EP0729516A1 - Adenovirus recombinants pour la therapie genique des cancers - Google Patents

Adenovirus recombinants pour la therapie genique des cancers

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Publication number
EP0729516A1
EP0729516A1 EP95900795A EP95900795A EP0729516A1 EP 0729516 A1 EP0729516 A1 EP 0729516A1 EP 95900795 A EP95900795 A EP 95900795A EP 95900795 A EP95900795 A EP 95900795A EP 0729516 A1 EP0729516 A1 EP 0729516A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
adenovirus
adenovirus according
promoter
expression
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95900795A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jean-François DEDIEU
Aude Le Roux
Michel Perricaudet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
Publication of EP0729516A1 publication Critical patent/EP0729516A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses

Definitions

  • the present invention relates to recombinant vectors of viral origin and their use for the treatment of cancers. More particularly, it relates to recombinant adenoviruses comprising a heterologous DNA sequence under the control of expression signals active specifically in tumor cells. The invention also relates to the preparation of these vectors, the pharmaceutical compositions containing them and their use in gene therapy.
  • Gene therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) by introducing genetic information into the affected cell or organ.
  • This genetic information can be introduced either in vitro into a cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the organism, or directly in vivo into the appropriate tissue.
  • Different techniques have been described for the introduction of this genetic information, among which various transfection techniques involving complexes of DNA and DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol.
  • viruses as vectors for gene transfer has emerged as a promising alternative to these physical transfection techniques.
  • retroviruses RSV, HMS, MMS, etc.
  • the HSV virus adeno-associated viruses
  • adenoviruses adenoviruses
  • EP 259 212 describes the preparation of vaccines intended for the treatment of cancers, comprising a modified virus capable of expressing a tumor-specific antigen, making it possible to generate an immune response against these cells.
  • application WO91 / 15580 describes the construction of retroviruses containing a gene coding for a ribozyme, the expression of which in cell culture can make it possible to destroy an mRNA of an oncogene. It is also known from the application WO 93/10814 to use vectors expressing immunogenic, non-tumorigenic forms of cellular oncogen involved in the development of cancers. Application WO 93/02556 finally describes the use of cells taken from the tumor, genetically modified ex vivo by the introduction of a toxic gene, then re-administered to the patient. However, this approach requires surgical steps, and moreover, the stability of the toxic gene in the transformed cell ex vivo has not been demonstrated.
  • the present invention provides an advantageous solution to these problems. It indeed provides vectors capable of directing the expression of a given gene selectively in tumor cells.
  • the present invention is based in particular on the demonstration that certain transcription control signals are active (or activated) specifically in tumor cells, and that they can be used for the selective expression of heterologous genes.
  • adenoviruses constitute particularly effective vectors for the transfer and expression of therapeutic genes in tumor cells.
  • adenoviruses have the advantage of not integrating into the genome of the cells they infect, of staying there in a very stable manner which makes it possible to obtain a lasting therapeutic effect, and of having a spectrum very broad host, which allows application to the treatment of cancers affecting all types of cells.
  • adenoviruses can be obtained with high titer, which allows work at high multiplicities of infection, and introduce multiple copies of the heterologous gene per cell.
  • the invention is also based on the demonstration that adenovirus type viruses are capable of incorporating heterologous sequences comprising such promoters, of transferring these sequences into tumor cells, and of expressing desired genes under the control of signals specific directly to the level of tumors.
  • a first object of the invention therefore resides in a defective recombinant adenovirus comprising a heterologous DNA sequence under the control of expression signals active specifically in tumor cells.
  • the invention also relates to the use of such a defective recombinant adenovirus for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment or prevention of cancers.
  • the defective adenoviruses according to the invention are adenoviruses incapable of replicating autonomously in the target cell.
  • the genome of the defective adenoviruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the inserted gene.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • adenovirus There are different serotypes of adenovirus, the structure and properties of which vary somewhat. However, these viruses are not pathogenic for humans, especially non-immunocompromised people. Among these serotypes, it is preferred to use, within the framework of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application FR 93 05954).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the adenoviruses of the invention carry a heterologous DNA sequence.
  • This heterologous DNA sequence allows the expression of a biological activity sought in tumor cells.
  • the heterologous DNA sequence comprises at least one gene chosen from a gene toxic to the infected cell, a gene whose expression makes it possible to at least partially inhibit cell division, or a gene coding for a lymphokine.
  • the adenoviruses of the invention can also comprise several of these sequences, in order to obtain in certain cases a synergistic anti-tumor effect.
