WO1996010642A1 - Adenoviraux comprenant deux genes therapeutiques: suicide et immunostimulant - Google Patents

Adenoviraux comprenant deux genes therapeutiques: suicide et immunostimulant Download PDF

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Definitions

  • Adenoviruses comprising two therapeutic genes: suicide and immunostimulant
  • the present invention relates to new viral vectors, their preparation and their use in gene therapy. It also relates to pharmaceutical compositions containing said viral vectors. More particularly, the present invention relates to recombinant adenoviruses as vectors for gene therapy.
  • Gene therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) by introducing genetic information into the affected cell or organ.
  • This genetic information can be introduced either in vitro into a cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the organism, or directly in vivo into the appropriate tissue.
  • different techniques exist, among which various transfection techniques involving complexes of DNA and DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol.
  • adenoviruses have certain properties of interest for use in gene therapy. In particular, they have a fairly broad host spectrum, are capable of infecting quiescent cells, do not integrate into the genome of the infected cell, and have not been associated to date with significant pathologies in man.
  • Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses approximately 36 kb in size. Their genome includes in particular a repeated inverted sequence (ITR) at their end, an encapsidation sequence, early genes and late genes (see FIG. 1).
  • the main early genes are the El (Ela and Elb), E2, E3 and E4 genes.
  • the main late genes are the L1 to L5 genes.
  • adenoviruses Given the properties of the adenoviruses mentioned above, these have already been used for gene transfer in vivo. To this end, different vectors derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different genes ( ⁇ -gal, OTC, ⁇ - 1 AT, cytokines, etc.). In each of these constructions, the adenovirus was modified so as to render it incapable of replication in the infected cell.
  • the constructions described in the prior art are adenoviruses deleted from the El regions (El a and / or Elb) and optionally E3 into which a heterologous DNA sequence is inserted (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161).
  • the present invention relates to new vectors derived from adenoviruses which are particularly effective for gene therapy applications. More particularly, the present invention derives in part from the demonstration that it is possible to incorporate several genes of interest into adenoviruses, and to obtain a significant expression of these different genes in the infected cells
  • the present invention follows also from the construction of adenoviral vectors capable of incorporating several therapeutic genes under conditions allowing their optimal expression. It also results from the demonstration of a synergistic effect of the vectors of the invention, linked to co-expression, in the same target cell, of complementary therapeutic genes
  • the present invention thus provides viral vectors exhibiting therapeutic properties which are entirely advantageous with a view to their use in gene or cell therapy.
  • the vectors of the invention have properties which are entirely advantageous for use in the treatment of pathologies presenting episodes of cellular hyperproliferation (cancers, restenosis, etc.)
  • a first object of the present invention relates to a defective recombinant adenovirus comprising two therapeutic genes, in which one of the therapeutic genes is a suicide gene and the other is an immunostimulatory or tumor suppressor gene.
  • the Applicant has indeed shown that the simultaneous co-expression of such genes in the same target cell produces a particularly advantageous anti-tumor therapeutic effect, much greater than the effect obtained by means of these genes alone or introduced separately.
  • the therapeutic genes used in the context of the present invention may be a cDNA, a genomic DNA (gDNA), or a hybrid construct consisting, for example, of a cDNA in which one or more introns would be inserted. They can also be synthetic or semi-synthetic sequences. Particularly advantageously, a cDNA or a gDNA is used.
  • the two therapeutic genes incorporated into the adenoviral vectors according to the present invention can be arranged in different ways.
  • the two genes can first of all constitute a single transcriptional entity.
  • the two genes are contiguous, arranged under the control of a single promoter, and give Heu to a single premessenger RNA.
  • This arrangement is advantageous since it allows the use of a single transcriptional promoter.
  • the two therapeutic genes can also be placed under the control of separate transcriptional promoters. This configuration makes it possible to obtain higher levels of expression, and offers better control of gene expression.
  • the two therapeutic genes can be inserted in the same orientation or in the opposite orientations, in the same site of the genome of the denovirus or in different sites
  • suicide gene use is preferably made of genes whose expression product confers on the cell a sensitivity to a therapeutic agent. More preferably, the suicide gene is the thymidine kinase gene, the expression product of which gives mammalian cells sensitivity to certain therapeutic agents such as ganciclovir or acyclovir.
  • the herpes simplex virus thymidine kinase is capable of phosphorylating nucleoside analogs such as acyclovir and ganciclovir.
  • These modified molecules can be incorporated into a DNA chain in the process of elongation, which results in the cessation of DNA synthesis, leading to cell death (FL Moolten, Cancer Res 46 (1986) 5276 ). This strategy thus makes it possible to specifically eliminate the cells expressing the suicide gene.
  • DNA synthesis is the target of toxicity, only the cells being divided are affected.
  • the human herpes virus thymidine kinase gene (hTK HSV-1) is used.
  • the sequence of this gene has been described in the literature (see in particular McKnight et al., Nucleic Acid. Res. 8 (1980) 5931). It is also possible to use derivatives of this sequence exhibiting greater substrate specificity or better kinase activity. Such derivatives can in particular be obtained by mutagenesis at the level of the binding site as described previously (Balasubramaniam et al., J. Gen. Virol. 71 (1990) 2979; Munir et al., JBC 267 (1992) 6584).
  • cytosine deaminase gene the expression product of which gives mammalian cells sensitivity to 5-fluoro- cytosine (5-FC) or nitroreductases which give mammalian cells sensitivity to nitroaromatic products (J. Biol. Chem. 266 (1991) 4126).
  • the immunostimulatory gene can be any gene whose expression product is capable of stimulating the body's defenses.
  • it is a gene coding for a cytokine, such as in particular a lymphokine (IL-1 to IL-12), an interferon (alpha, beta, etc.), a tumor necrosis factor, a factor of colony stimulation (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, SCF, etc.), etc.
  • Interleukin 2 is synthesized essentially by lymphocytes, in response to the presence of antigens, in particular tumor antigens. It then acts on the development of the immune response against these antigens, in particular by local activation of cytotoxic and killer T cells (NK).
  • NK cytotoxic and killer T cells
  • GM-CSF is a factor for stimulating colonies of granocytes and macrophages. It therefore stimulates the proliferation of these cells of immunity and therefore makes it possible to strengthen the immune defenses.
  • the GM-CSF gene and cDNA have been described in the literature. Its co-expression in a vector of the invention with a suicide gene produces a high synergistic anti-tumor effect
  • tumor suppressor genes which can be used in the context of the present invention, there may be mentioned more particularly the p53, Rb, raplA, DDC, WAF and MTS genes. More particularly, the p53 gene or the Rb gene is used.
  • the p53 gene codes for a 53 kDa nuclear protein.
  • the mutated deletion and / or mutation form of this gene is involved in the development of most human cancers (Baker et al., Science 244 (1989) 217). Its mutated forms are also capable of cooperating with ras oncogenes to transform murine fibroblasts.
  • the wild-type gene encoding native p53 inhibits the formation of foci of transformation in fibroblasts of rodents transfected with various combinations of oncogenes. Recent data highlights that the protein p53 could itself be a transcription factor and stimulate the expression of other tumor suppressor genes.
  • the Rb gene determines the synthesis of a nuclear phosphoprotein of approximately 927 amino acids (Friend et al., Nature 323 (1986) 643) whose function is to suppress the division of cells by making them enter the quiescence phase.
  • Inactivated forms of the Rb gene have been implicated in various tumors, and in particular in retinoblastomas or in mesenchymal cancers such as osteosarcomas. Reintroduction of this gene into tumor cells where it was inactivated produces a return to normal state and a loss of tumorigenicity (Huang et al., Science 242 (1988) 1563).
  • the invention relates to a defective recombinant adenovirus comprising a gene coding for thymidine kinase and a tumor suppressor gene. More preferably, it relates to an adenovirus comprising a gene coding for the thymidine kinase of the herpes virus and the wild-type p53 gene (Ad-TK-p53).
  • Ad-TK-p53 wild-type p53 gene
  • the two genes are placed under the control of separate promoters, preferably the promoter of the LTR of the HSV virus. Even more preferably, the two genes are inserted at the level of the E1 region of the adenovirus genome.
  • the invention relates to a defective recombinant adenovirus comprising a gene coding for thymidine kinase and a gene coding for a lymphokine. More preferably, it relates to an adenovirus comprising a gene coding for the thymidine kinase of the herpes virus and a gene coding for interleukin-2 (Ad-TK-EL2) or for GM-CSF (Ad-TK-GM -CSF).
  • Ad-TK-EL2 interleukin-2
  • Ad-TK-GM -CSF GM-CSF
  • the two genes are placed under the control of separate promoters, preferably the LTR promoter of the HSV virus. Even more preferably, the two genes are inserted at the level of the E1 region of the adenovirus genome.
  • transcriptional promoters used in the context of the present invention, they may be promoters which are naturally responsible for the expression of the therapeutic gene considered when these are capable of functioning in the infected cell. They may also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they may be promoter sequences of mammalian, eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect. Likewise, they may be promoter sequences originating from the genome of a virus, including the adenovirus used. In this regard, mention may be made, for example, of the promoters of the El A, MLP, CMV, RSV, etc. genes.
  • these expression sequences can be modified by adding activation, regulation or tissue-specific expression sequences.
  • the inserted gene when it does not contain expression sequences, it can be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence
  • a preferred promoter for producing the vectors of the invention consists of the LTR of the sorcoma virus (LTR-RSV).
  • Other particularly preferred promoters are the specific promoters of proliferative or cancerous cells. These promoters indeed make it possible to target the therapeutic effect on a defined cell population.
  • these are expression signals induced by or active in the presence of viruses responsible for or associated with tumors.
  • an expression signal inducible by the Epstein-Barr virus (EBV) or by the papilloma virus is used.
  • Epstein-Barr virus is associated with two types of human cancers, Burkitt lymphoma and nasopharyngeal cancer.
