CN100420742C - 一种肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其制备方法及用途。本发明的腺病毒是利用缺氧应答元件HRE和AFP核心启动子AF0.3来构建杂合启动子，构建保留有E1复制启动区基因的重组腺病毒穿梭质粒，再经过同源重组构建重组腺病毒质粒，转染细胞，包装出目的重组腺病毒颗粒。本发明的腺病毒具有肝癌靶向性，能在肝癌细胞内自我复制，达到裂解癌细胞的目的。具有高效、无致突变作用、安全性高的优点，可用于制备肝癌的治疗药物。

Description

一种肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种重组腺病毒，具体地说涉及一种肝癌靶向性溶瘤腺病毒，还涉及该病毒的制备方法及用途。

背景技术

肝癌发病率与死亡率在我国一直居高不下，是危害我国人群健康的主要肿瘤，但目前尚无特效治疗方法。如能研制有效的肝癌生物治疗制剂，不仅对探索肝癌治疗具有重要意义，而且具有明显的社会和经济效益。

肿瘤的发生发展往往是多基因协同作用的结果，仅靠恢复1个或几个抑癌基因功能的基因治疗方法一般难以奏效，美国伯明翰阿拉巴马大学的Miller和Curiel于1996年在《Gene Therapy》杂志上发表了一篇社论，首先提出了使用肿瘤选择复制性腺病毒(tumor selective replication Adenovirus，TSRA，亦称特异性溶瘤腺病毒selectively oncolytic Adenovirus)治疗肿瘤的新策略，这种重组腺病毒一旦感染肿瘤细胞即可在细胞内复制增殖并裂解肿瘤细胞，细胞裂解后释放的病毒颗粒可再次感染其它肿瘤细胞，直到将全部肿瘤细胞杀灭。但该病毒在正常细胞内不能增殖，对正常细胞损害不大。作为这种策略的实践，Khuri等于2000年使用E1b55缺失的复制性重组腺病毒ONYX-015(dl1520)选择性裂解P53-肿瘤细胞，获得可喜成绩。该研究小组在2000年8月的《自然医学》杂志上报道：在30名患有头颈部癌的病人身上试用了选择性攻击P53缺陷的肿瘤细胞的腺病毒突变体ONYX-015并联合常规化疗，使25名患者的肿瘤缩小，其中8名患者的肿瘤完全消失。基因疗法领域的先驱南加州大学的威廉.安德森评论说：这项成果非常令人振奋，因为这是首次在数量较多病人参与的二期临床试验中取得大量的肿瘤消失且不复发的结果。ONYX-015也已用于肝癌的基因治疗研究，尽管普遍认为ONYX-015仅对p53-肝癌细胞有裂解作用，但也有研究结果发现ONYX-015能在p53+肝癌细胞系如HepG2内复制，p53状态与ONYX-015的复制缺乏相关性。最近几年腺病毒突变体ONYX-015等多种增殖病毒已进入临床试验，为肿瘤的治疗开辟了一个新的研究领域。

选择复制性腺病毒之所以有很好疗效，主要是因为腺病毒能自主复制，呈对数增殖，使其治疗剂量成万倍地放大。腺病毒溶瘤疗法中，选择复制性腺病毒能主动地寻找靶细胞，在靶细胞内进行复制，将癌细胞裂解杀灭。

AdE1区基因是腺病毒的复制启动基因，包括E1a和E1b两部分，它的表达与否直接关系到腺病毒能否复制。因此如果把整个腺病毒比作一部机器，那么E1区就是这部机器的总开关，其作用至关重要。在腺病毒感染后的最初2.5小时内，只有E1a基因被转录、翻译，此蛋白可激活对腺病毒复制必需的各种细胞基因和病毒基因的表达。以前所用的复制缺陷型腺病毒正是剔除了这段序列。而在选择复制性腺病毒中正是保留和利用这一基因区，将其置于肿瘤组织或细胞特异的调控序列控制之下，或利用肿瘤细胞内特有的信号传导途径，使病毒复制并达到特异裂解杀灭癌细胞的目的。

肿瘤的基因疗法需要面对的一个首要问题是靶向性或特异性。人们为了特异性地杀伤肿瘤细胞，根据肿瘤细胞的生物学特性，细胞表面的受体分子的分布以及胞内基因表达的特殊性，设计了一些靶向的方法。如多用于中枢神经系统肿瘤的逆病毒载体，即是利用了其特异整合于分裂细胞的性质，将目的基因导入正在分裂的肿瘤细胞。而腺病毒突变体ONYX-015则是利用了肿瘤细胞内突变的p53基因产物不能阻止细胞进入复制期而可允许其同时增殖复制，最后导致癌细胞裂解。目前，研究者们普遍采用一个灵活而具有广泛意义的方法，即选用肿瘤特异性调控元件(启动子和增强子)以驱动目的基因表达于特定的靶细胞。此法已用于肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、骨肉瘤、黑色素瘤等实体瘤的实验研究。腺病毒溶瘤疗法也同样面对靶向性或特异性问题，特异性溶瘤腺病毒的构建大多也采用肿瘤特异性调控元件(启动子和增强子)来驱动腺病毒于特定的靶细胞内复制。

