CA2158869C - Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des adénovirus rocombinants comportant une séquence d'ADN hétérologue, leur préparation, et leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention des cancers.
Description
VIRUS RECOMBINANTS. PREPARATION ET UTILISATION
EN THERAPIE GENIOUE
La présente invention concerne des vecteurs recombinants d'origine virale et leur utilisation pour le traitement des cancers. Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN hétérologue dont l'expression dans une cellule se divisant anormalement permet d'inhiber au moins partiellement la division de ladite cellule. L'invention concerne également la préparation de ces vecteurs et les compositions pharmaceutiques les contenant.
La croissance cellulaire est régulée de manière extremement subtile par deux types de signaux. Certains favorisent la multiplication des cellules, tandis que d'autres, au contraire, les font entrer dans un état quiescent ou les font se différencier, selon les besoins de l'organisme. Les cancers sont tous caractérisés par un dérèglement des mécanismes contrôlant la division cellulaire, conduisant à une prolifération anormale.
Le plus souvent, le développement d'un cancer implique donc l'activation de gènes favorisant la multiplication des cellules (gènes désignés proto-oncogènes, qui sont activés en oncogènes) et la disparition ou l'inactivation de gènes inhibant la prolifération cellulaire. La présente invention offre la possibilité de traiter les cancers par la thérapie génique, par l'administration, à des cellules tumorales, d'un ou plusieurs de ces gènes dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la prolifération cellulaire.
La thérapie génique consiste à cozriger une déficience ou une anormalité
(mutation, expression aberrante) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette inforrnation génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 3o 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431). Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations
EN THERAPIE GENIOUE
La présente invention concerne des vecteurs recombinants d'origine virale et leur utilisation pour le traitement des cancers. Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN hétérologue dont l'expression dans une cellule se divisant anormalement permet d'inhiber au moins partiellement la division de ladite cellule. L'invention concerne également la préparation de ces vecteurs et les compositions pharmaceutiques les contenant.
La croissance cellulaire est régulée de manière extremement subtile par deux types de signaux. Certains favorisent la multiplication des cellules, tandis que d'autres, au contraire, les font entrer dans un état quiescent ou les font se différencier, selon les besoins de l'organisme. Les cancers sont tous caractérisés par un dérèglement des mécanismes contrôlant la division cellulaire, conduisant à une prolifération anormale.
Le plus souvent, le développement d'un cancer implique donc l'activation de gènes favorisant la multiplication des cellules (gènes désignés proto-oncogènes, qui sont activés en oncogènes) et la disparition ou l'inactivation de gènes inhibant la prolifération cellulaire. La présente invention offre la possibilité de traiter les cancers par la thérapie génique, par l'administration, à des cellules tumorales, d'un ou plusieurs de ces gènes dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la prolifération cellulaire.
La thérapie génique consiste à cozriger une déficience ou une anormalité
(mutation, expression aberrante) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette inforrnation génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 3o 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431). Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations
2 cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
La possibilité d'utiliser la thérapie génique pour traiter les cancers a déjà
été
évoquée dans la demande W091/15580. Cette demande décrit la construction de rétrovirus contenant un gène codant pour un ribozyme, dont l'expression en culture cellulaire peut permettre de détruire un ARNm d'un oncogène.
La présente invention résulte de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression de gènes thérapeutiques dans les tumeurs. En particulier, les adénovirus présentent l'avantage de ne pas s'intégrer au génome des cellules qu'ils infectent, de s'y maintenir de manière très stable ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable, et d'avoir un spectre d'hôte très large, ce qui permet une application au traitement de cancers affectant tout type de cellules. Par ailleurs, l'invention repose également sur la mise en évidence que les virus de type adénovirus sont capables de transférer et d'exprimer des gènes capables d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire directement au niveau de tumeurs.
Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant défectif contenant une séquence d'ADN hétérologue dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire.
Plus spécifiquement, l'invention a pour objet un adénovirus recombinant défectif contenant une séquence d'ADN hétérologue dont l'expression dans une cellule cible permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire, ladite séquence comprenant - au moins un gène codant pour la protéine p53 et, - une séquence promotrice permettant l'expression, dans la cellule infectée, dudit gène, la dite séquence promotrice ayant une origine différente de celle dudit gène.