  • the genes toxic to the infected cell mention may preferably be made of genes whose expression product gives the cell sensitivity to a therapeutic agent. More preferably, the toxic gene is chosen from the thymidine kinase gene, the expression product of which gives mammalian cells sensitivity to certain therapeutic agents such as ganciclovir or acyclovir.
  • the herpes simplex virus thymidine kinase is capable of phosphorylating nucleoside analogs such as acvclovir and ganciclovir. These modified molecules can be incorporated into a DNA chain in the process of elongation, which results in the cessation of DNA synthesis, leading to cell death (FL Moolten, Cancer Res. 46 (1986) 5276 ).
  • hTK HSV-1 human herpes virus thymidine kinase gene
  • cytosine deaminase gene the expression product of which confers on mammalian cells a sensitivity to 5-fluorocytosine (5-FC).
  • 5-FC 5-fluorocytosine
  • the genes whose expression makes it possible to at least partially inhibit cell division there may be mentioned more particularly the tumor suppressor (or anti-oncogene) genes or any active derivative thereof; the antisense sequences or the ribozymes, the expression of which in the target cell makes it possible to at least partially inhibit the expression of genes promoting cell division.
  • tumor suppressor genes which can be used in the context of the present invention, there may be mentioned more particularly the p53 gene (Baker et al., Science 244 (1989) 217); the Rb gene (Friend et al., Nature 323 (1986) 643; Huang et al., Science 242 (1988) 1563), the rap 1A gene (Kitayama et al., Cell 56 (1989) 77); the DCC gene (Fearon et al., Science 247 (1990) 49), the k-rev2 and k-rev3 genes; or any other tumor suppressor gene described in the literature (see example WO 91/15580).
  • the heterologous DNA sequence can also comprise an antisense sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes promoting cell proliferation. This control can intervene at the level of transcription, splicing of the premessager, degradation of the messenger, its translation into protein, or post-translational modifications.
  • the heterologous DNA sequence comprises a gene coding for an antisense RNA capable of controlling the translation of a target mRNA (EP 140 308).
  • antisense sequences which can be used in the context of the invention, there may be mentioned more particularly any antisense sequence making it possible to reduce the production levels of ras, myc, fos, c-erb B oncogenes, etc.
  • the gene coding for lymphokine generally comprises, upstream of the coding sequence, a signal sequence directing the polypeptide synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the lymphokine, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • the heterologous DNA sequence is placed under the control of expression signals active specifically in tumor cells.
  • the gene used is only expressed and produces its effect when the virus has actually infected a tumor cell.
  • these are expression signals induced by or active in the presence of viruses responsible for or associated with tumors. Even more preferably, it is used in the context of the present invention an expression signal inducible by the Epstein-Barr virus (EBV) or by the papilloma virus.
  • EBV Epstein-Barr virus
  • Epstein-Barr virus is associated with two types of human cancer: Burkitt's lymphoma and nasopharyngeal cancer.
  • the use of a recombinant adenovirus comprising a toxic gene under the control of a promoter inducible by EBV advantageously makes it possible to specifically express this toxic gene in tumor cells of the nasopharynx.
  • EBNA1 nuclear antigen is regularly present, which is involved in the maintenance of the viral genome in cells infected with EBV in latent phase, and which activates the viral promoter BCR2.
  • a particular object of the invention therefore resides in the use, for the specific expression of a gene in nasopharyngeal cancer cells, of a sequence responding to EBNA1 (EBNA1-RE: EBNA1 "responsive element").
  • the invention relates to an adenovirus comprising, as expression signal, a chimeric promoter comprising a sequence responding to EBNA1 fused upstream of another viral promoter, the promoter of the terminal protein 1 gene (TPI).
  • TPI terminal protein 1 gene
  • Papilloma viruses are responsible for 90% of cervical cancer in women and have been identified in pre-cancerous epithelial lesions (Riou et al., Lancet 335 (1990) 117).
  • the E6 gene product leads to the formation of tumors by greatly reducing the amount of wild-type p53, an anti-oncogene, in HPV-positive cells (Wrede et al., Mol. Carcinog. 4 (1991) 171).
  • the use of a recombinant adenovirus comprising a toxic gene under the control of a promoter inducible by HPV advantageously makes it possible to express this toxic gene specifically in the corresponding tumor cells.
  • ⁇ -fetoprotein promoter Alpha-fetoprotein promoter
  • P3 promoter e.g., IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, Lignin, Lignin, Lignin, Lignin, Lignin, ase, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12,
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia the heterologous DNA sequence. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%).
  • Strategies for constructing vectors derived from adenoviruses have also been described in applications No. FR 93 05954 and
  • the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant adenoviruses as described above.