  • the use of a recombinant adenovirus comprising a toxic gene under the control of a promoter inducible by EBV advantageously makes it possible to specifically express this toxic gene in tumor cells of the nasopharynx.
  • a single nuclear antigen is regularly present, EBNA1, which is involved in the maintenance of the viral genome in cells infected with EBV in the latent phase, and which activates the viral promoter BCR2.
  • a particular object of the invention therefore lies in the use, for the specific expression of a gene in cancer cells of the nasopharynx, of a sequence responding to EBNA1 (EBNA1-RE: EBNA1 "responsive element").
  • the invention relates to an adenovirus comprising, as expression signal, a chimeric promoter comprising a sequence responding to EBNA1 fused upstream of another viral promoter, the promoter of the terminal protein 1 gene (TPI).
  • TPI terminal protein 1 gene
  • Papilloma viruses are responsible for 90% of cervical cancer in women and have been identified in pre-cancerous epithelial lesions (Riou et al., Lancet 335 (1990) 1 17) .
  • the E6 gene product leads to the formation of tumors by greatly reducing the amount of wild-type p53, an anti-oncogene, in HPV-positive cells (Wrede et al., Mol Carcinog. 4 (1991) 171)
  • the use of a recombinant adenovirus comprising a toxic gene under the control of a promoter inducible by HPV advantageously makes it possible to specifically express this toxic gene in the corresponding tumor cells.
  • ⁇ -fetoprotein promoter Alpha-fetoprotein promoter
  • P3 promoter e.g., 'IGF-II (Sussenbach et al, Growth Regulation 2 (1992) 1), which are active in adults, only in hepatocarcinomas. It is also possible to use promoters induced by hormones in the case of hormone-dependent or associated hormonal tumors (breast or prostate tumor for example).
  • the vectors of the invention can first of all contain the two genes in the form of a single transcriptional entity.
  • the two genes are contiguous, arranged under the control of a single promoter, and give rise to a single premessenger RNA.
  • This configuration is advantageous since it makes it possible to use a single transcriptional promoter to regulate the expression of the 2 genes.
  • this unique transcriptional entity can be incorporated into the adenoviral vector in the two possible orientations.
  • the two genes can also be placed under the control of separate transcriptional promoters. This configuration provides levels expression, and provides better control of gene expression.
  • the two therapeutic genes can be inserted in the same orientation or in the opposite orientations, in the same site of the genome of the denovirus or in different sites.
  • the genes are inserted, at least in part, at the level of the El, E3 or E4 regions of the adenovirus genome.
  • the regions E1 and E3 or E1 and E4 are preferred in the context of the invention to use the regions E1 and E3 or E1 and E4.
  • a particularly advantageous embodiment is that in which two therapeutic genes are inserted at the level of the El region.
  • the examples indeed show that this organization allows a high expression of the two genes, without interference between the two.
  • the invention therefore also relates to any recombinant adenovirus comprising two genes of therapeutic interest inserted at the level of the E1 region of the genome
  • the immunostimulant gene may also contain a signal sequence directing the product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the immunostimulant product, but it may also be any other signal sequence. functional, or an artificial signal sequence.
  • the adenoviruses of the present invention are defective, that is to say that they are unable to replicate autonomously in the target cell.
  • the genome of the defective adenoviruses according to the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by therapeutic genes.
  • the defective nature of the adenoviruses of the invention is an important element, since it ensures the non-dissemination of the vectors of the invention after administration.
  • the adenoviruses of the invention comprise the ITR sequences and a sequence allowing the encapsidation, and have a deletion of all or part of the E 1 gene.
  • the inverted repeat sequences (ITR) constitute the origin of replication of adenoviruses. They are located at the 3 ′ and 5 ′ ends of the viral genome (cf. FIG. 1), from which they can be easily isolated according to the conventional techniques of molecular biology known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequence of the ITR sequences of human adenoviruses is described in the literature, as well as of canine adenoviruses (in particular CAV1 and CAV2).
  • the left ITR sequence corresponds to the region comprising nucleotides 1 to 103 of the genome
  • the packaging sequence (also called Psi sequence) is necessary for the packaging of viral DNA. This region must therefore be present to allow the preparation of defective recombinant adenoviruses according to the invention.
  • the packaging sequence is located in the adenovirus genome, between the left ITR (5 ') and the E1 gene (Cf figure 1) It can be isolated or artificially synthesized by standard molecular biology techniques
  • the nucleotide sequence of the packaging sequence of human adenoviruses (in particular of serotypes Ad2 and Ad5) is described in the literature, as well as canine adenoviruses (in particular CAV1 and CAV2).
  • Adenovirus Ad5 for example, the encapsidation sequence corresponds to the region comprising nucleotides 194 to 358 of the genome
  • the adenoviruses of the invention comprise the ITR sequences and a sequence allowing the packaging, and have a deletion of all or part of the El and E4 genes
  • the genome of the adenoviruses according to the invention is deleted from all or part of the El, E3 and E4 genes, and, even more preferably, from all or part of the El, E3, L5 and E4 genes
  • adenoviruses of the invention can be prepared from adenoviruses of various origins. There are in fact different serotypes of adenovirus, the structure and properties of which vary somewhat, but which have a comparable genetic organization. Thus, the teachings described in the present application can be easily reproduced by a person skilled in the art for any type of adenovirus.
  • the adenoviruses of the invention can be of human, animal, or mixed origin (human and animal) As regards adenoviruses of human origin, it is preferred to use those classified in group C. More preferably, among the various serotypes of human adenovirus, it is preferred to use, within the framework of the present invention, adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5).
  • the adenoviruses of the invention can also be of animal origin, or contain sequences derived from adenoviruses of animal origin.
  • the Applicant has indeed shown that adenoviruses of animal origin are capable of infecting human cells with great efficiency, and that they are unable to propagate in the human cells in which they have been tested (see request FR 93 05954).
  • the Applicant has also shown that adenoviruses of animal origin are in no way trans-complemented by adenoviruses of human origin, which eliminates any risk of recombination and of propagation in vivo, in the presence of a human adenovirus, which can lead to the formation of an infectious particle.
  • the use of adenoviruses or adenovirus regions of animal origin is therefore particularly advantageous since the risks inherent in the use of viruses as vectors in gene therapy are even lower.
  • the adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention can be of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, avian or else simienne (example: after-sales service).
  • serotypes 1 to 10 accessible to ATCC such as for example the strains Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR- 827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), Kl l (ATCC VR-921) or the strains referenced ATCC VR-831 to 835.
  • bovine adenoviruses it is possible to use the various known serotypes, and in particular those available at ATCC (types 1 to 8) under the references ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 and 769. It is also possible to use cite the murine adenoviruses FL (ATCC VR-550) and E20308 (ATCC VR-528), the sheep adenovirus type 5 (ATCC VR-1343), or type 6 (ATCC VR-1340); porcine adenovirus 5359), or simian adenoviruses such as in particular adenoviruses referenced in the ATCC under the numbers VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.
  • adenoviruses or regions of adenoviruses of canine origin are used in the context of the invention, and in particular all the strains of adenoviruses CAV2 [Manhattan strain or A26 / 61 ( ATCC VR-800) for example].
  • Canine adenoviruses have been the subject of numerous structural studies. . Thus, complete restriction maps of the CAV1 and CAV2 adenoviruses have been described in the prior art (Spibey et al., J. Gen. Virol.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared in different ways.
  • a first method consists in transfecting the DNA of the defective recombinant virus prepared in vitro (either by ligation or in the form of a plasmid) in a competent cell line, that is to say carrying in trans all the functions necessary for complementation of the defective virus. These functions are preferably integrated into the genome of the cell, which makes it possible to avoid the risks of recombination, and confers increased stability on the cell line.
  • a second approach consists in co-transfecting into a suitable cell line the DNA of the defective recombinant virus prepared in vitro (either by ligation or in the form of a plasmid) and the DNA of a helper virus.
  • a competent cell line capable of complementing all the defective functions of the recombinant adenovirus. Part of these functions is indeed complemented by the helper virus.
  • This helper virus must itself be defective and the cell line carries in trans the functions necessary for its complementation.
  • the human embryonic kidney line 293 there may be mentioned in particular the human embryonic kidney line 293, the cells KB, Hela cells, MDCK, GHK, etc. (see examples).
  • the vectors which have multiplied are recovered, purified and amplified according to conventional techniques of molecular biology.
  • the vectors of the invention advantageously have a deletion of all or part of certain viral genes, in particular the El, E3, E4 and / or L5 genes.
  • This deletion can correspond to any type of deletion affecting the gene considered. It may especially be the suppression of all or part of the coding region of said gene, and / or of all or part of the promoter region of the transcription of said gene.
  • Deletion is generally carried out on the DNA of the defective recombinant virus, for example by digestion using appropriate restriction enzymes, then ligation, according to molecular biology techniques, as illustrated in the examples.
  • Therapeutic genes can then be inserted into this DNA by enzymatic cleavage then ligation, at the level of the selected regions and in the chosen orientation.
  • the DNA thus obtained which therefore carries the appropriate deletions and the two therapeutic genes, makes it possible to directly generate the defective recombinant adenovirus carrying said deletions and therapeutic genes
  • This first variant is particularly suitable for the production of recombinant adenoviruses in which the genes therapeutics are arranged in the form of a single transcriptional unit or, under the control of separate promoters but inserted at the same site of the genome
  • the DNA of a first recombinant virus carrying the appropriate deletions (or part of said deletions) and one of the therapeutic genes is constructed, by ligation or in the form of a plasmid
  • This DNA is then used to generate a first recombinant virus carrying said deletions and a therapeutic gene
  • the DNA of this first virus is then isolated and co-transfected with a second plasmid or d DNA a second defective recombinant virus carrying the second therapeutic gene, the appropriate deletions (part not present on the first virus), and a region allowing homologous recombination
  • This second step thus generates the defective recombinant virus carrying the two therapeutic genes
  • This variant of preparation is particularly suitable for the preparation of recombinant virus nts carrying two therapeutic genes inserted in two different regions of the adenovirus genome.