L'invèntion a également pour objet, l'utilisation d'un tel adénovirus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des cancers.
2a Au sens de la présente invention, le terme "adénovirus défectif" désigne un adénovirus incapable de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible.
Généralement, le génorne des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des sé~uences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
La possibilité d'utiliser la thérapie génique pour traiter les cancers a déjà
été
évoquée dans la demande W091/15580. Cette demande décrit la construction de rétrovirus contenant un gène codant pour un ribozyme, dont l'expression en culture cellulaire peut permettre de détruire un ARNm d'un oncogène.
La présente invention résulte de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression de gènes thérapeutiques dans les tumeurs. En particulier, les adénovirus présentent l'avantage de ne pas s'intégrer au génome des cellules qu'ils infectent, de s'y maintenir de manière très stable ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable, et d'avoir un spectre d'hôte très large, ce qui permet une application au traitement de cancers affectant tout type de cellules. Par ailleurs, l'invention repose également sur la mise en évidence que les virus de type adénovirus sont capables de transférer et d'exprimer des gènes capables d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire directement au niveau de tumeurs.
Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant défectif contenant une séquence d'ADN hétérologue dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire.
Plus spécifiquement, l'invention a pour objet un adénovirus recombinant défectif contenant une séquence d'ADN hétérologue dont l'expression dans une cellule cible permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire, ladite séquence comprenant - au moins un gène codant pour la protéine p53 et, - une séquence promotrice permettant l'expression, dans la cellule infectée, dudit gène, la dite séquence promotrice ayant une origine différente de celle dudit gène.
L'invèntion a également pour objet, l'utilisation d'un tel adénovirus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des cancers.
2a Au sens de la présente invention, le terme "adénovirus défectif" désigne un adénovirus incapable de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible.
Généralement, le génorne des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des sé~uences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
-3-Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Néanmoins, ces virus ne sont pas pathogènes pour l'homme, et notamment les sujets non immuno-déprimés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5).
Dans le cas des adénovirus Ad 5, les séquences nécessaires à la réplication sont les régions E1A et E1B.
Au sens de la présente invention, la séquence d'ADN hétérologue dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire comprend de préférence au moins un gène choisi parmi les gènes suppresseur de tumeur (ou anti-oncogène) ou tout dérivé actif desdits gènes; les gène antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet d'inhiber l'expression de gènes favorisant la division cellulaire;
ou les gènes dont le prodûit d'expression induit une apoptose de la cellule infectée.
Parmi les gènes suppresseurs de tumeur utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les gènes suivants :
- Gène p53 :
Le gène p53 code pour une protéine nucléaire de 53 kDa. La forme mutée par délétion et/ou mutation de ce gène est impliquée dans le développement de la plupart des cancers humains (Baker et coll., Science 244 (1989) 217). Ses formes mutées sont également capables de coopérer avec les oncogènes ras pour transformer des fibroblastes murins. Le gène sauvage codant pour la p53 native inhibe en revanche la formation des foyers de transformation dans des fibroblastes de rongeurs transfectés avec diverses combinaisons d'oncogènes. Des données récentes soulignent que la protéine p53 pourrait être elle-même un facteur de transcription et stimuler l'expression d'autres gènes suppresseurs de tumeur.
- Gène Rb Le gène Rb détermine la synthèse d'une phosphoprotéine nucléaire de 927 acides aminés environ (Friend et coll., Nature 323 (1986) 643) dont la fonction est de réprimer la division des cellules en les faisant entrer en phase de quiescence. Des formes inactivées du gène Rb ont été mises en cause dans différentes tumeurs, et notamment dans les rétinoblastomes ou dans les cancers mésenchymateux comme les ostéosarcomes. La réintroduction de ce gène dans les cellules tumorales où il était inactivé produit un retour à l'état normal et une perte de la tumorigénicité
(Huang et coll., Science 242 (1988) 1563). Récemment, il a été démontré que la protéine Rb WO 94/24297 n PCT/FR94/00421
Dans le cas des adénovirus Ad 5, les séquences nécessaires à la réplication sont les régions E1A et E1B.