  • the pharmaceutical compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for a formulation directly injectable into the tumors to be treated. They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes. Direct injection into the tumor to be treated is advantageous because it allows the therapeutic effect to be concentrated in the affected tissues. However, it is also possible to use pharmaceutical compositions formulated for topical, oral, parenteral, intra-nasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • adenoviruses recombinants according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 14 pfu / ml, and preferably 10 6 to 10 10 pfu / ml.
  • pfu plaque forming unit
  • plaque forming unit corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 48 hours, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the present invention thus provides a very effective means for the treatment or prevention of cancers. It is particularly suitable for the treatment of cancers of the nasopharynx or hepatocarcinomas.
  • this treatment can concern both humans and any animal such as sheep, cattle, domestic animals (dogs, cats, etc.), horses, fish, etc.
  • Figure 1 Representation of the vector pONT-tk
  • Figure 2 Representation of the vector pONT- ⁇ -gal
  • the plasmids of the pBR322, pUC type and the phages of the Ml 3 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, phenol extracts or by a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of ADX ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations.
  • the filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease SI.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham.
  • Example 1 Construction of the Ad-ONT-tk vector carrying the tk gene under the control of a chimeric promoter EBNA1-RE / TP1 (FIG. 1).
  • This example describes the construction of a recombinant adenovirus comprising the thymidine kinase gene of the herpes simplex virus (tk) under the control of a promoter specifically active in cells infected with the EBV virus (chimeric promoter EBNA1-RE TP1).
  • This example describes the construction of the plasmid p7tkl containing the open reading phase of the tk gene of 1131 base pairs (ATG 114-116 and stop codon TGA 1242-1244), inserted into a cloning multisite.
  • the BglII-NcoI fragment containing the thymidine kinase (tk) gene of the herpes simplex virus type 1 was isolated from the plasmid pHSV-106 (marketed by Gibco BRL), repaired by the action of the klenow fragment and then inserted into the site. Smal of plasmid pGEM7zf (+) (marketed by Promega). The Smal and BglII sites are destroyed during this step, the Ncol site is preserved. The plasmid obtained was designated p7tkl.
  • the EcoRI (7315) -SmaI (8191) fragment of the EBV virus was isolated from the B95-8 strain. The complete sequence of the EBV virus has been described by Baer et al. (Nature 310 (1984) 207). This fragment contains the sequences necessary for transactivation by nuclear antigen 1 (EBNA1) (D. Reisman & B. Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol. 6 pp. 3838-3846). This fragment was then fused to the Nrul (166,241) -PstI (166,559) fragment of EBV B95-8 (the PstI site was digested with T4 polymerase), containing the TPI promoter. The chimeric promoter thus obtained was then inserted into the multisite for cloning the plasmid pBluescript II SK.
  • EBNA1 nuclear antigen 1
  • the plasmid obtained was designated pONTl.
  • the plasmid pONTtk contains the thymidine kinase gene of the herpes simplex virus (tk) cloned in the plasmid p7tkl, under the control of the chimeric promoter EBNA1-RE / TP1 cloned in the plasmid pONTl.
  • plasmid pAd.RSV ⁇ gal contains, in the orientation 5 '-> 3',
  • the PvuII fragment corresponding to the left end of the Ad5 adenovirus comprising: the ITR sequence, the origin of replication, the packaging signals and the E1A amplifier; - the gene coding for ⁇ -galactosidase under the control of the RSV promoter
  • the plasmid obtained was designated pONTtk ( Figure 1).
  • the vector pONTtk was linearized and cotransfected with a deficient adenoviral vector, in helper cells (line 293) providing in trans the functions coded by the El regions (El A and E11B) of adenovirus.
  • the adenovirus Ad-ONT-tk was obtained by homologous in vivo recombination between the mutant adenovirus Ad-dl324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) and the vector pONTtk, according to the following protocol: the plasmid pONTtk, linearized by Xmnl, and the adenovirus dl324, linearized by the enzyme ClaI, were cotransfected in line 293 in the presence of calcium phosphate, to allow homologous recombination. The recombinant adenoviruses thus generated were selected by plaque purification.
  • the DNA of the recombinant adenovirus was amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titre of approximately 10 10 pfu / ml.
  • the viral particles are generally purified by centrifugation on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
  • the Ad-ONT-tk adenovirus can be stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • This example describes the construction of a recombinant adenovirus comprising the E.coli beta-galactosidase gene ( ⁇ gal) under the control of a promoter specifically active in cells infected with the EBV virus (chimeric promoter EBNA1-RE / TP1).