  • the present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant adenoviruses as described above.
  • the pharmaceutical compositions of the invention can be formulated for administration by topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, -cutaneous, intraocular, transdermal, etc.
  • the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation.
  • pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation can be in particular saline solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition depending on the case of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutions.
  • the doses of virus used for the injection can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 14 pfu / ml, and preferably 10 6 to 10 10 pfu / ml
  • the term pfu (“plaque forming unit ”) corresponds to the infectivity of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 5 days, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature
  • the adenoviruses of the invention can be used for the treatment or prevention of many pathologies. They are particularly advantageous for the treatment of hyperproliferative pathologies (cancers, restenosis, etc.), by direct injection at the site concerned.
  • the present invention also relates to a method for the destruction of proliferative cells comprising the infection of said cells or of a part of them with an adenoviral vector as defined above.
  • the suicide gene is a gene which confers sensitivity to a therapeutic agent
  • the method of destruction according to the invention then comprises the treatment of the cells with said therapeutic agent.
  • the invention also relates to products comprising a recombinant adenovirus as defined above in which the suicide gene is a gene conferring sensitivity to a therapeutic agent; and said therapeutic agent, as a combination product for simultaneous, separate or spread over time use for the treatment of hyperproliferative pathologies.
  • the suicide gene is a thymidine kinase gene and the therapeutic agent is gancyclovir or acyclovir or an analog.
  • the plasmids of type pBR322, pUC and the phages of the Ml 3 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories)
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations
  • the filling of the prominent 5 'ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al [Nucleic Acids Res H (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham Enzymatic amplification of DNA fragments by the so-called PCR technique
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham.
  • - Human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) This line contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome of the human adenovirus Ad5 (12%) .
  • - Human cell line KB From a human epidermal carcinoma, this line is accessible to the ATCC (ref. CCL17) as well as the conditions allowing its culture.
  • Hela Human cell line Hela: From a carcinoma of the human epithelium, this line is accessible to the ATCC (ref. CCL2) as well as the conditions allowing its culture.
  • MDCK canine cell line The culture conditions for MDCK cells have been described in particular by Macatney et al. Science 44 (1988) 9.
  • DBP6 cell line (Brough et al., Virology 190 (1992) 624). This line consists of Hela cells carrying the E2 gene of adenovirus under the control of the LTR of MMTV.
  • Example 1 Construction of defective recombinant adenoviruses comprising the TK gene under the control of a cancer-specific promoter and the p53 gene under the control of the CMV promoter.
  • adenoviruses were constructed by homologous recombination between a plasmid carrying the left part of the adenovirus Ad5, the two therapeutic genes and a region of the Ad5 adenovirus (corresponding to protein IX) and the DNA of a defective adenovirus carrying different deletions.
  • the BglII-NcoI fragment containing the thymidine kinase (tk) gene of the herpes simplex virus type 1 was isolated from the plasmid pHSV-106 (marketed by Gibco BRL), repaired by the action of the klenow fragment and then inserted into the site Smal of the plasmid pGEM7zf (+) (sold by Promega) The Smal and BglII sites are destroyed during this step, the Ncol site is preserved
  • the plasmid obtained was designated p7tkl
  • This example describes the construction of a plasmid containing a chimeric promoter consisting of a sequence necessary for transactivation by the EBNA1 antigen and of the TPI promoter of the EBV virus.
  • the EcoRI (7315) -SmaI (8191) fragment of the EBV virus was isolated from the B95-8 strain.
  • the complete sequence of the EBV virus was described by Baer et al. (Nature 310 (1984) 207)
  • This fragment contains the sequences necessary for transactivation by nuclear antigen 1 (EBNA1) (D Reisman & B. Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol 6 pp 3838-3846) was then fused to the Nrul (166,241) -PstI (166,559) fragment of EBV B95-8 (the PstI site was digested with T4 polymerase), containing the TPI promoter.
  • the chimeric promoter thus obtained was then inserted into the multisite for cloning the plasmid pBluescript II SK.
  • the plasmid obtained was designated pONT 1
  • the plasmid pONTtk contains the gene for the thymidine kinase of the herpes simplex virus (tk) cloned in the plasmid p7tkl, under the control of the chimeric promoter EBNA1-RE / TP1 cloned in the plasmid pONTl To construct this plasmid, the BamHI-XhoI fragment from pONTl which contains the chimeric promoter transactivated by EBNA-1 and EBNA-2, and the fragment
  • plasmid pAd.RSV ⁇ gal contains, in the orientation 5 '-> 3',
  • the PvuII fragment corresponding to the left end of the Ad5 adenovirus comprising: the ITR sequence, the origin of replication, the packaging signals and the El A amplifier;
  • This example describes the construction of a vector carrying the left part of the adenovirus Ad5 (comprising the left ITR, the encapsidation region and the start of the E1 region), the tk gene under the control of the ONT promoter, the gene p53 under the control of the CMV promoter and a second fragment of the Ad5 genome (pIX protein) allowing homologous recombination with a view to the generation of the recombinant adenovirus (cf. example 1.3).
  • This plasmid was constructed from the plasmid pONTtk, by insertion, downstream of the tk gene and in the same orientation, of a fragment carrying the p53 gene under the control of the CMV promoter and followed by the polyadenylation site of the SV40 virus. More specifically, the inserted fragment comprises:
  • CMV cytomegalovirus
  • the suppressor gene is in the form of c DNA, that is to say devoid of introns. This makes it possible in particular to reduce the size of the vector. Furthermore, it has been verified that the expression levels obtained are comparable in the presence or absence of introns - the polyadenylation signal from the late genes of the SV40 virus, which corresponds to a very effective polyadenylation signal.
  • Two unique restriction sites SalI and HindIII are located downstream of the polyadenylation signal
  • the vector obtained was designated pONTtkCMVp53
  • the vector pONTtkCMVp53 was linearized and cotransfected with an adenoviral vector deficient in the El gene, in helper cells (line 293) providing in trans the functions coded by the El regions (El A and El B) of adenovirus.
  • the adenovirus Ad-ONTtkCMVp53, ⁇ El is obtained by homologous recombination in vivo between the adenovirus Ad-RSV ⁇ gal (Cf Stratford-Perricaudet et al cited above) and the vector pONTtkCMVp53, according to the following protocol: the plasmid pONTtkCMVp53, linearized by Xmnl, and the adenovirus Ad-RSV ⁇ gal, linearized by the enzyme Clal, are co-transfected in line 293 in the presence of calcium phosphate, to allow homologous recombination. The recombinant adenoviruses thus generated are then selected by plaque purification.
  • the DNA of the recombinant adenovirus is amplified in the line cell 293, which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately 10 10 pfu / ml.
  • the viral particles are generally purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
  • Ad-ONT-tkCMVp53, ⁇ El adenovirus can be stored at -80 ° C in 20% glycerol
  • the vector pONTtkCMVp53 was linearized and cotransfected with an adenoviral vector deficient in the El and E3 genes, in the helper cells (line 293) bringing in irons the functions coded by the El regions (El A and El B) of adenovirus
  • the adenovirus Ad-ONTtkCMVp53, ⁇ El, ⁇ E3 is obtained by homologous recombination in vivo between the mutant adenovirus Ad-dll324 (Thimmappaya et al, Cell 3 1 (1982) 543) and the vector pONTtkCMVp53, according to the following protocol the plasmid pONTtkCMVp53, linearized by Xmnl, and the adenovirus Ad-dll324, linearized by the enzyme ClaI, are co-transfected in line 293 in the presence of calcium phosphate, to allow homologous recombination.
  • the recombinant adenoviruses thus generated are then selected by plaque purification. After isolation, the DNA of the recombinant adenovirus is amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the non-purified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately 10- ° pfu / ml.
  • the viral particles are generally purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al, Virology 52 (1973) 456)
  • the adenovirus Ad-ONT-tkCMVp53, ⁇ El, ⁇ E3 can be stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • adenoviruses in which the tk and p53 genes are positioned in the opposite orientations can be constructed starting from the plasmid pONTtkCMVp53inv.
  • Example 2 Construction of defective recombinant adenoviruses comprising the TK gene under the control of the RSV virus LTR promoter and the p53 gene under the control of the CMV promoter.
  • adenoviruses were constructed by homologous recombination between a plasmid carrying the left part of the adenovirus Ad5, the two therapeutic genes and a region of the adenovirus Ad5 (corresponding to protein IX) and the DNA of a defective adenovirus carrying different deletions.
  • This plasmid was constructed from the plasmid pONTtk (Example 11), by substitution of the promoter transactivable by EBNA1 by the promoter of the LTR of RSV.
  • the RSV promoter was isolated in the form of a BamHI-SalI fragment from the plasmid pAd.RSV. ⁇ gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), then cloned at the BamHI (478) and Sall (1700) sites of the plasmid pONTtk.
  • the resulting plasmid was designated pRSVtk ( Figure 4).
  • This example describes the construction of a vector carrying the left part of the adenovirus Ad5 (comprising the left ITR, the encapsidation region and the start of the E1 region), the tk gene under the control of the RSV promoter, the gene p53 under the control of the CMV promoter and a second fragment of the Ad5 genome (protein pIX) allowing homologous recombination with a view to the generation of the recombinant adenovirus (cf. example 2.3).
  • This plasmid was constructed from the plasmid pRSVtk, by insertion, downstream of the tk gene, of a fragment carrying the p53 gene under the control of the CMV promoter and followed by the polyadenylation site of the SV40 virus. More specifically, the inserted fragment comprises:
  • CMV cytomegalovirus
  • the suppressor gene is in the form of cDNA, that is to say devoid of introns. This makes it possible in particular to reduce the size of the vector. Furthermore, it has been verified that the expression levels obtained are comparable in the presence or absence of introns.
