CA2176585A1 - Adenovirus recombinants pour la therapie genique des cancers - Google Patents
Adenovirus recombinants pour la therapie genique des cancersInfo
- Publication number
- CA2176585A1 CA2176585A1 CA002176585A CA2176585A CA2176585A1 CA 2176585 A1 CA2176585 A1 CA 2176585A1 CA 002176585 A CA002176585 A CA 002176585A CA 2176585 A CA2176585 A CA 2176585A CA 2176585 A1 CA2176585 A1 CA 2176585A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- gene
- adenovirus
- adenovirus according
- promoter
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
La présente invention concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN hétérologue sous le contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales, leur préparation, et leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention des cancers.
Description
_ W O95/14101 2 1 7 6 5 8 5 PCTnFRg4/01284 ADEN W IRUS RECOMBINANTS POUR LA THERAPIE GENIQUE DES CANCERS
La présente invention concerne des vecteurs recornbin~nt.~ d'origine virale et leur utili.~tion pour le traitement des can~Pr~. Plus particulièrement, elle conceme des adénovirus recombinants co.npo~lanl une séquence d'ADN hétérologue sous le c,ontrole de signaux d't:A~r~s~ion actifs specifiqu~ t dans les cellules tumorales.
L'invention concerne égalPmPnt la p~p~lion de ces ve~;~e~, les compositions pl~ eu~ ues les contenant et leur utilisation en thérapie génique.
La thérapie génique collsi~e à corriger une ~lP.fi~ n-e ou une ~n(nm~lie (mutationJ expression abellal"e, etc) par intr~llction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette inform~tinn génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule mo(lifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu applo~ié. Dirrére,-Les techniques ont été décrites pour l'introdt~chQn de cette inform~tion génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413),1'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative promettel~e à ces techniques physiques detransfection. A cet égard, dirré~ virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les le~virus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
De nombreuses applications de la thérapie génique sont en cours d'étude, telles que les maladies génétiques (ll~yopa~llie, mucovi~cj~lose, SCID, etc), les pathologies du système nerveux central (~l7hPimPr, Parkinson, etc), les maladiescardiovasculaires (hémophilie, athérosclérose), le SIDA ou les cancers. Plus particulièrement, concernant le traitement des cancers, dirrél~ es stratégies ont été
proposées dans l'art antérieur. Ainsi, la ~em~n~l~P EP 259 212 décrit la préparation de 30 vaccins destinés au traitement des cancers, col.lpre.lant un virus modifié capable d'exprimer un antigène spécifique d'une tumeur, permettant de générer une réponse immunitaire contre ces cellules. Par ailleurs, la dem~n(le W O91/15580 décrit laconstruction de rétrovirus contenant un gène codant pour un ribozyme, dont s~ion en culture cellulaire peut permettre de détruire un ARNm d'un oncogène.
woss/l4l01 2 1 7 6 5 8 5 l~l/r~s/0l284 Il est également connu de la demande WO 93/10814 d'utiliser des vecteurs exprimant des formes immunogéniques, non tumorigénique, d'oncogène cellulaires impliqués dans le développement des cAn~rs. La demAn-ie WO 93/02556 décrit enfin l'ntili~Atinn de cellules prélevées dans la tumeur, m~xlifiées génétiquement ex vivo par introduction 5 d'un gène toxique, puis .æari~";~ es au patient. Toutefois, cette approche impose des étapes de chilu~gie, et de plus, la stabilité du gène toxique dans la cellule l.~lsr~"lnée ex vivo n'est pas l~...onl,~e.
Aussi, bien que des résultats illlé.e:~&n~s aient été obtenus, les constructionsdécrites dans l'art antérieur ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante certaines difficultés, et nol~ .ent le ciblage précis des cellules à traiter. Ainsi, il a été
proposé d'utiliser des rel-~vi~ls recombinants cornme vecteurs pour le transfert de gènes thérapeutiques. En effet, ces virus ne sont capables d'infecter que les cellules qui se divisent. Cepçn~Ant, l'emploi de ce type de vecteur ne permet pas de cibler avec sl~rri.CA-~ ent de sélectivité les cellules tumorales. De plus, ces virus ne peuvent être obtenus avec des titres très élevés ce qui limité l'effira~ité thérapeutique. Il a par ailleurs été proposé d'a~imini~trer directement le gène dans la tumeur. Ici encore, les risques de diffusion aux cellules el,vi~onl~Alllp~ ne sont pas exlus. Pour cette raison, il a été proposé de modifier la spécificité d'hote des virus utilisés, en incorporant dans leur enveloppe des protéines reconn~i~.c~nt des récepteurs spécifiques de cellules tumorales (WO93/00103; WO92/14829). Toutefois, ces constructions ne permettent pas d'obtenir des ciblages s1~ffi~ntc, notamment lorsque le virus utilisé code pour une protéine toxique destinee à la destruction des cellules.
La présente invention apporte une sollltion avantageuse à ces problèmes. Elle fournit en effet des ve~;lelus capables de diriger l'expression d'un gène donné
2s sélectivement dans les cellules tumorales. La présente invention repose en particulier sur la mise en évidence que certains signaux de controle de la transcription sont actifs (ou activés) spécifiquement dans les cellules tumorales, et qu'ils peuvent être utilisés pour l'expression sélective de gène hétérologues. Elle résulte également de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression de gènes thérapeutiques dans les cellules tumorales. En particulier, les adénovirus présentent l'avantage de ne pas s'intégrer au génome des cellules qu'ils infectent, de s'y m~int~nir de manière très stable ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable, et d'avoir un spectre d'hôte très large, ce qui permet une application au traitement de cancers affectant tout type de cellules. De plus, des 3~ adénovirus recombinants peuvent être obtenus avec des titres élevés, ce qui permet de WO 95tl4101 P~llr~ 1/01284 travailler à des multiplicités d'infection élevées, et d'introduire plusieurs copies du gène hétérologue par cellule. L'invention repose également sur la mise en évidence que les virus de type adénovirus sont capables d'incorporer des séquences hétérologues co-l-prenant de tels promoteurs, de transférer ces séquences dans les cellules s tumorales, et d't:A~imer des gènes désirés sous le controle de signaux spécifiques dire.-le..,~nl au niveau de 11~mPl~rs.
Un p.e,llier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant défectif co~ n~ll une séquence d'ADN hétérologue sous le contrôle de signaux d'e~,~ion actifs spécifiquement dans les cellules tumorales.
L'invention a é~lP,mPnt pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus rec~mbin~nt défectif pour la pr~pa~alion d'une co-~lpo~i~ion ph~n-n~ceutique destinée au tr~itPmP-nt ou à la ~venlion des cancers.
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adéno-virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences npcec.c~ires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré.
P~erérenliellement, le virus défectif conserve né~nmoinc les séquences de son génome qui sont nPcPcc~ires à l'Pn-~p~ tion des particules virales.
Il existe di~-~n~ sé-ulype~ d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Néanmoins, ces virus ne sont pas pathogènes pour l'homme, et not~mm~nt les sujets non immuno--lepnm.os. Parmi ces séiu~yl)es, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus hnm~in~ de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir ~lem~n~e FR 93 05954). PalTni les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV).
De p,~fe~ ce, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus ~n~rel~ iellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~ n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple].
De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine ..."~;ne ou canine ou mixte.
Comme indiqué ci-dessus, les adénovirus de l'invention portent une séquence 35 d'ADN hétérologue. Cette séquence d'ADN hétérologue permet l'expression d'une WO9~/14101 2 1 7 6 5 8 5 PCT~g4/01284 activité biologique recherchée au niveau des cellules tumorales. De préférence, la séquence d'ADN hétérologue comprend au moins un gène choisi parmi un gène toxique pour la cellule infectée, un gène dont l'expression permet d'inhiber au moins parti~ll.om~nt la division cellulaire, ou un gène codant pour une lymph~ in~. Les s adénovirus de l'invention peuvelll en outre con-po-le, plusieurs de ces séquences, afin d'obtenir dans certains cas un effet synergique anti-tumoral.
