NO319893B1 - Defektiv, rekombinert adenovirus og farmasoytisk preparat omfattende denne. - Google Patents

Abstract

Nye virale vektorer, avledet fra adenoviruser, særlig defektive, rekombinante adenoviruser som omfatter to terapeutiske gener der det ene er et selvmordsgen og det andre et immunstimulerende gen eller et tumorsuppressorgan. Vektorenes fremstilling beskrives. Vektorene finner særlig anvendelse ved genterapi.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår defektiv, rekombinant adenovirus. Oppfinnelsen angår likeledes farmasøytiske preparater inneholdende disse adenovirusene.

Genterapi består i å korrigere en defekt eller en anomali (mutasjon, feilaktig ekspresjon, og så videre) ved innføring av en genetisk informasjon i den angjeldende celle eller det angjeldende organ. Denne genetiske informasjon kan innføres enten in vitro i en celle som er hentet fra organet og der den modifiserte celle deretter gjeninnføres i organismen, eller direkte in vivo i det tilsiktede vev. I det andre tilfellet foreligger det spesielle teknikker blant hvilke skal nevnes forskjellige transfeksjonsteknikker som implikerer DNA-komplekser og DEAE-dekstran (Pagano et al., "J. Virol.", 1 (1967) 891), DNA og nukleære proteiner (Kaneda et al., "Science", 243 (1989) 375), DNA og lipider (Felgner et al., "PNAS", 84 (1987) 7413), anvendelsen av liposomer (Fraley et al., "J. Biol. Chem.", 255 (1980) 10431) og så videre. I den senere tid har anvendelsen av virus som vektorer for overføring av gener kommet som et lovende alternativ til de fysiske transfeksjonsteknikker. I denne forbindelse er forskjellige vimser prøvet med henblikk på deres evne til å infisere visse cellulære populasjoner. Særlig gjelder dette retrovirusene (RSV, HMS, MMS, og så videre), HSV-viruset, de adeno-assosierte vimser og adenovirusene.

Blant disse vimser viser adenovimsene visse interessante egenskaper for anvendelse ved genterapi. Særlig har de et bredt vertsspektrum, er i stand til å infisere hvilende celler, integreres ikke i den infiserte celles genom og er til i dag ikke forbundet med noen vesentlige patologier hos mennesker. Adenovimsene er vimser med en lineær dobbelt-strenget DNA med en størrelse på ca. 36 kb. Deres genom omfatter særlig en repetert invers sekvens, ITR, ved enden, en enkapsideringssekvens, tidlige gener og sene gener. De vesentlige tidlige gener er genene El (Ela og Elb), E2, E3 og E4. De vesentlig sene gener er genene LI til L5.

På grunn av egenskapene hos de ovenfor nevnte adenoviruser, er disse allerede benyttet for overføring av gener in vivo. For dette formål er det fremstilt forskjellige vektorer avledet fra adenovimser og som har innarbeidet flere gener (B-gal, OTC, a-1 AT, cytokiner og så videre). I hver av disse konstruksjoner er adenovirusen modifisert på en slik måte at den er ute av stand til replikering i den infiserte celle. Således er de konstruksjoner som er beskrevet i den kjente teknikk, adenovimser som er deletert i områdene El (Ela og/eller Elb) og eventuelt E3 på nivå med hvilke det er innskutt en heterolog DNA-sekvens (Levero et al., "Gene", 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., "Gene", 50 (1986) 161).

Fra WO 93/21959 og WO 93/10218 er det kjent genterapeutiske retrovirusvektorer som omfatter to terapeutiske gener hvor det ene er et selvmordsgen og det andre et immunostimulerende gen. Videre er det fra Cancer Gen Therapy, vol.l, 1994, side 5-13 av Zhang et al., kjent et rekombinant tumorsupressor-uttrykkende adenovirus. Fra PNAS, vol. 91, no. 8,1994, side 3054-3057 av Chen et al., er det kjent å bruke adenovirus til overføring av thymidin kinasesekvenser til tumorer. Videre er det fra Cancer Gen Therapy, vol. 1, no. 2, 1994, side 1007-1012 av Shewach et al., kjent at adenoviral overføring av thymidin kinase til rotte gliomaceller er mer effektiv enn retroviral overføring. Ingen av disse publikasjoner antyder eller foreslår imidlertid kombinasjonen av bruken av et selvmordsgen og et immunostimulerende gen.

Foreliggende oppfinnelse angår nye vektorer som er avledet fra adenoviruser og som er spesielt effektive for anvendelse ved genterapi. Mer spesielt stammer oppfinnelsen delvis fra påvisningen av at det er mulig å innarbeide flere gener av interesse i adenovirusene og derved å oppnå en betydelig ekspresjon av disse forskjellige gener i de infiserte celler. Oppfinnelsen stammer likeledes fra konstruksjonen av adenovirale vektorer som er i stand til å innarbeide flere terapeutiske gener under betingelser som tillater deres optimale ekspresjon. Oppfinnelsen er likeledes basert på påvisningen av en synergistisk virkning for vektorene, forbundet med en koekspresjon, i den samme målcelle, av komplementære, terapeutiske gener. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således adenovirus som oppviser terapeutiske egenskaper som helt og holdent er fordelaktige med henblikk på deres anvendelse ved gen- eller cellulær terapi. Særlig oppviser adenovirusene ifølge oppfinnelsen egenskaper som absolutt er fordelaktige for en anvendelse ved behandling av patologier som oppviser cellulære hyperprolifereringsepisoder (cancere, restenose og så videre).

En første gjenstand for foreliggende oppfinnelse angår således en defektiv, rekombinant adenovirus omfattende to terapeutiske gener, det første et selvmordsgen og det andre et immunostimulerende eller tumorsuppressorgen. Foreliggende søkere har vist at den samtidige ko-ekspresjon av slike gener i en og samme målcelle gir en spesielt fordelaktig anti-tumoral terapeutisk effekt, godt overlegen den effekt som oppnås ved hjelp av disse gener alene eller innført separat.

Foretrukne utførelsesformer av adenovirusene er angitt i de uselvstendige kravene.

De terapeutiske gener som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen kan være en cDNA, en genomisk DNA eller gDNA, eller en hybridkonstruksjon, for eksempel bestående av en cDNA i hvilken det er innskutt en eller flere introner. Det kan likeledes dreie seg om syntetiske eller semisyntetiske sekvenser. Spesielt fordelaktig er det å benytte en cDNA eller en gDNA.

De to terapeutiske gener som innarbeides i de adenovirale vektorer ifølge oppfinnelsen kan være oppnådd på forskjellige måter.

De kan således bestå av en eneste transkripsjonen enhet. I denne konfigurasjon er de to gener tilstøtende, anbrakt under kontroll av en eneste promotor og gir opphav til en eneste før-budbringer-RNA. Denne disposisjon er fordelaktig fordi den tillater å benytte kun en transkripsjonen promotor.

De to terapeutiske gener kan likeledes være brakt under kontroll av separate transkripsjonene promotorer. Denne konfigurasjon tillater å oppnå overlegne ekspresjonsnivåer og gir en bedre kontroll av ekspresjonen av genene. I dette tilfellet kan de to terapeutiske gener skytes inn i den samme orientering eller i motsatt orientering, i ett og samme sete i genomet av adenovirusen eller i forskjellige seter.

