NO317725B1 - Rekombinante adenoviruser for genterapi mot cancer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår rekombinante vektorer av viral opprinnelse og deres anvendelse i forbindelse med behandling av cancer. Mer spesielt angår oppfinnelsen rekombinante adenoviruser som bærer en heterolog DNA-sekvens under kontroll av aktive ekspresjonssignaler som er spesifikke i de tumorale celler.

Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av de ovenfor beskrevne adenovirus for fremstilling av farmasøytiske preparater samt de derved oppnådde preparater.

Genterapien består i å korrigere en defekt eller en anomali (mutasjon, feilekspresjon, og så videre) ved innføring av genetisk informasjon i cellen eller det påvirkede organ. Denne genetiske informasjon kan innføres enten in vitro i en celle som er trukket ut fra organet, der den således modifiserte celle så gjeninnføres i organismen, eller direkte in vivo i det angjeldende vev. Forskjellige teknikker er beskrevet for innføring av denne genetiske informasjon, blant hvilke forskjellige transfeksjonsteknikker implikerer DNA-kompleks og DEAE-dekstran (Pagano et al., "J. Virol.", 1 (1967) 891), DNA og nukleære proteiner (Kaneda et al., "Science", 243 (1989 375), DNA og lipider (Felgner et al., "PNAS", 84 (1987) 7413), anvendelsen av liposomer (Fraley et al., "J. Biol. Chem.", 255 (1980) 10431), og så videre. I den senere tid har anvendelsen av virus som vektor for overføring av gener kommet som et lovende alternativ til de fysiske transfeksjonsteknikker. I denne forbindelse er forskjellige vimser prøvet med henblikk på evnen til å infisere visse cellepopulasjoner. Dette gjelder særlig retrovirusene (RSV, HMS, MMS, og så videre) HSV-virus, adeno-assosierte vimser og adenoviruser.

Tallrike génterapeutiske anvendelser blir for tiden studert, for eksempel genetiske sykdommer (myopati, mukoviskidose, SCID, og så videre), patologier i sentralnervesyste-met (Alzheimer, Parkinson, og så videre), kardiovaskulære sykdommer (hemofili, atero-sklerose), AIDS eller cancere. Mer spesielt er det når det gjelder behandling av cancere, foreslått forskjellige strategier i den kjente teknikk. Således beskriver EP 259 212 fremstillingen av vaksiner som er ment for behandling av cancere og som omfatter en modifisert vims som er i stand til å uttrykke et antigen som er spesifikt for en tumor og som tillater å generere en immunrespons mot dets celler. Videre beskriver WO 91/15580 konstruksjonen av en retrovims som inneholder et gen som koder for et ribozym hvis ekspresjon i cellekulturer tillater å destruere en mRNA av et onkogen. Det er fra WO 93/10814 likeledes kjent å anvende vektorer som uttrykker immunogener, ikke-tumorigene former av et cellulært onkogen som er implikert i utviklingen av cancere. WO 93/02556 beskriver til slutt anvendelsen av celler som er hentet fra tumoren, genetisk modifisert ex vivo ved innføring av et toksisk gen, der cellene så readministreres til pasienten. Imidlertid medfører denne arbeidsmåte kirurgiske trinn og videre er stabilite-ten for det toksiske gen i den transformerte celle ex vivo, ennu ikke påvist.