Au sens de la présente invention, la séquence d'ADN hétérologue dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire comprend de préférence au moins un gène choisi parmi les gènes suppresseur de tumeur (ou anti-oncogène) ou tout dérivé actif desdits gènes; les gène antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet d'inhiber l'expression de gènes favorisant la division cellulaire;
ou les gènes dont le prodûit d'expression induit une apoptose de la cellule infectée.
Parmi les gènes suppresseurs de tumeur utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les gènes suivants :
- Gène p53 :
Le gène p53 code pour une protéine nucléaire de 53 kDa. La forme mutée par délétion et/ou mutation de ce gène est impliquée dans le développement de la plupart des cancers humains (Baker et coll., Science 244 (1989) 217). Ses formes mutées sont également capables de coopérer avec les oncogènes ras pour transformer des fibroblastes murins. Le gène sauvage codant pour la p53 native inhibe en revanche la formation des foyers de transformation dans des fibroblastes de rongeurs transfectés avec diverses combinaisons d'oncogènes. Des données récentes soulignent que la protéine p53 pourrait être elle-même un facteur de transcription et stimuler l'expression d'autres gènes suppresseurs de tumeur.
- Gène Rb Le gène Rb détermine la synthèse d'une phosphoprotéine nucléaire de 927 acides aminés environ (Friend et coll., Nature 323 (1986) 643) dont la fonction est de réprimer la division des cellules en les faisant entrer en phase de quiescence. Des formes inactivées du gène Rb ont été mises en cause dans différentes tumeurs, et notamment dans les rétinoblastomes ou dans les cancers mésenchymateux comme les ostéosarcomes. La réintroduction de ce gène dans les cellules tumorales où il était inactivé produit un retour à l'état normal et une perte de la tumorigénicité
(Huang et coll., Science 242 (1988) 1563). Récemment, il a été démontré que la protéine Rb WO 94/24297 n PCT/FR94/00421
-4 -normale, mais pas ses formes mutées, réprime l'expression du proto-oncogène c-fos, gène indispensable à la prolifération cellulaire.
- Gène rap l A
Le gène rap lA (également désigné k-revl) code pour une protéine de 21 kDa associée à la face interne de la membrane cytoplasmique. Cette protéine est capable, à des niveaux élevés, de réverter des cellules transformées exprimant les oncogènes ras mutés (Kitayama et coll., Cell 56 (1989) 77).
- Gène DCC
Le gène DCC code pour une protéine homologue avec les protéines d'adhésion cellulaire de la famille N-CAM. Ce gène est très fréquemment délété
dans les carcinomes du colon (Fearon et coll., Science 247 (1990) 49).
- Gènes k-rev2 et k-rev3 Le gène k-rev2 code pour une protéine sécrétée de 60 acides aminés, et le gène k-rev3 code pour une version tronquée d'une protéine de la matrice extracellulaire. Ces deux gènes sont capables de réverter des cellules NIH 3T3 transformées par l'oncogène Ki-ras.
D'autres gènes peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention pour leur effet anti-tumoral, et notamment d'autres gènes suppresseurs de tumeur décrits dans la littérature, ou tout autre gène dont le produit d'expression peut induire l'apoptose cellulaire.
Comme indiqué plus haut, la séquence d'ADN hétérologue peut comporter le gène suppresseur de tumeur natif ou un dérivé actif dudit gène. Un tel dérivé
peut être obtenu par mutation, délétion, substitution et/ou addition d'une ou plusieurs paires de bases dans la séquence du gène, selon les techniques classiques de biologie moléculaire. L'activité du dérivé ainsi obtenu peut ensuite être confirmée in vitro sur des tests connus de l'homme du métier, tels que ceux décrits dans les exemples.
Au sens de l'invention, la séquence d'ADN hétérologue peut également comprendre un gène antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires codant pour des protéines favorisant la prolifération cellulaire. De tels gènes peuvent par exemple être
- Gène rap l A
Le gène rap lA (également désigné k-revl) code pour une protéine de 21 kDa associée à la face interne de la membrane cytoplasmique. Cette protéine est capable, à des niveaux élevés, de réverter des cellules transformées exprimant les oncogènes ras mutés (Kitayama et coll., Cell 56 (1989) 77).