  • the Xba ⁇ - (Hind ⁇ II) fragment of the plasmid pONTl which contains the chimeric promoter transactivated by EBNA-1 and EBNA-2 and the (Stul) -Kpnl fragment of the plasmid pAd.RSV ⁇ gal which contains the ⁇ -galactosidase gene have been cloned to Xbal sites
  • the vector pONT- ⁇ gal obtained in example 2.1 was used, by homologous recombination according to the protocol described in example 1.4., To prepare a recombinant adenovirus comprising the gene of oli beta-galactosidase ( ⁇ gal) under the control of the chimeric promoter EBNAl-RE / TPl.
  • the Ad-ONTl- ⁇ gal adenovirus thus obtained can be stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • This example describes the construction of a vector comprising the chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene under the control of a promoter specifically active in cells infected with the EBV virus (chimeric promoter EBNAl-RE / TP1).
  • CAT chloramphenicol acetyl transferase
  • NruI (166241) -PstI (1665S9) from EBV This fragment was then fused to the CAT gene, and inserted, in the form of a NruI-BamHI fragment, into the plasmid pGem7ZF (Promega).
  • the resulting plasmid was designated pTP1-CAT.
  • the NruI-BamHI fragment of the plasmid pTP1-CAT was then fused, downstream of the EcoRI (7315) - Smal (8191) fragment of the EBV strain B95-8, containing the sequences necessary for transactivation by EBNA1 (cf. example 1.2 .).
  • the fragment obtained comprising the CAT gene under the control of the chimeric promoter EBNAl-RE / TP1, was inserted at the EcoRI and BamHI sites of the plasmid pBluescript SK to generate the plasmid pONT-CAT.
  • a plasmid has also been constructed in which the response elements to the TNA promoter EBNA2 antigen have been deleted.
  • the TPI promoter was isolated in the form of the Nrul (166375) -Pstl (1 66559) fragment of EBV. This plasmid was designated pOST-CAT.
  • the pONT-CAT, pOST-CAT and pTP1-CAT vectors were transfected by electroporation into a line of EBV " B lymphocytes (DG75 cells), either alone, either in the presence of expression vectors of the viral antigens EBNAl, EBNA2 or EBNAl + EBNA2. 48 hours after transfection, the cells were lyzed by freezing / thawing, the cellular debris eliminated, then the extracts obtained were normalized according to the quantity of proteins. The CAT activity was then assayed in these extracts by enzymatic assay. The results obtained are as follows:

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Abstract

La présente invention concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN hétérologue sous le contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales, leur préparation, et leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention des cancers.

Description

ADENOVIRUS RECOMBINANTS POUR LA THERAPIE GENIQUE DES CANCERS
La présente invention concerne des vecteurs recombinants d'origine virale et leur utilisation pour le traitement des cancers. Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN hétérologue sous le contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. L'invention concerne également la préparation de ces vecteurs, les compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation en thérapie génique.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Différentes techniques ont été décrites pour l'introduction de cette information génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al, PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
De nombreuses applications de la thérapie génique sont en cours d'étude, telles que les maladies génétiques (myopathie, mucoviscidose, SCID, etc), les pathologies du système nerveux central (alzheimer, Parkinson, etc), les maladies cardiovasculaires (hémophilie, athérosclérose), le SIDA ou les cancers. Plus particulièrement, concernant le traitement des cancers, différentes stratégies ont été proposées dans l'art antérieur. Ainsi, la demande EP 259 212 décrit la préparation de vaccins destinés au traitement des cancers, comprenant un virus modifié capable d'exprimer un antigène spécifique d'une tumeur, permettant de générer une réponse immunitaire contre ces cellules. Par ailleurs, la demande WO91/15580 décrit la construction de rétrovirus contenant un gène codant pour un ribozyme, dont l'expression en culture cellulaire peut permettre de détruire un ARNm d'un oncogène. Il est également connu de la demande WO 93/10814 d'utiliser des vecteurs exprimant des formes immunogéniques, non tumorigénique, d'oncogène cellulaires impliqués dans le développement des cancers. La demande WO 93/02556 décrit enfin l'utilisation de cellules prélevées dans la tumeur, modifiées génétiquement ex vivo par introduction d'un gène toxique, puis réadministrées au patient. Toutefois, cette approche impose des étapes de chirurgie, et de plus, la stabilité du gène toxique dans la cellule transformée ex vivo n'est pas démontrée.