  • the polyadenylation signal of the late genes of the SV40 virus which corresponds to a very effective polyadenylation signal
  • Two unique restriction sites Sali and HindIII are located downstream of the polyadenylation signal
  • the vector obtained was designated pRSVtkCMVp53
  • the adenovirus Ad-RSV-tkCMVp53, ⁇ El thus obtained can be stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • This adenovirus is constructed according to the protocol described in Example 1 (3.2.).
  • the adenovirus Ad-RSV-tkCMVp53, ⁇ El, ⁇ E3 thus obtained can be stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • Example 3 Construction of defective recombinant adenoviruses comprising the TK gene under the control of the LTR promoter of the RSV virus and the interleukin-2 gene under the control of the same promoter. These adenoviruses were constructed by homologous recombination between a plasmid carrying the left part of the adenovirus Ad5, the two therapeutic genes and a region of the adenovirus Ad5 (corresponding to protein IX) and the DNA of a defective adenovirus carrying different deletions.
  • This example describes the construction of a vector carrying the left part of the adenovirus Ad5 (comprising the left ITR, the encapsidation region and the start of the E1 region), the tk gene under the control of the RSV promoter, the gene interleukin-2 under the control of the RSV promoter and a second fragment of the Ad5 genome (pIX protein) allowing homologous recombination with a view to the generation of the recombinant adenovirus (cf. example 3.2).
  • This plasmid was constructed from the plasmid pRSVtk (see example 2), by insertion, downstream of the tk gene, of a fragment carrying the interleukin-2 gene under the control of the RSV promoter and monitoring of the polyadenylation site of the virus. SV40. More specifically, the inserted fragment comprises:
  • RSV virus LTR promoter isolated in the form of a BamHI-SalI fragment from the plasmid pAd.RSV. ⁇ gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626),
  • the therapeutic gene is in the form of cDNA.
  • polyadenylation signal from late genes of the SV40 virus, which corresponds to a very effective polyadenylation signal.
  • Two unique restriction sites SalI and HindIII are located downstream of the polyadenylation signal.
  • the vector obtained was designated pRSVtkRSVIL-2.
  • adenoviruses Two types of recombinant adenoviruses are constructed according to the protocol described in Example 1 or 2. These adenoviruses carry the two therapeutic genes inserted in the same orientation, at the level of the E1 region and have a deletion in the E1 region or in the El and E3 regions.
  • the adenoviruses Ad-RSV-tkRSVIL-2, ⁇ El and Ad-RSV-tkRSVTL-2, ⁇ El, ⁇ E3 thus obtained can be stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • Example 4 Construction of defective recombinant adenoviruses comprising the TK gene and the gene coding for the stimulation factor of the colonies of granocytes and macrophages (GM-CSF).
  • defective adenoviruses carrying the tk gene (under the control of the ONT or RSV promoter for example) and the GM-CSF gene under the control of its own promoter or of the RSV promoter in particular can be constructed
  • an intermediate vector carrying the two genes can be constructed from the pONTtk or pRSVtk vector by insertion, in the same orientation or in the reverse orientation, of a fragment carrying the GM-CSF gene under the control of the promoter.
  • the gene coding for GM-CSF and constructs containing it have been described in particular in application WO86 / 03225.
  • Example 5 Construction of defective recombinant adenoviruses comprising two genes of interest, one inserted at the level of the E1 region and the other inserted at the level of the E3 region.
  • adenoviruses are constructed by homologous recombination between a DNA from a defective first virus carrying the first gene inserted at the E 1 region and DNA from a second defective adenovirus carrying the second gene inserted at the region E3.
  • This virus is constructed from the Addl324 adenovirus (Thimmappaya et al.,
  • This virus carries a deletion at the level of the E1 and E3 region (deleted Xbal-EcoRI fragment).
  • the DNA of the Add1324 virus was isolated and purified. This DNA is then cut by the enzymes Xbal and EcoRI. A Xbal-EcoRI fragment is then derived from the plasmid pRSVtk carrying the sequence coding for the thymidine kinase under the control of the RSV promoter, then inserted at said sites in the DNA of Add1324 opened as above.
  • the DNA thus obtained therefore comprises a deletion at the level of the E1 region and the TK gene inserted at the level of the E3 region.
  • adenoviruses carrying the two genes The DNA of the recombinant virus prepared above and the DNA of a recombinant adenovirus carrying an immunostimulating or tumor suppressor gene inserted at the level of the E1 region, linearized with BamHI, are co-transfected into line 293 in the presence of calcium phosphate, to allow homologous recombination. The recombinant adenoviruses thus generated are then selected by plaque purification.
  • the DNA of the recombinant adenovirus is amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the non-purified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately 10 1 () pfu / ml
  • the viral particles are generally purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al, Virology 52 (1973) 456)

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux dérivés des adénovirus, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique. Elle concerne plus particulièrement des adénovirus recombinants défectifs comprenant deux gènes thérapeutiques, le premier étant un gène suicide et le second un gène immunostimulant ou un gène suppresseur de tumeurs.

Description

Adénovlraux comprenant deux gènes thérapeutiques: suicide et Immuno- stlnulant
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits vecteurs viraux. Plus particulièrement, la présente invention concerne des adénovirus recombinants comme vecteurs pour la thérapie génique.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
Parmi ces virus, les adénovirus présentent certaines propriétés intéressantes pour une utilisation en thérapie génique. Notamment, ils ont un spectre d'hôte assez large, sont capables d'infecter des cellules quiescentes, ne s'intègrent pas au génome de la cellule infectée, et n'ont pas été associés à ce jour à des pathologies importantes chez l'homme. Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à leur extrémité, une séquence d'encapsidation, des gènes précoces et des gènes tardifs (Cf figure 1). Les principaux gènes précoces sont les gènes El (Ela et Elb), E2, E3 et E4. Les principaux gènes tardifs sont les gènes Ll à L5.
Compte tenu des propriétés des adénovirus mentionnées ci-dessus, ceux-ci ont déjà été utilisés pour le transfert de gènes in vivo. A cet effet, différents vecteurs dérivés des adénovirus ont été préparés, incorporant différents gènes (β-gal, OTC, α- 1 AT, cytokines, etc). Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés des régions El (El a et/ou Elb) et éventuellement E3 au niveau desquelles est insérée une séquence d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gène 50 (1986) 161).
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs dérivés des adénovirus particulièrement efficaces pour des applications de thérapie génique. Plus particulièrement, la présente invention découle en partie de la mise en évidence qu'il est possible d'incorporer plusieurs gènes d'intérêt dans des adénovirus, et d'obtenir une expression importante de ces différents gènes dans les cellules infectées La présente invention découle également de la construction de vecteurs adénoviraux capables d'incorporer plusieurs gènes thérapeutiques dans des conditions permettant leur expression optimale Elle découle encore de la mise en évidence d'un effet synergique des vecteurs de l'invention, lié à la co-expression, dans la même cellule cible, de gènes thérapeutiques complémentaires La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux présentant des propriétés thérapeutiques tout à fait avantageuses en vue de leur utilisation en thérapie génique ou cellulaire. En particulier, les vecteurs de l'invention présentent des propriétés tout à fait avantageuses pour une utilisation dans le traitement des pathologies présentant des épisodes d'hyperprolifération cellulaire (cancers, resténose, etc)
Un premier objet de la présente invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant deux gènes thérapeutiques, dans lequel l'un des gènes thérapeutiques est un gène suicide et l'autre est un gène immunostimulant ou suppresseur de tumeurs. La demanderesse a en effet montré que la co-expression simultanée de tels gènes dans une même cellule cible produisait un effet thérapeutique anti-tumoral particulièrement avantageux, bien supérieur à l'effet obtenu au moyen de ces gènes seuls ou introduits séparément.
Les gènes thérapeutiques utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. Les deux gènes thérapeutiques incorporés dans les vecteurs adénoviraux selon la présente invention peuvent être agencés de différentes manières.
Ils peuvent tout d'abord constituer une entité transcriptionnelle unique. Dans cette configuration, les deux gènes sont contigus, disposés sous le contrôle d'un promoteur unique, et donnent Heu à un ARN prémessager unique. Cette disposition est avantageuse puisqu'elle permet d'utiliser un seul promoteur transcriptionnel.
Les deux gènes thérapeutiques peuvent également être placés sous le contrôle de promoteurs transcriptionnels séparés. Cette configuration permet d'obtenir des niveaux d'expression supérieurs, et offre un meilleur contrôle de l'expression des gènes. Dans ce cas, les deux gènes thérapeutiques peuvent être insérés dans la même orientation ou dans les orientations opposées, dans un même site du génome de l'dénovirus ou en des sites différents
Comme gène suicide, on utilise préférentiellement les gènes dont le produit d'expression confère à la cellule une sensibilité à un agent thérapeutique. Plus préférentiellement, le gène suicide est le gène de la thymidine kinase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à certains agents thérapeutiques tels le ganciclovir ou l'acyclovir. La thymidine kinase du virus de l'herpès simplex est capable de phosphoryler les analogues de nucléosides tels que l'acyclovir et le ganciclovir. Ces molécules modifiées peuvent être incorporées dans une chaine d'ADN en cours d'élongation, ce qui a pour conséquence l'arrêt de la synthèse d'ADN, entrainant la mort de la cellule (F.L Moolten, Cancer Res 46 (1986) 5276). Cette stratégie permet ainsi d'éliminer spécifiquement les cellules exprimant le gène suicide. De plus, la synthèse d'ADN étant la cible de la toxicité, seules les cellules en cours de division sont affectées.
Plus préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (hTK HSV-1). La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight et al., Nucleic Acid. Res. 8 (1980) 5931). Il est également possible d'utiliser des dérivés de cette séquence présentant une plus grande spécificité de substrat ou une meilleure activité kinase. De tels dérivés peuvent en particulier être obtenus par mutagénèse au niveau du site de liaison comme décrit précédemment (Balasubramaniam et al., J. Gen. Virol. 71 (1990) 2979; Munir et al., JBC 267 (1992) 6584).