Selv om det således er oppnådd interessante resultater, tillater de konstruksjoner som er beskrevet i den kjente teknikk ikke på tilfredsstillende måte å løse visse problemer og særlig den nøyaktige målretting mot cellene som skal behandles. Således er det foreslått å benytte rekombinante retroviruser som vektorer for oppføring av terapeutiske gener. Disse vimser er ikke i stand til å infisere annet enn celler som deler seg. Imidlertid tillater denne type vektor ikke innsikting med tilstrekkelig selektivitet mot de tumorale celler. Videre kan disse vimser ikke oppnås med høye konsentrasjoner, noe som begrenser den terapeutiske effektiviteten. Det er videre foreslått direkte å administrere genet i tumoren. Her er imidlertid ikke risiki for diffusjon til omgivende celler, helt utelukket. Av denne grunn har det vært foreslått å modifisere spesifisiteten til verten for de benyttede vimser ved i deres omhylling åinnarbeide proteiner som erkjenner spesifikke reseptorer for de tumorale celler (WO 93/00103; WO 92/14829). Imidlertid tillater disse konstruksjoner ikke å oppnå tilstrekkelig treffsikkerhet, særlig fordi den benyttede vims koder for et toksisk protein som er ment for destruksjon av celler.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fordelaktig løsning på disse problemer. Den tilveiebringer således vektorer som er i stand til å styre ekspresjonen av et gitt gen se-lektivt i de tumorale celler. Foreliggende oppfinnelse er særlig basert på påvisningen av at visse kontrollsignaler for transkripsjonen er aktive spesifikt i de tumorale celler og at de kan benyttes for selektiv ekspresjon av heterologe gener. Den er likeledes resultatet av påvisningen av at adenoviruser utgjør spesielt effektive vektorer for overføring og ekspresjon av terapeutiske gener i tumorale celler. Særlig oppviser adenovirusene forde-len av ikke å integrere seg i genomet til cellene som infiseres, å holde seg der på meget stabil måte og samtidig å tillate å oppnå en varig, terapeutisk virkning, og samtidig ha et meget bredt vertsspektrum, noe som tillater en anvendelse ved behandling av cancere som påvirker enhver type celler. Videre kan de rekombinante adenovimser oppnås i høye konsentrasjoner, noe som tillater å arbeide meget høye infeksjonsmultiplisiteter og å innføre tallrike kopier av det heterologe gen pr. celle. Oppfinnelsen er videre basert på påvisningen av at vimser av adenovirustypen er i stand til å innarbeide heterologe sekvenser som omfatter ved slike promotere å overføre disse sekvenser til de tumorale celler og å uttrykke de ønskede gener under kontroll av spesifikke signaler direkte på nivå med tumoren.

En første gjenstand for oppfinnelsen er en defektiv, rekombinant adenovirus som karakteriseres ved at den omfatter en heterolog DNA-sekvens under kontroll av et ekspresjonssignal som kan induseres av eller er aktiv i nærvær av Epstein-Barr-virusen (EBV) eller papillom-virusen.

Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av en slik adenovirus for fremstilling av et far-masøytisk preparat ment for behandling og/eller prevensjon av cancer.

Til slutt angår oppfinnelsen et farmasøytisk preparat som karakteriseres ved at den omfatter en eller flere defektive, rekombinante adenoviruser som beskrevet ovenfor, fortrinnsvis i injiserbar form.

I en spesiell utførelsesform angår oppfinnelsen en adenovirus som beskrevet ovenfor som karakteriseres ved at promoteren omfatter en sekvens som responderer på EBNA1, fusjonert oppstrøms en annen viral promoter, fortrinnsvis promoteren av genet av det terminale protein 1 (TP1).

De defektive adenoviruser ifølge oppfinnelsen er adenoviruser som ikke er i stand til å replikere seg autonomt i målcellen. Generelt er genomet til de defektive adenoviruser som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen berøvet i det minste de sekvenser som er nødvendige for dets replikering i den infiserte celle. Disse områder kan enten være eliminert (helt eller delvis), gjort ikke-funksjonelle eller erstattet med andre sekvenser og særlig med det innskutte gen. Fortrinnsvis bevarer den defektive virus ikke desto mindre de sekvenser i sitt genom som er nødvendige for enkapsidering av de virale partikler.

Det foreligger forskjellige typer adenoviruser hvis struktur og egenskaper varierer noe. Disse vimser er ikke patogener for mennesker og særlig ikke for ikke-immuno-depri-merte personer. Blant serotypene foretrekker man innenfor rammen av oppfinnelsen å benytte humane adenovimser av type 2 eller 5 (Ad 2 eller Ad 5) eller adenoviruser av animalsk opprinnelse (se søknad FR 93 05954). Blant adenovimser av animalsk opprinnelse som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen skal nevnes adenovimser av canin-, bovin-, murin (for eksempel: Mavl, Beard et al., "Virology", 75 (1990) 81), ovin-, porcin-, aviar- eller også simien-opprinnelse (eksempel: SAV). Fortrinnsvis er adenovimsen av animalsk opprinnelse en canin-adenovirus og fortrinnsvis adenovirusen CAV2 (for eksempel stamme manhattan eller A26/62 (ATCC VR-800)).

Fortrinnsvis benytter man innenfor rammen av oppfinnelsen adenovimser av human-

eller canin-opprinnelse eller en blanding derav.