Parmi les gènes toxiques pour la cellule i~fectée, on peut citer éfele~ m~nt les gènes dont le produit d'e~.e~ion confère à la cellule une s~n.cihilite à un agent thél~peulique. Plus préféLellliellement, le gène toxique est choisi 0 parmi le gène de la l~-yn~;d ne kinase, dont le produit d'eA~Ie~ion confère aux cellules irè.es une s~ncihilité à certains agents thérapeutiques tels le ganciclovir ou l'acyclovir. La thymidine kinase du virus de l'herpès simplex est capable de phosphoryler les analogues de nucléosides tels que l'acyclovir et le ganciclovir. Ces molec~ c malifiees peuvel-l être incorporées dans une chaine d'ADN encours d'ék~ng~tinn~ ce qui a pour consé4uence l'arrêt de la synthèse d'ADN, entrainant la mort de la cellule (F.L. Moolten, Cancer Res. 46 (1986) 5276). Cette stratégie permet ainsi d'élimin~r spécifiquè-l.e,-L les cellules e~l~lim~nl le gène suicide. De plus, la synthèse d'ADN étant la cible de la toxicité, seules les cellules encours de division sont affectées.
Plus préfé-e,.liellement, on utilise dans le cadre de la présente invention le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (hTK HSV-1). La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight et al., Nucleic Acid. Res. 8 (1980) 5931).
Il est é~l~m~nt possible d'utiliser le gène de la cytosine ~les~ ;n~ce~ dont le 2s produit d'e~es~ion confère aux cellules ~K~;rèlès une s~n.~ihilité à la 5-fluoro-cytosine (5-FC). Par ailleurs, parmi les gènes toxiques ~Itili~hles dans le cadre de la présente invention, on peut citer égalernent les gènes dont le produit d'expression induit une apoptose de la cellule infectée.
Parmi les gènes dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire, on peut citer plus particulièrement les gènes suppresseur de tumeur (ou anti-oncogène) ou tout dérivé actif de ceux-ci; les séquences antisens ou les ribozymes, dont l'expression dans la cellule cible permet d'inhiber au moins partiel-lement l'expression de gènes favorisant la division cellulaire.
Parmi les gènes suppresseurs de tumeur lltili.e~hl~ dans le cadre de la présente invention, on peut citer plus particulièrement le gène p53 (Baker et coll., WO95/l4lOl 2 1 76585 l~ir~S/0l284 Science 244 (1989) 2]7); le gène Rb (F!iend et coll., Nature 323 (1986) 643; Huang et coll., Science 242 (1988) 1563), le gène rap lA (Kitayama et coll., Cell 56 (1989) 77); le gène DCC (Fearon et coll., Science 247 (1990) 49), les gènes k-rev2 et k-rev3;
ou tout autre gène suppresseur de tumeur décrit dans la lilLé,alu~e (Cf part exemple 5 WO 91/15580).
La séquence d'ADN hétérologue peut eg~lem~nt co.~.p-endre une séquence ~nti~Pn.c, dont l~ ;on dans la cellule cible permet de contrôler ll~A~ sion de gènes ~IVUliSall~ la prolifération cellulaire. Ce controle peut ~ au niveau de la lldl~cri,vlion, du splicing du prémessager, de la dégradation du messager, de sa10 traduction en protéine, ou de modifications post-traductionnelles. ~ ,el,liellement.
la séquence d'ADN hétérologue comporte un gène codant pour un ARN ~nti.cens capable de controler la traduction d'un ARNm cible (EP 140 308). Parmi les séquences ~nticf~.n.c utili~bl~s dans le cadre de l'invention, on peut citer plus particulièrement toute séquence ~nticen.c permettant de .li",in,ler les niveaux de production des15 oncogènes ras, myc, fos, c erb B, etc.
Parmi les gènes codant pour des lymph~in~s, on peut citer plus particulièl~.,-el,t les gènes codant pour les interleukines (IL-1 à IL-3 de pl~félellce), les interférons, les facteurs de nécrose des tumeurs, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc), le TGF-13, etc. Par ailleurs, le gène codant 20 pour la lymrhokine co,l,p~e,ld généralement, en amont de la séquence codante, une séquence signal tliri~nt le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de la lymph~1~inP, mais il peut eg~lemP.nt s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. De telles constructions pennettent en particulier 25 d'augmenter les taux de lymphokine de manière très localisée, et ainsi, en présence d'un antigene spécifique de tumeur, d'amplifier la réponse jmmlmit~ire contre un typeparticulier de tumeur, ce qui donne un effet particulièrement avantageux.
Comme indiqué ci-dessus, la séquence d'ADN hétérologue est placée sous le contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. De 30 cette façon, le gène utilisé n'est exprimé et ne produit son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule tumorale.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, il s'agit de signau~;
d`eA,ul~s~ion induitc par ou actifs en présence de virus respon.ca~lçs ou associés à des tumeurs. Encore plus pr~félentiellement, on utilise dans le cadre de la présente wog5ll4l0l 2 1 7 6 5 8 5 l~,l/r~1/01284 invention un signal d'expression inductible par le virus d'Epstein-Barr (EBV) ou par le virus du papillome.
Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est associé à deux types de cancers hllm~in.s:
le ly...phn..~e de Burkitt et le cancer du nasopharynx. L'~ltili.~ation d'un adénovirus 5 recombin~nt colnpreilan~ un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur in~t~ctible par l'EBV permet av~nt~ nt d'exprimer spé-ifiguem~nt ce gène toxique dans les cellules tumorales du nasopha..ynx. Dans les hiop~ c de cancers du nasopharynx, un seul ~nti~en~ nucléaire est réguliè~ en~ présent, EBNA1, qui est impli~ e dans la l"~;n~ ce du génome viral dans les cellules infectées par l'EBV en phase latente, et qui transactive le promoteur viral BCR2. Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'~ti~ tion~ pour l'expression spécifique d'un gène dans les cellules de cancers du nasoph~yn~, d'une séquence répondant à EBNA1 (EBNA1-RE: EBNA1 "responsive element"). En particulier, l'invention concerne un adénovirus co--,preilant comme signal d'ex~ ion un promoteur chimère col-lprenal,L une séquence répondant à
EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, le promoteur du gène de la terminale protéine 1 (TP1). Les exemples décrits dans la présente ~l~m~n~ montrent bien que ce promoteur chimère est inductible par EBNA1.
Les virus du papillome (notamment le virus HPV 16 et 18) sont responsables de 90 % des cancers du cervix chez la femme et ont été i~ntifi~s dans des lésions épithéliales pré-cancéreuses (Riou et al., Lancet 335 (1990) 117). Le produit du gène E6 conduit à la forrnation de turneurs en ~ nl.~ fo-l~nle-ll la quantité de p53 sauvage, un anti-oncogène, dans les cellules HPV-posilives (Wrede et al., Mol.
Carcinog. 4 (1991) 171). L'utili~ticn d'un adénovirus recomhin~nt co",~rellant un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur in~ chhle par le HPV (par exemple la protéine E6) perrnet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans les cellules humorales co.lespondantes.
Il peut encore s'agir de signaux d'expression inactifs dans les cellules norrnales et actifs dans les cellules tumorales. En particulier, on peut utiliser dans le cadre de la présente invention le promoteur de l'a-foelop,.~léine (Alpert E., dans Hepatocellular carcinoma, Okuda & Peters (eds), New York, 1976, 353) ou le promoteur P3 de l'IGF-II (Sussenbach et al., Growth Regulation 2 (1992) 1), qui sont actifs chezl'adulte, uniquement dans les hépatocarcinomes. Il est également possible d'utiliser des promoteurs induits par des hormones dans le cas de tumeurs horrnono-dépPn-l~ntes ou hormonaux associées (turneur du sein ou de la prosla~e par exemple).
La présente invention concerne des vecteurs recornbin~nt.~ d'origine virale et leur utili.~tion pour le traitement des can~Pr~. Plus particulièrement, elle conceme des adénovirus recombinants co.npo~lanl une séquence d'ADN hétérologue sous le c,ontrole de signaux d't:A~r~s~ion actifs specifiqu~ t dans les cellules tumorales.
L'invention concerne égalPmPnt la p~p~lion de ces ve~;~e~, les compositions pl~ eu~ ues les contenant et leur utilisation en thérapie génique.