- Gène DCC
Le gène DCC code pour une protéine homologue avec les protéines d'adhésion cellulaire de la famille N-CAM. Ce gène est très fréquemment délété
dans les carcinomes du colon (Fearon et coll., Science 247 (1990) 49).
- Gènes k-rev2 et k-rev3 Le gène k-rev2 code pour une protéine sécrétée de 60 acides aminés, et le gène k-rev3 code pour une version tronquée d'une protéine de la matrice extracellulaire. Ces deux gènes sont capables de réverter des cellules NIH 3T3 transformées par l'oncogène Ki-ras.
D'autres gènes peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention pour leur effet anti-tumoral, et notamment d'autres gènes suppresseurs de tumeur décrits dans la littérature, ou tout autre gène dont le produit d'expression peut induire l'apoptose cellulaire.
Comme indiqué plus haut, la séquence d'ADN hétérologue peut comporter le gène suppresseur de tumeur natif ou un dérivé actif dudit gène. Un tel dérivé
peut être obtenu par mutation, délétion, substitution et/ou addition d'une ou plusieurs paires de bases dans la séquence du gène, selon les techniques classiques de biologie moléculaire. L'activité du dérivé ainsi obtenu peut ensuite être confirmée in vitro sur des tests connus de l'homme du métier, tels que ceux décrits dans les exemples.
Au sens de l'invention, la séquence d'ADN hétérologue peut également comprendre un gène antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires codant pour des protéines favorisant la prolifération cellulaire. De tels gènes peuvent par exemple être
-5-transcrits, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine.
Parmi les gènes antisens utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer plus particulièrement toute séquence antisens permettant de diminuer les niveaux de production des oncogènes ras, myc, fos, c-erb B, etc.
Généralement, la séquence d'ADN hétérologue comprend également des séquences promotrices permettant l'expression du ou des gènes capables d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire dans la cellule cible. Il peut s'agir de séquences promotrices qui sont naturellement responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences promotrices d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou méme synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter.
De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences promotrices peuvent être modifiées par addition cle séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque la séquence d'ADN hétérologue ne comporte pas de séquences d'expression, elle peut être insérée dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Il est également possible d'utiliser des promoteurs inductibles.
Par ailleurs, dans un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, la séquence d'ADN hétérologue comprend, en plus du gène suppresseur de tumeur ou du gène antisens, un gène codant pour un antigène spécifique de tumeur et/ou un gène codant pour une lymphokine. La combinaison de ces gènes permet en effet (i) de stopper la division cellulaire dans une tumeur et ainsi, de faire régresser ladite tumeur, et (ii), d'augmenter la réponse immunitaire de l'organisme contre ladite tumeur.
Les antigènes spécifiques de tumeur sont des motifs antigéniques qui apparaissent à la surface de cellules tumorales, mais qui n'existent pas à la surface des mêmes cellules non tumorales. De tels antigènes sont généralement utilisés pour le diagnostic de cancers. Plus récemment, ils ont été décrits pour la réalisation de vaccins anti-tumoraux (EP 259 212). Cependant, ils n'ont jamais été combinés à
d'autres gènes thérapeutiques comme dans le cadre de la présente invention.
Parmi les gènes antisens utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer plus particulièrement toute séquence antisens permettant de diminuer les niveaux de production des oncogènes ras, myc, fos, c-erb B, etc.
Généralement, la séquence d'ADN hétérologue comprend également des séquences promotrices permettant l'expression du ou des gènes capables d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire dans la cellule cible. Il peut s'agir de séquences promotrices qui sont naturellement responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences promotrices d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou méme synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter.
De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences promotrices peuvent être modifiées par addition cle séquences d'activation, de régulation, etc. Par ailleurs, lorsque la séquence d'ADN hétérologue ne comporte pas de séquences d'expression, elle peut être insérée dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Il est également possible d'utiliser des promoteurs inductibles.
Par ailleurs, dans un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, la séquence d'ADN hétérologue comprend, en plus du gène suppresseur de tumeur ou du gène antisens, un gène codant pour un antigène spécifique de tumeur et/ou un gène codant pour une lymphokine. La combinaison de ces gènes permet en effet (i) de stopper la division cellulaire dans une tumeur et ainsi, de faire régresser ladite tumeur, et (ii), d'augmenter la réponse immunitaire de l'organisme contre ladite tumeur.