Som angitt ovenfor bærer adenovirusene ifølge oppfinnelsen en heterolog DNA-sekvens. Denne heterologe DNA-sekvens tillater ekspresjon av en ønsket, biologisk aktivitet på nivå med de tumorale celler. Fortrinnsvis omfatter den heterologe DNA-sekvens minst et gen valgt blant et gen som er toksisk for den infiserte celle, et gen hvis ekspresjon i det minste partielt tillater å inhibere celledelingen, eller et gen som koder for et lymfokin. Adenovirusene ifølge oppfinnelsen tillater videre muligheten for å bære flere av disse sekvenser for derved i visse tilfelle å oppnå en synergistisk, anti-tumoral effekt.

Blant genene som er toksiske for den infiserte celle kan fortrinnsvis nevnes gener hvis ekspresjonsprodukt gir cellen en sensibilitet mot et terapeutisk middel. Fortrinnsvis vel-ges det toksiske gen blant genet av thymidin-kinase hvis ekspresjonsprodukt gir mammifere celler en sensibilitet overfor visse terapeutiske midler som ganciklovir eller acyklovir. Thymidin-kinase av herpes simplex-virusen er i stand til å fosforylere nukleosidanaloger som acyklovir og ganciklovir. Disse modifiserte molekyler kan inn-arbeides i en DNA-kjede under forlengelse, noe som medfører en stans av DNA-syntesen som i sin tur medfører celledød (F.L. Moolten, "Cancer Res.", 46 (1986) 5276). Denne strategi tillater således spesifikt å eliminere cellene som eksprimerer dre-pergenet. Videre blir, da DNA-syntesen er målet for toksisiteten, kun celler under de-ling, påvirket.

Fortrinnsvis benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen genet av thymidin-kinase av human herpesvirus (hTK HSV-1). Sekvensen for dette gen er beskrevet i litteraturen (spesielt McKnight et al., "Nucleic Acid. Res.", 8 (1980) 5931).

Det er likeledes mulig å benytte genet av cytosin-desaminase hvis ekspresjonsprodukt gir mammifere celler med en sensibilitet mot 5-fluorcytosin (5-FC). Blant toksiske gener som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen kan likeledes nevnes gener hvis ekspresjonsprodukt induserer en apoptose i den infiserte celle.

Blant genene hvis ekspresjon i det minste delvis tillater åinhibere celledeling kan særlig nevnes tumor-suppressorgener (eller anti-onkogen) eller ethvert aktivt derivat derav; antisens-sekvensene eller ribozymene hvis ekspresjon i målcellen i det minste delvis tillater å inhibere ekspresjonen av gener som favoriserer celledeling.

Blant de tumor-suppressorgener som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen skal særlig nevnes genet p53 (Baker et al., "Science", 244 (1989) 217); genet Rb (Friend et al., "Nature", 323 (1986) 643; Huang et al., "Science", 242 (1988), genet rap IA (Ki-tayama et al., "Cell", 56 (1989) 77); genet DCC (Fearon et al., "Science", 247 (1990) 49), genene k—Tev2 og k—rev3; eller et hvilket som helst annet tumor-suppressorgen som er beskrevet i litteraturen (jevnfør for eksempel eksemplene i WO 91/15580).

Den heterologe DNA-sekvens kan likeledes omfatte en anti-retningssekvens hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener som favoriserer den cel-lulære proliferering. Denne kontroll kan intervenere på nivå med transkripsjonen, splei-singen av formeddeleren, nedbrytning av meddeleren, dennes traduksjon til protein eller post-traduksjonelle modifikasjoner. Fortrinnsvis omfatter den heterologe DNA-sekvens et gen som koder for et anti-retnings-RNA som er i stand til å kontrollere traduksjonen av et mål mRNA (EP 140 308). Blant de anti-retningssekvenser som kan benyttes innenfor oppfinnelsens ramme kan særlig nevnes enhver anti-retningssekvens som tillater åredusere produksjonsnivåene for onkogenene ras, mye, fos, c—erb B, og så videre.