理论上，可以通过调控腺病毒复制的各个环节来构建TSRAd；实际上近年来的研究表明，主要的策略就三种：一是剔除(全部或部分)腺病毒在肿瘤细胞中复制时多余的基因，而这些基因在正常细胞中却必不可少，如通过与p53或Rb结合而激活细胞周期的基因；第二种策略则是用肿瘤特异的启动子替换掉天然的病毒启动子以控制病毒复制基因的表达；三是改造腺病毒纤毛蛋白，使其特异地感染肿瘤并在其中复制。

在逆转录病毒载体介导的肝癌自杀基因疗法研究中，用血管内皮生长因子VEGF上游的缺氧应答元件HRE与AFP核心启动子AF0.3构成的杂合启动子HREAF，可指导自杀基因HSV tk在几乎所有产生或不产生AFP的(如HLF)肝癌细胞系中特异性高表达，增强子HRE在缺氧条件下选择性地激活了不产生AFP的肝癌细胞中的痕量AFP启动子活性。因此，杂合启动子HREAF大大拓展了AFP启动子在肝癌靶向性或特异性基因治疗中的应用范围。不过在此逆转录病毒载体介导的肝癌自杀基因疗法中，由于存在“旁观者效应”，肝脏干细胞还是难免会被波及，肝储备能力会受到影响。

经检索，目前仅见国外有构建含AFP甲胎蛋白及HRE缺氧应答元件的逆病毒载体，以及不带有肝癌靶向性的E1区缺失的腺病毒载体，尚未见到构建肝癌靶向性可复制性溶瘤腺病毒进行肝癌基因治疗的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种肝癌靶向性的溶瘤腺病毒，以及该腺病毒的制备方法及用途。

本发明的肝癌靶向性溶瘤腺病毒包含缺氧应答元件HRE和AFP核心启动子AF0.3来构建的肝癌靶向性的杂合启动子HREAF，以及腺病毒E1区复制启动基因，腺病毒E1区复制启动基因位于肝癌靶向性杂合启动子的下游。

本发明采用穿梭质粒构建重组腺病毒穿梭质粒，再经同源重组构建重组腺病毒质粒，经纯化、酶切，转染细胞，包装出目的重组腺病毒颗粒。

本发明的肝癌靶向性溶瘤腺病毒的制备方法包括以下步骤：

1、克隆HRE和AF0.3及构建杂合启动子HREAF

(1)设计缺氧应答元件HRE、AFP核心启动子AF0.3的PCR引物，以人肝细胞癌细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

(2)将PCR产物克隆至pGEM-T easy载体，构建质粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3。

(3)进行PCR及酶切鉴定及测序鉴定。

(4)杂合启动子HREAF的构建。将HRE与AF0.3进行PCR扩增，回收PCR产物并纯化、酶切后，在体外连接，得杂合启动子HREAF。

2、构建腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55

重组腺病毒所需的细菌同源重组系统包括E.coli BJ5183(Stratagene公司产品)和穿梭质粒pShuttle、pShuttle-CMV以及腺病毒骨架质粒pAdEasy-1。pShuttle可供插入包含调控序列至polyA加尾信号的完整基因，pShuttle-CMV则可供插入仅含翻译起始密码至终止密码的编码序列。但在本发明中，需要在穿梭载体中插入不同来源的调控序列HREAF、编码序列AdE1或AdE1Δ55，并且需要为其提供polyA加尾信号。因此本发明中将要构建的穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55均不能在pShuttle或pShuttle-CMV的基础上直接构建，需先对其进行改构，本发明选择在pShuttle中插入polyA加尾信号。改构路线如图3所示。

(1)设计穿梭质粒构建所需引物。

(2)重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1的构建及鉴定。将腺病毒穿梭载体pShuttle和pShuttle-CMV分别进行酶切，连接酶切片段并转化，获得在pShuttle中插入了SV40加尾信号序列的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-R；

将pShuttle-R和HREAF的PCR产物分别进行酶切，连接酶切片段并转化，获得在pShuttle-R中插入了调控序列HREAF的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF；

将pShuttle-HREAF和AdE1的PCR产物分别进行双酶切，连接酶切片段并转化，获得在pShuttle-HREAF中插入了腺病毒AdE1基因的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1，采用PCR及酶切方法进行鉴定。

(3)pShuttle-HREAF-E1Δ55的构建及鉴定

由于腺病毒的包装能力有限，为了构建出腺病毒衣壳能包装得下的肝癌特异性溶瘤腺病毒，本发明构建了pShuttle-HREAF-E1Δ55。pShuttle-HREAF-E1Δ55的构建路线与pShuttle-HREAF-E1相似。

将pShuttle-HREAF和缺失E1b55的AdE1Δ55基因的PCR产物分别进行酶切，连接酶切片段并转化，获得重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1Δ55，采用PCR及酶切方法进行鉴定。