Som selvmordsgen foretrekker man å benytte gener hvis ekspresjonsprodukt gir cellen en sensibilitet overfor et terapeutisk middel. Mer spesielt er selvmordsgen et gen av thymidinkinase hvis ekspresjonsprodukt gir mammifære celler en sensibilitet overfor visse terapeutiske midler som gancyklovir og acyklovir. Thymidinkinasen av virusen av herpes simplex er i stand til å fosforylere nukleosidanaloger som acyklovir og gancyklovir. De modifiserte molekyler kan innarbeides i en DNA-kjede under dennes forlengelse, noe som har som konsekvens en syntesestans av DNA, noe som medfører cellens død (F.L. Moolten, "Cancer Res.", 46 (1986) 5276). Denne strategi tillater således spesifikt å eliminere celler som uttrykker selvmordsgenet. Videre blir, da DNA-syntesen er målet for toksisiteten, kun de celler som er under deling, påvirket.

Fortrinnsvis benyttes det innenfor rammen av oppfinnelsen gener av thymidinkinase av den humane herpes-virus (hTK HSV-1). Sekvensen for dette gen er angitt i litteraturen (se særlig McKnight et al., "Nucleic Acid. Res.", 8 (1980) 5931). Det er likeledes mulig å benytte derivater av denne sekvens som oppviser en større substratspesifisitet eller en bedre kinaseaktivitet. Slike derivater kan særlig oppnås ved mutagenese på nivå med bindingssetet som beskrevet tidligere (Balasubramaniam et al., "J. Gen. Virol." 71

(1990) 2797; Munir et al., "JBC" 267 (1992) 6584).

Det er likeledes mulig å benytte genet av cytosindesaminase, hvis ekspresjonsprodukt gir mammifære celler en sensibilitet overfor 5-fluorcytosin (5-FC) eller nitroreduktaser som gir mammifære celler en sensibilitet overfor nitroaromatiske produkter ("J. Biol. Chem.", 266 (1991) 4126).

Som angitt tidligere er det særlig fordelaktig å forbinde selvmordsgenet med et immunostimulerende eller tumorundertrykkende gen. I denne forbindelse kan det immunostimulerende gen være et hvilket som helst gen hvis ekspresjonsprodukt er i stand til å stimulere organismens forsvar. Fortrinnsvis dreier det seg om et gen som koder for et cytokin, særlig et lymfokin (IL-1 til IL-12), et interferon (a-, 13- og så videre), en tumomekrosefaktor, en kolonistimulerende faktor (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, SCF, og så videre). Aller helst dreier det seg om genet som koder for inter-leukin—2 eller GM-CSF. Interleukin-2 syntetiseres i det vesentlige av lymfocytter som respons på nærværet av antigener, særlig tumorale antigener. Det dreier seg som følge derav om utvikling av immunitær respons mot disse antigener og særlig ved lokal aktivering av cytotoksiske og drepende (NK) T-celler. Dette lymfokin spiller således en vesentlig rolle ved den antitumorale immunitet. Takket være oppfinnelsens vektorer er det nu mulig å oppnå en synergistisk antitumoral virkning som et resultat av en samtidig ekspresjon, i den samme tumorale celle, av interleukin-2 og et selvmordsgen som thymidinkinasegenet.

GM-CSF er en faktor for stimulering av kolonier av granocytter og makrofager. Den stimulerer således prolifereringen av disse immunitetsceller og tillater således å forsterke immunforsvaret. Gen og cDNA av GM-CSF er beskrevet i litteraturen. Dens ko-ekspresjon i en vektor ifølge oppfinnelsen med et selvmordsgen gir en øket antitumoral synergistisk virkning.

Blant de tumorsuppressorgener som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen, skal særlig nevnes genene p53, Rb, rapi A, DDC, WAF og MTS. Særlig benyttes genet p53 eller genet Rb.

Genet p53 koder for et nukleært protein på 53 kDa. Formen som er mutert ved delesjon og/eller mutasjon av dette genet er implikert i utviklingen av de fleste humane cancere (Baker et al., "Science" 244 (1989) 217). Dens muterte former er likeledes i stand til å samarbeide med ras-onkogenene for transformering av murine fibroblaster. Villgenet som koder for nativ p53 inhiberer til gjengjeld dannelsen av transformasjonsfoyer i gnagerfibroblaster som er transfektert med forskjellige onkogene kombinasjoner. Nylige opplysninger understreker at proteinet p53 i seg selv kan være en transkripsjonsfaktor og stimulere ekspresjonen av andre tumorsuppressorgener. Videre har en virkning av p53 på prolifereringen av vaskulære glattmuskelceller vært påvist i den senere tid (Epstein et al., "Science", 151 (1994)).

Genet Rb bestemmer syntesen av et nukleært fosfoprotein på ca. 927 aminosyrer (Friend et al., "Nature", 323 (1986) 643) hvis funksjon er å reprimere delingen av celler og bringe dem til en rolig fase. De inaktive former av genet Rb er påvist i forskjellige tumorer og særlig i retinoblastomer eller i mesenkymantøse cancere som osteosarkomer. Gjeninnføringen av dette gen i de tumorale celler der de har vært inaktivert gir til gjengjeld en normal tilstand og et tap av tumorigenisitet (Huang et al., "Science", 242

(1988) 1563). I den senere tid har det vært vist at det normale protein Rb, imidlertid ikke de muterte former, reprimerer ekspresjonen av proto-onkogenet c-fos, et gen som er uunnværlig ved cellulær proliferering.

Genene WAF og MTS og deres antitumorale egenskaper er beskrevet i litteraturen ("Cell" 75 (1993) 817; "Science", 264 (1994) 436.

I en særlig utførelsesform av oppfinnelsen angår den en defektiv, rekombinant adenovirus omfattende et gen som koder for thymidinkinase og et tumorsuppressorgen. Fortrinnsvis angår oppfinnelsen en adenovirus som omfatter et gen som koder for thymidinkinase av herpes-virus og villgenet p53 (Ad-TK-p53). Spesielt fordelaktig er det at de to gener er anbrakt under kontroll av separate promotorer, fortrinnsvis promotoren LTR av virus HSV. Ennu mere foretrukket er det at de to gener i innskutt på nivå med El-området av adenovirusens genom.

I en andre spesiell utførelsesform av oppfinnelsen angår den en defektiv, rekombinant adenovirus som omfatter et gen som koder for thymidinkinase og et gen som koder for et lymfokin. Mere spesielt angår oppfinnelsen en adenovirus som omfatter et gen som koder for thymidasekinase av herpes-virusen og et gen som koder for interleukin-2 (Ad-TK-IL2) eller for Gm-CSF (Ad-TK-GM-CSF). Spesielt fordelaktig er det når de to gener er anbragt under kontroll av separate promotorer, fortrinnsvis LTR-promotoren av HSV-virusen. Ennu mere foretrukket er det når de to gener er innskutt på nivå med området El av genomet av adenovirusen.

Når det gjelder de transkripsjonelle promotorer som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen, kan det dreie seg om promotorer som naturlig er ansvarlige for ekspresjonen av det angjeldende terapeutiske gen når disse er i stand til å fungere i den infiserte celle. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av forskjellig opprinnelse (ansvarlig for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotorsekvenser av mammifære, eukaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotorsekvenser som stammer fra genomet av cellen man ønsker å infisere. På samme måte kan det dreie seg om promotorsekvenser som stammer fra genomet av et virus, derunder den benyttede adenovirus. I denne forbindelse kan man som eksempel nevne promotorene av genene EIA, MLP, CMV,

RSV, og så videre. Videre kan disse ekspresjonssekvenser være modifisert ved addisjon av sekvenser for aktivering eller regulering eller som tillater en vevspesifikk ekspresjon. Når videre det innskutte gen ikke omfatter ekspresjonssekvenser, kan det være innskutt inn i genomet av den defektive virus nedstrøms en slik sekvens. En foretrukken promotor for realisering av oppfinnelsens vektorer er virusen av roussarkomet (LTR-RSV). Andre promotorer som spesielt er foretrukket, er promotorer som er spesifikke for proliferative eller cancerøse celler. Disse promotorer tillater å innstille en terapeutisk effekt på en definert cellepopulasjon.