Blant de gener som koder for lymfokiner kan man mere spesielt nevne genene som koder for interleukinene (fortrinnsvis IL—1 til IL—3), interferonene, tumornekrosefaktore-ne, de kolonistimulerende faktorer (G—CSF, M-CSF, GM-CSF, og så videre), TGF—B, og så videre. Således omfatter genet som koder for lymfokin generelt, oppstrøms den kodende sekvens, en signalsekvens som dirigerer det syntetiserte polypeptid inn i sekre-sjonsveiene for målcellen. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for lymfokiner, men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funksjo-nell signalsekvens eller en kunstig signalsekvens. Slike konstruksjoner tillater særlig å øke mengdene av lymfokin meget lokalt, og således nærværet av et tumor-spesifikt antigen, åforsterke immunresponsen mot en spesiell type tumor, noe som gir en spesielt fordelaktig virkning.

Som antydet ovenfor er den heterologe DNA-sekvens plassert under kontroll av aktive ekspresjonssignaler som spesifikke i den tumorale celle. På denne måte blir det benyttede gen ikke uttrykt og utøver sin virkning kun når en virus effektivt har infisert en tumoral celle.

Spesielt benytter man innenfor rammen av oppfinnelsen en promoter som induseres av Epstein-Barr-virusen, EBV, eller papillom-virusen.

Epstein-Barr-virusen, EBV, er forbundet med to typer humancancere, Burkitt-lymfom

og nasofarynx cancer. Anvendelsen av en rekombinant adenovirus som omfatter et toksisk gen under kontroll av en promoter som induseres av EBV, tillater med fordel spesifikt å uttrykke dette toksiske gen i de nasofarynx-tumorale celler. Ved biopsier av nasfa-rynx cancere er det regelmessig kun et nukleært antigen til stede, EBNA1, som er implikert i opprettholdelsen av det virale genom i cellene som er infisert med EBV i latent fase, og som transaktiverer den virale promoter BCR2. En spesiell gjenstand for oppfinnelsen ligger således, for spesifikk ekspresjon av et gen i nasofarynx cancerceller, åanvende en sekvens som gir respons på EBNA1 (EBNA1-RE:EBNA1 "responsivt element"). Særlig angår oppfinnelsen en adenovirus som som ekspresjonssignal omfatter en kimær promoter som omfatter en sekvens som responderer på EBNA1 som er fusjonert oppstrøms en annen viral promoter, promoteren for genet av det terminale protein 1 (TP1). Eksemplene som beskrives i foreliggende søknad viser godt at denne kimære promoter kan induseres av EBNA1.

Papillomvirusene (særlig virus HPV 16 og 18) er ansvarlige for 90% av cervix-cancere hos kvinner og er identifisert i pre-cancerøse epiteliale lesjoner (Riou et al., "Lancet", 335 (1990) 117). Produktet av genet E6 fører til dannelsen av tumorer som sterkt redu-serer mengden av vill p53, et anti-onkogen, i HPV-positive celler (Wrede et al., "Mol. Carcinog.", 4 (1991) 171). Anvendelsen av en rekombinant adenovirus omfattende et toksisk gen under kontroll av en promoter som er induserbar av HPV (for eksempel pro-teinet E6) tillater med fordel spesifikt å uttrykke dette toksiske gen i de tilsvarende tumorale celler.

Det kan videre dreie seg om inaktive ekspresjonssignaler i normale og aktive celler i de tumorale celler. Særlig kan man innenfor rammen av oppfinnelsen benytte promoteren av a-foetoprotein (E. Alpert i "Hepatocellular carcinoma", Okuda & Peter (utg.), New York, 1976,353) eller promoteren P3 av IGF-II (Sussenbach et al., "Growth Regula-tion", 2 (1992) 1), som er aktive hos voksne, kun i hepatocarcinomene. Det er likeledes å benytte promoterene som induseres av hormoner når det gjelder hormon-avhengige tumorer eller hormon-assosierte tumorer (for eksempel nyre- eller prostatatumor).

Videre kan promotersekvensene modifiseres ved tilsetning av aktiverings-, regulerings-sekvenser og så videre.