3、生产重组溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55

(1)采用AdEasy XL adenoviral vector system(Stratagene公司产品)生产重组腺病毒的原理，该系统中骨架质粒pAdEasy-1长33.5kb，已剔除了E1区和E3区，含有氨苄青霉素抗性基因；已克隆入外源目的基因的穿梭质粒如pShuttl-HREAF-E1和pShuttl-HREAF-E1Δ55分别长10.45kb和9.3kb，均含有卡那霉素抗性基因。骨架质粒和穿梭质粒均含有pBR322复制起始位点，可在细菌中复制扩增。

将构建好的穿梭质粒进行线性化，与pAdEasy-1一起转化感受态细菌进行同源重组，经抗生素抗性选择，再经体外酶切鉴定。鉴定后的重组腺病毒质粒被转化至重组缺陷型菌株大量扩增。纯化后的重组腺病毒质粒经酶切，暴露出左右反向重复序列(ITR)后转染细胞，包装出目的重组腺病毒颗粒。

(2)细菌中重组腺病毒质粒的产生和鉴定

将穿梭质粒pShuttl-HREAF-E1和pShuttl-HREAF-E1Δ55线性化，分别与骨架质粒pAdEasy-1一起转化感受态细菌，抗生素平板选择培养，只有具备卡那霉素抗性的重组质粒pAdhafE1或pAdhafE1Δ55可被选择。分别挑出pAdhafE1克隆及pAdhafE1Δ55克隆，抽提质粒，进行酶切鉴定。

(3)哺乳动物细胞中产生腺病毒

发明人选择重组质粒pAdhafE1Δ55来进行重组腺病毒AdhafE1Δ55的包装生产。将重组质粒pAdhafE1Δ55大量扩增、纯化，经酶切，暴露出左右ITR后转染哺乳动物细胞(如293细胞)，进行重组腺病毒颗粒AdhafE1Δ55的包装。待细胞出现完全病变，回收细胞，提取重组腺病毒基因组DNA，作为模板，进行PCR鉴定，同时设立阴性对照。

4、AdhafE1Δ55对人肝癌细胞的特异杀伤作用

(1)形态学观察AdhafE1Δ55对人肝癌细胞的特异杀伤

将人肝癌细胞和肺癌细胞铺板，以低剂量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分别攻击，缺氧条件下培养，观察细胞生长情况。

(2)MTT实验检测AdhafE1Δ55对人肝癌细胞的特异杀伤

将人肝癌细胞和肺癌细胞铺板，以低剂量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分别攻击，缺氧诱导条件下培养。分别测定各孔细胞的光吸收值，绘制细胞生长曲线，并对各肿瘤细胞在各时间点上进行AdhafE1Δ55感染与否之间的生存状况比较，以及对各肿瘤细胞之间在各时间点上进行生存率的比较。

(3)RT-PCR检测E1a的表达

以AdhafE1Δ55分别感染人肝癌细胞和肺癌细胞，培养收集细胞，提取总RNA，用RT-PCR检测E1a的表达。

肿瘤的进展需要建立新生血管为其供应氧气和营养物质，具备血管形成能力也就成为肿瘤生长的前提条件。在促进肿瘤新生血管生成的众多因素中，VEGF扮演了极其重要的角色，其表达是在缺氧条件下通过存在于其基因5’端上游的HRE来诱导的。HRE于缺氧条件下诱导目的基因增强表达，存在组织或细胞特异性，其组织或细胞特异性是由与其紧邻的启动子所限定。肝癌被认为是高血管分布的肿瘤，不过仍发现它比相应的非肿瘤组织表达更高水平的VEGF。Ido等观察由HRE和AF0.3杂合而成的启动子HREAF介导的肝癌特异性，亦证明增强子HRE在缺氧条件下诱导的目的基因的增强表达可被启动子AF0.3限定于肝癌细胞内(Ido A，Uto H，Moriuchi A，et al.Genetherapy targeting for hepatocellular carcinoma：selective and enhanced suicidegene expression regulated by a hypoxia-inducible enhancer linked to a humanα-fetoprotein promoter.Cancer Research，2001；61：3016-3021)。

根据肝癌高表达VEGF的特点及杂合启动子HREAF所介导目的基因表达的高效、严谨的肝癌特异性，如果将HREAF用于指导溶瘤腺病毒在肝癌细胞内特异复制并裂解之，则会因特异性溶瘤腺病毒具有的“复制与裂解的一一对应关系”特点，而至少在理论上可避免对肝储备能力的影响，尽可能地达到特异杀伤肝癌细胞的要求。因为肝脏再生过程则呈有序适度特征，氧供充足，不同于在肝炎、肝硬化等组织中会由缺氧条件及多种细胞因子和生长因子而介导VEGF的表达，亦不同于在实体瘤中会因瘤体增长过快及无序新生血供而导致主要由缺氧条件介导VEGF表达。

本发明采用选择复制性腺病毒溶瘤策略进行肝癌基因治疗，为了解决肝癌基因治疗中的靶向性或特异性问题，并尽量针对所有AFP产量不等的肝癌，发明人构建了杂合启动子HREAF指导的肝癌靶向性溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55，并进行了初步的体外肝癌细胞特异杀伤研究，取得了预期的对肝癌细胞的特异杀伤结果。利用本发明的重组腺病毒，可以制备用于治疗肝癌的药物。本发明的重组腺病毒可作为肝癌生物治疗的选择之一，为肝癌患者带来福音。