La thérapie génique collsi~e à corriger une ~lP.fi~ n-e ou une ~n(nm~lie (mutationJ expression abellal"e, etc) par intr~llction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette inform~tinn génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule mo(lifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu applo~ié. Dirrére,-Les techniques ont été décrites pour l'introdt~chQn de cette inform~tion génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413),1'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative promettel~e à ces techniques physiques detransfection. A cet égard, dirré~ virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les le~virus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
De nombreuses applications de la thérapie génique sont en cours d'étude, telles que les maladies génétiques (ll~yopa~llie, mucovi~cj~lose, SCID, etc), les pathologies du système nerveux central (~l7hPimPr, Parkinson, etc), les maladiescardiovasculaires (hémophilie, athérosclérose), le SIDA ou les cancers. Plus particulièrement, concernant le traitement des cancers, dirrél~ es stratégies ont été
proposées dans l'art antérieur. Ainsi, la ~em~n~l~P EP 259 212 décrit la préparation de 30 vaccins destinés au traitement des cancers, col.lpre.lant un virus modifié capable d'exprimer un antigène spécifique d'une tumeur, permettant de générer une réponse immunitaire contre ces cellules. Par ailleurs, la dem~n(le W O91/15580 décrit laconstruction de rétrovirus contenant un gène codant pour un ribozyme, dont s~ion en culture cellulaire peut permettre de détruire un ARNm d'un oncogène.
woss/l4l01 2 1 7 6 5 8 5 l~l/r~s/0l284 Il est également connu de la demande WO 93/10814 d'utiliser des vecteurs exprimant des formes immunogéniques, non tumorigénique, d'oncogène cellulaires impliqués dans le développement des cAn~rs. La demAn-ie WO 93/02556 décrit enfin l'ntili~Atinn de cellules prélevées dans la tumeur, m~xlifiées génétiquement ex vivo par introduction 5 d'un gène toxique, puis .æari~";~ es au patient. Toutefois, cette approche impose des étapes de chilu~gie, et de plus, la stabilité du gène toxique dans la cellule l.~lsr~"lnée ex vivo n'est pas l~...onl,~e.
Aussi, bien que des résultats illlé.e:~&n~s aient été obtenus, les constructionsdécrites dans l'art antérieur ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante certaines difficultés, et nol~ .ent le ciblage précis des cellules à traiter. Ainsi, il a été
proposé d'utiliser des rel-~vi~ls recombinants cornme vecteurs pour le transfert de gènes thérapeutiques. En effet, ces virus ne sont capables d'infecter que les cellules qui se divisent. Cepçn~Ant, l'emploi de ce type de vecteur ne permet pas de cibler avec sl~rri.CA-~ ent de sélectivité les cellules tumorales. De plus, ces virus ne peuvent être obtenus avec des titres très élevés ce qui limité l'effira~ité thérapeutique. Il a par ailleurs été proposé d'a~imini~trer directement le gène dans la tumeur. Ici encore, les risques de diffusion aux cellules el,vi~onl~Alllp~ ne sont pas exlus. Pour cette raison, il a été proposé de modifier la spécificité d'hote des virus utilisés, en incorporant dans leur enveloppe des protéines reconn~i~.c~nt des récepteurs spécifiques de cellules tumorales (WO93/00103; WO92/14829). Toutefois, ces constructions ne permettent pas d'obtenir des ciblages s1~ffi~ntc, notamment lorsque le virus utilisé code pour une protéine toxique destinee à la destruction des cellules.
La présente invention apporte une sollltion avantageuse à ces problèmes. Elle fournit en effet des ve~;lelus capables de diriger l'expression d'un gène donné
2s sélectivement dans les cellules tumorales. La présente invention repose en particulier sur la mise en évidence que certains signaux de controle de la transcription sont actifs (ou activés) spécifiquement dans les cellules tumorales, et qu'ils peuvent être utilisés pour l'expression sélective de gène hétérologues. Elle résulte également de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression de gènes thérapeutiques dans les cellules tumorales. En particulier, les adénovirus présentent l'avantage de ne pas s'intégrer au génome des cellules qu'ils infectent, de s'y m~int~nir de manière très stable ce qui permet d'obtenir un effet thérapeutique durable, et d'avoir un spectre d'hôte très large, ce qui permet une application au traitement de cancers affectant tout type de cellules. De plus, des 3~ adénovirus recombinants peuvent être obtenus avec des titres élevés, ce qui permet de WO 95tl4101 P~llr~ 1/01284 travailler à des multiplicités d'infection élevées, et d'introduire plusieurs copies du gène hétérologue par cellule. L'invention repose également sur la mise en évidence que les virus de type adénovirus sont capables d'incorporer des séquences hétérologues co-l-prenant de tels promoteurs, de transférer ces séquences dans les cellules s tumorales, et d't:A~imer des gènes désirés sous le controle de signaux spécifiques dire.-le..,~nl au niveau de 11~mPl~rs.
Un p.e,llier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant défectif co~ n~ll une séquence d'ADN hétérologue sous le contrôle de signaux d'e~,~ion actifs spécifiquement dans les cellules tumorales.
L'invention a é~lP,mPnt pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus rec~mbin~nt défectif pour la pr~pa~alion d'une co-~lpo~i~ion ph~n-n~ceutique destinée au tr~itPmP-nt ou à la ~venlion des cancers.
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adéno-virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences npcec.c~ires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène inséré.
P~erérenliellement, le virus défectif conserve né~nmoinc les séquences de son génome qui sont nPcPcc~ires à l'Pn-~p~ tion des particules virales.
Il existe di~-~n~ sé-ulype~ d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Néanmoins, ces virus ne sont pas pathogènes pour l'homme, et not~mm~nt les sujets non immuno--lepnm.os. Parmi ces séiu~yl)es, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus hnm~in~ de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir ~lem~n~e FR 93 05954). PalTni les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV).
De p,~fe~ ce, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus ~n~rel~ iellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~ n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple].
De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine ..."~;ne ou canine ou mixte.
Comme indiqué ci-dessus, les adénovirus de l'invention portent une séquence 35 d'ADN hétérologue. Cette séquence d'ADN hétérologue permet l'expression d'une WO9~/14101 2 1 7 6 5 8 5 PCT~g4/01284 activité biologique recherchée au niveau des cellules tumorales. De préférence, la séquence d'ADN hétérologue comprend au moins un gène choisi parmi un gène toxique pour la cellule infectée, un gène dont l'expression permet d'inhiber au moins parti~ll.om~nt la division cellulaire, ou un gène codant pour une lymph~ in~. Les s adénovirus de l'invention peuvelll en outre con-po-le, plusieurs de ces séquences, afin d'obtenir dans certains cas un effet synergique anti-tumoral.
Parmi les gènes toxiques pour la cellule i~fectée, on peut citer éfele~ m~nt les gènes dont le produit d'e~.e~ion confère à la cellule une s~n.cihilite à un agent thél~peulique. Plus préféLellliellement, le gène toxique est choisi 0 parmi le gène de la l~-yn~;d ne kinase, dont le produit d'eA~Ie~ion confère aux cellules irè.es une s~ncihilité à certains agents thérapeutiques tels le ganciclovir ou l'acyclovir. La thymidine kinase du virus de l'herpès simplex est capable de phosphoryler les analogues de nucléosides tels que l'acyclovir et le ganciclovir. Ces molec~ c malifiees peuvel-l être incorporées dans une chaine d'ADN encours d'ék~ng~tinn~ ce qui a pour consé4uence l'arrêt de la synthèse d'ADN, entrainant la mort de la cellule (F.L. Moolten, Cancer Res. 46 (1986) 5276). Cette stratégie permet ainsi d'élimin~r spécifiquè-l.e,-L les cellules e~l~lim~nl le gène suicide. De plus, la synthèse d'ADN étant la cible de la toxicité, seules les cellules encours de division sont affectées.
Plus préfé-e,.liellement, on utilise dans le cadre de la présente invention le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (hTK HSV-1). La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight et al., Nucleic Acid. Res. 8 (1980) 5931).