I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen dreier det seg om ekspresjonssignaler som induseres av eller er aktive i nærvær av vimser som er ansvarlige for eller forbundet med tumorene. Ennå mer foretrukket benytter man innenfor rammen av oppfinnelsen et ekspresjonssignal som er induserbart av Epstein-Barr-virusen (EBV) eller av papillom-virusen.

Epstein-Barr-virusen eller EBV er assosiert med to typer humane cancere, Burkitts lymfom og nasofaryngsal cancer. Anvendelsen av en rekombinant adenovirus omfattende et toksisk gen under kontroll av en promotor som er induserbar av EBV tillater med fordel spesifikt å uttrykke dette toksiske gen i de nasofaryngsale celler. I biopsier av nasofaryngs cancere er et enkelt nukleært antigen regelmessig til stede, nemlig EBNA1, som er implikert i opprettholdelsen av det virale genom i cellene som er infisert med EBV i latent fase, og som transaktiverer den virale promotor BCR2. Spesielt kan oppfinnelsen anvendes for spesifikk ekspresjon av et gen i nasofaryngs cancerceller, av en sekvens tilsvarende EBNA1 (EBNA1-RE:EBNA1 "responsive element"). Særlig angår oppfinnelsen en adenovims som som ekspresjonssignal omfatter en kimer promotor omfattende en sekvens som gir respons på EBNA1 fusjonert oppstrøms en annen viral promotor, promotoren av genet av det terminale protein 1 (TP1). Eksemplene i foreliggende søknad viser klart at den kimere promotor

kan induseres av EBNA1.

Papillomvirusen (særlig virusen HPV 16 og 18) er ansvarlige for 90% av cervix-cancere hos kvinner og er identifisert i epiteliale, pre-cancerøse lesjoner (Riou et al., "Lancet" 335 (1990) 117). Produktet av genet E6 fører til dannelsen av tumorer som sterkt reduserer mengden av vill-p53, et anti-onkogen, i HPV-positive celler (Wrede et al., "Mol. Carcinog." 4 (1991) 171). Anvendelsen av en rekombinant adenovirus omfattende et toksisk gen under kontroll av en promotor som kan induseres av HPV (for eksempel protein E6) tillater med fordel spesifikt å uttrykke dette toksiske gen i de tilsvarende, tumorale celler.

Det kan videre dreie seg om ekspresjonssignaler som er inaktive i de normale celler og aktive i de tumorale celler. Særlig kan man innenfor rammen av oppfinnelsen benytte promotoren av a-føtoprotein (E. Alpert i "Hepatocellular carcinoma", Okuda & Peters (utg.), New York, 1976, 353) eller promotoren P3 av IGF-II (Sussenbach et al., "Growth Regulation" 2 (1992) 1), som er aktive hos voksne, særlig i hepatokarsinomer. Det er likeledes mulig å benytte promotorer som induseres av hormoner når det gjelder hormono-avhengige eller hormonalt assosierte tumorer (for eksempel nyre- eller prostatatumor).

Som antydet ovenfor, kan man ta sikte på forskjellige konfigurasjoner for realisering av oppfinnelsens adenoviruser. Adenovirusene ifølge oppfinnelsen kan således inneholde de to gener i form av en eneste, transkripsjonen enhet. I denne konfigurasjon ligger de to gener tilstøtende, anbragt under kontroll av en eneste promotor, og gir opphav til en eneste før-budbringer-RNA. Denne konfigurasjon er fordelaktig fordi den tillater å benytte en eneste transkripsjonen promotor for å regulere ekspresjonen av de to gener. Videre kan denne eneste transkripsjonene enhet innarbeides i den adenovirale vektor i to mulige retninger.

De to gener kan likeledes anbringes under kontroll av separate, transkripsjonene promotorer. Denne konfigurasjon tillater å oppnå overlegne ekspresjonsnivåer og gir en forbedret kontroll av ekspresjonen av genene. I dette tilfellet kan de to terapeutiske gener skytes inn i samme retning eller i motsatt retning, i det samme setet av genomet av adenovirusen eller i forskjellige seter.

Fortrinnsvis blir genene, i det minste delvis, skutt inn på nivå med områdene El, E3 eller E4 av genomet av adenovirusen. Når de skytes inn på to forskjellige steder, foretrekker man innenfor oppfinnelsens ramme å benytte områdene El og £3 eller El og E4. En særlig fordelaktig utførelsesform av oppfinnelsen er den der de to terapeutiske gener skytes inn på nivå med området El. Eksemplene viser således at denne organisasjon tillater en øket ekspresjon av de to gener uten å interferere med hverandre. Oppfinnelsen angår således likeledes enhver rekombinant adenovirus ifølge oppfinnelsen som omfatter to gener av terapeutisk interesse, innskutt på nivå med området El av genomet.

Videre kan det immunostimulerende gen likeledes omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiserte produkt inn i målcellens sekresjonsveier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det immunostimulerende produkt, men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funksjonell signalsekvens, eller en kunstig signalsekvens.

Som antydet ovenfor, er adenovirusene ifølge oppfinnelsen defektive, dvs. at de ikke er i stand til autonom replikasjon i målcellene. Generelt er således genomet av den defektive adenovirus ifølge oppfinnelsen berøvet i det minste de sekvenser som er nødvendige for replikasjon av virusen i den infiserte celle. Disse områder kan enten være helt eller delvis eliminert, gjort ikke-funksjonelle eller være erstattet med andre sekvenser og særlig med terapeutiske gener. Den defektive karakter av adenovirusene ifølge oppfinnelsen er et viktig element, fordi den sikrer ikke-disseminasjonen av oppfinnelsens vektorer etter administrering.

I en foretrukken utførelsesform omfatter adenovirusene ifølge oppfinnelsen ITR-sekvensene og en sekvens som tillater enkapsidering, og som har en delesjon av hele eller en del av genet El.

De repeterte inverse sekvenser, ITR, utgjør replikasjonsopprinnelsen for adenovirusene. De er lokalisert ved endene 3' og 5' av det virale genom, der de lett kan isoleres i henhold til klassiske teknikker i molekylærbiologien som velkjent av fagmannen. Nukleotidsekvensen for ITR-sekvensene av humanadenoviruser (særlig serotypene Ad2 og AdS) er beskrevet i litteraturen på samme måte som caninadenovirusene (særlig CAV1 og CAV2). Hva angår for eksempel adenovirusen Ad5 tilsvarer den venstre ITR-sekvens området som omfatter nukleotidene 1 til 103 i genomet.

Enkapsideringssekvensene (likeledes kalt Psi-sekvensen) er nødvendig for enkapsidering av viralt DNA. Dette området må således være til stede for å tillate fremstilling av defektive, rekombinante adenoviruser ifølge oppfinnelsen. Enkapsideringssekvensen er lokalisert i området av adenovirusene mellom den venstre ITR (5') og genet El. De kan isoleres eller syntetiseres kunstig ved klassiske teknikker i molekylærbiologien. Nukleotidsekvensen av enkapsiderings-sekvensen for humane adenoviruser (særlig serotypene Ad2 og Ad5) er beskrevet i litteraturen på samme måte som canin-adenovirusene (særlig CAV1 og CAV2). Når det gjelder for eksempel adenovirusen Ad5, tilsvarer enkapsideringssekvensen det området som ligger mellom nukleotidene 194 og 358 i genomet.

Mere spesielt omfatter adenovirusene ifølge oppfinnelsen ITR-sekvensene og en sekvens som tillater enkapsidering og som har en delesjon av hele eller en del av genene El og E4.