Les antigènes spécifiques de tumeur sont des motifs antigéniques qui apparaissent à la surface de cellules tumorales, mais qui n'existent pas à la surface des mêmes cellules non tumorales. De tels antigènes sont généralement utilisés pour le diagnostic de cancers. Plus récemment, ils ont été décrits pour la réalisation de vaccins anti-tumoraux (EP 259 212). Cependant, ils n'ont jamais été combinés à
d'autres gènes thérapeutiques comme dans le cadre de la présente invention.
-6-Parmi les gènes codant pour des lymphokines, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour les interleukines (IL-1 à IL-13), les interférons, les facteurs de nécrose des tumeurs, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, M-CSF, GM-CSF) , le TGFB: . Par ailleurs, le gène codant pour la lyrnpholcine comprend généralement, en amont de la séquence codante, une séquence d'expression et une séquence signal dirigeant le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de la lymphokine, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. De telles constructions permettent en particulier d'augmentér les taux de lymphokine de manière très localisée, et ainsi, en présence d'un antigène spécifique de tumeur, d'amplifier la réponse immunitaire contre un type particuliuer de tumeur, ce qui donne un effet particulièrement avantageux. De tels adénovirus recombinants sont particulièrement utilisables pour la préparation de vaccins anti-tumoraux.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN hétérologue. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %).
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comrne illustré dans les exemples.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une forYnulation directement injectable dans les tumeurs à traiter. Il peut s'agir en particulier de
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN hétérologue. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %).
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comrne illustré dans les exemples.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une forYnulation directement injectable dans les tumeurs à traiter. Il peut s'agir en particulier de
7 PCT/FR94/00421 solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la tumeur à
traiter est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/mI. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des cancers. En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La pi-ésente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figties Figure 1: Représentation du vecteur mp53wtI-.CMV
-25 Figure 2 Représentation du vecteur mp53pIX.CMV
Techniques génér=ales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN
plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification cle fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de WO 94/24297 ~ 1 C Q Q L' Q PCT/FR94/00421
traiter est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/mI. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des cancers. En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La pi-ésente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figties Figure 1: Représentation du vecteur mp53wtI-.CMV
-25 Figure 2 Représentation du vecteur mp53pIX.CMV
Techniques génér=ales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN
plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification cle fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de WO 94/24297 ~ 1 C Q Q L' Q PCT/FR94/00421
-8-l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phâges de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peiivent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destnaction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
Lolymérase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. ] 55 (1987) 335-3501 peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467]
en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exempl e.s El. Construction du vecteur mp53wtl-CMV portant le gène p53 sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus (figure 1).
Le vecteur d'expression eucaryote mp53%vtI-CMV a été construit à partir du plasmide pUCl9, par insertion :
WO 94/24297 ' m. 21 C Q Q~(~ PCT/FR94/00421
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phâges de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peiivent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destnaction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
Lolymérase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. ] 55 (1987) 335-3501 peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467]
en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exempl e.s El. Construction du vecteur mp53wtl-CMV portant le gène p53 sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus (figure 1).
Le vecteur d'expression eucaryote mp53%vtI-CMV a été construit à partir du plasmide pUCl9, par insertion :
WO 94/24297 ' m. 21 C Q Q~(~ PCT/FR94/00421
-9-- d'une région promotrice d'origine virale qui correspond au promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV). Cette région est entourée dans le vecteur de sites de restrictions uniques EcoRI-SphI à la jonction CMV / pUC et BamHI à la jonction CMV / p53. La présence de sites uniques flanquant la région promotrice permet de remplacer la région CMV par tout autre promoteur. Une deuxième série de vecteurs est ainsi obtenue dans laquelle le gène p53 est placé sous le contrôle d'un promoteur inductible : le promoteur de la metallothionine, inductible par les métaux lourds (cadnium et zinc).
- d'une séquence de 1173 pb correspondant à l'ADNc codant pour la protéine p53 de souris sous sa forme sauvage (Zakut-Houri et al., Nature 36 (1983) 594). Dans cette construction, le gène suppresseur est sous forme d'ADNc, c'est-à-dire dépourvue d'introns. Ceci permet notamment de réduit-e la taille du vecteur. Par ailleurs, il a été
vérifié que les niveaux d'expression obtenus sont comparables en présence ou en l'absence d'introns.