Il est é~l~m~nt possible d'utiliser le gène de la cytosine ~les~ ;n~ce~ dont le 2s produit d'e~es~ion confère aux cellules ~K~;rèlès une s~n.~ihilité à la 5-fluoro-cytosine (5-FC). Par ailleurs, parmi les gènes toxiques ~Itili~hles dans le cadre de la présente invention, on peut citer égalernent les gènes dont le produit d'expression induit une apoptose de la cellule infectée.
Parmi les gènes dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire, on peut citer plus particulièrement les gènes suppresseur de tumeur (ou anti-oncogène) ou tout dérivé actif de ceux-ci; les séquences antisens ou les ribozymes, dont l'expression dans la cellule cible permet d'inhiber au moins partiel-lement l'expression de gènes favorisant la division cellulaire.
Parmi les gènes suppresseurs de tumeur lltili.e~hl~ dans le cadre de la présente invention, on peut citer plus particulièrement le gène p53 (Baker et coll., WO95/l4lOl 2 1 76585 l~ir~S/0l284 Science 244 (1989) 2]7); le gène Rb (F!iend et coll., Nature 323 (1986) 643; Huang et coll., Science 242 (1988) 1563), le gène rap lA (Kitayama et coll., Cell 56 (1989) 77); le gène DCC (Fearon et coll., Science 247 (1990) 49), les gènes k-rev2 et k-rev3;
ou tout autre gène suppresseur de tumeur décrit dans la lilLé,alu~e (Cf part exemple 5 WO 91/15580).
La séquence d'ADN hétérologue peut eg~lem~nt co.~.p-endre une séquence ~nti~Pn.c, dont l~ ;on dans la cellule cible permet de contrôler ll~A~ sion de gènes ~IVUliSall~ la prolifération cellulaire. Ce controle peut ~ au niveau de la lldl~cri,vlion, du splicing du prémessager, de la dégradation du messager, de sa10 traduction en protéine, ou de modifications post-traductionnelles. ~ ,el,liellement.
la séquence d'ADN hétérologue comporte un gène codant pour un ARN ~nti.cens capable de controler la traduction d'un ARNm cible (EP 140 308). Parmi les séquences ~nticf~.n.c utili~bl~s dans le cadre de l'invention, on peut citer plus particulièrement toute séquence ~nticen.c permettant de .li",in,ler les niveaux de production des15 oncogènes ras, myc, fos, c erb B, etc.
Parmi les gènes codant pour des lymph~in~s, on peut citer plus particulièl~.,-el,t les gènes codant pour les interleukines (IL-1 à IL-3 de pl~félellce), les interférons, les facteurs de nécrose des tumeurs, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc), le TGF-13, etc. Par ailleurs, le gène codant 20 pour la lymrhokine co,l,p~e,ld généralement, en amont de la séquence codante, une séquence signal tliri~nt le polypeptide synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de la lymph~1~inP, mais il peut eg~lemP.nt s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. De telles constructions pennettent en particulier 25 d'augmenter les taux de lymphokine de manière très localisée, et ainsi, en présence d'un antigene spécifique de tumeur, d'amplifier la réponse jmmlmit~ire contre un typeparticulier de tumeur, ce qui donne un effet particulièrement avantageux.
Comme indiqué ci-dessus, la séquence d'ADN hétérologue est placée sous le contrôle de signaux d'expression actifs spécifiquement dans les cellules tumorales. De 30 cette façon, le gène utilisé n'est exprimé et ne produit son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule tumorale.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, il s'agit de signau~;
d`eA,ul~s~ion induitc par ou actifs en présence de virus respon.ca~lçs ou associés à des tumeurs. Encore plus pr~félentiellement, on utilise dans le cadre de la présente wog5ll4l0l 2 1 7 6 5 8 5 l~,l/r~1/01284 invention un signal d'expression inductible par le virus d'Epstein-Barr (EBV) ou par le virus du papillome.
Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est associé à deux types de cancers hllm~in.s:
le ly...phn..~e de Burkitt et le cancer du nasopharynx. L'~ltili.~ation d'un adénovirus 5 recombin~nt colnpreilan~ un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur in~t~ctible par l'EBV permet av~nt~ nt d'exprimer spé-ifiguem~nt ce gène toxique dans les cellules tumorales du nasopha..ynx. Dans les hiop~ c de cancers du nasopharynx, un seul ~nti~en~ nucléaire est réguliè~ en~ présent, EBNA1, qui est impli~ e dans la l"~;n~ ce du génome viral dans les cellules infectées par l'EBV en phase latente, et qui transactive le promoteur viral BCR2. Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'~ti~ tion~ pour l'expression spécifique d'un gène dans les cellules de cancers du nasoph~yn~, d'une séquence répondant à EBNA1 (EBNA1-RE: EBNA1 "responsive element"). En particulier, l'invention concerne un adénovirus co--,preilant comme signal d'ex~ ion un promoteur chimère col-lprenal,L une séquence répondant à
EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral, le promoteur du gène de la terminale protéine 1 (TP1). Les exemples décrits dans la présente ~l~m~n~ montrent bien que ce promoteur chimère est inductible par EBNA1.
Les virus du papillome (notamment le virus HPV 16 et 18) sont responsables de 90 % des cancers du cervix chez la femme et ont été i~ntifi~s dans des lésions épithéliales pré-cancéreuses (Riou et al., Lancet 335 (1990) 117). Le produit du gène E6 conduit à la forrnation de turneurs en ~ nl.~ fo-l~nle-ll la quantité de p53 sauvage, un anti-oncogène, dans les cellules HPV-posilives (Wrede et al., Mol.
Carcinog. 4 (1991) 171). L'utili~ticn d'un adénovirus recomhin~nt co",~rellant un gène toxique sous le contrôle d'un promoteur in~ chhle par le HPV (par exemple la protéine E6) perrnet avantageusement d'exprimer spécifiquement ce gène toxique dans les cellules humorales co.lespondantes.
Il peut encore s'agir de signaux d'expression inactifs dans les cellules norrnales et actifs dans les cellules tumorales. En particulier, on peut utiliser dans le cadre de la présente invention le promoteur de l'a-foelop,.~léine (Alpert E., dans Hepatocellular carcinoma, Okuda & Peters (eds), New York, 1976, 353) ou le promoteur P3 de l'IGF-II (Sussenbach et al., Growth Regulation 2 (1992) 1), qui sont actifs chezl'adulte, uniquement dans les hépatocarcinomes. Il est également possible d'utiliser des promoteurs induits par des hormones dans le cas de tumeurs horrnono-dépPn-l~ntes ou hormonaux associées (turneur du sein ou de la prosla~e par exemple).
2 1 76585 Wo 95/14101 P~llr~4/01284 En outre, ces séquences promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc.
Les adénovirus recomhin~ntc défectifs selon l'invention peu~enl être préparés par toute technique connue de l'homme du mhier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être p~éparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un p1~mi~P portant entre autre la séquence d'ADN hétérologue. La recomh;.~ n homologue se produit après co-t~reclion desdits adénovirus et pl~emi~lP dans une lignée cP11~ ire app,up.iée. La lignée cellulaire utilisée doit de p~ ence (i) être transformable par lo lesdits PlemPnt.C, et (ii), colJ.poller les séquences c~p~hl~P~ de compléllle~ r la partie du génome de l'adénovirus défectif, de pl~:Çé~nce sous forme intégrée pour éviter les risques de recoml~inaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui c-ntiçnt nol~n~.~P~.~ intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~o). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les (lPm~n~P,s n FR 93 05954 et FR 93 08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
La présente invention concerne également une composition pharm~ceutique co.llprenant un ou plusieurs adénovirus rec- mbin~nt.c d~re~ s tels que décrits précé~mmPnt. De préférence, les compositions ph~rm~- elltiques de l'invention conti~nnPnt un véhicule pharm~ceutiquement acceptable pour une form~ ti~-n directement injectable dans les tumeurs à traiter. Il peut s'agir en particulier de 2s solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, not~mmPnt Iyophili~éçs, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la con.~titution de solutés injectables. L'injection directe dans la tumeur à traiter est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thél~peulique au niveau des tissus affectés. Toutefois, il est ég~lPmPnt possible d'utiliser des compositions pharmaceu-tiques formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intra-nasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif 1Itili~éçs pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et not~mment en fonction du mode d'a~ .;ni~llalion utilisé, de la pathologie concernée, du gène à e~rimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus WO9S/14101 2 1 7 6 5 8 5 PCT~4/~1284 recombinants selon l'invention sont formulés et ~rlmini.ctrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de ple~erence 106 à 101 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pol,vc,ir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire approp~iée, et mesure, généralement 5 après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solt~ti~n virale sont bien documentées dans la La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la pic~v~l~lion des c~n~rs. Elle est tout particuliè~,llen~ adaptée au traitement des 0 cancers du nasopha,y,~ ou des h~pator~rcinomes.