I en spesielt foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er genomet av adenovirusene ifølge oppfinnelsen helt eller delvis deletert for genene El, E3 og E4 og, ennu mere foretrukket, helt eller delvis for genene El, E3, L5 og E4.

Adenovirusene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles fra adenoviruser med forskjellige opprinnelser. Det eksisterer således forskjellige serotyper av adenovirus, hvis struktur og egenskaper varierer noe, men som oppviser en sammenlignbar genetisk organisasjon. Likeledes kan de opplysninger som er beskrevet i foreliggende søknad lett reproduseres av fagmannen for en hvilken som helst type adenovirus.

Mer spesielt kan adenovirusen være av human, animalsk eller blandet human og animalsk opprinnelse.

Når det gjelder adenoviruser av human opprinnelse, foretrekker man å benytte de som er klassifisert i gruppe C. Mer spesielt foretrekker man, blant de forskjellige serotyper av humane adenoviruser, innenfor rammen av oppfinnelsen å benytte adenoviruser av type 2eller5(Ad2 eller Ad5).

Som antydet ovenfor, kan adenovirusene ifølge oppfinnelsen likeledes være av animalsk opprinnelse eller omfatte sekvenser som stammer fra adenoviruser av animalsk opprinnelse. Foreliggende søkere har vist at adenovirusene av animalsk opprinnelse er i stand til, med stor effektivitet, å infisere humane celler og at de ikke er i stand til å propagere i de humane celler i hvilke de er prøvet (jevnfør FR-søknad 93 05954). Foreliggende søkere har likeledes vist at adenovirusene av animalsk opprinnelse overhodet ikke trans-komplementeres av adenoviruser av human opprinnelse, noe som eliminerer enhver risiko for rekombinering og propagering in vivo, i nærvær av en human adenovirus, noe som kunne føre til dannelse av en infektiøs partikkel. Anvendelsen av adenoviruser eller områder av adenoviruser av animalsk opprinnelse er således spesielt fordelaktig fordi de inherente risiko ved anvendelsen av vimser som vektorer ved genterapi er ennå lavere.

Adenovimsene av animalsk opprinnelse som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen kan være av canin, bovin eller munn (eksempel: Mavl, Beard et al., "Virology", 75 (1990) 81), ovin, porcin, aviær eller også simien (eksempel: SAV) opprinnelse. Mere spesielt kan man blant de aviære adenovimser nevne serotypene 1 til 10 som er tilgjengelige ved ATCC, for eksempel stammene Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-l 1 (ATCC VR-921) eller også de stammer som har referansene ATCC VR-831 til 835. Blant de bovine adenovimser kan man benytte forskjellige kjente serotyper og særlig de som er tilgjengelige fra ATCC (typene 1 til 8) under referansene ATCC VR-313,314,639-642, 768 og 769. Man kan likeledes angi de murine adenoviruser FL (ATCC VR-550) og E20308 (ATCC VR-528), ovin-adenoviraser type 5 (ATCC VR-1343) eller type 6 (ATCC VR-1340); adenovims porcin 5359), eller simien-adenoviruser som særlig den som har referansen ved ATCC under numrene VR-591-594, 941-943,195-203, og så videre.

Blant de forskjellige adenovimser av animalsk opprinnelse benyttes fortrinnsvis, innenfor rammen av oppfinnelsen, adenovimser eller områder av adenovimser av canin-opprinnelse og særlig alle stammene av adenovims CAV2 [for eksempel stammen Manhattan eller A26/61 (ATCC VR-800)]. Canin-adenovimser har vært gjort til gjenstand for tallrike studier. Således er de fullstendige restriksjonskart for adenovimsene CAV1 og CAV2 beskrevet i den kjente teknikk (Spibey et al., "J. Gen. Virol.", 70 (1989) 165), og genene Ela, E3 samt ITR-sekvensene er klonet og sekvensert (se særlig Spibey et al., "Vims Res.", 14 (1989) 241; Linné, "Vims Res.", 23

(1992) 119, WO 91/11525).

De defektive, rekombinante adenovimser ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på forskjellig måte.

En første metode består i å transfektere DNA av den defektive, rekombinante vims, fremstilt in vitro (enten ved ligering eller i form av plasmid) i en kompetent cellelinje, det vil si som i trans bærer alle funksjoner som er nødvendige for komplementering av den defektive virus. Disse funksjoner er fortrinnsvis integrert i cellens genom, noe som tillater å unngå risiko for rekombinering, og som gir cellelinjen en øket stabilitet.

En annen tilnærming består i ko-transfeksjon i en egnet cellelinje av DNA av den defektive, rekombinante virus, fremstilt in vitro (enten ved ligering, eller i form av plasmid) og DNA av en virushjelper. I henhold til denne metode er det ikke nødvendig å disponere over en kompetent cellelinje som er i stand til å komplementere alle de defektive funksjoner av den rekombinante adenovirus. En del av disse funksjoner blir komplementært ved virushjelperen. Denne virushjelper må i seg selv være defektiv og cellelinje må i trans bære de funksjoner som er nødvendige for dens komplementering. Blant de cellelinjer som særlig kan benyttes innenfor rammen av denne andre tilnærming kan spesielt nevnes den humane embryo-nyrelinje 293, KB-cellene, Hela-cellene, MDCK, GHK, og så videre (jevnfør eksemplene).

Til slutt blir de vektorer som er multiplikert, gjenvunnet, renset og forsterket i henhold til klassiske teknikker i molekylærbiologien.

I henhold til en variant av gjennomføringen, er det mulig in vitro å fremstille enten ved ligering, eller i form av plasmid, DNA av den defektive, rekombinante virus som bærer de egnede delesjoner og de to terapeutiske gener. Som antydet ovenfor, har vektorene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis en delesjon av hele eller en del av visse virale gener og som særlig genene El, E3, E4 og/eller L5. Denne delesjon kan tilsvare en hvilken som helst type suppressjon som påvirker det angjeldende gen. Det kan særlig dreie seg om suppressjonen av hele eller en del av området som koder for genet, og/eller hele eller en del av promotorområdet for transkripsjonen av genet. Suppressjonen er generelt realisert på DNA av defektiv, rekombinant virus, for eksempel ved fermentering ved hjelp av egnede restriksjonsenzymer, deretter ligering, i henhold til molekylærbiologiske teknikker, som vist i eksemplene. De terapeutiske gener kan deretter skytes inn i denne DNA ved enzymatisk spalting og etterfølgende ligering, på nivå med de seleksjonerte områder og i den valgte orientering.

Det således oppnådde DNA som bærer de egnede delesjoner og de to terapeutiske gener, tillater direkte å generere de defektive, rekombinante adenoviruser som bærer de nevnte delesjoner og terapeutiske gener. Denne første variant er særlig tilpasset realiseringen av rekombinante adenoviruser i hvilke de terapeutiske gener er anordnet i form av en eneste transkripsjonen enhet, eller under kontroll av separate promotorer,

men innskutt på ett og samme sete i genomet.

Det er likeledes mulig å fremstille de rekombinante viruser i to trinn, noe som tillater suksessiv innføring av de to terapeutiske gener. Således konstrueres det DNA av en første rekombinant virus som bærer de egnede delesjoner (eller en del av disse) og ett av de terapeutiske gener, ved ligering eller i form av plasmid. Denne DNA blir deretter benyttet for å generere en første rekombinant virus som bærer de nevnte delesjoner og et terapeutisk gen. DNA av denne første virus blir deretter isolert og ko-transfektert med et andre plasmid eller DNA av en andre defektiv, rekombinant virus som bærer det andre terapeutiske gen, de egnede delesjoner (del som ikke er til stede på den første virus) og et område som tillater homolog rekombinering. Dette andre trinn gir således den defektive, rekombinante virus som bærer de to terapeutiske gener. Denne fremstillingsvariant er særlig hensiktsmessig for fremstilling av rekombinante viruser som bærer to terapeutiske gener innskutt i to forskjellige områder av adenovirusens genom.