Il est également possible d'utiliser le gène de la cytosine désaminase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à la 5-fluoro- cytosine (5-FC) ou des nitroréductases qui confèrent aux cellules mammifères une sensibilité aux produits nitroaromatiques (J. Biol. Chem. 266 (1991) 4126).
Comme indiqué ci-avant, il est tout particulièrement avantageux d'associer le gène suicide à une gène immunostimulant ou suppresseur de tumeurs. A cet égard, le gène immunostimulant peut être tout gène dont le produit d'expression est capable de stimuler les défenses de l'organisme. Préférentiellement, il s'agit d'un gène codant pour une cytokine, telle que notamment une lymphokine (IL-1 à IL- 12), un interféron (alpha, béta, etc), un facteur de nécrose des tumeurs, un facteur de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, SCF, etc), etc. Encore plus préférentiellement, il s'agit du gène codant pour l'interleukine-2 ou le GM-CSF L'interleukine 2 est synthétisée essentiellement par les lymphocytes, en réponse à la présence d'antigènes, notamment d'antigènes tumoraux. Elle agit ensuite sur le développement de la réponse immunitaire à l'encontre de ces antigènes, en particulier par activation locale des cellules T cytotoxiques et tueuses (NK). Cette lymphokine joue ainsi un rôle important dans l'immunité anti-tumorale. Grâce aux vecteurs de la présente invention, il est maintenant possible d'obtenir un effet antitumoral synergique résultant d'une expression simultanée, dans la même cellule tumorale, de l'interleukine 2 et d'un gène suicide, tel que le gène de la thymidine kinase. Le GM-CSF est un facteur de stimulation des colonies de granocytes et macrophages. Il stimule donc la prolifération de ces cellules de l'immunité et permet donc de renforcer les défenses immunitaires. Le gène et le cDNA du GM-CSF ont été décrits dans la littérature. Sa co-expression dans un vecteur de l'invention avec un gène suicide produit un effet synergique antitumoral élevé
Parmi les gènes suppresseur de tumeurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les gènes p53, Rb, raplA, DDC, WAF et MTS. Plus particulièrement, on utilise le gène p53 ou le gène Rb.
Le gène p53 code pour une protéine nucléaire de 53 kDa. La forme mutée par délétion et/ou mutation de ce gène est impliquée dans le développement de la plupart des cancers humains (Baker et coll., Science 244 (1989) 217). Ses formes mutées sont également capables de coopérer avec les oncogènes ras pour transformer des fibroblastes murins. Le gène sauvage codant pour la p53 native inhibe en revanche la formation des foyers de transformation dans des fibroblastes de rongeurs transfectés avec diverses combinaisons d'oncogènes. Des données récentes soulignent que la protéine p53 pourrait être elle-même un facteur de transcription et stimuler l'expression d'autres gènes suppresseurs de tumeur. Par ailleurs, un effet de p53 sur la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires a été mis en évidence récemmant (Epstein et al. Science 151 (1994)). Le gène Rb détermine la synthèse d'une phosphoprotéine nucléaire de 927 acides aminés environ (Friend et coll., Nature 323 (1986) 643) dont la fonction est de réprimer la division des cellules en les faisant entrer en phase de quiescence. Des formes inactivées du gène Rb ont été mises en cause dans différentes tumeurs, et notamment dans les rétinoblastomes ou dans les cancers mésenchymateux comme les ostéosarcomes. La réintroduction de ce gène dans les cellules tumorales où il était inactivé produit un retour à l'état normal et une perte de la tumorigénicité (Huang et coll., Science 242 ( 1988) 1563). Récemment, il a été démontré que la protéine Rb normale, mais pas ses formes mutées, réprime l'expression du proto-oncogène c-fos, gène indispensable à la prolifération cellulaire. Les gènes WAF et MTS et leurs propriétés antitumorales ont été décrits dans la littérature (Cell 75 (1993) 817; Science 264 (1994) 436).
Dans un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant un gène codant pour la thymidine kinase et un gène suppresseur de tumeurs. Plus préférentiellement, elle concerne un adénovirus comprenant un gène codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès et le gène p53 sauvage (Ad-TK-p53). De manière particulièrement avantageuse, les deux gènes sont placés sous le contrôle de promoteurs séparés, de préférence le promoteur du LTR du virus HSV. Encore plus préférentiellement, les deux gènes sont insérés au niveau de la région El du génome de l'adénovirus.
Dans un autre mode particulièrement préféré de mise en oeuvre, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant un gène codant pour la thymidine kinase et un gène codant pour une lymphokine. Plus préférentiellement, elle concerne un adénovirus comprenant un gène codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès et un gène codant pour l'interleukine-2 (Ad-TK-EL2) ou pour le GM-CSF (Ad-TK-GM-CSF). De manière particulièrement avantageuse, les deux gènes sont placés sous le contrôle de promoteurs séparés, de préférence le promoteur du LTR du virus HSV. Encore plus préférentiellement, les deux gènes sont insérés au niveau de la région El du génome de l'adénovirus.
Concernant les promoteurs transcriptionnels utilisés dans le cadre de la présente invention, il peut s'agir de promoteurs qui sont naturellement responsables de l'expression du gène thérapeutique considéré lorsque ceux-ci sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques) Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes mammifères, eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes El A, MLP, CMV, RSV, etc En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique Par ailleurs, lorsque le gène inséré ne comporte pas de séquences d'expression, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence Un promoteur préféré pour la réalisation des vecteurs de l'invention est constitué par le LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV). D'autres promoteurs particulièrement préférés sont les promoteurs spécifiques des cellules prolifératives ou cancéreuses Ces promoteurs permettent en effet de cibler l'effet thérapeutique sur une population de cellule définie
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, il s'agit de signaux d'expression induits par ou actifs en présence de virus responsables ou associés à des tumeurs. Encore plus préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention un signal d'expression inductible par le virus d'Epstein-Barr (EBV) ou par le virus du papillome
Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est associé à deux types de cancers humains le lymphome de Burkitt et le cancer du nasopharynx L'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'EBV permet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans les cellules tumorales du nasopharynx. Dans les biopsies de cancers du nasopharynx, un seul antigène nucléaire est régulièrement présent, EBNA1, qui est impliqué dans la maintenace du génome viral dans les cellules infectées par l'EBV en phase latente, et qui transactive le promoteur viral BCR2. Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation, pour l'expression spécifique d'un gène dans les cellules de cancers du nasopharynx, d'une séquence répondant à EBNA1 (EBNA1-RE : EBNA1 "responsive élément"). En particulier, l'invention concerne un adénovirus comprenant comme signal d'expression un promoteur chimère comprenant une séquence répondant à EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, le promoteur du gène de la terminale protéine 1 (TPI). Les exemples décrits dans la présente demande montrent bien que ce promoteur chimère est inductible par EBNA1.
Les virus du papillome (notamment le virus HPV 16 et 18) sont responsables de 90 % des cancers du cervix chez la femme et ont été identifiés dans des lésions épithéliales pré-cancéreuses (Riou et al., Lancet 335 (1990) 1 17). Le produit du gène E6 conduit à la formation de tumeurs en diminuant fortement la quantité de p53 sauvage, un anti-oncogène, dans les cellules HPV-positives (Wrede et al., Mol Carcinog. 4 (1991) 171 ) L'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur inductible par le HPV (par exemple la protéine E6) permet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans les cellules tumorales correspondantes.
Il peut encore s'agir de signaux d'expression inactifs dans les cellules normales et actifs dans les cellules tumorales. En particulier, on peut utiliser dans le cadre de la présente invention le promoteur de l'α-foetoprotéine (Alpert E., dans Hepatocellular carcinoma, Okuda & Peters (eds), New York, 1976, 353) ou le promoteur P3 de l'IGF-II (Sussenbach et al , Growth Régulation 2 (1992) 1), qui sont actifs chez l'adulte, uniquement dans les hépatocarcinomes. Il est également possible d'utiliser des promoteurs induits par des hormones dans le cas de tumeurs hormono-dépendantes ou hormonaux associées (tumeur du sein ou de la prostate par exemple).
Comme indiqué ci-avant, différentes configurations peuvent être envisagées pour la réalisation des vecteurs de l'invention. Les vecteurs de l'invention peuvent tout d'abord contenir les deux gènes sous forme d'une entité transcriptionnelle unique. Dans cette configuration, les deux gènes sont contigus, disposés sous le contrôle d'un promoteur unique, et donnent lieu à un ARN prémessager unique. Cette configuration est avantageuse puisqu'elle permet d'utiliser un seul promoteur transcriptionnel pour réguler l'expression des 2 gènes. Par ailleurs, cette entité transcriptionnelle unique peut être incorporée dans le vecteur adénoviral dans les deux orientations possibles.
Les deux gènes peuvent également être placés sous le contrôle de promoteurs transcriptionnels séparés. Cette configuration permet d'obtenir des niveaux d'expression supérieurs, et offre un meilleur contrôle de l'expression des gènes. Dans ce cas, les deux gènes thérapeutiques peuvent être insérés dans la même orientation ou dans les orientations opposées, dans un même site du génome de l'dénovirus ou en des sites différents.
Préférentiellement, les gènes sont insérés, au moins en partie, au niveau des régions El, E3 ou E4 du génome de l'adénovirus. Lorsqu'ils sont insérés en deux sites différents, on préfère dans le cadre de l'invention utiliser les régions El et E3 ou El et E4. Un mode de réalisation particulièrement avantageux est celui dans lesquels deux gènes thérapeutiques sont insérés au niveau de la région El . Les exemples montrent en effet que cette organisation permet une expression élevée des deux gènes, sans interférence entre les deux. L'invention concerne donc également tout adénovirus recombinant comprenant deux gènes d'intérêt thérapeutique insérés au niveau de la région El du génome
Par ailleurs, le gène immunostimulant peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit immunostimulant, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Comme indiqué ci-avant, les adénovirus de la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adénovirus défectifs selon la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par les gènes thérapeutiques. Le caractère défectif des adénovirus de l'invention est un élément important, puisqu'il assure la non dissémination des vecteurs de l'invention après administration.