En outre, ce tr~it~m~nt peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domesti-lues (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples 15 qui suivent, qui doivent être c-~n.~i~f~res comme illustratifs et non li~ t;
LéPende des f sJures Figure 1: Représentation du vecteur pONT-tk Figure 2: Représentation du vecteur pONT-~-gal Techni~ues pénérales de biolo~ie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions ~ p~aLives d'ADN r~mi~liqu~, la centrifugation d'ADN pl~,mi~ ue en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragm~ntc d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chlol.~fc,l,l,e, la pré~ipit~tion d'ADN en milieu salin par de 25 l'éthanol ou de l'isol)ropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular ('.kming, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laborator~, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les pl~mi-les de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Reth~s~l~ Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragm~nt~ d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un WO95/l4l0l 2 1 7 6 5 ~ 5 rcT~4/0l284 mélange phénol/chlOr~folme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le r~mpli~s~ge des e~lé-"iles 5' proéminentes peut être effectué par le fragrnent de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications 5 du fol~rni~e~r La destruction des e~l,~,-,i~és 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polyrnérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~nd~til~n~ du fabricant. La destruction des e~lle"-i~s 5' prcç~..;n~ es est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La m~lt~enèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthhiques peut 0 être ~rr~;lllée selon la méthocle développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en 1~tili~nt le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fr~gmPntc d'ADN par la technique dite de PCR
[~olymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être 15 effectuée en utili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en lltili~nt le kit distribué par Amersham.
20 F.~em~l~
Exemple 1. Construction du vecteur Ad-ONT-tk portant le gène tk sous le contrôle d'un ~ t~llr chimère EBNAl-RE/TPl (figure 1).
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recom~in~nt co-l.pr~nant le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle d'un 2~ promoteur spécifinluement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1-REm1).
1.1. Construction du plasmide p7tkl Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la phase ouverte de lecture du gène tk de 1131 paires de bases (ATG 114-116 et codon stop30 TGA 1242-1Z44), insérée dans un mtllti~ite de clonage.
Le fragment BgIII-NcoI conten~nt le gène de la thymidine kinase (tk) du virus herpès simplex type 1 a été isolé à partir du pl~mi~le pHSV-106 (cl~mm~rcialisé
par Gibco BRL), réparé par l'action du fragment klenow puis inséré au site SmaI du WO9S/14101 2 1 76585 l~ ~S,~1284 plasmide pGEM7zf(+) (commercialisé par Promega). Les sites SmaI et BgIII sont détruits lors de cette étape, le site NcoI est conser~é.
Le pl~mide obtenu a été désigné p7tkl.
1.2. Construction du pl~mi-le pONT1 Cet PyPmplP décrit la coristruction d'un pl~cmi~P contPn~nt un promoteur chimère con~tit~lé d'une séquence nPcç~ire à la transaclivalion par l'antigène EBNA1 et du promoteur TP1 du virus EBV.
Le fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) du virus EBV a été isolé à partir de la souche B95-8. La séquence complète du virus EBV a été décrite par Baer et al.
l0 (Nature 310 (1984) 207). Ce fragment contiPnt les séquences n~cPc~ires à la transactivation par l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) (D. Reisman & B. Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol. 6 pp. 3838-3846). Ce fragment a ensuite étéfusionné au fragment NruI(166 241)-PstI(166 559) de l'EBV B95-8 (le site PstI a été
digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TP1. Le promoteur chimère 15 ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluescript II
SK.
Le plasmide obtenu a été désigné pONT1.
1.3. Construction du plasmide pONTtk Le pl~mirle pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de 20 l'herpès simplex (tk) cloné dans le pl~mi(lP p7tkl, sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-RE/TP1 cloné dans le pl~mi~ie pONT1.
Pour construire ce pl~mi~e~ le fragment BamHI-XhoI de pONT1 qui conti~nt le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2, et le fragment XhoI-ClaI de p7tkl qui c-)nti~nt la phase ouverte de lecture de tk ont été clonés aux 25 sites BamHI (478) et ClaI (4550) du plasmide pAd.RSV~gal. Le plasmide pAd.RSV~Gal conti~nt~ dans l'orientation 5'->3', - le fragment PvuII correspondant à l'ex~ "ilé gauche de l'adénovirus Ad5 co,l,~lellant: la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d~enr~rc;rl~tion et l'amplificateur ElA;
- le gène codant pour la ~-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sarcome de Rous), - un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le pl~cmide pAd.RSV~Gal et l'adénovirus dl324. Le WO95/14101 2 1 7 6 5 8 5 Pcr~g4/01284 plasmide pAd.RSV~3Gal a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
Tous les sites de clonage sont conservés. Le plasmide obtenu a hé désigné
pONTtk (figure 1).
1.4. Construction de l'adénovirus recombinant Ad-ONT-tk Le vecteur pONTtk a été linP~ri~é et cotransfecté avec un ve~;~eu~ adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) appo lanl en trans les fon- tinn~ codées par les régions E1 (ElA et EllB) d'adénovirus.
Plus pL~;~ nt~ l'adénovirus Ad-ONT-tk a été obtenu par re~omhin~i~on homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dl324 (Thimm~ppaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pONTtk, selon le protocole suivant: le ~l~smirle pONTtk, lin~ri~é par XmnI, et l'adénovirus dl324, linéarisé par l'enzyme ClaI, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de c~l~itlm, pour permettre la recomhin~i~on homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été
sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirusrecombinant a été ~mplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture con~n~nt l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titred'environ 10l pfu/ml.
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir not~mm~t Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-ONT-tk peut être conservé à -80C
dans 20 ~o de glycérol.
Exemple 2. Construction du vecteur Ad-ONT-l~gal Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant co,nprenant le gène de la béta-galactos~ e d'E.coli (13gal) sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1-RE/TP1).
2.1. Construction du plasmide pONT-~gal Le fragment XbaI-(HindIII) du plasmide pONT1 qui contient le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2 et le fragment (StuI)-KpnI du pl~mi~le pAd.RSV~gal qui conti~nt le gène de la ~-galactosidase ont été clonés aux sites XbaI
(484) et KpnI (4520) du pl~mide pAd.RSV~gal. Les sites HindIII et StuI sont WogS/l4l0l 2 1 7 6 5 8 5 P~ ~1/0l284 détruits au cours de cette étape. Le plasmide obtenu a été désigné pONT-13gal (figure 2).
2.2. Construction de l'adénovirus Ad-ONT-~gal Le vecteur pONT-~gal obtenu dans l'exemple 2.1, a été utilisé, par 5 recomb..laison homologue selon le protocole décrit dans l'exemple 1.4., pour ~Jlep~C~L
un adénovirus recomhin~nt coil.~renant le gène de la béta-galactosi~ e d'E.coli (~gal) sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-REJI P1. L'adél~vi. us Ad-ONT1-Bgal ainsi obtenu peut être conservé à -80C dans 20 % de glycérol.
Exemple 3. Construction du vecteur pONT-CAT
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur co~llprellant le gène de la chlor~mphPnicol acétyl transférase (CAT) sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1 -RE/ I P1) .