本发明的创新点在于用可复制性溶瘤腺病毒代替逆病毒，通过腺病毒本身的复制达到裂解靶细胞的目的，与复制缺陷型腺病毒相比，本发明保留和利用了腺病毒复制启动基因AdE1基因，使病毒复制并达到特异裂解杀灭癌细胞的目的。并具有以下优点：1，靶细胞不一定在复制分裂期即可被杀伤，效率高。2，腺病毒不插入靶细胞核基因组，无致突变作用。3，一过性作用，安全性高。

附图说明

图1为pGEM-HREAF结构示意图。

图2为杂合启动子HREAF构建示意图。

图3为重组质粒pShuttle-HREAF-E1构建示意图。

图4为重组质粒pShuttle-HREAF-E1Δ55构建示意图。

图5为AdEasy XL adenoviral vector system生产重组腺病毒示意图。

图6为重组腺病毒质粒pAdhafE1的酶切鉴定，其中

1，3为酶切前，2，4为PacI酶切后，5为DNA marker λ-Hind III

图7为质粒pAdhafE1Δ55电泳图，其中

1，2，3，5，6，7为质粒pAdhafE1Δ55，4为DNA marker λ-Hind III

图8为PacI酶切鉴定pAdhafE1Δ55图，其中

1，2，3，5，6，7为pAdhafE1Δ55的PacI酶切产物，4为DNA markerλ-Hind III

图9为细胞病变效应图，图中a为病变孔细胞，b为对照孔细胞。

图10为重组腺病毒AdhafE1Δ55的基因组DNA，其中

1为DNA Marker λ-HindIII digest，

2为293细胞中包装出的AdhafE1Δ55，

3为HepG2细胞中包装出的AdhafE1Δ55。

图11为重组腺病毒AdhafE1Δ55的PCR鉴定电泳图，其中

1为DNA Marker DL2000

2为以293细胞中包装出的重组腺病毒基因组DNA为模板PCR扩增HREAF

3为以HepG2细胞中包装出的重组腺病毒基因组DNA为模板PCR扩增HREAF

4为阴性对照

图12为AdhafE1Δ55对人肝癌细胞的特异杀伤作用图，其中

a为Bel7402细胞/AdhafE1Δ55，

b为对照Bel7402细胞，

c为HepG2细胞/AdhafE1Δ55，

d为对照HepG2细胞，

e为PLA801C/AdhafE1Δ55，

f为对照PLA801C。

图13为肝癌细胞感染AdhafE1Δ55后的生存曲线图。

图14为RT-PCR方法检测AdhafE1Δ55感染肝癌细胞后E1a的特异表达图，

其中

1，2，3分别为HepG2、Bel7402和PLA801C细胞的G3PDH RT-PCR产物

4为DNA Marker DL2000，

5，6，7分别为HepG2、Bel7402和PLA801C细胞的E1a RT-PCR。

具体实施方式

实施例一克隆HRE和AF0.3及构建杂合启动子HREAF

1、从Genbank中查出人血管内皮生长因子VEGF上游缺氧应答元件HRE及人α-甲胎蛋白核心启动子AF0.3的序列，并进行内部酶切位点的分析

(1)含缺氧应答元件HRE序列为见GenBank data accession no.M63971，序列中SacI与PstI之间(1188-1572)约380bpDNA片段即为缺氧应答元件HRE。

(2)含α-甲胎蛋白核心启动子AF0.3序列为见GenBank data accessionno.L34019，序列中723～981之间的259bpDNA片段即为AFP核心启动子AF0.3。设计出缺氧应答元件HRE、AFP核心启动子AF0.3的PCR引物，缺氧应答元件HRE引物：上游引物见序列表中序列1，下游引物见序列表中序列2。在其上游引物中插入HindIII位点，便于随后插入增强子序列，下游引物中插入BamHI位点，以利于后续的连接、克隆操作。预期扩增产物约560bp。

AFP核心启动子AF0.3引物：上游引物见序列表中序列3，下游引物见序列表中序列4。在其上游引物中插入BamHI位点，便于随后插入增强子序列，下游引物中插入HindIII位点，以利于后续的连接、克隆操作。预期扩增产物约310bp。

3、缺氧应答元件HRE、AFP核心启动子AF0.3的PCR扩增

以人肝细胞癌HepG2细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所)基因组DNA为模板，分别用设计的引物进行HRE和AF0.3的高保真PCR扩增，电泳观察，可见分别有约310bp和560bp的扩增条带，且为主要产物，与预期的结果一致。

4、将缺氧应答元件HRE、AFP核心启动子AF0.3的PCR产物克隆至pGEM-T easy载体，构建质粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3。

将HRE和AF0.3的上述PCR产物经乙醇沉淀后，用Taq DNA聚合酶加A尾，然后与T载体相连，转化JM109宿主菌(Stratagene公司产品)，铺于含X-gal、IPTG、Amp的琼脂平皿中，结果长出许多蓝色和白色菌落。白色菌落即为侯选克隆。