Aussi, bien que des résultats intéressants aient été obtenus, les constructions décrites dans l'art antérieur ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante certaines difficultés, et notamment le ciblage précis des cellules à traiter. Ainsi, il a été proposé d'utiliser des rétrovirus recombinants comme vecteurs pour le transfert de gènes thérapeutiques. En effet, ces virus ne sont capables d'infecter que les cellules qui se divisent. Cependant, l'emploi de ce type de vecteur ne permet pas de cibler avec suffisamment de sélectivité les cellules tumorales. De plus, ces virus ne peuvent être obtenus avec des titres très élevés ce qui limité l'efficacité thérapeutique. Il a par ailleurs été proposé d'administrer directement le gène dans la tumeur. Ici encore, les risques de diffusion aux cellules environnantes ne sont pas exlus. Pour cette raison, il a été proposé de modifier la spécificité d'hote des virus utilisés, en incorporant dans leur enveloppe des protéines reconnaissant des récepteurs spécifiques de cellules tumorales (WO93/00103; WO92/14829). Toutefois, ces constructions ne permettent pas d'obtenir des ciblages suffisants, notamment lorsque le virus utilisé code pour une protéine toxique destinée à la destruction des cellules.
La présente invention apporte une solution avantageuse à ces problèmes. Elle fournit en effet des vecteurs capables de diriger l'expression d'un gène donné sélectivement dans les cellules tumorales. La présente invention repose en particulier sur la mise en évidence que certains signaux de contrôle de la transcription sont actifs (ou activés) spécifiquement dans les cellules tumorales, et qu'ils peuvent être utilisés pour l'expression sélective de gène hétérologues. Elle résulte également de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression de gènes thérapeutiques dans les cellules tumorales. En particulier, les adénovirus présentent l'avantage de ne pas s'intégrer au génome des cellules qu'ils infectent, de s'y maintenir de manière très stable ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable, et d'avoir un spectre d'hôte très large, ce qui permet une application au traitement de cancers affectant tout type de cellules. De plus, des adénovirus recombinants peuvent être obtenus avec des titres élevés, ce qui permet de travailler à des multiplicités d'infection élevées, et d'introduire plusieurs copies du gène hétérologue par cellule. L'invention repose également sur la mise en évidence que les virus de type adénovirus sont capables d'incorporer des séquences hétérologues comprenant de tels promoteurs, de transférer ces séquences dans les cellules tumorales, et d'exprimer des gènes désirés sous le contrôle de signaux spécifiques directement au niveau de tumeurs.
Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN hétérologue sous le contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des cancers.
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non- fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Néanmoins, ces virus ne sont pas pathogènes pour l'homme, et notamment les sujets non immuno-déprimés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR- 800) par exemple].
De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Comme indiqué ci-dessus, les adénovirus de l'invention portent une séquence d'ADN hétérologue. Cette séquence d'ADN hétérologue permet l'expression d'une activité biologique recherchée au niveau des cellules tumorales. De préférence, la séquence d'ADN hétérologue comprend au moins un gène choisi parmi un gène toxique pour la cellule infectée, un gène dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire, ou un gène codant pour une lymphokine. Les adénovirus de l'invention peuvent en outre comporter plusieurs de ces séquences, afin d'obtenir dans certains cas un effet synergique anti-tumoral.
Parmi les gènes toxiques pour la cellule infectée, on peut citer préférentiellement les gènes dont le produit d'expression confère à la cellule une sensibilité à un agent thérapeutique. Plus préférentiellement, le gène toxique est choisi parmi le gène de la thymidine kinase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à certains agents thérapeutiques tels le ganciclovir ou l'acyclovir. La thymidine kinase du virus de l'herpès simplex est capable de phosphoryler les analogues de nucléosides tels que l'acvclovir et le ganciclovir. Ces molécules modifiées peuvent être incorporées dans une chaine d'ADN encours d'élongation, ce qui a pour conséquence l'arrêt de la synthèse d'ADN, entrainant la mort de la cellule (F.L. Moolten, Cancer Res. 46 (1986) 5276). Cette stratégie permet ainsi d'éliminer spécifiquement les cellules exprimant le gène suicide. De plus, la synthèse d'ADN étant la cible de la toxicité, seules les cellules encours de division sont affectées. Plus préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (hTK HSV-1). La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight et al., Nucleic Acid. Res. 8 (1980) 5931).
Il est également possible d'utiliser le gène de la cytosine désaminase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à la 5-fluoro- cytosine (5-FC). Par ailleurs, parmi les gènes toxiques utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer également les gènes dont le produit d'expression induit une apoptose de la cellule infectée.
Parmi les gènes dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire, on peut citer plus particulièrement les gènes suppresseur de tumeur (ou anti-oncogène) ou tout dérivé actif de ceux-ci; les séquences antisens ou les ribozymes, dont l'expression dans la cellule cible permet d'inhiber au moins partiel¬ lement l'expression de gènes favorisant la division cellulaire.