Dans un mode de réalisation préféré, les adénovirus de l'invention comprennent les séquences ITR et une séquence permettant l'encapsidation, et possèdent une délétion de tout ou partie du gène E 1. Les séquences inversées répétées (ITR) constituent l'origine de réplication des adénovirus. Elles sont localisées aux extrémités 3' et 5' du génome viral (Cf figure 1), d'où elles peuvent être isolées aisément selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. La séquence nucléotidique des séquences ITR des adénovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2) Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, la séquence ITR gauche correspond à la région comprenant les nucléotides 1 à 103 du génome
La séquence d'encapsidation (également désignée séquence Psi) est nécessaire à l'encapsidation de l'ADN viral Cette région doit donc être présente pour permettre la préparation d'adénovirus recombinants défectifs selon l'invention La séquence d'encapsidation est localisée dans le génome des adénovirus, entre l'ITR gauche (5') et le gène El (Cf figure 1) Elle peut être isolée ou synthétisée artificiellement par les techniques classiques de biologie moléculaire La séquence nucléotidiques de la séquence d'encapsidation des adénovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2) Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, la séquence d'encapsidation correspond à la région comprenant les nucléotides 194 à 358 du génome
Plus préférentiellement, les adénovirus de l'invention comprennent les séquences ITR et une séquence permettant l'encapsidation, et possèdent une délétion de tout ou partie des gènes El et E4
Dans un mode particulièrement préféré de réalisation, le génome des adénovirus selon l'invention est délété de tout ou partie des gènes El, E3 et E4, et, encore plus préférentiellement, de tout ou partie des gènes El, E3, L5 et E4
Les adénovirus de l'invention peuvent être préparés à partir d'adénovirus d'origines diverses. Il existe en effet différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable Ainsi, les enseignements décrits dans la présente demande peuvent être aisément reproduits par l'homme du métier pour tout type d'adénovirus.
Plus particulièrement, les adénovirus de l'invention peuvent être d'origine humaine, animale, ou mixte (humaine et animale) Concernant les adénovirus d'origine humaine, on préfère utiliser ceux classés dans le groupe C. Plus préférentiellement, parmi les différents sérotypes d'adénovirus humain, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5).
Comme indiqué plus haut, les adénovirus de l'invention peuvent également être d'origine animale, ou comporter des séquences issues d'adénovirus d'origine animale. La demanderesse a en effet montré que les adénovirus d'origine animale sont capables d'infecter avec une grande efficacité les cellules humaines, et qu'ils sont incapables de se propager dans les cellules humaines dans lesquelles ils ont été testés (Cf demande FR 93 05954). La demanderesse a également montré que les adénovirus d'origine animale ne sont nullement trans-complémentés par des adénovirus d'origine humaine, ce qui élimine tout risque de recombinaison et de propagation in vivo, en présence d'un adénovirus humain, pouvant conduire à la formation d'une particule infectieuse. L'utilisation d'adénovirus ou de régions d'adénovirus d'origine animale est donc particulièrement avantageuse puisque les risques inhérents à l'utilisation de virus comme vecteurs en thérapie génique sont encore plus faibles.
Les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). Plus particulièrement, parmi les adénovirus aviaires, on peut citer les sérotypes 1 à 10 accessibles à l'ATCC, comme par exemple les souches Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-l l (ATCC VR-921) ou encore les souches référencées ATCC VR-831 à 835. Parmi les adénovirus bovins, on peut utiliser les différents sérotypes connus, et notamment ceux disponibles à l'ATCC (types 1 à 8) sous les référencesATCC VR-313, 314, 639-642, 768 et 769. On peut également citer les adénovirus murins FL (ATCC VR-550) et E20308 (ATCC VR- 528), l'adénovirus ovin type 5 (ATCC VR-1343), ou type 6 (ATCC VR-1340); l'adénovirus porcin 5359), ou les adénovirus simiens tels que notamment les adénovirus référencée à l'ATCC sous les numéros VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.
De préférence, parmi les différents adénovirus d'origine animale, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus ou des régions d'adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. Les adénovirus canins ont fait l'objet de nombreuses études structurales. .Ainsi, des cartes de restriction complètes des adénovirus CAV1 et CAV2 ont été décrites dans l'art antérieur (Spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989) 165), et les gènes Ela, E3 ainsi que les séquences ITR ont été clones et séquences (voir notamment Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241, Linné, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525).
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés de différentes façons.
Une première méthode consiste à transfecter l'ADN du virus recombinant défectif préparé in vitro (soit par ligature, soit sous forme de plasmide) dans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en trans toutes les fonctions nécessaires à la complémentation du virus défectif. Ces fonctions sont préférentiellement intégrées dans le génome de la cellule, ce qui permet d'éviter les risques de recombinaison, et confère une stabilité accrue à la lignée cellulaire.
Une seconde approche consiste à co-transfecter dans une lignée cellulaire apppropriée l'ADN du virus recombinant défectif préparé in vitro (soit par ligature, soit sous forme de plasmide) et l'ADN d'un virus helper. Selon cette méthode, il n'est pas nécessaire de disposer d'une lignée cellulaire compétente capable de complémenter toutes les fonctions défectives de l'adénovirus recombinant Une partie de ces fonctions est en effet complémentée par le virus helper. Ce virus helper doit lui-même être défectif et la lignée cellulaire porte en trans les fonctions nécessaires à sa complémentation Parmi les lignées cellulaires utilisables notamment dans le cadre de cette seconde approche, on peut citer notamment la lignée de rein embryonnaire humain 293, les cellules KB, les cellules Hela, MDCK, GHK, etc (Cf exemples).
Ensuite, les vecteurs qui se sont multipliés sont récupérés, purifiés et amplifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
Selon une variante de mise en oeuvre, il est possible de préparer in vitro, soit par ligature, soit sous forme de plasmide, l'ADN du virus recombinant défectif portant les délétions appropriées et les deux gènes thérapeutiques Comme indiqué ci-avant, les vecteurs de l'invention possèdent avantageusement une délétion de tout ou partie de certains gènes viraux, notammment des gènes El, E3, E4 et/ou L5. Cette délétion peut correspondre à tout type de suppression affectant le gène considéré. Il peut s'agir notamment de la suppression de tout ou partie de la région codante dudit gène, et/ou de tout ou partie de la région promotrice de la transcription dudit gène. La suppression est généralement réalisée sur l'ADN du virus recombinant défectif, par exemple par digestion au moyen d'enzymes de restriction appropriées, puis ligature, selon les techniques de biologie moléculaire, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les gènes thérapeutiques peuvent ensuite être insérés dans cet ADN par clivage enzymatique puis ligature, au niveau des régions sélectionnées et dans l'orientation choisie. L'ADN ainsi obtenu, qui porte donc les délétions appropriées et les deux gènes thérapeutiques, permet de générer directement l'adénovirus recombinant défectif portant lesdites délétions et gènes thérapeutiques Cette première variante est particulièrement adaptée à la réalisation d'adénovirus recombinants dans lesquels les gènes thérapeutiques sont disposés sous forme d'une unité transcriptionnelle unique ou, sous contrôle de promoteurs séparés mais insérés en un même site du génome
Il est également possible de préparer le virus recombinant en deux étapes, permettant l'introduction successive des deux gènes thérapeutiques Ainsi, l'ADN d'un premier virus recombinant portant les délétions appropriées (ou une partie desdites délétions) et un des gènes thérapeutiques est construit, par ligature ou sous forme de plasmide Cet ADN est ensuite utilisé pour générer un premier virus recombinant portant lesdites délétions et un gène thérapeutique L'ADN de ce premier virus est ensuite isolé et co-transfecté avec un second plasmide ou l'ADN d'un second virus recombinant défectif portant le deuxième gène thérapeutique, les délétions appropriées (partie non présente sur le premier virus), et une région permettant la recombinaison homologue Cette deuxième étape génère ainsi le virus recombinant défectif portant les deux gènes thérapeutiques Cette variante de préparation est particulièrement appropriée pour la préparation de virus recombinants portant deux gènes thérapeutiques insérés en deux régions différentes du génome de l'adénovirus.
La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 5 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature
Les adénovirus de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies. Ils sont particulièrement avantageux pour le traitement des pathologies hyperprolifératives (cancers, resténose, etc), par injection directe au niveau du site concerné. A cet égard, la présente invention concerne également une méthode pour la destruction de cellules prolifératives comprenant l'infection desdites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec un vecteur adénoviral tel que défini ci-dessus. Dans le cas où le gène suicide est un gène conférant une sensibilité à un agent thérapeutique, la méthode de destruction selon l'invention comprend ensuite le traitement des cellules par ledit agent thérapeutique. Pour la mise en oeuvre de cette méthode, l'invention a également pour objet les produits comprenant un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant dans lequel le gène suicide est un gène conférant une sensibilité à un agent thérapeutique; et ledit agent thérapeutique, comme produit de combinaison pour une utilisation simultannée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement des pathologies hyperprolifératives. Plus particulièrement, le gène suicide est un gène thymidine kinase et l'agent thérapeutique est le gancyclovir ou l'acyclovir ou un analogue.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures Figure 1 Organisation génétique de l'adénovirus Ad5. La séquence complète de l'Ad5 est disponible sur base de données et permet à l'homme du métier de sélectionner ou de créer tout site de restriction, et ainsi d'isoler toute région du génome Figure 2 Carte de restriction de l'adénovirus CAV2 souche Manhattan (d'après Spibey et al précité)
Figure 3 Représentation du vecteur pONTtk Figure 4 Représentation du vecteur pRSVtk
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorese sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc . sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T et al , "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y , 1982, Ausubel F M et al (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons. New York, 1987]
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories)
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S 1
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al [Nucleic Acids Res H (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
[Polymérase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-
1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Lignées cellulaires utilisées
Dans les exemples qui suivent, les lignées cellulaires suivantes ont ou peuvent être utilisées :
- Lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) Cette lignée contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de l'adénovirus humain Ad5 (12 %). - Lignée de cellules humaines KB : Issue d'un carcinome épidermique humain, cette lignée est accessible à l'ATCC (réf. CCL17) ainsi que les conditions permettant sa culture.
