ген белка файбер со встройкой домена fiber knob аденовируса 3 серотипа, представленный на SEQ.1, обладающий повышенной трансдукцией в опухолевые клетки.