Parmi les gènes suppresseurs de tumeur utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer plus particulièrement le gène p53 (Baker et coll., Science 244 (1989) 217); le gène Rb (Friend et coll., Nature 323 (1986) 643; Huang et coll., Science 242 (1988) 1563), le gène rap 1A (Kitayama et coll., Cell 56 (1989) 77); le gène DCC (Fearon et coll., Science 247 (1990) 49), les gènes k-rev2 et k-rev3; ou tout autre gène suppresseur de tumeur décrit dans la littérature (Cf part exemple WO 91/15580).
La séquence d'ADN hétérologue peut également comprendre une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes favorisant la prolifération cellulaire. Ce contrôle peut intervenir au niveau de la transcription, du splicing du prémessager, de la dégradation du messager, de sa traduction en protéine, ou de modifications post-traductionnelles. Préférentiellement, la séquence d'ADN hétérologue comporte un gène codant pour un ARN antisens capable de contrôler la traduction d'un ARNm cible (EP 140 308). Parmi les séquences antisens utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer plus particulièrement toute séquence antisens permettant de diminuer les niveaux de production des oncogènes ras, myc, fos, c-erb B, etc.
Parmi les gènes codant pour des lymphokines, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour les interleukines (IL-1 à IL-3 de préférence), les interférons, les facteurs de nécrose des tumeurs, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc), le TGF-β, etc. Par ailleurs, le gène codant pour la lymphokine comprend généralement, en amont de la séquence codante, une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de la lymphokine, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. De telles constructions permettent en particulier d'augmenter les taux de lymphokine de manière très localisée, et ainsi, en présence d'un antigène spécifique de tumeur, d'amplifier la réponse immunitaire contre un type particulier de tumeur, ce qui donne un effet particulièrement avantageux.
Comme indiqué ci-dessus, la séquence d'ADN hétérologue est placée sous le contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. De cette façon, le gène utilisé n'est exprimé et ne produit son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule tumorale.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, il s'agit de signaux d'expression induits par ou actifs en présence de virus responsables ou associés à des tumeurs. Encore plus préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention un signal d'expression inductible par le virus d'Epstein-Barr (EBV) ou par le virus du papillome.
Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est associé à deux types de cancers humains : le lymphome de Burkitt et le cancer du nasopharynx. L'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'EBV permet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans les cellules tumorales du nasopharynx. Dans les biopsies de cancers du nasopharynx, un seul antigène nucléaire est régulièrement présent, EBNA1, qui est impliqué dans la maintenace du génome viral dans les cellules infectées par l'EBV en phase latente, et qui transactive le promoteur viral BCR2. Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation, pour l'expression spécifique d'un gène dans les cellules de cancers du nasopharynx, d'une séquence répondant à EBNA1 (EBNA1-RE : EBNA1 "responsive élément"). En particulier, l'invention concerne un adénovirus comprenant comme signal d'expression un promoteur chimère comprenant une séquence répondant à EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, le promoteur du gène de la terminale protéine 1 (TPI). Les exemples décrits dans la présente demande montrent bien que ce promoteur chimère est inductible par EBNA1.
Les virus du papillome (notamment le virus HPV 16 et 18) sont responsables de 90 % des cancers du cervix chez la femme et ont été identifiés dans des lésions épithéliales pré-cancéreuses (Riou et al., Lancet 335 (1990) 117). Le produit du gène E6 conduit à la formation de tumeurs en diminuant fortement la quantité de p53 sauvage, un anti-oncogène, dans les cellules HPV-positives (Wrede et al., Mol. Carcinog. 4 (1991) 171). L'utilisation d'un adénovirus recombinant comprenant un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur inductible par le HPV (par exemple la protéine E6) permet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans les cellules tumorales correspondantes.
Il peut encore s'agir de signaux d'expression inactifs dans les cellules normales et actifs dans les cellules tumorales. En particulier, on peut utiliser dans le cadre de la présente invention le promoteur de l'α-foetoprotéine (Alpert E., dans Hepatocellular carcinoma, Okuda & Peters (eds), New York, 1976, 353) ou le promoteur P3 de l'IGF-II (Sussenbach et al., Growth Régulation 2 (1992) 1), qui sont actifs chez l'adulte, uniquement dans les hépatocarcinomes. Il est également possible d'utiliser des promoteurs induits par des hormones dans le cas de tumeurs hormono-dépendantes ou hormonaux associées (tumeur du sein ou de la prostate par exemple). En outre, ces séquences promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN hétérologue. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n° FR 93 05954 et
FR 93 08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation directement injectable dans les tumeurs à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la tumeur à traiter est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Toutefois, il est également possible d'utiliser des compositions pharmaceu- tiques formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intra- nasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des cancers. Elle est tout particulièrement adaptée au traitement des cancers du nasopharynx ou des hépatocarcinomes.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1 : Représentation du vecteur pONT-tk Figure 2 : Représentation du vecteur pONT-β-gal
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADX ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
[Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 23_Q (1985) 1350-
1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1. Construction du vecteur Ad-ONT-tk portant le gène tk sous le contrôle d'un promoteur chimère EBNA1-RE/TP1 (figure 1).