Les adénovirus recomhin~ntc défectifs selon l'invention peu~enl être préparés par toute technique connue de l'homme du mhier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être p~éparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un p1~mi~P portant entre autre la séquence d'ADN hétérologue. La recomh;.~ n homologue se produit après co-t~reclion desdits adénovirus et pl~emi~lP dans une lignée cP11~ ire app,up.iée. La lignée cellulaire utilisée doit de p~ ence (i) être transformable par lo lesdits PlemPnt.C, et (ii), colJ.poller les séquences c~p~hl~P~ de compléllle~ r la partie du génome de l'adénovirus défectif, de pl~:Çé~nce sous forme intégrée pour éviter les risques de recoml~inaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui c-ntiçnt nol~n~.~P~.~ intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~o). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les (lPm~n~P,s n FR 93 05954 et FR 93 08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
La présente invention concerne également une composition pharm~ceutique co.llprenant un ou plusieurs adénovirus rec- mbin~nt.c d~re~ s tels que décrits précé~mmPnt. De préférence, les compositions ph~rm~- elltiques de l'invention conti~nnPnt un véhicule pharm~ceutiquement acceptable pour une form~ ti~-n directement injectable dans les tumeurs à traiter. Il peut s'agir en particulier de 2s solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, not~mmPnt Iyophili~éçs, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la con.~titution de solutés injectables. L'injection directe dans la tumeur à traiter est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thél~peulique au niveau des tissus affectés. Toutefois, il est ég~lPmPnt possible d'utiliser des compositions pharmaceu-tiques formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intra-nasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif 1Itili~éçs pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et not~mment en fonction du mode d'a~ .;ni~llalion utilisé, de la pathologie concernée, du gène à e~rimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus WO9S/14101 2 1 7 6 5 8 5 PCT~4/~1284 recombinants selon l'invention sont formulés et ~rlmini.ctrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de ple~erence 106 à 101 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pol,vc,ir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire approp~iée, et mesure, généralement 5 après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solt~ti~n virale sont bien documentées dans la La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la pic~v~l~lion des c~n~rs. Elle est tout particuliè~,llen~ adaptée au traitement des 0 cancers du nasopha,y,~ ou des h~pator~rcinomes.
En outre, ce tr~it~m~nt peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domesti-lues (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples 15 qui suivent, qui doivent être c-~n.~i~f~res comme illustratifs et non li~ t;
LéPende des f sJures Figure 1: Représentation du vecteur pONT-tk Figure 2: Représentation du vecteur pONT-~-gal Techni~ues pénérales de biolo~ie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions ~ p~aLives d'ADN r~mi~liqu~, la centrifugation d'ADN pl~,mi~ ue en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragm~ntc d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chlol.~fc,l,l,e, la pré~ipit~tion d'ADN en milieu salin par de 25 l'éthanol ou de l'isol)ropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular ('.kming, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laborator~, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les pl~mi-les de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Reth~s~l~ Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragm~nt~ d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un WO95/l4l0l 2 1 7 6 5 ~ 5 rcT~4/0l284 mélange phénol/chlOr~folme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le r~mpli~s~ge des e~lé-"iles 5' proéminentes peut être effectué par le fragrnent de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications 5 du fol~rni~e~r La destruction des e~l,~,-,i~és 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polyrnérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~nd~til~n~ du fabricant. La destruction des e~lle"-i~s 5' prcç~..;n~ es est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La m~lt~enèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthhiques peut 0 être ~rr~;lllée selon la méthocle développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en 1~tili~nt le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fr~gmPntc d'ADN par la technique dite de PCR
[~olymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être 15 effectuée en utili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en lltili~nt le kit distribué par Amersham.
20 F.~em~l~
Exemple 1. Construction du vecteur Ad-ONT-tk portant le gène tk sous le contrôle d'un ~ t~llr chimère EBNAl-RE/TPl (figure 1).
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recom~in~nt co-l.pr~nant le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle d'un 2~ promoteur spécifinluement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1-REm1).
1.1. Construction du plasmide p7tkl Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la phase ouverte de lecture du gène tk de 1131 paires de bases (ATG 114-116 et codon stop30 TGA 1242-1Z44), insérée dans un mtllti~ite de clonage.
Le fragment BgIII-NcoI conten~nt le gène de la thymidine kinase (tk) du virus herpès simplex type 1 a été isolé à partir du pl~mi~le pHSV-106 (cl~mm~rcialisé
par Gibco BRL), réparé par l'action du fragment klenow puis inséré au site SmaI du WO9S/14101 2 1 76585 l~ ~S,~1284 plasmide pGEM7zf(+) (commercialisé par Promega). Les sites SmaI et BgIII sont détruits lors de cette étape, le site NcoI est conser~é.
Le pl~mide obtenu a été désigné p7tkl.
1.2. Construction du pl~mi-le pONT1 Cet PyPmplP décrit la coristruction d'un pl~cmi~P contPn~nt un promoteur chimère con~tit~lé d'une séquence nPcç~ire à la transaclivalion par l'antigène EBNA1 et du promoteur TP1 du virus EBV.
Le fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) du virus EBV a été isolé à partir de la souche B95-8. La séquence complète du virus EBV a été décrite par Baer et al.
l0 (Nature 310 (1984) 207). Ce fragment contiPnt les séquences n~cPc~ires à la transactivation par l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) (D. Reisman & B. Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol. 6 pp. 3838-3846). Ce fragment a ensuite étéfusionné au fragment NruI(166 241)-PstI(166 559) de l'EBV B95-8 (le site PstI a été
digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TP1. Le promoteur chimère 15 ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluescript II
SK.
Le plasmide obtenu a été désigné pONT1.
1.3. Construction du plasmide pONTtk Le pl~mirle pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de 20 l'herpès simplex (tk) cloné dans le pl~mi(lP p7tkl, sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-RE/TP1 cloné dans le pl~mi~ie pONT1.
Pour construire ce pl~mi~e~ le fragment BamHI-XhoI de pONT1 qui conti~nt le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2, et le fragment XhoI-ClaI de p7tkl qui c-)nti~nt la phase ouverte de lecture de tk ont été clonés aux 25 sites BamHI (478) et ClaI (4550) du plasmide pAd.RSV~gal. Le plasmide pAd.RSV~Gal conti~nt~ dans l'orientation 5'->3', - le fragment PvuII correspondant à l'ex~ "ilé gauche de l'adénovirus Ad5 co,l,~lellant: la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d~enr~rc;rl~tion et l'amplificateur ElA;
- le gène codant pour la ~-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sarcome de Rous), - un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le pl~cmide pAd.RSV~Gal et l'adénovirus dl324. Le WO95/14101 2 1 7 6 5 8 5 Pcr~g4/01284 plasmide pAd.RSV~3Gal a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
Tous les sites de clonage sont conservés. Le plasmide obtenu a hé désigné
pONTtk (figure 1).
1.4. Construction de l'adénovirus recombinant Ad-ONT-tk Le vecteur pONTtk a été linP~ri~é et cotransfecté avec un ve~;~eu~ adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) appo lanl en trans les fon- tinn~ codées par les régions E1 (ElA et EllB) d'adénovirus.
Plus pL~;~ nt~ l'adénovirus Ad-ONT-tk a été obtenu par re~omhin~i~on homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dl324 (Thimm~ppaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pONTtk, selon le protocole suivant: le ~l~smirle pONTtk, lin~ri~é par XmnI, et l'adénovirus dl324, linéarisé par l'enzyme ClaI, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de c~l~itlm, pour permettre la recomhin~i~on homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été
sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirusrecombinant a été ~mplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture con~n~nt l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titred'environ 10l pfu/ml.
Les particules virales sont généralement purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir not~mm~t Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-ONT-tk peut être conservé à -80C
dans 20 ~o de glycérol.
Exemple 2. Construction du vecteur Ad-ONT-l~gal Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant co,nprenant le gène de la béta-galactos~ e d'E.coli (13gal) sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1-RE/TP1).
2.1. Construction du plasmide pONT-~gal Le fragment XbaI-(HindIII) du plasmide pONT1 qui contient le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2 et le fragment (StuI)-KpnI du pl~mi~le pAd.RSV~gal qui conti~nt le gène de la ~-galactosidase ont été clonés aux sites XbaI
(484) et KpnI (4520) du pl~mide pAd.RSV~gal. Les sites HindIII et StuI sont WogS/l4l0l 2 1 7 6 5 8 5 P~ ~1/0l284 détruits au cours de cette étape. Le plasmide obtenu a été désigné pONT-13gal (figure 2).