Foreliggende oppfinnelse angår likeledes ethvert farmasøytisk preparat som omfatter en eller flere defektive, rekombinante adenoviruser som beskrevet ovenfor. De farmasøy-tiske preparater ifølge oppfinnelsen kan formuleres med henblikk på administrering ad topisk, oral, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokulær, transdermal vei eller annet.

Fortrinnsvis inneholder det farmasøytiske preparat farmasøytisk akseptable bærere for en injiserbar formulering. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske saltoppløsninger (mono-, di-natriumfosfat, natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumklorid, og så videre eller blandinger derav), eller tørre preparater, særlig lyofiliserte preparater som ved tilsetning av sterilisert vann eller fysiologisk serum tillater konstituering av injiserbart, oppløst materiale.

Dosene av virus som benyttes for injeksjon kan tilpasses som funksjon av forskjellige parametere og særlig som funksjon av den benyttede administreringsmåte, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den tilsiktede behandlings varighet. Rent generelt formuleres og administreres de rekombinante adenoviruser ifølge oppfinnelsen i form av doser som ligger mellom IO* og 10^ pfu/ml og fortrinnsvis 10^ til 1<0>^ pfu/ml. Uttrykket pfu eller "plaque forming unit" tilsvarer infeksjonskraften for en virusoppløsning og bestemmes ved infeksjon av en egnet cellekultur og måling, generelt efter 5 dager, av antallet populasjoner av infiserte celler. Teknikkene for bestemmelse av pfu-verdien for en viral oppløsning er godt dokumentert i litteraturen. ;Adenovirusene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for terapi eller prevensjon av tallrike patologien De er spesielt fordelaktige for behandling av hyperproliferative patologier (cancere, restenose, og så videre), ved direkte injeksjon på nivå med det angjeldende setet. I denne forbindelse kan oppfinnelsen anvendes ved en fremgangsmåte for desim-ering av proliferative celler omfattende infeksjon av cellene eller en del av disse med en adenoviral vektor som beskrevet ovenfor. I det tilfellet der selvmordsgenet er et gen som gir en sensibilitet overfor et terapeutisk middel omfatter fremgangsmåten for destruering også behandling av cellene med det terapeutiske middel. For å gjennomføre denne metode angår oppfinnelsen også preparater som omfatter en rekombinant adenovims som definert ovenfor der selvmordsgenet er et gen som gir en sensibilitet overfor et terapeutisk middel; og det terapeutiske middel, som kombinasjonsprodukt for anvendelse samtidig, separert eller trinnvis, for behandling av hyperproliferative patologier. Mer spesielt er selvmordsgenet et thymidinkinasegen og det terapeutiske middel gancyklovir eller acyklovir eller en analog derav. ;Foreliggende oppfinnelse skal forklares nærmere under henvisning til de følgende illustrerende eksempler. ;Generelle teknikker i molekylærbiologien ;De klassiske metoder som benyttes innen molekylærbiologien, for eksempel preparativ ekstrahering av plasmidisk DNA, sentrifugering av plasmidisk DNA i cesiumkloirdgradient, elektroforese på agarose- eller akrylamidgel, rensing av DNA-fragmentene ved elektroeluering, ekstrahering av proteinene med fenol eller fenol-kloroform, precipitering av DNA i saltmedium med etanol eller isopropanol, transformering i Escherichia coli, og så videre, er velkjente av fagmannen og rikelig beskrevet i litteraturen [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. ;(utgivere), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. ;Plasmidene av typen pBR322, pUC og fagene av serie Ml 3 er av kommersiell opprinnelse (Bethesda Research Laboratories). ;For ligaturene kan DNA-fragmentene separeres i henhold til størrelse ved elektroforese på agarose- eller akrylamidgel, ekstrahering med fenol eller med en blanding fenol:kloroform, precipitering fra etanol med deretter inkubering i nærvær av DNA-ligase av fagen T4 (Biolabs) i henhold til leverandørens anbefalinger. ;Oppfyllingen av de proeminente 5'-ender kan gjennomføres med Klenow-rfagmentet av DNA-polymerase I av E. coli (Biolabs) i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Destrueringen av de proeminente 5'-ender gjennomføres i nærvær av DNA-polymerase av fagen T4 (Biolabs), anvendt i henhold til fabrikantens anbefalinger. Destrueringen av de proeminente 5'-ender gjennomføres ved en behandling med nukleasen Sl. ;Den styrte mutagenese in vitro med syntetiske oligodeoksynukleotider kan gjennomføres i henhold til den metode som er utviklet av Taylor et al. ["Nucleic Acids Res.", 13 (1985) 8749-8764] under anvendelse av den kit som markedsføres av Amersham. ;Den enzymatiske forsterkning av DNA-fragmentene ved den teknikk som kalles PCR ["Polymerase-catalyzed Chain Reaction", Saiki R.K. et al., "Science", 230 (1985) 1350-1354; Mullins K.B. og Faloona F.A., "Meth. Enzym.", 155 (1987) 335-350], kan gjennomføres ved anvendelse en "DNA thermal cycler" (Perkin Eimer Cetus) i henhold til fabrikantens spesifikasjoner. ;Verifiseringen av nukleotidsekvensene kan gjennomføres i henhold til den metode som er utviklet av Sanger et al. ["Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 74 (1977) 5463-5467] under anvendelse av den kit som markedsføres av Amersham. ;Benyttede cellelinjer ;I eksemplene som følger kan man benytte de følgende cellelinjer: ;Human embryo-nyrelinje 293 (Graham et al., "J. Gen. Virol.", 36 (1977) 59). ;Denne linje inneholder særlig, integrert i sitt genom, den venstre del av genomet av den humane adenovirus Ad5 (12%). ;Human cellelinje KB: Stammer fra et humant epidermisk karsinom, linjen er tilgjengelig fra ATCC (ref. CCL17) på samme måte som de betingelser som tillater dens dyrking. ;Human cellelinjen Hela: Stammer fra et humant epiteliumkarsinom, linjen er tilgjengelig fra ATCC (ref. CCL12) på samme måte som betingelsene som tillater ;dens dyrking. ;Canin-cellelinjen MDCK: Betingelsene for dyrking av MDCK-cellene er særlig ;beskrevet av Macatney et al., "Science", 44 (1988) 9. ;- Cellelinjen gm DBP6 (Brough et al.,"Virology", 190 (1992) 624). Denne linje består av Hela-celler som bærer adenovirusgenet E2 under kontroll av LTR av ;MMTV. ;EKSEMPLER ;Eksempel 1. Konstruksjon av en defektiv, rekombinant adenovirus omfattende genet TK under kontroll av en cancer- spesifikk promotor og ;genet p53 under kontroll av promotoren CMV. ;Disse adenoviruser konstrueres ved homolog rekombinasjon mellom et plasmid som bærer den venstre del av adenovirusen Ad5, de to terapeutiske gener og et område av adenovirusen Ad5 (tilsvarende protein DC) og DNA av en defektiv adenovirus som bærer forskjellige delesjoner. ;1. Konstruksjon av vektoren pONT- tk. ;1.1. Konstruksjon av plasmidet p7tkl. ;Dette eksempel beskriver konstruksjonen av plasmidet p7tkl inneholdende den åpne lesefase av genet tk på 1131 basepar (ATG 114-116 og kodonstopp TGA 1242-1244), innskutt i et kloningsmultisete. ;Fragmentet Bglll-Ncol inneholdende genet av thymidinkinase, tk, av herpes simplex-virus type 1, isoleres fra plasmid pHSV-106 (kommersielt tilgjengelig fra Gibco BRL), reparert ved virkning av Klenow-fragmentet og deretter innskutt på Smal-setet av plasmidet pGEM7zf(+) (kommersielt tilgjengelig fra Promega). Setene Smal og BgHI destrueres i et trinn og setet Ncol bevares. ;Det oppnådde plasmid kalles p7tkl. ;1.2. Konstruksjon av plasmid pONTl. ;Dette eksempel beskriver konstruksjonen av et plasmid inneholdende en kimer promotor som utgjør en nødvendig sekvens for transaktivering ved antigenet EBNA1 og promotoren TP1 av virusen EBV. ;Fragmentet EcoRI(7315)-SmaI(8191) av virus EBV isoleres fra stammen B95-8. Den fullstendige sekvens for virusen EBV er beskrevet av Baer et al. ("Nature" 310 (1984) 