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant comprenant le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1-RE TP1).
1.1. Construction du plasmide p7tkl
Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la phase ouverte de lecture du gène tk de 1131 paires de bases (ATG 114-116 et codon stop TGA 1242-1244), insérée dans un multisite de clonage.
Le fragment BglII-NcoI contenant le gène de la thymidine kinase (tk) du virus herpès simplex type 1 a été isolé à partir du plasmide pHSV-106 (commercialisé par Gibco BRL), réparé par l'action du fragment klenow puis inséré au site Smal du plasmide pGEM7zf(+) (commercialisé par Promega). Les sites Smal et BglII sont détruits lors de cette étape, le site Ncol est conservé. Le plasmide obtenu a été désigné p7tkl.
1.2. Construction du plasmide pONTl Cet exemple décrit la construction d'un plasmide contenant un promoteur chimère constitué d'une séquence nécessaire à la transactivation par l'antigène EBNA1 et du promoteur TPI du virus EBV.
Le fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) du virus EBV a été isolé à partir de la souche B95-8. La séquence complète du virus EBV a été décrite par Baer et al. (Nature 310 (1984) 207). Ce fragment contient les séquences nécessaires à la transactivation par l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) (D. Reisman & B. Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol. 6 pp. 3838-3846). Ce fragment a ensuite été fusionné au fragment Nrul(166 241)-PstI(166 559) de l'EBV B95-8 (le site PstI a été digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TPI. Le promoteur chimère ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluescript II SK.
Le plasmide obtenu a été désigné pONTl .
1.3. Construction du plasmide pONTtk
Le plasmide pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) clone dans le plasmide p7tkl, sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-RE/TP1 clone dans le plasmide pONTl.
Pour construire ce plasmide, le fragment BamHI-XhoI de pONTl qui contient le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2, et le fragment
Xhol-Clal de p7tkl qui contient la phase ouverte de lecture de tk ont été clones aux sites BamHI (478) et Clal (4550) du plasmide pAd.RSVβgal. Le plasmide pAd.RSVβGal contient, dans l'orientation 5'->3',
- le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant : la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur E1A; - le gène codant pour la β-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSVβGal et l'adénovirus dl324. Le plasmide pAd.RSVβGal a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
Tous les sites de clonage sont conservés. Le plasmide obtenu a été désigné pONTtk (figure 1).
1.4. Construction de l'adénovirus recombinant Ad-ONT-tk
Le vecteur pONTtk a été linéarisé et cotransf ecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (El A et E11B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad-ONT-tk a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dl324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pONTtk, selon le protocole suivant : le plasmide pONTtk, linéarisé par Xmnl, et l'adénovirus dl324, linéarisé par l'enzyme Clal, ont été co- transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-ONT-tk peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol.
Exemple 2. Construction du vecteur Ad-ONT-βgal
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant comprenant le gène de la béta-galactosidase d'E.coli (βgal) sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1-RE/TP1).
2.1. Construction du plasmide pONT-βgal
Le fragment XbaΙ-(HindΙII) du plasmide pONTl qui contient le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2 et le fragment (Stul)-Kpnl du plasmide pAd.RSVβgal qui contient le gène de la β-galactosidase ont été clones aux sites Xbal
(484) et Kpnl (4520) du plasmide pAd.RSVβgal. Les sites HindlII et StuI sont détruits au cours de cette étape. Le plasmide obtenu a été désigné pONT-βgal (figure 2).
2.2. Construction de l'adénovirus Ad-ONT-βgal
Le vecteur pONT-βgal obtenu dans l'exemple 2.1, a été utilisé, par recombinaison homologue selon le protocole décrit dans l'exemple 1.4., pour préparer un adénovirus recombinant comprenant le gène de la béta-galactosidase d'E oli (βgal) sous le contrôle du promoteur chimère EBNAl-RE/TPl. L'adénovirus Ad-ONTl-βgal ainsi obtenu peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol.