5、缺氧应答元件HRE、AFP核心启动子AF0.3的PCR及酶切鉴定

各挑白色克隆，热裂解法制备质粒作模板，用特异引物分别进行HRE和AF0.3的PCR扩增，电泳观察，可见挑取的克隆均能扩增出约310bp和560bp的目的片段。提取质粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3，进行BamHI+HindIII双酶切鉴定，可见质粒pGEM-HRE可酶切出约560bp的目的片段，pGEM-AF0.3可酶切出约310bp的目的片段。

结合以上对质粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3的PCR及酶切鉴定结果，表明克隆入pGEM-T easy载体的缺氧应答元件HRE、AFP核心启动子AF0.3的酶切位点及大小正确，送pGEM-AF0.3和pGEM-HRE质粒到上海生工公司测序。

6、测序鉴定

缺氧应答元件HRE、AFP核心启动子AF0.3已测序部分与文献报道一致，在两端已分别加入了HindIII和BamHI酶切位点，可确定质粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3中外源DNA片段HRE和AF0.3的插入方向。

7、杂合启动子HREAF的构建

将HRE与AF0.3进行PCR扩增，回收PCR产物并纯化、酶切后，在体外进行连接，得杂合启动子HREAF，将此连接产物克隆至pGEM-T easy载体，如图1所示，经PCR、酶切及测序鉴定正确。

为了便于HREAF的构建，另设计了一条AF0.3下游引物，带入了SphI位点，如序列表中序列14所示。杂合启动子HREAF的构建路线如图2所示，预期可得约700bp的连接产物HREAF。

以HREAF连接产物作为模板，以HRE上游引物与AF0.3下游引物配对，进行PCR扩增，结果与预期一致。

根据对HRE和AF0.3序列酶切位点的分析以及HREAF的构建路线，可预期在连接产物HREAF中应有两个SacI位点，相距约445bp。因此对HREAFPCR产物纯化回收后，用SacI进行单酶切，结果如预期所料，酶切出了HREAF序列中部的445bp特异片段及两端分别约200bp和50bp的条带。

将HREAF PCR产物经乙醇沉淀后，用Taq DNA聚合酶加A尾，然后与T载体相连，转化JM109宿主菌，铺于含X-gal、IPTG、Amp的琼脂平皿中，结果长出许多蓝色和白色菌落。白色菌落即为侯选克隆。挑白色克隆，热裂解法制备质粒作模板，用特异引物分别进行HREAF的PCR扩增，电泳观察，可见扩增出约700bp的目的片段。

小提质粒pGEM-HREAF进行EcoR I单酶切鉴定，结果酶切出约700bp的目的片段。

结合以上对HREAF连接产物和质粒pGEM-HREAF的PCR及酶切鉴定结果，表明克隆入pGEM-T easy载体的杂合启动子HREAF的酶切位点及大小正确，送pGEM-HREAF质粒到晶泰生物技术公司采用T7通用引物进行测序测定，HREAF测序结果如序列表中序列5所示，其中的缺氧应答元件HRE、AFP核心启动子AF0.3分别与文献报道一致，符合预期构建设想，可确定质粒pGEM-HREAF中外源DNA片段HREAF的插入方向分别如图所示。

实施例二腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55的构建

1、设计穿梭质粒构建所需引物

依据文献中报道的缺氧应答元件HRE(GenBank data accession no.M63971)、AFP核心启动子AF0.3(GenBank data accession no.L34019)、腺病毒E1a和Elb(GenBank data accession no.X02996)及穿梭质粒pShuttle多克隆位点(MCS)两端的序列(Stratagene公司网站www.stratagene.com)，分别设计引物，并视载体构建的需要，在其5’端或3’端分别加入不同的限制性内切酶位点，用于各构建元件的PCR扩增，引物由赛百胜公司合成。

HREAF引物：上游引物如序列表中序列6所示，加入KpnI位点，下游引物如序列表中序列7所示，加入XhoI位点，预期扩增目的产物约为720bp；

E1a引物：上游引物如序列表中序列8所示，加入XhoI位点，下游引物如序列表中序列9所示，预期扩增目的产物为1000bp(在RT-PCR中，可能会扩增出约1000bp、880bp或740bp的cDNA条带)；

E1b引物：下游引物如序列表中序列10所示，加入EcoR V位点。与E1a上游引物配对，预期扩增目的产物为2950bp，为全长AdE1；

E1bΔ55引物：下游引物如序列表中序列11所示，加入EcoR V位点。与E1a上游引物配对，预期扩增目的产物为1720bp，为缺失E1b55的AdE1Δ55基因；

pShuttle MCS两端引物：上游引物如序列表中序列12所示，下游引物如序列表中序列13所示，预期扩增目的产物大小据插入片段的大小而定；各次PCR反应条件根据引物搭配使用情况及目的产物大小而定。