207). Dette fragment inneholder de sekvenser som er nødvendige for transaktivering ved det nukleære antigen 1 (EBNA1) (D. Reisman & B. Sugden, 1986, "Molecular and Cellular Biology", vol. 6, sidene 3838-3846). Dette fragment funksjoneres deretter til fragment Nrul(166 241)-PstI(166 559) av EBV B95-8 (setet Pstl digereres med polymerase T4), inneholdende promotoren TP1. Den således oppnådde kimere promotor innskytes så i kloningsmultisetet av plasmidet pBluescript II SK. ;Det oppnådde plasmid kalles pONTl. ;1.3. Konstruksjon av plasmid pONTtk. ;Plasmidet pONTtk omfatter genet av thymidinkinase av virusen av herpes simplex (tk) klonet inn i plasmid p7tkl, under kontroll av den kimere promotor EBNA1-RE/TP1 klonet i plasmidet pONTl. ;For å konstruere dette plasmid blir fragmentet BamHI-XhoI av pONTl som inneholder den kimere promotor, transaktivert med EBNA-1 og EBNA-2, og fragmentet Xhol-Clal av p7tkl som inneholder den åpne lesefase av tk, klonet på setene BamHI (478) og Clal ;(4550) av plasmidet pAd.RSVJ3gal. Plasmidet pAd.RSVBGal inneholder, i retning 5'^3': fragmentet PvuII tilsvarende den venstre ende av adenovirusen Ad5 omfattende: ITR-sekvensen, replikasjonsopprinnelsen, enkapsideringssignalene og forsterkeren ;EIA; ;genet som koder for J3-galaktosidase under kontroll av promotoren RSV (Rous-sarkomvirusen), ;et andre fragment av genomet av adenovirusen Ad5 som tillater homolog rekombinasjon mellom plasmidet pAd.RSVBGal og adenovirusen dl324. Plasmidet pAd.RSVBGal er beskrevet av Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90 (1992) ;626). ;Alle kloningssetene er bevart. Det oppnådde plasmid kalles pONTtk. ;2. Konstruksjon av plasmidet pQNTtkCMVp53. ;Dette eksempel beskriver konstruksjonen av en vektor som bærer den venstre del av adenovirusen Ad5 (omfattende den venstre ITR, enkapsideringsområdet og begynnelsen av området El), genet tk under kontroll av promotoren ONT, genet p53 under kontroll av promotoren CMV og et andre fragment av genomet Ad5 (protein pDC) som tillater homolog rekombinasjon med henblikk på dannelse av en rekombinant adenovirus (jevnfør eksempel 1.3). ;Dette plasmid er konstruert fra plasmidet pONTtk ved innskyting, nedstrøms genet tk og i samme retning, av et fragment som bærer genet p53 under kontroll av promotoren CMV og fulgt av polyadenyleringssetet av virusen SV40. Mer spesielt omfatter det innskutte fragment: et promotorområde av viral opprinnelse som tilsvarer den tidlige promotor av cytomegalovirusen (CMV). Dette området er omgitt av vektoren av de unike restriksjonsseter EcoRI-SphI ved skjøten CMV/pONTtk og BamHI ved skjøten CMV/p53. Nærværet av de unike seter som flankerer promotorområdet tillater å erstatte området CMV med en hvilken som helst annen promotor. En andre serie vektorer oppnås således der genet p53 er brakt under kontroll av en induktibel promotor: metallotioninpromotoren, som kan induseres av tungmetaller (kadmium ;og sink). ;en sekvens på 1173 pb tilsvarende cDNA som koder for proteinet p53 av mus i sin ville form (Zakut-Houri et al., "Nature", 36 (1983) 594). I denne konstruksjon foreligger suppressorgenet i form av cDNA, det vil si uten introner. Dette tillater særlig å redusere vektorens størrelse. Videre er det verifisert at de oppnådde ;ekspresjonsnivåer er sammenlignbare i nærvær eller fravær av introner. ;Signalet for polyadenylering av sene gener av virusen SV40 som tilsvarer et meget effektivt polyadenyleringssete. To unike restriksjonsseter Sali og Hindlll befinner seg nedstrøms polyadenyleirngssetet. ;Den oppnådde vektor kalles pONTtkCMVp53. ;Det skal være klart at innskytingen av fragmentet kan gjennomføres på tilsvarende måte i omvendt retning, noe som fører til et plasmid der genet tk og genet p53 befinner seg i motsatte retning (pONTtkCMVp53inv). ;3. Konstruksjon av rekombinante adenoviruser. ;3.1. Konstruksjonen av en rekombinant adenovirus som er deletert i området El og som bærer to terapeutiske gener, innskutt i samme ;retning, på nivå med området El. ;Vektoren pONTtkCMVp53 lineariseres og ko-transfekteres med en defektiv, adenoviral vektor i genet El, i hjelperceller (linje 293) som i trans bærer funksjonene som kodes av områdene El (EIA og E1B) av adenovirusen. ;Mere spesielt oppnås adenovirusen Ad-ONTtkCMVp53, AE1 ved homolog rekombinasjon in vivo mellom adenovirusen Ad-RSVJ3gal (jevnfør Stratford-Perricaudet et al., supra) og vektoren pONTtkCMVp53, i henhold til følgende protokoll: plasmidet pONTtkCMvV53, linearisert med XmnI, og adenovirusen Ad-RSVBgal, linearisert med enzymet Clal, ko-transfekteres i linje 293 i nærvær av kalsiumfosfat for derved å tillate homolog rekombinasjon. De således dannede rekombinante adenoviruser blir deretter seleksjonen ved rensing på plaque. Etter isolasjon blir DNA av den rekombinante adenovirus forsterket i cellelinje 293, noe som fører til en kultursupernatant inneholdende den ikke-rensede, rekombinante, defektive adenovirusen med en titer på ca. 10^ pfu/ml. ;De virale partikler blir generelt renset ved sentrifugering på cesiumkloridgradient i henhold til kjente teknikker (se særlig Graham et al., "Virology", 52 (1973) 456). Adenovirusen Ad-ONT-tkCMVp53, AE1 kan oppbevares ved —80°C i 20% glycerol. ;3.2. Konstruksjon av en rekombinant adenovirus, deletert i området El og E3, med to terapeutiske gener innskutt i samme retning, på nivå med ;området El. ;Vektoren pONTtkCMVp53 lineariseres og ko-transfekteres med en defektiv, adenoviral vektor i genene El og E3, i hjelperceller (linje 293) som i trans bærer de funksjoner som koder for områdene El (EIA og E1B) av adenovirusen. ;Mer spesielt oppnås adenovirusen Ad-ONTtkCMVp53, AE1, AE3 ved homolog rekombinasjon in vivo mellom den mutante adenovirus Ad-dll324 (Thimmappaya et al., "Cell", 31 (1982) 543) og vektoren pONTtkCMVp53 i henhold til følgende protokoll: plasmidet pONTtkCMVp53, linearisert med XmnI, og adenovirusen Ad-dll324, linearisert med enzymet Clal, ko-transfekteres i linje 293 i nærvær av kalsiumfosfat, for derved å tillate homolog rekombinasjon. De rekombinante adenoviruser som dannes på denne måte blir deretter seleksjonert ved rensing på plaque. Etter isolasjon blir DNA av den rekombinante adenovirus forsterket i cellelinje 293, noe som fører til en kultursupernatant som inneholder ikke-renset, rekombinant, defektiv adenovirus med en titer på ca. 10^ pfu/ml. ;De virale partikler blir generelt renset ved sentrifugering over cesiumkloirdgradient i henhold til kjente teknikker (se særlig Graham et al., "Virology", 52 (1973) 456). Adenovirusen Ad-ONT-tkCMVp53, AE1, AE3 kan oppbevares ved -80°C i 20% glycerol. ;3.3. Konstruksjon av en adenovirus der genene tk og p53 er anordnet i motsatt retning. ;Ved å følge de protokoller som er beskrevet i punktene 3.1 og 3.2 ovenfor kan man konstruere adenoviruser der genene tk og p53 er posisjonert i motsatt retning ved å gå ut fra plasmidet pONTtkCMVp53inv. ;Eksempel 2. Konstruksjon av defektive. rekombinante adenoviruser som bærer genet TK under kontroll av promotoren av LTR av virusen RSV ;og genet p53 under kontroll av promotoren CMV. ;Disse adenoviruser konstrueres ved homolog rekombinasjon mellom et plasmid som bærer den venstre del av adenovirusen Ad5, de to terapeutiske gener og et område av adenovirusen Ad5 (tilsvarende proteinet IX) og DNA av en defektiv adenovirus som bærer forskjellige delesjoner. ;1. Konstruksjon av vektoren pRSVtk. ;Dette plasmid konstrueres fra plasmidet pONTtk (eksempel 1.1) ved substitusjon av promotoren som er transaktiverbar med EBNA1, med promotoren av LTR av RSV. For dette formål blir promotoren RSV isolert i form av et fragment BamHI-Sall fra plasmidet pAd.RSV.6gal (Stratford-Perricaudet et al., "J. Clin. Invest.", 90 (1992) 626), deretter klonet i setene