Exemple 3. Construction du vecteur pONT-CAT
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur comprenant le gène de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNAl-RE/TPl).
3.1. Construction du vecteur Le promoteur TPI de l'EBV a été isolé sous la forme du fragment
NruI(166241)-PstI(1665S9) de l'EBV. Ce fragment a ensuite été fusionné au gène CAT, et inséré, sous forme d'un fragment NruI-BamHI, dans le plasmide pGem7ZF (Promega). Le plasmide résultant a été désigné pTPl-CAT. Le fragment NruI-BamHI du plasmide pTPl-CAT a ensuite été fusionné, en aval du fragment EcoRI(7315)- Smal(8191) de l'EBV souche B95-8, contenant les séquences nécessaires à la transactivation par EBNA1 (Cf exemple 1.2.). Le fragment obtenu, comprenant le gène CAT sous contrôle du promoteur chimère EBNAl-RE/TPl, a été inséré aux sites EcoRI et BamHI du plasmide pBluescript SK pour générer le plasmide pONT-CAT. Un plasmide a également été construit dans lequel les éléments de réponse à l'antigène EBNA2 du promoteur TPI ont été délétés. Pour cela, le promoteur TPI a été isolé sous la forme du fragment Nrul(166375)-Pstl(l 66559) de l'EBV. Ce plasmide a été désigné pOST-CAT.
3.2. Activité in vitro
Cet exemple démontre que les constructions décrites ci-dessus sont induites spécifiquement par des antigènes du virus d'Epstein Barr.
Les vecteurs pONT-CAT, pOST-CAT et pTPl-CAT ont été transfectés par électroporation dans une lignée de lymphocytes B EBV" (cellules DG75), soit seuls, soit en présence de vecteurs d'expression des antigènes viraux EBNAl, EBNA2 ou EBNAl + EBNA2. 48 heures après la transfection, les cellules ont été lysées par congélation/décongélation, les débris cellulaires éliminés, puis les extraits obtenus ont été normalisés suivant la quantité de protéines. L'activité CAT a ensuite été dosée dans ces extraits par dosage enzymatique. Les résultats obtenus sont les suivants :
Seul +EBNA2 +EBNA1 +EBNA1/A2
pTPl-CAT 1 35 2,5 17
pONT-CAT 1 16 34 136
pOST-CAT 1 1,4 19,5 22,5
Ces résultats montrent clairement que le promoteur ONT est spécifiquement actif en présence des antigènes EBNAl et EBNA2, et qu'il induit une très forte expression du gène CAT.

Claims

REVENDICATIONS
1. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN hétérologue sous le contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales.
2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule cible.
3. Adénovirus selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 5 ou canin de type CAV-2.
4. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue contient au moins un gène toxique pour la cellule infectée.
5. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que le gène toxique est un gène dont le produit d'expression confère à la cellule infectée une sensibilité à un agent thérapeutique.
6. Adénovirus selon la revendication 5 caractérisé en ce que le gène toxique est le gène de la thymidine kinase et l'agent thérapeutique est le gancyclovir ou l'acyclovir.
7. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue contient au moins un gène dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire.
8. Adénovirus selon la revendication 7 caractérisé en ce que le gène est choisi parmi les gènes suppresseur de tumeur, les séquences antisens et les ribozymes.
9. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue contient au moins un gène dont le produit d'expression induit l'apoptose de la cellule infectée.
10. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce qu'il comprend des signaux d'expression induits par ou actifs en présence de virus responsables ou associés à des tumeurs.
11. Adénovirus selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comprend un signal d'expression inductible par le virus d'Epstein-Barr (EBV) ou par le virus du papillome.
12. Adénovirus selon la revendication 11 caractérisé en ce que le signal d'expression comprend une séquence répondant à l'antigène EBNAl.
13. Adénovirus selon la revendication 12 caractérisé en ce que le signal d'expression est constitué d'un promoteur chimère comprenant une séquence répondant à EBNAl fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, de préférence le promoteur du gène de la terminale protéine 1 (TPI).
14. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce qu'il comprend des signaux d'expression choisis parmi le promoteur de l'α-foetoprotéine et le promoteur P3 de riGF-II.
15. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 14 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des cancers.
16. Utilisation d'un adénovirus selon la revendication 12 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des cancers du nasopharynx.
17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16 pour la préparation d'une composition pharmaceutique en vue d'une administration directe dans la tumeur à traiter.
18. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 14.
19. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.
20. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.
21. Promoteur chimère comprenant une séquence répondant à EBNAl fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, de préférence le promoteur du gène de la terminale protéine 1 (TPI).
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