- du signal de polyadénylation des gènes tardifs du virus SV40, qui correspond à un signal de polyadénylation très efficace. Deux sites de restriction uniques Sall et HindlIl sont situés en aval du signal de polyadénylation. Ces sites ont permis l'insertion des régions pIX de l'adénovirus (Cf E3).
E2. Activité in vitro du vectetir nip53%i,tI-CMV
La fonctionnalité du vecteur mp53wtl-CMV a été confirmée in vitro, par expression transitoire dans les cellules HeLa. Pour cela, le vecteur a été
introduit dans les cellules par transfection et, 40 heures après, la protéine p53 a été dosée par immunofluorescence et immunoprécipitation. Les résultats obtenus montrent que plus de 50% des cellules transfectées induisent des taux importants de protéine p53.
E3. Construction du vecteur mp53pIX.CMV
Les plasmides utilisés pour générer, par recombinaison homologue, les adénovirus recombinants exprimant le gène p53 ont été construits comme suit :
Le vecteur d'expression eucaryote mp53pIX.CMV a été construit par inseRion de la séquence pIX issue du génome de l'adénovirus entre les sites Sall et EcoRl de mpl3wtI-.CMV. La séquence pIX a été isolée à partir du plasmide recombinant pLTR-(3gal pIX (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) par digestion au moyen des enzymes EcoRV et HindIII.
Le vecteur d'expression mp53pIX.CMV ainsi obtenu (figure 2) possède un site unique HindIII en aval de l'insert pIX ce qui permet une linéarisation de la construction (Cf E4.).
E4. Construction d'un adénovirus recombinant défectif portant le gène p53 sous le contrôle du promoteur CMV.
Le vecteur mp53pIX.CMV est linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trarrs les fonctions codées par les régions E 1(E 1 A et E 11 B) d'adénovirus.
On obtient l'adénovirus Ad.p53 par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-d1324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur mp53pIX.CMV, selon le protocole suivant : après linéarisation par l'enzyme HindIII, le plasmide mp53pIX.CMV et l'adénovirus d1324 sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Adp53 peut être conservé à-80 C dans 20 %
de glycérol.
La capacité de l'adénovirus Ad-p53 à infecter des cellules en culture et à
exprimer dans le milieu de culture une forme biologiquement active de la p53 sauvage a été démontrée par infection des cellules de la lignée 293 humaine. La présence de p53 dans le surnageant de culture a ensuite été mise en évidence au moyen d'un anticorps monoclonal spécifique de la p53.
Ces études permettent de montrer que l'adénovirus exprime bien une forrne biologiquement active de la p53.
- d'une séquence de 1173 pb correspondant à l'ADNc codant pour la protéine p53 de souris sous sa forme sauvage (Zakut-Houri et al., Nature 36 (1983) 594). Dans cette construction, le gène suppresseur est sous forme d'ADNc, c'est-à-dire dépourvue d'introns. Ceci permet notamment de réduit-e la taille du vecteur. Par ailleurs, il a été
vérifié que les niveaux d'expression obtenus sont comparables en présence ou en l'absence d'introns.
- du signal de polyadénylation des gènes tardifs du virus SV40, qui correspond à un signal de polyadénylation très efficace. Deux sites de restriction uniques Sall et HindlIl sont situés en aval du signal de polyadénylation. Ces sites ont permis l'insertion des régions pIX de l'adénovirus (Cf E3).
E2. Activité in vitro du vectetir nip53%i,tI-CMV
La fonctionnalité du vecteur mp53wtl-CMV a été confirmée in vitro, par expression transitoire dans les cellules HeLa. Pour cela, le vecteur a été
introduit dans les cellules par transfection et, 40 heures après, la protéine p53 a été dosée par immunofluorescence et immunoprécipitation. Les résultats obtenus montrent que plus de 50% des cellules transfectées induisent des taux importants de protéine p53.