De defekte, rekombinante adenoviruser ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved en hvilken som helst kjent teknikk (Levero et al., "Gene", 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, "EMBO J.", 3 (1984) 2917). Særlig kan de fremstilles ved homolog rekombinering mellom en adenovirus og et plasmid som blant annet bærer den heterologe DNA-sekvens. Den homologe rekombinering skjer efter ko-transfektering av adenovirusen og plasmidet i en egnet cellelinje. Den benyttede cellelinje er fortrinnsvis (i) transformerbar med elementene, og (ii) bærer sekvensene som er i stand til å komplementere genomde-len av den defekte adenovirus, fortrinnsvis i integrert form for å unngå risiki for rekombinering. Som eksempel på en cellelinje kan nevnes human embryonyrelinjen 293 (Graham et al., "J. Gen. Virol.", 36 (1977) 59) som særlig, integrert i sitt genom, inneholder den venstre del av genomet av en adenovirus Ad5 (12%). Konstruksjonsstrategiene for vektorene avledet fra adenoviruser er likeledes beskrevet i FR 93 05954 og FR 93 08596.

Til slutt blir de multipliserte adenoviruser gjenvunnet og renset i henhold til klassiske teknikker innen molekylbiologien som illustrert i eksemplene.

Foreliggende oppfinnelse angår likeledes et farmasøytisk preparat omfattende en eller flere defektive, rekombinante adenoviruser som beskrevet ovenfor. Fortrinnsvis inneholder de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen en farmasøytisk akseptabel bærer for en formulering som direkte kan injiseres i tumorene som skal behandles. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske oppløsninger eller tørkede preparater, særlig lyo-filiserte, som ved tilsetning for eksempel av sterilisert vann eller fysiologisk serum tillater konstituering av injiserbare væsker. Den direkte injeksjon i tumoren som skal behandles er fordelaktig for dette tillater å konsentrere den terapeutiske virkning på nivå med det påvirkede vev. Imidlertid er det også mulig å benytte farmasøytiske preparater som er formulert med henblikk på administrering av topisk, oral, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokulær, transdermal vei eller andre veier.

Dosene av defektive, rekombinante adenoviruser som benyttes for injeksjon kan tilpas-ses som en funksjon av forskjellige parametere og særlig som en funksjon av den benyttede administreringsvei, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den tilsiktede behandlingsvarighet. Rent generelt blir de rekombinante adenoviruser ifølge oppfinnelsen formulert og administrert i form av doser som ligger mellom 1 0^ og 10^<4> pfu/ml og fortrinnsvis 10*> og 10^ pfu/ml. Uttrykket pfu eller "plaque forming unit" uttrykker infeksjonskraften for en virusoppløsning og bestemmes ved infeksjon av en egnet cellekultur og etterfølgende måling, generelt efter 48 timer, av antallet infek-terte cellepopulasjoner. Teknikkene for bestemmelse av pfu-titeren i en viral oppløsning er godt dokumentert i litteraturen.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør således en meget effektiv behandling eller prevensjon av cancere. Den er særlig tilpasset behandling av nasofarynx-cancere eller hepato-carcinomer.

Dette gjelder både mennesker og dyr av typen oviner, boviner, husdyr (hunder, katter og så videre), hester, fisk, og så videre.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av de nedenfor følgende eksempler under henvisning til de ledsagende figurer der:

Figur 1 illustrerer vektoren pONT-tk; og

Figur 2illustrerer vektoren pONT-B-gal.

Generelle teknikker i mikrobiologien

De klassiske metoder som benyttes i molekylbiologien, for eksempel preparativ ekstrahering av plasmidisk DNA, sentrifugering av plasmidisk DNA i cesiumkloirdgradient, elektroforese på agarose- eller akrylamidgel, rensing av DNA-fragmenter ved elektroe-luering, ekstrahering av proteiner med fenol eller fenol-kloroform, precipitering av DNA i saltmedium med etanol eller isopropanol, transforming i Eschehchia coli, og så videre, er alle velkjente for fagmannen og rikelig beskrevet i litteraturen [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (utg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].

Plasmidene av typen pBR322, pUC og fagene fra serie M13 er av kommersiell opprinnelse (Bethesda Research Laboratories).

For ligaturene kan DNA-fragmentene separeres i henhold til størrelse ved elektroforese

i agarose- eller akrylamidgel, ekstraheres med fenol eller med en blanding av fenol og kloroform, precipiteres fra etanol og deretter inkuberes i nærvær av DNA-ligase av fag T4 (Biolabs) i henhold til leverandørens anbefalinger.

Oppfyllingen av de proeminente 5-ender kan gjennomføres med Klenow-rfagmentet av DNA-polymerase IE. coli (Biolabs) i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Desim-eringen av de proeminente 3'-ender gjennomføres i nærvær av DNA-polymerase av fag T4 (Biolabs), benyttet i henhold til fabrikantens anbefalinger. Destmeringen av de pro-

eminente 5'-ender gjennomføres ved en behandling med nuklease Sl.