- Lignée de cellules humaines Hela : Issue d'un carcinome de l'épithelium humain, cette lignée est accessible à l'ATCC (réf. CCL2) ainsi que les conditions permettant sa culture.
- Lignée de cellules canines MDCK : Les conditions de culture des cellules MDCK ont été décrites notamment par Macatney et al.. Science 44 (1988) 9.
- Lignée de cellules gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624). Cette lignée est constituée de cellules Hela portant le gène E2 d'adénovirus sous le contrôle du LTR de MMTV.
EXEMPLES
Exemple 1. Construction d'adénovirus recombinants défectifs comprenant le gène TK sous le contrôle d'un promoteur cancer-spécifique et le gène p53 sous le contrôle du promoteur CMV.
Ces adénovirus ont été construits par recombinaison homologue entre un plasmide portant la partie gauche de l'adénovirus Ad5, les deux gènes thérapeutiques et une région de l'adénovirus Ad5 (correspondant à la protéine IX) et l'ADN d'un adénovirus défectif portant différentes délétions.
1. Construction du vecteur pONT-tk
1.1. Construction du plasmide p7tkl Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la phase ouverte de lecture du gène tk de 1 131 paires de bases (ATG 1 14-1 16 et codon stop TGA 1242-1244), insérée dans un multisite de clonage
Le fragment BglII-NcoI contenant le gène de la thymidine kinase (tk) du virus herpès simplex type 1 a été isolé à partir du plasmide pHSV-106 (commercialisé par Gibco BRL), réparé par l'action du fragment klenow puis inséré au site Smal du plasmide pGEM7zf(+) (commercialise par Promega) Les sites Smal et BglII sont détruits lors de cette étape, le site Ncol est conservé
Le plasmide obtenu a été désigné p7tkl
1.2. Construction du plasmide pONTl
Cet exemple décrit la construction d'un plasmide contenant un promoteur chimère constitué d'une séquence nécessaire à la transactivation par l'antigène EBNA1 et du promoteur TPI du virus EBV
Le fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191 ) du virus EBV a été isolé à partir de la souche B95-8 La séquence complète du virus EBV a été décrite par Baer et al. (Nature 310 (1984) 207) Ce fragment contient les séquences nécessaires à la transactivation par l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) (D Reisman & B. Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol 6 pp 3838-3846) Ce fragment a ensuite été fusionné au fragment Nrul(166 241)-PstI(166 559) de l'EBV B95-8 (le site PstI a été digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TPI . Le promoteur chimère ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluescript II SK.
Le plasmide obtenu a été désigné pONT 1
1.3. Construction du plasmide pONTtk Le plasmide pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) clone dans le plasmide p7tkl, sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-RE/TP1 clone dans le plasmide pONTl Pour construire ce plasmide, le fragment BamHI-XhoI de pONTl qui contient le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2, et le fragment
Xhol-Clal de p7tkl qui contient la phase ouverte de lecture de tk ont été clones aux sites BamHI (478) et Clal (4550) du plasmide pAd.RSVβgal. Le plasmide pAd.RSVβGal contient, dans l'orientation 5'->3',
- le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant : la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur El A;
- le gène codant pour la β-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSVβGal et l'adénovirus dl324. Le plasmide pAd.RSVβGal a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J Clin Invest 90 (1992) 626). Tous les sites de clonage sont conservés. Le plasmide obtenu a été désigné pONTtk (figure 3).
2. Construction du plasmide pONTtkCMVp53
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur portant la partie gauche de l'adénovirus Ad5 (comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation et le début de la région El), le gène tk sous contrôle du promoteur ONT, le gène p53 sous contrôle du promoteur CMV et un second fragment du génome de l'Ad5 (protéine pIX) permettant la recombinaison homologue en vue de la génération de l'adénovirus recombinant (Cf exemple 1.3 ).
Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pONTtk, par insertion, en aval du gène tk et dans la même orientation, d'un fragment portant le gène p53 sous contrôle du promoteur CMV et suivi du site de polyadénylation du virus SV40. Plus précisément, le fragment inséré comprend :
- une région promotrice d'origine virale qui correspond au promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV). Cette région est entourée dans le vecteur de sites de restrictions uniques EcoRI-SphI à la jonction CMV/pONTtk et BamHI à la jonction CMV / p53. La présence de sites uniques flanquant la région promotrice permet de remplacer la région CMV par tout autre promoteur. Une deuxième série de vecteurs est ainsi obtenue dans laquelle le gène p53 est placé sous le contrôle d'un promoteur inductible : le promoteur de la metallothionine, inductible par les métaux lourds (cadnium et zinc).
- une séquence de 1173 pb correspondant à l'ADNc codant pour la protéine p53 de souris sous sa forme sauvage (Zakut-Houri et al., Nature 36 (1983) 594). Dans cette construction, le gène suppresseur est sous forme d'ADN c, c'est-à-dire dépourvue d'introns. Ceci permet notamment de réduire la taille du vecteur. Par ailleurs, il a été vérifié que les niveaux d'expression obtenus sont comparables en présence ou en l'absence d'introns - le signal de polyadénylation des gènes tardifs du virus SV40, qui correspond à un signal de polyadénylation très efficace. Deux sites de restriction uniques Sali et HindIII sont situés en aval du signal de polyadénylation
Le vecteur obtenu a été désigné pONTtkCMVp53
Il est entendu que l'insertion dudit fragment peut être effectuée de manière similaire dans l'orientation inverse, conduisant à un plasmide dans lequel le gène tk et le gène p53 sont dans les orientations opposées (pONTtkCMVp53inv)
3. Construction des adénovirus recombinants
3.1. Construction d'un adénovirus recombinant délété dans la région El, portant les deux gènes thérapeutiques insérés dans la même orientation, au niveau de la région El
Le vecteur pONTtkCMVp53 a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient dans le gène El, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (El A et El B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad-ONTtkCMVp53,ΔEl est obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus Ad-RSVβgal (Cf Stratford- Perricaudet et al citée plus haut) et le vecteur pONTtkCMVp53, selon le protocole suivant : le plasmide pONTtkCMVp53, linéarisé par Xmnl, et l'adénovirus Ad- RSVβgal, linéarisé par l'enzyme Clal, sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont ensuite sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-ONT-tkCMVp53,ΔEl peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol
3 2 Construction d'un adénovirus recombinant délété dans la région El et E3, portant les deux gènes thérapeutiques insérés dans la même orientation, au niveau de la région El
Le vecteur pONTtkCMVp53 a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient dans les gènes El et E3, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en irons les fonctions codées par les régions El (El A et El B) d'adénovirus
Plus précisément, l'adénovirus Ad-ONTtkCMVp53,ΔEl,ΔE3 est obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 (Thimmappaya et al , Cell 3 1 ( 1982) 543) et le vecteur pONTtkCMVp53, selon le protocole suivant le plasmide pONTtkCMVp53, linéarisé par Xmnl, et l'adénovirus Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme Clal, sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont ensuite sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit a un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 10-° pfu/ml
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al , Virology 52 (1973) 456) L'adénovirus Ad-ONT-tkCMVp53,ΔEl,ΔE3 peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol.
3.3. Construction d'adénovirus dans lesquels les gènes tk et p53 sont positionnés dans les orientations opposées
En suivant les protocoles décrits dans les exemples 3.1. et 3.2. ci-dessus, des adénovirus dans lesquels les gènes tk et p53 sont positionnés dans les orientations opposées peuvent être construits en partant du plasmide pONTtkCMVp53inv. Exemple 2. Construction d'adénovirus recombinants défectifs comprenant le gène TK sous le contrôle du promoteur du LTR du virus RSV et le gène p53 sous le contrôle du promoteur CMV.
Ces adénovirus ont été construits par recombinaison homologue entre un plasmide portant la partie gauche de l'adénovirus Ad5, les deux gènes thérapeutiques et une région de l'adénovirus Ad5 (correspondant à la protéine IX) et l'ADN d'un adénovirus défectif portant différentes délétions.
1. Construction du vecteur pRSVtk
Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pONTtk (exemple 1 1), par substitution du promoteur transactivable par EBNA1 par le promoteur du LTR du RSV. Pour cela, le promoteur RSV a été isolé sous forme d'un fragment BamHI-Sall à partir du plasmide pAd.RSV.βgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), puis clone aux sitesBamHI(478) et Sall(1700) du plasmide pONTtk. Le plasmide résultant a été désigné pRSVtk (figure 4).
2. Construction du plasmide pRSVtkCMVp53
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur portant la partie gauche de l'adénovirus Ad5 (comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation et le début de la région El), le gène tk sous contrôle du promoteur RSV, le gène p53 sous contrôle du promoteur CMV et un second fragment du génome de l'Ad5 (protéine pIX) permettant la recombinaison homologue en vue de la génération de l'adénovirus recombinant (Cf exemple 2.3 ).
Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pRSVtk, par insertion, en aval du gène tk, d'un fragment portant le gène p53 sous contrôle du promoteur CMV et suivi du site de polyadénylation du virus SV40. Plus précisément, le fragment inséré comprend :
- une région promotrice d'origine virale qui correspond au promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV). Cette région est entourée dans le vecteur de sites de restrictions uniques EcoRI-Sphl à la jonction CMV/pONTtk et BamHI à la jonction
CMV / p53. La présence de sites uniques flanquant la région promotrice permet de remplacer la région CMV par tout autre promoteur. Une deuxième série de vecteurs est ainsi obtenue dans laquelle le gène p53 est placé sous le contrôle d'un promoteur inductible : le promoteur de la metallothionine, inductible par les métaux lourds (cadnium et zinc).