2.2. Construction de l'adénovirus Ad-ONT-~gal Le vecteur pONT-~gal obtenu dans l'exemple 2.1, a été utilisé, par 5 recomb..laison homologue selon le protocole décrit dans l'exemple 1.4., pour ~Jlep~C~L
un adénovirus recomhin~nt coil.~renant le gène de la béta-galactosi~ e d'E.coli (~gal) sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-REJI P1. L'adél~vi. us Ad-ONT1-Bgal ainsi obtenu peut être conservé à -80C dans 20 % de glycérol.
Exemple 3. Construction du vecteur pONT-CAT
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur co~llprellant le gène de la chlor~mphPnicol acétyl transférase (CAT) sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement actif dans les cellules infectées par le virus EBV (promoteur chimère EBNA1 -RE/ I P1) .
3.1. Construction du vecteur lS Le promoteur TP1 de l'EBV a été isolé sous la forme du fragment NruI(166241)-PstI(166559) de l'EBV. Ce fragment a ensuite été fusioMé au gène CAT, et inséré, sous forme d'un fragment NruI-BamHI, dans le pl~mi(lP pGem7ZF
(Promega). Le plasmide résultant a été désigné pTP1-CAT. Le fragment NruI-BamHI
du plasmide pTP1-CAT a ensuite été fusionné, en aval du fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) de l'EBV souche B95-8, cont~n~nt les séquences npcp~;.s~ s à la transactivation par EBNA1 (Cf Py~mrle 1.2.). Le fragment obtenu, colnprenant le gène CAT sous contrôle du promoteur cl~i"lè~ EBNA1-RE/TP1, a été inséré aux sites EcoRI et BamHI du plasmide pBluescript SK pour générer le pl~midP pONT-CAT.
Un plasmide a également été construit dans lequel les PlP~PntS de réponse à l'antigène 2s EBNA2 du promoteur TP1 ont été délétés. Pour cela, le promoteur TP1 a été isolé
sous la forme du fragment NruI(166375)-PstI(166559) de l'EBV. Ce pl~mid~ a été
désigné pOST-CAT.
3.2. Activité in vitro Cet exemple démontre que les constructions décrites ci-dessus sont induites spécifiquement par des antigènes du virus d'Epstein Barr.
Les vecteurs pONT-CAT, pOST-CAT et pTP1-CAT ont été transfectés par électroporation dans une lignée de lymphocytes B EBV- (cellules DG75), soit seuls, Wo 95/14101 2 1 7 6 5 8 5 ~ ~ ~lr~ 1/01284 soit en présence de vecteurs d'expression des antigènes viraux EBNA1, EBNA2 ou EBNA1 + EBNA2. 48 heures après la transfection, les cellules ont été Iysées par congélation/déc-ng~l~tiQn, les débris cellulaires éliminés, puis les extraits obtenus ont été normalisés suivant la quantité de protéines. L'activité CAT a ensuite été dosée dans s ces extraits par dosage enzymatique. Les résultats obtenus sont les S~livilllLS:
Seul +EBNA2 +EBNA1 +EBNAl/A2 pTP1-CAT 1 35 2,5 17 pONT-CAT 1 16 34 136 pOST-CAT 1 1,4 19,5 22,5 Ces résultats montrent clairement que le promoteur ONT est spécifiquement actif en présence des antigènes EBNA1 et EBNA2, et qu'il induit une très forte expression du gène CAT.
(Promega). Le plasmide résultant a été désigné pTP1-CAT. Le fragment NruI-BamHI
du plasmide pTP1-CAT a ensuite été fusionné, en aval du fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) de l'EBV souche B95-8, cont~n~nt les séquences npcp~;.s~ s à la transactivation par EBNA1 (Cf Py~mrle 1.2.). Le fragment obtenu, colnprenant le gène CAT sous contrôle du promoteur cl~i"lè~ EBNA1-RE/TP1, a été inséré aux sites EcoRI et BamHI du plasmide pBluescript SK pour générer le pl~midP pONT-CAT.
Un plasmide a également été construit dans lequel les PlP~PntS de réponse à l'antigène 2s EBNA2 du promoteur TP1 ont été délétés. Pour cela, le promoteur TP1 a été isolé
sous la forme du fragment NruI(166375)-PstI(166559) de l'EBV. Ce pl~mid~ a été
désigné pOST-CAT.
3.2. Activité in vitro Cet exemple démontre que les constructions décrites ci-dessus sont induites spécifiquement par des antigènes du virus d'Epstein Barr.
Les vecteurs pONT-CAT, pOST-CAT et pTP1-CAT ont été transfectés par électroporation dans une lignée de lymphocytes B EBV- (cellules DG75), soit seuls, Wo 95/14101 2 1 7 6 5 8 5 ~ ~ ~lr~ 1/01284 soit en présence de vecteurs d'expression des antigènes viraux EBNA1, EBNA2 ou EBNA1 + EBNA2. 48 heures après la transfection, les cellules ont été Iysées par congélation/déc-ng~l~tiQn, les débris cellulaires éliminés, puis les extraits obtenus ont été normalisés suivant la quantité de protéines. L'activité CAT a ensuite été dosée dans s ces extraits par dosage enzymatique. Les résultats obtenus sont les S~livilllLS:
Seul +EBNA2 +EBNA1 +EBNAl/A2 pTP1-CAT 1 35 2,5 17 pONT-CAT 1 16 34 136 pOST-CAT 1 1,4 19,5 22,5 Ces résultats montrent clairement que le promoteur ONT est spécifiquement actif en présence des antigènes EBNA1 et EBNA2, et qu'il induit une très forte expression du gène CAT.
Claims (18)
1. Adénovirus recombinant defectif comprenant une séquence d'ADN hétérologue sous le controle de signaux d'expression induits par ou actifs en présence de virus responsables ou associés à des tumeurs
2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un signal d'expression inducrible par le virus d'Ebstein-Barr (EBV) ou par le virus du papillome.
3. Adenovirus selon la revendication 2 caractérise en ce que le signal d'expression comprend une séquence répondant à l'antigène EBNA1.
4. Adénovirus selon la revendication 3 caractérisé en ce que le signal d'expression est constitué d'un promoteur chimère comprenant une sequence répondant à EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral de préférence le promoteur du gène de la terminale protéine 1(TP1).
5. Adénovirus selon l'une quelconques des revendications 1 à 4 caracterisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa replication dans la cellule cible.
6. Adénovirus selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus humain de type Ad 5 ou canin de type CAV-2.
7. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la séquence d'ADN héterologue contient au moins un gène toxique pour la cellule infectée.
8. Adénovirus selon la revendication 7 caractérisé en ce que le gène toxique est un gène dont le produit d'expression confère à la cellule infectée une sensibilité à un agent thérapeutique.
9. Adénovirus selon la revendication 8 caractérisé en ce que le gene toxique est le gène de la thymidine kinase et l'agent thérapeutique est le gancyclovir ou l'acyclovir.
10. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérise en ce que la séquence d'ADN hétérologue contient au moins un gène dont l'expression permet d'inhiber au moins partiellement la division cellulaire.
11. Adenovirus selon la revendication 10 caractérisé en ce que le gène est choisi parmi les gènes suppresseur de tumeur, les sequences antisens et les ribozymes.
12. Adénovirus selon la revendication 7 caractérisé en ce que la séquence d'ADN
hétérologue contient au moins un gène dont le produit d'expression induit l'apoptose de la cellule infectée
hétérologue contient au moins un gène dont le produit d'expression induit l'apoptose de la cellule infectée
13. Utilisation d'un adenovirus selon l'une des revendications 1 à 12 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinee au traitement et/ou à la prévention des cancers.
14. Utilisation d'un adenovirus selon la revendication 3 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des cancers du nasopharynx.
15. Utilisation selon la revendication 13 ou 14 pour la préparation d'une composition pharmaceutique en vue d'une administration directe dans la tumeur à traiter
16. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 12.
17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.