Den styrte mutagenese in vitro med syntetiske oligodeoksnukleotider kan gjennomføres i henhold til den metode som er utviklet av Taylor et al. i "Nucleic Acids Res.", 13

(1985) 8749-8764, under anvendelse av den kitt som markedsføres av Amersham. Den enzymatiske forsterkning av DNA-fragmentene ved den teknikk som kalles PCR (Polymérase-catalyzed Chain Reaction", Saiki R.K. et al., "Science", 230, (1985) 1350-1354; Mullis K.B. og Faloona F.A., "Meth. Enzym.", 155 (1987) 335-350), kan gjen-nomføres ved å benytte en "DNA thermal cycler" (Perkin Eimer Cetus) i henhold til fabrikantens spesifikasjoner.

Verifiseringen av nukleotidsekvensene kan gjennomføres ved den metode som er utviklet av Sanger et al. i "Proe. Nati. Acad. Sei.", USA, 74 (1977) 5463-5467, under anvendelse av den kitt som markedsføres av Amersham.

Oppfinnelsen skal beskrives under henvisning til de følgende eksempler.

Eksempel 1. Konstruksjon av en vektor Ad-ONT-tk som bærer tk-genet under

kontroll av kimær promoter EBNA1—RE/TP1 (figur 1).

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av en rekombinant adenovirus omfattende genet av thymidin-kinase av herpes simplex-virus, tk, under kontroll av en promoter som spesifikt er aktiv i celler som er infisert med EBV-virus (promoter-kimær EBNA1-RE/TP1).

1.1. Konstruksjon av plasmidet p7tkl.

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av plasmidet p7tkl inneholdende den åpne lesefase av genet tk på 1131 basepar (ATG 114—116 og kodonstopp TG A 1242-1244), innskutt i et kloningsmultisete.

Fragmentet Bglll-Ncol inneholdende genet av thymidin-kinase (tk) av herpes simplex-virus type 1 isoleres fra plasmid pHSV-106 (markedsføres av Gibco BRL), repareres ved innvirkning av Klenow-rfagmentet og skytes så inn på setet Smal av plasmid pGEM7zf(+) (markedsføres av Promega). Setene Smal og Bglll destrueres under dette trinn, mens setet Ncol bevares.

Det oppnådde plasmid kalles p7tkl.

1.2. Konstruksjon av plasmid pONTl.

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av et plasmid inneholdende en kimær promoter bestående av en sekvens som er nødvendig for transaktivering med antigen EBNA1 og promoter TP1 av virus EBV.

Fragmentet EcoRI(7315)-SmaI(8191) av virus EBV isoleres fra stammen B95-8. Den totale sekvens for virus EBV er beskrevet av Baer et al., "Nature", 310 (1984) 207. Dette fragment inneholder de sekvenser som er nødvendig for transaktivering med det nukleære antigen 1 (EBNA1) (D. Reisman & B. Sugden, 1986, "Molecular and Cellular Biology", vol. 6, s. 3838-3846). Dette fragment ble derefter fusjonert til fragment Nrul(166 241)-PstI(166 559) av EBV B95-8 (sete Pstl digereres med polymerase T4), inneholdende promoteren TP1. Den således oppnådde kimære promoter skytes så inn i kloningsmultisetet av plasmid pBluescript II SK.

Det oppnådde plasmid kalles pONTl.

1.3. Konstruksjon av plasmid pONTtk.

Plasmid pONTtk omfattende genet av thymidin-kinase av herpes simplex-virus (tk), klonet inn i plasmid p7tkl, under kontroll av den kimære promoter EBNA1-RE/TP1 klonet inn i plasmid pONTl.