2、重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1的构建

将腺病毒穿梭载体pShuttle和pShuttle-CMV分别进行Xho I和EcoR I双酶切，分别回收纯化pShuttle来源的大片段和pShuttle-CMV来源的小片段，T4连接酶连接并转化感受态细胞JM109，筛选阳性克隆子，经PCR及酶切鉴定，获得在pShuttle中插入了SV40加尾信号序列的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-R。将pShuttle-R和HREAF的PCR产物分别进行Xho I和Kpn I双酶切，乙醇沉淀后如上述方法进行连接、转化、筛选、鉴定，获得在pShuttle-R中插入了调控序列HREAF的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF。将pShuttle-HREAF和AdE1的PCR产物分别进行Xho I和EcoR V双酶切，乙醇沉淀后如上述方法进行连接、转化、筛选、鉴定，获得在pShuttle-HREAF中插入了腺病毒AdE1基因的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1。对上述构建的各质粒分别进行PCR和酶切鉴定。

3、pShuttle-HREAF-E1的构建及鉴定

将上述各质粒作为模板，以pShuttle MCS两端引物对插入片段进行PCR鉴定，可见pShuttle改构前MSC两端之间仅有约150bp长，改构后的pShuttle-R由于插入了约230bp长的SV40加尾信号序列，MSC两端之间距离变为约380bp长；插入HREAF后，间距进一步变为约1080bp；当插入了E1后，间距最终变为约4000bp。以pShuttle-HREAF-E1为模板，分别以特异引物对扩增HREAF、E1及HREAF-E1，可得预期大小分别约为700bp、2950bp及3650bp的特异外源片段。

当以Kpn I和EcoR V双酶切上述各质粒时，在pShuttle-HREAF能得到与外源目的片段HREAF和pShuttle酶切片段大小相同的两条带；但由于E1内部有KpnI限制性内切酶位点，故在pShuttle-HREAF-E1得到了三条带，仅其中一条与pShuttle酶切片段大小相同；但如果改用XhoI和EcoR V双酶切，则在pShuttle-HREAF-E1能得到与外源目的片段E1和pShuttle-HREAF的XhoI和EcoR V双酶切片段大小相同的两条带。

以上PCR及酶切鉴定结果表明pShuttle-R、pShuttle-HREAF及pShuttle-HREAF-E1构建正确。

4、pShuttle-HREAF-E1Δ55的构建及鉴定

pShuttle-HREAF-E1Δ55的构建路线与pShuttle-HREAF-E1相似，只是把pShuttle-HREAF-E1构建示意图(见图3)中的E1PCR产物换成E1Δ55PCR产物，最后构建成的穿梭质粒结构示意图见图4。

将pShuttle-HREAF和缺失E1b55的AdE1Δ55基因的PCR产物分别进行XhoI和EcoR V双酶切，乙醇沉淀后如上述方法进行连接、转化、筛选、鉴定，获得在pShuttle-HREAF中插入了腺病毒AdE1Δ55基因的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1Δ55。

pShuttle-HREAF-E1Δ55经过PCR及酶切鉴定后，将此质粒作为模板，以pShuttle MCS两端引物对全部插入片段进行PCR鉴定，可见在插入了E1Δ55后，间距最终变为约2800bp。以特异引物E1a-up+E1bΔ55-down引物对PCR扩增E1Δ55，可得预期大小约为1720bp的特异外源片段。用XhoI和EcoR V双酶切pShuttle-HREAF-E1Δ55，能酶切出与外源目的片段E1Δ55片段大小相同的特异条带。PCR及酶切鉴定结果说明pShuttle-HREAF-E1Δ55构建正确。

实施例三制备重组溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55

1、采用AdEasy XL adenoviral vector system生产重组腺病毒(图5)

穿梭质粒构建好后，用PmeI将其线性化，与骨架质粒pAdEasy-1一起转化BJ5183(Stratagene公司产品)感受态细菌。二质粒在菌体内同源重组，重组腺病毒质粒经卡那霉素抗性选择，再经体外PacI酶切鉴定。重组腺病毒质粒经PacI酶切后应产生一条约30kb的大片段，和一条3.0kb(重组发生在左臂)或4.5kb(重组发生在pBR322复制起始位点)的小片段。未经PacI酶切的重组腺病毒质粒，在0.8％琼脂糖凝胶电泳条带上表现为顶部靠近上样孔处的模糊条带，经常还会有一条刚好在23kb DNA marker下面的小条带。

鉴定后的重组腺病毒质粒被转化至重组缺陷型菌株如JM109内大量扩增。纯化后的重组腺病毒质粒即可经PacI酶切，暴露出左右ITR后经由Lipofectamine 2000(Invitragen公司)介导转染293细胞(Stratagene公司产品)，包装出目的重组腺病毒颗粒。