BamHI(478) og Sall(1700) av plasmidet pONTtk. Det resulter-ende plasmid kalles pRSVtk. ;2. Konstruksjon av plasmid pRSVtkCMVp53. ;Dette eksempel beskriver konstruksjonen av en vektor som bærer den venstre del av adenovirusen Ad5 (omfattende den venstre 1TR, enkapsideringsområdet og begynnelsen av området El), genet tk under kontroll av promotoren RSV, genet p53 under kontroll av promotoren CMV og et andre fragment av genomet av Ad5 (protein pIX) som tillater homolog rekombinasjon med henblikk på generering av en rekombinant adenovirus (jevnfør eksempel 2.3). ;Dette plasmid konstrueres fra plasmid pRSVtk ved innskyting, nedstrøms genet tk, av et fragment som bærer genet p53 under kontroll av promotoren CMV og fulgt av polyadenyleringssetet av virusen SV40. Mer spesielt omfatter det innskutte fragment: et promotorområde av viral opprinnelse som tilsvarer den tidlige promotor av cytomegalovirusen (CMV). Dette området er omgitt av vektoren av de unike restriksjonsseter EcoRI-SphI ved skjøten CMV/pONTtk og BamHI ved skjøten CMV/p53. Nærværet av de unike seter omgivende promotorområdet tilsvarer å erstatte området CMV med en hvilken som helst annen promotor. En andre serie vektorer oppnås så der genet p53 er anbragt under kontroll av en induktibel promotor: promotoren av metallotionin, induktibel ved tungmetaller (kadmium og ;sink). ;en sekvens på 1173 pb tilsvarende cDNA som koder for protein p53 av mus i sin villform (Zakut-Houri et al., "Nature" 36 (1983) 594). I denne konstruksjon foreligger suppressorgenet i form av cDNA, det vil si berøvet introner. Dette tillater særlig å redusere vektorens størrelse. Videre er det verifisert at de oppnådde ;ekspresjonsnivåer er sammenlignbare ved og uten nærvær av introner. polyadenyleringssetet av sene gener av virusen SV40 som tilsvarer et meget effektivt polyadenyleringssignal. To unike restriksjonsseter Sali og Hindlll befinner seg nedstrøms polyadenyleirngssignalet. ;Den oppnådde vektor kalles pRSVtkCMVp53. ;3. Konstruksjon av rekombinante adenoviruser. ;3.1. Konstruksjon av en rekombinant adenovirus, deletert i området El, ;med to terapeutiske gener innskutt i samme retning, på nivå med ;området El. ;Denne adenovirus konstrueres i henhold til den protokoll som er beskrevet i eksempel 1(3.1). Den således oppnådde adenovirus Ad-RSV-tkCMVp53, AE1 kan oppbevares ved -80°C i 20% glycerol. ;3.2. Konstruksjon av en rekombinant adenovirus som er delert i områdene El og E3, og som bærer to terapeutiske gener innskutt i samme retning, ;på nivå med området El. ;Denne adenovirus konstrueres i henhold til den protokoll som er beskrevet i eksempel 1(3.2). Den således oppnådde adenovirus Ad-RSV-tkCMVp53, AE1.AE3 kan oppbevares ved —80°C i 20% glycerol. ;Eksempel 3. Konstruksjon av en defektiv. rekombinant adenovirus omfattende genet TK under kontroll av promotoren av LTR av virusen RSV og genet av interleukin- 2 under kontroll av den samme ;promotor. ;Disse adenoviruser konstrueres ved homolog rekombinasjon mellom et plasmid som bærer den venstre del av adenovirusen Ad5, de to terapeutiske gener og et område av adenovirusen Ad5 (tilsvarende proteinet DC) og DNA av en defektiv adenovirus som bærer forskjellige delesjoner. ;1. Konstruksjon av plasmid pRSVtkRSVIL- 2. ;Dette eksempel beskriver konstruksjonen av en vektor som bærer den venstre del av adenovirusen AdS (omfattende den venstre ITR, enkapsideringsområdet og begynnelsen av området El), genet tk under kontroll av promotoren RSV, genet av interleukin-2 under kontroll av promotoren RSV og et andre fragment av genomet av Ad5 (protein pIX) som tillater homolog rekombinasjon med henblikk på dannelsen av en rekombinant adenovirus (jevnfør eksempel 3.2). ;Dette plasmid er konstruert fra plasmid pRSVtk (jevnfør eksempel 2) ved innskyting, nedstrøms genet tk, av et fragment som bærer genet av interleukin-2 under kontroll av promotoren RSV og fulgt av et polyadenyleringssete av virusen SV40. Mere spesielt omfatter det innskutte fragment: promotoren av LTR av virus RSV, isolert i form av et fragment BamHI-Sall fra plasmid pAd.RSV.Bgal (Stratford-Perricaudet et al., "J. Clin. Invest.", 90 (1992) ;626); ;en sekvens tilsvarende det cDNA som koder for human interleukin—2 (EP 91 539). ;I denne konstruksjon foreligger det terapeutiske gen i form av cDNA. polyadenyleirngssignalet for de sene gener av virusen SV40 som tilsvarer et meget effektivt polyadenyleirngssignal. To unike restriksjonsseter Sali og Hindlll befinner seg nedstrøms polyadenyleirngssignalet. ;Den oppnådde vektor kalles pRSVtkRSVIL—2. ;2. Konstruksjon av rekombinante adenoviruser. ;Det konstrueres to typer rekombinante adenoviruser i henhold til den protokoll som er beskrevet i eksemplene 1 eller 2. Disse adenoviruser bærer to terapeutiske gener innskutt i samme retning på nivå med området El og oppviser en delesjon i området El ;eller i områdene El og E3. ;Adenovirusene Ad-RSV-tkRSVIL-2, AE1 og Ad-RSV-tkRSVIL-2,AEl, AE3 som oppnås på denne måte kan oppbevares ved — 80°C i 20% glycerol. ;Eksempel 4. Konstruksjon av defektive. rekombinante adenoviruser omfattende genet TK og genet som koder for kolonistimuleringsfaktoren av ;granocytter og makrofager ( GM- CSF). ;Ved å følge de protokoller som er beskrevet i de foregående eksempler kan defektive adenoviruser som bærer genet tk (for eksempel under kontroll av promotoren ONT eller RSV) og genet GM—CSF under kontroll av sin egen promotor eller særlig RSV-promotoren, konstrueres. ;For dette formål blir en mellomvektor som bærer de to gener konstruert fra vektoren pONTtk eller pRSVtk ved innskyting, i samme eller motsatt retning, av et fragment som bærer genet av GM-CSF under kontroll av promotoren. Genet som koder for GM-CSF og konstruksjonen som inneholder det er allerede beskrevet særlig i WO 86/03225. ;Eksempel 5. Konstruksjon av defektive. rekombinante adenoviruser omfattende to gener av interesse, et innskutt på nivå med området El og det ;andre på nivå med området E3. ;Disse adenoviruser er konstruert ved homolog rekombinasjon mellom et DNA av en første, defektiv virus som bærer det første gen innskutt på nivå med området El og DNA av en andre, defektiv adenovirus som bærer det andre gen innskutt på nivå med området E3. ;1. Konstruksjon av det defektive virus som bærer genet ;innskutt på nivå med området E3. ;Denne virus konstrueres fra adenovirusen Addl324 (Thimmappaya et al., "Cell", 31 ;(1982) 543). Virusen bærer en delesjon på nivå med området El og E3 (delert fragment Xbal-EcoRI). DNA av virus Addl324 og isoleres og renses. Dette DNA kuttes deretter med enzymene Xbal og EcoRI. Et fragment Xbal-EcoRI blir så hentet fra plasmid pRSVtk og som bærer sekvensen som koder for thymidinkinase under kontroll av promotoren RSV, så innskutt på nivå med nevnte seter i DNA av Addl324, åpent som tidligere. ;Denne således oppnådde DNA omfatter ■således en delesjon på nivå med området El og ;genet TK innskutt på nivå med området E3. ;2. Konstruksjon av adenoviruser som bærer de to gener. ;DNA av den ovenfor fremstilte, rekombinante virus og DNA av en rekombinant adenovirus som bærer det immunostimulerende eller tumorsuppressorgen, innskutt på nivå med området El, linearisert med BamHI, ko-transfekteres i linje 293 i nærvær av kalsiumfosfat for å tillate homolog rekombinasjon. De rekombinante adenoviruser som oppnås på denne måte seleksjoneres så ved rensing på plaque. Efter isolasjon forsterkes DNA av adenovirusen i cellelinje 293, noe som fører til en kultursupernatant inneholdende ikke-renset, defektiv, rekombinant adenovirus med en titer på ca. 10^ pfu/ml. ;De virale partikler blir generelt renset ved sentrifugering på en cesiumkloridgradient i henhold til kjente teknikker (se særlig Graham et al., "Virology", 52 (1973) 456). *