- une séquence de 1 173 pb correspondant à l'ADNc codant pour la protéine p53 de souris sous sa forme sauvage (Zakut-Houri et al., Nature 36 (1983) 594). Dans cette construction, le gène suppresseur est sous forme d'ADNc, c'est-à-dire dépourvue d'introns. Ceci permet notamment de réduire la taille du vecteur. Par ailleurs, il a été vérifié que les niveaux d'expression obtenus sont comparables en présence ou en l'absence d'introns. - le signal de polyadénylation des gènes tardifs du virus SV40, qui correspond à un signal de polyadénylation très efficace Deux sites de restriction uniques Sali et HindIII sont situés en aval du signal de polyadénylation
Le vecteur obtenu a été désigné pRSVtkCMVp53
3. Construction des adénovirus recombinants
3 1 Construction d'un adénovirus recombinant délété dans la région El, portant les deux gènes thérapeutiques insérés dans la même orientation, au niveau de la région El . Cet adénovirus est construit selon le protocole décrit dans l'exemple 1(3.1 ).
L'adénovirus Ad-RSV-tkCMVp53,ΔEl ainsi obtenu peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol.
3.2. Construction d'un adénovirus recombinant délété dans les régions El et E3, portant les deux gènes thérapeutiques insérés dans la même orientation, au niveau de la région El .
Cet adénovirus est construit selon le protocole décrit dans l'exemple 1(3.2.). L'adénovirus Ad-RSV-tkCMVp53,ΔEl,ΔE3 ainsi obtenu peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol.
Exemple 3. Construction d'adénovirus recombinants défectifs comprenant le gène TK sous le contrôle du promoteur du LTR du virus RSV et le gène de l'interleukine-2 sous le contrôle du même promoteur. Ces adénovirus ont été construits par recombinaison homologue entre un plasmide portant la partie gauche de l'adénovirus Ad5, les deux gènes thérapeutiques et une région de l'adénovirus Ad5 (correspondant à la protéine IX) et l'ADN d'un adénovirus défectif portant différentes délétions.
1. Construction du plasmide pRSVtkRSVIL-2
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur portant la partie gauche de l'adénovirus Ad5 (comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation et le début de la région El ), le gène tk sous contrôle du promoteur RSV, le gène de l'interleukine-2 sous contrôle du promoteur RSV et un second fragment du génome de l'Ad5 (protéine pIX) permettant la recombinaison homologue en vue de la génération de l'adénovirus recombinant (Cf exemple 3.2 ).
Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pRSVtk (Cf exemple2), par insertion, en aval du gène tk, d'un fragment portant le gène de l'interleukine-2 sous contrôle du promoteur RSV et suivi du site de polyadénylation du virus SV40. Plus précisément, le fragment inséré comprend :
- le promoteur du LTR du virus RSV, isolé sous forme d'un fragment BamHI-SalI à partir du plasmide pAd.RSV.βgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626),
- une séquence correspondant à l'ADNc codant pour l'interleukine-2 humaine (EP91 539) Dans cette construction, le gène thérapeutique est sous forme d'ADNc.
- le signal de polyadénylation des gènes tardifs du virus SV40, qui correspond à un signal de polyadénylation très efficace. Deux sites de restriction uniques Sali et HindIII sont situés en aval du signal de polyadénylation.
Le vecteur obtenu a été désigné pRSVtkRSVIL-2.
2 Construction des adénovirus recombinants
Deux types d'adénovirus recombinants sont construits selon le protocole décrit dans l'exemple 1 ou 2. Ces adénovirus portent les deux gènes thérapeutiques insérés dans la même orientation, au niveau de la région El et présentent une délétion dans la région El ou dans les régions El et E3. Les adénovirus Ad-RSV-tkRSVIL-2,ΔEl et Ad-RSV-tkRSVTL-2,ΔEl,ΔE3 ainsi obtenus peuvent être conservés à -80°C dans 20 % de glycérol.
Exemple 4. Construction d'adénovirus recombinants défectifs comprenant le gène TK et le gène codant pour le facteur de stimulation des colonies de granocytes et macrophages (GM-CSF).
En suivant les protocoles décrits dans les exemples précédents, des adénovirus défectifs portant le gène tk (sous contrôle du promoteur ONT ou RSV par exemple) et le gène du GM-CSF sous contrôle de son propre promoteur ou du promoteur RSV notamment peuvent être construits
Pour cela, un vecteur intermédiaire portant les deux gènes peut être construit à partir du vecteur pONTtk ou pRSVtk par insertion, dans la même orientation ou dans l'orientation inverse, d'un fragment portant le gène du GM-CSF sous contrôle du promoteur. Le gène codant pour le GM-CSF et des constructions le contenant ont été décrits notamment dans la demande WO86/03225.
Exemple 5. Construction d'adénovirus recombinants défectifs comprenant deux gènes d'intérêt, l'un inséré au niveau de la région El et l'autre inséré au niveau de la région E3.
Ces adénovirus sont construits par recombinaison homologue entre un l'ADN d'un premier virus défectif portant le premier gène inséré au niveau de la région E 1 et l'ADN d'un deuxième adénovirus défectif portant le deuxième gène inséré au niveau de la région E3.
1. Construction du virus défectif portant le gène inséré au niveau de la région E3
Ce virus est construit à partir de l'adénovirus Addl324 (Thimmappaya et al.,
Cell 31 (1982) 543). Ce virus porte une délétion au niveau de la région El et E3 (fragment Xbal-EcoRI délété). L'ADN du virus Addl324 a été isolé et purifié. Cet ADN est ensuite coupé par les enzymes Xbal et EcoRI. Un fragment Xbal-EcoRI est ensuite issu du plasmide pRSVtk portant la séquence codant pour la thymidine kinase sous contrôle du promoteur RSV, puis inséré au niveau desits sites dans l'ADN de Addl324 ouvert comme précédemment. L'ADN ainsi obtenu comporte donc une délétion au niveau de la région El et le gène TK inséré au niveau de la région E3.
2. Construction des adénovirus portant les deux gènes. L'ADN du virus recombinant préparé ci-dessus et l'ADN d'un adénovirus recombinant portant un gène immunostimulant ou suppresseur de tumeurs inséré au niveau de la région El, linéarisé par BamHI, sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont ensuite sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 101 () pfu/ml
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham ét al , Virology 52 (1973) 456)

Claims

REVENDICATIONS
1. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il comprend deux gènes thérapeutiques, le premier étant un gène suicide et le second un gène immunostimulant ou un gène suppresseur de tumeurs.
2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que les deux gènes constituent une entité transcriptionnelle unique sous le contrôle d'un promoteur unique
3 Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que les deux gènes sont sous le contrôle de promoteurs transcriptionnels séparés
4. Adénovirus selon la revendication 3 caractérisé en ce que les deux gènes sont insérés dans la même orientation.
5 Adénovirus selon la revendication 3 caractérisé en ce que les deux gènes sont insérés dans les orientations opposées.
6 Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que les deux gènes thérapeutiques sont insérés dans un même site du génome, de préférence au niveau des régions El , E3 ou E4.
7. Adénovirus selon la revendication 6 caractérisé en ce que les deux gènes sont insérés au niveau de la région El .
8. Adénovirus selon l'une des revendications 1, 3, 4 et 5 caractérisé en ce que les deux gènes thérapeutiques sont insérés en des sites différents du génome.
9. Adénovirus selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'un des gènes est inséré au niveau de la région El et l'autre au niveau de la région E3 ou E4.
10. Adénovirus recombinant défectif selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'il comprend les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, et en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes El et E4.
1 1. Adénovirus selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comprend les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, et en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes El, E3 et E4.
12. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 1 1 caractérisé en ce que son génome est délété de tout ou partie des gènes El, E3, L5 et E4
13. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est d'origine humaine, animale, ou mixte
14 Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine humaine sont choisis parmi ceux classés dans le groupe C, de préférence parmi les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5)
15 Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine animale sont choisis parmi les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, ovine, porcine, aviaire et simienne.
16 Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène suicide est un gène de la thymidine kinase, de préférence le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès HSV-I.
17 Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour la thymidine kinase et un gène suppresseur de tumeurs
18 Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour la thymidine kinase et un gène codant pour une lymphokine.
19. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès et le gène p53 sauvage (Ad-TK- p53)
20. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès et un gène codant pour l'interleukine-2 (Ad-TK-IL2).
21. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès et un gène codant pour le GM- CSF (Ad-TK-GM-CSF).
22. Adénovirus selon les revendications 2 ou 3 caractérisé en ce que le ou les promoteurs transcriptionnels sont choisis parmi les promoteurs mammifères, eucaryotes ou viraux.
23. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le gène immunostimulant comporte une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible
24. Composition pharmaceutique comprenant au moins un adénovirus recombinant défectif selon l'une des revendications 1 à 23
25. Composition pharmaceutique selon la revendication 24 comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable
26. Produits comprenant : - un ou plusieurs adénovirus recombinants tels que définis dans les revendication 1 à 23 dans lequel le gène suicide est un gène conférant une sensibilité à un agent thérapeutique, et,
- ledit agent thérapeutique comme produit de combinaison pour une utilisation simultannée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement des pathologies hyperprolifératives
27. Produits selon la revendication 26 caractérisé en ce que le gène suicide est un gène thymidine kinase et l'agent thérapeutique est le gancyclovir ou l'acyclovir ou un analogue.
28. Adénovirus recombinant défectif comprenant deux gènes d'intérêt thérapeutique insérés au niveau de la région El du génome.
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