For å konstruere dette plasmid blir fragmentet BamHI-XhoI av pONTl som inneholder den kimære promoter som er transaktivert EBNA-1 og EBNA-2, og fragmentet Xhol-Clal av p7tkl som inneholder den åpne lesefase av tk, klones til setene BamHI (478) og Clal (4550) av plasmidet pAd.RSVBgal. Plasmidet pAd.RSVBGal inneholder, i retning

fragmentet PvuII tilsvarende den venstre ende av adenovirus Ad5 omfattende: sekvensen UR, replikeringsopprinnelsen, enkapsideringssignalene og forsterkeren EIA;

genet som koder for B-galaktosidase under kontroll av promoteren RSV (virusen av Rous-sarkomet);

et andre fragment av genomet av adenovirus Ad5 som tillater homolog rekombinering mellom plasmid pAd.RSVBGal og adenovirus dl 324. Plasmidet pAd.RSOBGal er beskrevet av Stratford-Perricaudet et al. ("J. Clin. Invest.", 90 (1992) 626).

Alle kloningssetene bevares. Det oppnådde plasmid kalles pONTtk (figur 1).

1.4. Konstruksjon av det rekombinante adenovirus Ad- ONT- tk.

Vektoren pONTtk lineariseres og ko-transfekteres med en deficient, adenoviral vektor, i hjelperceller (linje 293) som i trans bærer funksjoner som er kodet av områdene El (El A og El IB) av adenovirus.

Mer spesielt blir adenovirus Ad-ONT-tk oppnådd ved homolog rekombinering in vivo mellom den mutante adenovirus Ad-dl324 (Thimmappaya et al., "Cell", 31 (1982) 543) og vektoren pONTtk, i henhold til den følgende protokoll: plasmidet pONTtk, linearisert med XmnI, og adenovirusen dl324, linearisert med enzymet Clal, ko-transfekteres i linje 293 i nærvær av kalsiumfosfat for å tillate homolog rekombinasjon. De således oppnådde, rekombinante adenoviruser seleksjoneres ved rensing på plaque. Efter isole-ring blir DNA av den rekombinante adenovirus forsterket i linje 293, noe som fører til en kultursupematant inneholdende den ikke-rensede, rekombinante adenovirus med en titer på ca. 10^ pfu/ml.

De virale partikler renses generelt ved sentrifugering over en cesiumkloirdgradient i henhold til kjente teknikker (se særlig Graham et al. i "Virology", 52 (1973) 456. Adenovirusen Ad-ONT-tk kan bevares ved — 80°C i 20% glycerol.

Eksempel 2. Konstruksjon av vektoren Ad-ONT-Bgal

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av en rekombinant adenovirus omfattende genet av B-galaktosidase av E.coli (Bgal) under kontroll av en promoter som spesifikt er aktivt i cellene som er infisert med virus EBV (kimær promoter EBNA1-RE/TP1).

2.1. Konstruksjon av plasmid pONT- figal.

Fragmentet Xbal-(Hindlll) av plasmid pONTl som inneholder den kimære promoter som er transaktivert med EBNA-1 og EBNA-2 og fragmentet (Stul)-Kpnl av plasmid pAd.RSVBgal som inneholder genet av B-galaktosidase, klones til setene Xbal (484 og Kpnl (4520) av plasmid pAd.RSVBgal. Setene Hindlll og Stul destrueres under dette trinn. Det oppnådde plasmid kalles pONT-Bgal (figur 2).

2.2. Konstruksjon av adenovirusen Ad- ONT- Bgal.

Vekten pONT-Bgal som oppnås i eksempel 2.1 benyttes, ved homolog rekombinasjon i henhold til den protokoll som er beskrevet under 1.4, for å fremstille en rekombinant adenovirus som omfatter genet av B-galaktosidase av E.coli (Bgal) under kontroll av den kimære promoter EBNAl-RE/TPl. Adenovirusen Ad-ONTl-Bgal som oppnås på denne måte kan bevares ved —80°C i 20% glycerol.

Eksempel 3. Konstruksjon av vektoren pONT-CAT

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av en vektor omfattende genet av kloramfeni-kolacetyltransferase (CAT) under kontroll av en promoter som spesifikt er aktiv i de infiserte celler ved virus EBV (kimær promoter EBNA1—RE/TP1).