Claims (28)

1. Defektiv, rekombinant adenovirus, karakterisert ved at den omfatter to terapeutiske gener, det første et selvmordsgen og det andre et immunostimulerende eller tumorsuppressorgen.

2. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at de to gener utgjør en eneste transkripsjonen enhet under kontroll av en unik promotor.

3. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at de to gener befinner seg under kontroll av separate, transkripsjonene promotorer.

4. Adenovirus ifølge krav 3, karakterisert ved at de to gener innskytes i samme retning.

5. Adenovirus ifølge krav 3, karakterisert ved at de to gener innskytes i motsatt retning.

6. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at de to terapeutiske gener skytes inn på ett og samme sete i genomet, fortrinnsvis på nivå med områdene El, E3 eller E4.

7. Adenovirus ifølge krav 6, karakterisert ved at de to gener skytes inn på nivå med området El.

8. Adenovirus ifølge kravene 1, 3,4 og 5, karakterisert ved at de to terapeutiske gener skytes inn på forskjellige seter i genomet.

9. Adenovirus ifølge krav 8, karakterisert ved at ett av genene skytes inn på nivå med området El og det andre på nivå med området E3 eller E4.

10. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, karakterisert ved at det omfatter ITR-sekvensene, en sekvens som tillater enkapsidering og at det bærer en delesjon av hele eller en del av genene El og E4.

11. Adenovirus ifølge krav 10, karakterisert ved at den omfatter ITR-sekvensene, en sekvens som tillater enkapsidering og at den bærer en delesjon av hele eller en del av genene El, E3 og E4.

12. Adenovirus iøflge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, karakterisert ved at genomet er deletert over hele eller en del av genene EI,E3,L5ogE4.

13. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at den er av human, animalsk eller blandet opprinnelse.

14. Adenovirus ifølge krav 13, karakterisert ved at adenoviruser av human opprinnelse velges blant de som er klassifisert i gruppe C og fortrinnsvis blant adenoviruser av type 2 eller 5 (Ad2 eller Ad5).

15. Adenovirus ifølge krav 13, karakterisert ved at adenovirusene av animalsk opprinnelse er valgt blant canin-, bovin-, murin-, ovin-, porcin-, aviar- og simienadenoviruser.

16. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at selvmordsgenet er et gen av thymidinkinase og fortrinnsvis genet av thymidinkinase av herpes HSV—1-virusen.

17. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter et gen som koder for thymidinkinase og et tumorsuppressorgen.

18. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter et gen som koder for thymidinkinase og et gen som koder for et lymfokin.

19. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter et gen som koder for thymidinkinase av herpesvirus og villgenet p53 (Ad-TK-p53).

20. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter et gen som koder for thymidinkinase av herpesvirusen og et gen som koder for interleukin-2 (Ad-TK-IL2).

21. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter et gen som koder for thymidinkinase av herpesvirus og et gen som koder for GM-CSF (Ad-TK-GM-CSF).

22. Adenovirus ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at den eller de transkripsjonene promotorer er valgt blant mammifære, eukaryotiske eller virale promotorer.

23. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det immunostimulerende gen omfatter en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt inn i målcellens sekresjonsveier.

24. Aadenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter to gener av terapeutisk interesse innskutt på nivå med genomets område El.

25. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter minst en defektiv, rekombinant adenovirus i henhold til et av kravene 1 til 23.

26. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, karakterisert v e d at det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering.

27. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, karakterisert ved at det omfatter: en eller flere rekombinante adenoviruser som beskrevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 23 der selvmordsgenet er et gen som tilveiebringer en sensibilitet overfor et terapeutisk middel, og nevnte terapeutiske middel, som kombinasjonsprodukt for en samtidig, separat eller tidsforskutt anvendelse for behandling av hyperproliferative patologier.

28. Farmasøytisk preparat ifølge krav 25, karakterisert ved at selvmordsgenet er et thymidinkinasegen og det terapeutiske middel er gancyklovir eller acyklovir eller en analog derav.