2、细菌中重组腺病毒质粒的产生和鉴定

穿梭质粒pShuttl-HREAF-E1和pShuttl-HREAF-E1Δ55分别用PmeI将其线性化，分别与骨架质粒pAdEasy-1一起转化BJ5183感受态细菌，铺于卡那霉素抗性LB平板上选择培养。在该受体菌中两者的同源序列之间同源重组，重组后的质粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55具备卡那霉素抗性，因此只有都具备卡那霉素抗性的穿梭质粒pShuttl-HREAF-E1或pShuttl-HREAF-E1Δ55及重组质粒pAdhafE1或pAdhafE1Δ55可被选择。挑出pAdhafE1及pAdhafE1Δ55克隆，抽提质粒，并用PacI酶切后，0.8％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带大小鉴定pAdhafE1重组子见图6和pAdhafE1Δ55重组子见图7，图8。可以见到未经PacI酶切的重组腺病毒质粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55，在0.8％琼脂糖凝胶电泳条带上表现为顶部靠近上样孔处的模糊条带，和一条刚好在23kb DNA marker下面的小条带。经PacI酶切后，2个pAdhafE1重组子和4个pAdhafE1Δ55重组子均产生了一条约30kb的大片段和一条4.5kb(重组发生在pBR322复制起始位点)的小片段；另有2个pAdhafE1Δ55重组子产生了3.0kb(重组发生在左臂)的小片段，表明已在BJ5183细菌内成功地重组出了肝癌特异性溶瘤腺病毒质粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55。

3、哺乳动物细胞中产生腺病毒

发明人选择重组质粒pAdhafE1Δ55来进行重组腺病毒AdhafE1Δ55的包装生产。

将重组质粒pAdhafE1Δ55大量扩增、纯化，经PacI酶切，暴露出左右ITR后经由Lipofectamine2000介导转染293细胞，进行重组腺病毒颗粒AdhafE1Δ55的包装；或转染HepG2细胞，在缺氧诱导培养条件下(1％O2，5％CO2和94％N2，37℃)进行重组腺病毒颗粒AdhafE1Δ55的包装。

转染后第7～8天，可见细胞出现病变，如图9所示。

随后病变区域逐渐扩大，直至完全病变。将细胞回收，冻融三次，释放病毒，再分别接种于293细胞或HepG2细胞中，2天后细胞出现完全病变。将细胞回收，冻融三次，释放病毒，离心取上清，提取重组腺病毒基因组DNA见图10，作为PCR反应的模板，以杂合启动子HREAF的上下游引物对(HRE-up+AF0.3-down)进行PCR鉴定，同时设立以哺乳动物细胞基因组DNA为模板的阴性对照，结果如图11所示。

虽然杂合启动子HREAF片段中的两个组成部分在哺乳动物细胞基因组DNA中均存在，但正常的哺乳动物细胞基因组DNA中并无HREAF这一杂合片段，因此可以确认在293细胞或HepG2细胞中包装出的重组腺病毒即为AdhafE1Δ55。

快速CPE法测定重组腺病毒AdhafE1Δ55滴度约为2～3×10⁶pfu/ml。

实施例四AdhafE1Δ55对人肝癌细胞的特异杀伤作用

使用上面实施例中经肝癌细胞HepG2包装出的溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55进行体外细胞水平的肝癌细胞特异杀伤试验。

1、形态学观察AdhafE1Δ55对人肝癌细胞的特异杀伤

将5×10⁴/孔人肝癌细胞系HepG2、Bel7402(购自中国医学科学院基础医学研究所，国家ATCC细胞库)和肺癌细胞系PLA801C(国家ATCC细胞库保存)铺于6孔板，以1×10⁴pfu低剂量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分别攻击，缺氧诱导条件下(1％O₂，5％CO₂和94％N₂，37℃)培养。结果，6天后HepG2、Bel7402细胞大部死亡，而PLA801C细胞则未受影响，生长正常。结果如图12所示。

2、MTT实验检测AdhafE1Δ55对人肝癌细胞的特异杀伤

将1～2×10³/孔人肝癌细胞系HepG2、Bel7402和肺癌细胞系PLA801C铺于96孔板，以1×10⁴pfu低剂量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分别攻击，缺氧诱导条件下(1％O₂，5％CO₂和94％N₂，37℃)培养。分别于24h、48h、72h及84h测定各孔细胞的光吸收值，绘制细胞生长曲线见图13，并对各肿瘤细胞在各时间点上进行AdhafE1Δ55感染与否之间的生存状况比较，以及对各肿瘤细胞之间在各时间点上进行生存率的比较(表1)。结合图13和表1可以发现，人肝癌细胞系HepG2、Bel7402在感染AdhafE1Δ55 72h后，无论是相对于未感染AdhafE1Δ55的同种肝癌细胞，还是相对于也感染AdhafE1Δ55的肺癌细胞PLA801C，其存活细胞数均已显著下降(P＜0.05)，而感染与未感染AdhafE1Δ55的肺癌细胞PLA801C之间在各时间点上的存活细胞数均无统计学上的差别(P＞0.05)。MTT实验的结果说明重组溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55可特异裂解、杀伤肝癌细胞HepG2和Bel7402。

表1感染AdhafE1Δ55后肿瘤细胞生存状况差异的t检验

(P值＜0.05为差异显著)

3、RT-PCR检测E1a的表达

以1×10⁶pfu AdhafE1Δ55分别感染HepG2、Bel7402和PLA801C，缺氧诱导(1％O₂，5％CO₂和94％N₂，37℃)培养3小时后，收集细胞，提取细胞总RNA，用RT-PCR检测E1a的表达。结果在肝癌细胞HepG2和Bel7402检测到了大小约为1000bp的E1a cDNA，说明AdhafE1Δ55在HepG2和Bel7402中表达了E1a，而在PLA801C中没有表达见图14。这个结果提示，在形态学观察和MTT生化实验中观察到的AdhafE1Δ55对人肝癌细胞HepG2和Bel7402的特异杀伤是由于该病毒在HepG2和Bel7402细胞中选择性复制引起的。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120>一种肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其制备方法及用途