3.1. Konstruksjon av vektoren.

Promoteren TP1 av EBV isoleres i form av fragmentet Nrul(166241)-Pstl(166559) av EBV. Dette fragment fusjoneres så til genet CAT og skytes, i form av et fragment Nrul-BamHI, inn i plasmid pGem7ZF (Promega). Det resulterende plasmid kalles pTPl-CAT. Fragmentet NruI-BamHI av plasmid pTPl-CAT blir derefter fusjonert, oppstrøms fragmentet EcoRI(7315)-SmaI(8191) av EBV-stamme B95-8, inneholdende de sekvenser som er nødvendige for transaktivering med EBNA1 (jevnfør eksempel 1.2). Det oppnådde fragment, omfattende genet CAT under kontroll av den kimære promoter EBNAl-RE/TPl, skytes inn på setene EcoRI og BamHI av plasmidet pBluescript SK for å oppnå plasmid pONT-CAT. Det konstrueres likeledes et plasmid der elementene for respons på antigen EBNA2 av promoter TP1, er utelatt. For dette formål isoleres promoteren TP1 i form av fragment Nrul(166375)-Pstl( 166559) av EBV. Dette plasmid kalles pOST-CAT.

3.2. Aktivitet in vitro.

Dette eksempel viser at de ovenfor beskrevne konstruksjoner spesifikt induseres av antigener for Epstein-Barr-viruset.

Vektorene pONT-CAT, pOST-CAT og pTPl-CAT transfekteres ved elektroporering i en linje av lymfocyttene B EBV" (cellene DG75), enten alene eller i nærvær av ekspre-sjonsvektorer for de virale antigener EBNA1, EBNA2 eller EBNA1 + EBNA2. 48 timer efter transfeksjon lyseres cellene ved frysing/tining, celledebris fjernes, de oppnådde ekstrakter normaliseres i henhold til proteinmengdene. CAT-aktiviteten bestemmes derefter i ekstraktene ved enzymatisk bestemmelse. De oppnådde resultater er som følger: Disse resultater viser klart at promoteren ONT spesifikt er aktiv i nærvær av antigenene EBNA1 og EBNA2 og at den induserer en sterk ekspresjon av genet CAT.

Claims (17)

1. Defektiv, rekombinant adenovirus, karakterisert ved at den omfatter en heterolog DNA-sekvens under kontroll av en promoter som induseres av Epstein-Barr-virusen (EBV) eller papillom-virusen.

2. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at promoteren omfatter en sekvens som responderer på antigenet EBNA1.

3. Adenovirus ifølge krav 2, karakterisert ved at promoteren består av en kimær promoter omfattende en sekvens som responderer på EBNA1, fusjonert oppstrøms en annen viral promoter, fortrinnsvis promoteren av gen av det terminale protein 1 (TP1).

4. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 ti 13,karakterisert ved at det er berøvet de regioner i sitt genom som er nødvendige for replikering i målcellen.

5. Adenovirus ifølge krav 4, karakterisert ved at den human adenovirus type Ad5 eller en canin adenovirus av typen CAV-2.

6. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at den heterologe DNA-sekvens inneholder minst et gen som er toksisk for målcellen.

7. Adenovirus ifølge krav 6, karakterisert ved at det toksiske genet er et gen hvis ekspresjonsprodukt gir den infiserte celle en sensibilitet overfor et terapeutisk middel.

8. Adenovirus ifølge krav 7, karakterisert ved at det toksiske gen er et gen av thymidin-kinase og det terapeutiske middel er gancyklovir eller acyklovir.

9. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at den heterologe DNA-sekvens inneholder minst et gen hvis ekspresjon i det minste partielt tillater å inhibere celledeling.

10. Adenovirus ifølge krav 9, karakterisert ved at genet er valgt blant tumor-suppressorgener, anti-retningssekvenser og ribozymer.

11. Adenovirus ifølge krav 6, karakterisert ved at den heterologe DNA-sekvens inneholder minst et gen hvis ekspresjonsprodukt induserer apoptose i den infiserte cellen.

12. Anvendelse av en adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11 for fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling og/eller prevensjon av cancer.

13. Anvendelse av en adenovirus ifølge krav 2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling og/eller prevensjon av nasofarynx cancer.

14. Anvendelse ifølge krav 12 eller 13 for fremstilling av et farmasøytisk preparat med henblikk på direkte administrering i tumoren som skal behandles.

15. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en eller flere defektive, rekombinante adenoviruser ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11.

16. Farmasøytisk preparat ifølge krav 15, karakterisert ved at det foreligger i injiserbar form.

17. Adenovirus ifølge krav 1 med en kimær promoter, karakterisert ved at promoteren omfatter en sekvens som responderer på EBNA1, fusjonert oppstrøms en annen viral promoter, fortrinnsvis promoteren av genet av det terminale protein 1 (TP1).