E3. Construction du vecteur mp53pIX.CMV
Les plasmides utilisés pour générer, par recombinaison homologue, les adénovirus recombinants exprimant le gène p53 ont été construits comme suit :
Le vecteur d'expression eucaryote mp53pIX.CMV a été construit par inseRion de la séquence pIX issue du génome de l'adénovirus entre les sites Sall et EcoRl de mpl3wtI-.CMV. La séquence pIX a été isolée à partir du plasmide recombinant pLTR-(3gal pIX (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) par digestion au moyen des enzymes EcoRV et HindIII.
Le vecteur d'expression mp53pIX.CMV ainsi obtenu (figure 2) possède un site unique HindIII en aval de l'insert pIX ce qui permet une linéarisation de la construction (Cf E4.).
E4. Construction d'un adénovirus recombinant défectif portant le gène p53 sous le contrôle du promoteur CMV.
Le vecteur mp53pIX.CMV est linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trarrs les fonctions codées par les régions E 1(E 1 A et E 11 B) d'adénovirus.
On obtient l'adénovirus Ad.p53 par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-d1324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur mp53pIX.CMV, selon le protocole suivant : après linéarisation par l'enzyme HindIII, le plasmide mp53pIX.CMV et l'adénovirus d1324 sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Adp53 peut être conservé à-80 C dans 20 %
de glycérol.
La capacité de l'adénovirus Ad-p53 à infecter des cellules en culture et à
exprimer dans le milieu de culture une forme biologiquement active de la p53 sauvage a été démontrée par infection des cellules de la lignée 293 humaine. La présence de p53 dans le surnageant de culture a ensuite été mise en évidence au moyen d'un anticorps monoclonal spécifique de la p53.
Ces études permettent de montrer que l'adénovirus exprime bien une forrne biologiquement active de la p53.
Claims (15)
1. Adénovirus recombinant défectif contenant une séquence d'ADN hétérologue dont l'expression dans une cellule cible permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire, ladite séquence comprenant - au moins un gène codant pour la protéine p53 et, - une séquence promotrice permettant l'expression, dans la cellule infectée, dudit gène, la dite séquence promotrice ayant une origine différente de celle dudit gène.
2. Adénovirus recombinant défectif selon la revendication 1 contenant une séquence codant pour la protéine p53 sauvage sous contrôle d'un promoteur hétérologue.
3. Adénovirus recombinant défectif selon la revendication 2 contenant une séquence codant pour la protéine p53 sauvage sous contrôle du promoteur précoce du cytomégalovirus.
4. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé
en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule cible.
en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule cible.
5. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un adénovirus de type Ad 5.
6. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que la séquence d'ADN hétérologue comprend en outre un gène codant pour un antigène spécifique de tumeur ou un gène codant pour une lymphokine.
7. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 6 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou la prévention des cancers par administration directe dans la tumeur à traiter.
8. Utilisation d'un adénovirus selon la revendication 2 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des cancers associés à la présence d'une forme mutée de p53.
9. Utilisation selon la revendication 7 pour la préparation d'un vaccin anti-tumoral.
10. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 6.
11. Composition pharmaceutique selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.
12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 10 4 et 10 14 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.
13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 10 6 et 10 10 pfu/ml adénovirus recombinants.
14. Utilisation d'un adénovirus recombinant défectif contenant une séquence d'ADN hétérologue comprenant un gène codant pour la protéine p53, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des cancers.
15. Utilisation d'un adénovirus recombinant défectif contenant une séquence d'ADN hétérologue codant pour la protéine p53 sauvage pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à induire l'apoptose cellulaire.
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| FR93/04745 | 1993-04-22 | ||
| FR9304745A FR2704234B1 (fr) | 1993-04-22 | 1993-04-22 | Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique. |
| PCT/FR1994/000421 WO1994024297A1 (fr) | 1993-04-22 | 1994-04-15 | Adenovirus recombinants defectifs pour la therapie genique des tumeurs |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2158869A1 CA2158869A1 (fr) | 1994-10-27 |
| CA2158869C true CA2158869C (fr) | 2007-07-03 |
Family
ID=38246505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002158869A Expired - Lifetime CA2158869C (fr) | 1993-04-22 | 1994-04-15 | Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CA (1) | CA2158869C (fr) |
-
1994
- 1994-04-15 CA CA002158869A patent/CA2158869C/fr not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2158869A1 (fr) | 1994-10-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| EEER | Examination request | ||
| MKEX | Expiry |
Effective date: 20140415 |