<130>

<160>14

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>

<400>1

ctcaagctta gctatgagtc tgggcttgg    29

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>

<400>2

ctcggatcct ttgggactgg agttgcttc    29

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>

<400>3

ctcggatcct ctgcaactta gggacaagtc a 31

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>

<400>4

ctcaagcttg ttattggcag tggtggaa    28

<210>5

<211>900

<212>DNA

<213>

<400>5

gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg cccacgtcgc atgctcccgg ccgccatggc     60

ggccgggaa ttcgattctca agcttagcta tgagtctggg cttgggctga tagaagcctt    120

ggcccctggc ctggtgggag ctctgggcag ctggcctaca gacgttcctt agtgctggcg    180

ggtaggtttg aatcatcacg caggccctgg acctccaccc gcccccacca gccccctggc    240

ctcagttccc tggcaacatc tggggttggg ggggcagcag gaacaagggc ctctgtctgc    300

ccagctgcct ccccctttgg gttttgccag actccacagt gcatacgtgg gctccaacag    360

gtcctcttcc ctcccagtca ctgactaacc ccggaaccac acagcttccc gttctcagct    420

ccacaaactt ggtgccaaat tcttctcccc tgggaagcat ccctggacac ttcccaaagg    480

accccagtca ctccagcctg ttggctgccg ctcactttga tgtcatttgt tatatttgca    540

aaataaaata agtttgcaag tttttttttt ctgccccaaa gagctctgtg tccttgaaca    600

taaaatacaa ataaccgcta tgctgttaat tattggcaaa tgtcccattt tcaacctaag    660

gaaataccat aaagtaacag atataccaac aaaaggttac tagttaacag gcattgcctg    720

aaaagagtat aaaagaattt cagcatgatt ttccatattg tgcttccacc actgccaata    780

acgcatgcga ggagaatcac tagtgaattc gcggccgcct gcaggtcgac catatgggag    840

agctcccaac gcgttggatg catagcttga gtattctata gtgtcaccta aatagcttgg    900

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>

<400>6

ctcaggtacc agctatgagt ctgggct tgg                                    30

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>

<400>7

ctcactcgag gttattggca gtggtggaa                                      29

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>

<400>8

ctcactcgag aaaatgagac atattatc                                       28

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>

<400>9

ctcttatggc ctggggcgtt ta           22

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>

<400>10

ctcagatatc tcaatctgta tcttcatcg    29

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>

<400>11

ctcagatatc ggatacagtt cagccacctg   30

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>

<400>12

gaagtgaaat ctgaataatt ttgtg        25

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>

<400>13

caaaactaca taggaccccc ac           22

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>

<400>14

ctcgcatgcgttattggcag tggtggaa      28

Claims (7)

1. 一种肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其特征在于包含由缺氧应答元件HRE与AFP核心启动子AF0.3构成的肝癌靶向性杂合启动子和腺病毒E1区复制启动基因，所说的腺病毒E1区复制启动基因缺失了E1b55基因，位于肝癌靶向性杂合启动子的下游。

2. 根据权利要求1所述的腺病毒，其特征在于所说的肝癌靶向性杂合启动子具有序列表中序列5所示的核苷酸序列。

3. 制备权利要求1或2所述的腺病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)克隆HRE和AF0.3及构建杂合启动子HREAF；

(2)构建如图3所示的腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1和如图4所示的腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1Δ55；

(3)生产重组溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于克隆HRE和AF0.3及构建杂合启动子HREAF包括以下步骤：

(1)设计引物，进行PCR扩增；

(2)构建质粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3，并鉴定；

(3)杂合启动子HREAF的构建。

5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于构建腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55包括以下步骤：

(1)设计穿梭质粒构建所需引物；

(2)将腺病毒穿梭载体pShuttle和pShuttle-CMV分别进行酶切，连接酶切片段并转化，制备在pShuttle中插入了SV40加尾信号序列的如图3所示的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-R；

(3)制备如图3所示的pShuttle-HREAF；

(4)制备pShuttle-HREAF-E1；

(5)制备pShuttle-HREAF-E1Δ55。

6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于生产重组溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55包括如下步骤：

(1)将权利要求5构建好的腺病毒穿梭质粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55线性化，分别与腺病毒骨架质粒pAdEasyl共转化于BJ5183感受态细菌内进行同源重组；

(2)细菌中重组腺病毒质粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55的制备和鉴定：抗生素卡那霉素平板选择阳性同源重组细菌克隆，PCR扩增重组质粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55，进行酶切鉴定；

(3)哺乳动物细胞中产生腺病毒：

将上述获得的重组质粒扩增、纯化，酶切线性化后转染细胞293，包装重组腺病毒颗粒。

7. 权利要求1或2所述的重组腺病毒在制备肝癌治疗药物中的应用。

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