18. Promoteur chimère comprenant une séquence répondant à EBNA1 fusionnée en amont d'un autre promoteur viral de préférence le promoteur du gene de la terminale protéine 1 (TP1).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9313766A FR2712602B1 (fr) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| FR93/13766 | 1993-11-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2176585A1 true CA2176585A1 (fr) | 1995-05-26 |
Family
ID=9452970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002176585A Abandoned CA2176585A1 (fr) | 1993-11-18 | 1994-11-07 | Adenovirus recombinants pour la therapie genique des cancers |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5837531A (fr) |
| EP (1) | EP0729516A1 (fr) |
| JP (1) | JPH09504955A (fr) |
| KR (1) | KR100368292B1 (fr) |
| AU (1) | AU699867B2 (fr) |
| CA (1) | CA2176585A1 (fr) |
| FI (1) | FI962114A0 (fr) |
| FR (1) | FR2712602B1 (fr) |
| IL (1) | IL111682A0 (fr) |
| NO (1) | NO317725B1 (fr) |
| WO (1) | WO1995014101A1 (fr) |
| ZA (1) | ZA949103B (fr) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992015680A1 (fr) | 1991-03-06 | 1992-09-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Procedes et compositions d'inhibition selective de l'expression de genes |
| US5747469A (en) | 1991-03-06 | 1998-05-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53 |
| US6410010B1 (en) | 1992-10-13 | 2002-06-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant P53 adenovirus compositions |
| AU2434195A (en) * | 1994-05-02 | 1995-11-29 | University Of Washington | Thymidine kinase mutants |
| EP1369487A3 (fr) | 1994-08-16 | 2004-04-07 | Crucell Holland B.V. | Vecteurs récombinants dérivés d'Adenovirus pour la thérapie genique |
| US7001765B2 (en) | 1996-03-06 | 2006-02-21 | Medigene Ag | Adeno-associated virus vector for boosting immunogenicity of cells |
| DE19608751B4 (de) * | 1996-03-06 | 2006-05-18 | Medigene Ag | Verwendung eines Adeno-assoziierten Virus-Vektors zur Steigerung der Immunogenität von Zellen |
| US6054467A (en) * | 1996-07-05 | 2000-04-25 | Sidney Kimmel Cancer Center | Down-regulation of DNA repair to enhance sensitivity to P53-mediated apoptosis |
| US5958892A (en) | 1996-07-30 | 1999-09-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells |
| US7041654B2 (en) | 1997-10-03 | 2006-05-09 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity |
| CA2319112C (fr) * | 1998-02-13 | 2003-10-28 | Genetrace Systems, Inc. | Utilisation de ribozymes afin d'identifier la fonction de genes |
| CN1405312A (zh) * | 2001-01-18 | 2003-03-26 | 中山卫健生物科技有限公司 | 一种能特异性杀灭eb病毒相关肿瘤的重组病毒及其构建方法 |
| AU2002351568A1 (en) * | 2001-12-06 | 2003-06-17 | University Health Network | Nucleic acids and methods for treating ebv-positive cancers |
| US20040052161A1 (en) * | 2002-09-17 | 2004-03-18 | Steven Liao | Mechanical clock having wireless manipulation and adjustment function |
| AU2003286729A1 (en) * | 2002-10-25 | 2004-05-13 | University Of Massachusetts | Modulation of cellular proliferation |
| US7442830B1 (en) | 2007-08-06 | 2008-10-28 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Proteasome inhibitors |
| US20090325903A1 (en) | 2008-06-17 | 2009-12-31 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Boronate ester compounds and pharmaceutical compositions thereof |
| SG11201609259VA (en) | 2014-05-20 | 2016-12-29 | Millennium Pharm Inc | Boron-containing proteasome inhibitors for use after primary cancer therapy |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4939088A (en) * | 1987-02-18 | 1990-07-03 | Meloy Laboratories Inc. | Sustained production of recombinant gamma interferon using an Epstein-Barr virus replicon |
| US5672344A (en) | 1987-12-30 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Viral-mediated gene transfer system |
| GB8919607D0 (en) * | 1989-08-30 | 1989-10-11 | Wellcome Found | Novel entities for cancer therapy |
| US5194601A (en) * | 1989-09-18 | 1993-03-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Lytic origin of replication for Epstein-Barr virus (EBV) |
| NO312681B1 (no) * | 1990-08-24 | 2002-06-17 | Univ California | Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasöytisk blanding med suppresiv virkning/aktivitet |
| CA2091346C (fr) * | 1990-09-14 | 2007-04-24 | Philip Frost | Methodes et compositions pour la therapie genetique et la potentialisation de l'immunite antitumorale |
| FR2688514A1 (fr) * | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
| US5631236A (en) * | 1993-08-26 | 1997-05-20 | Baylor College Of Medicine | Gene therapy for solid tumors, using a DNA sequence encoding HSV-Tk or VZV-Tk |
-
1993
- 1993-11-18 FR FR9313766A patent/FR2712602B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-11-07 KR KR1019960702622A patent/KR100368292B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-11-07 US US08/646,246 patent/US5837531A/en not_active Ceased
- 1994-11-07 AU AU81471/94A patent/AU699867B2/en not_active Ceased
- 1994-11-07 CA CA002176585A patent/CA2176585A1/fr not_active Abandoned
- 1994-11-07 JP JP7514247A patent/JPH09504955A/ja active Pending
- 1994-11-07 EP EP95900795A patent/EP0729516A1/fr not_active Withdrawn
- 1994-11-07 US US09/654,223 patent/USRE39078E1/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-11-07 WO PCT/FR1994/001284 patent/WO1995014101A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1994-11-16 ZA ZA949103A patent/ZA949103B/xx unknown
- 1994-11-17 IL IL11168294A patent/IL111682A0/xx unknown
-
1996
- 1996-05-14 NO NO19961977A patent/NO317725B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-05-17 FI FI962114A patent/FI962114A0/fi not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU8147194A (en) | 1995-06-06 |
| NO317725B1 (no) | 2004-12-13 |
| NO961977L (no) | 1996-05-14 |
| FI962114A (fi) | 1996-05-17 |
| NO961977D0 (no) | 1996-05-14 |
| FR2712602B1 (fr) | 1996-02-09 |
| IL111682A0 (en) | 1995-01-24 |
| AU699867B2 (en) | 1998-12-17 |
| EP0729516A1 (fr) | 1996-09-04 |
| FR2712602A1 (fr) | 1995-05-24 |
| KR100368292B1 (ko) | 2003-12-24 |
| JPH09504955A (ja) | 1997-05-20 |
| FI962114A0 (fi) | 1996-05-17 |
| USRE39078E1 (en) | 2006-04-25 |
| ZA949103B (en) | 1995-07-21 |
| WO1995014101A1 (fr) | 1995-05-26 |
| US5837531A (en) | 1998-11-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FR2712603A1 (fr) | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. | |
| EP0695360B1 (fr) | Adenovirus recombinants defectifs pour la therapie genique des tumeurs | |
| EP0667912B1 (fr) | Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique | |
| CA2163256C (fr) | Vecteurs adenoviraux d'origine animale et utilisation en therapie genique | |
| CA2176585A1 (fr) | Adenovirus recombinants pour la therapie genique des cancers | |
| JP3816952B2 (ja) | 治療遺伝子と免疫保護遺伝子とを含む欠陥アデノウイルス | |
| KR102150027B1 (ko) | 종양 선택적 ｅ１ａ 및 ｅ１ｂ 돌연변이 | |
| JP2002516568A (ja) | α−フェトタンパク質を発現する細胞に特異的なアデノウイルスベクターおよびその使用の方法 | |
| FR2707664A1 (fr) | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. | |
| JP2000106875A (ja) | 目的遺伝子の発現を改善するためのアデノウイルスｅ４リ―ディングフレ―ムの使用 | |
| EP0809516B1 (fr) | Association medicamenteuse utile pour la transfection et l'expression in vivo d'exogenes | |
| FR2724945A1 (fr) | Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique | |
| FR2755699A1 (fr) | Nouvelles constructions et vecteurs pour l'expression ciblee et inductible des genes | |
| CA2200629A1 (fr) | Adenoviraux comprenant deux genes therapeutiques: suicide et immunostimulant | |
| CA2257916A1 (fr) | Generation de molecules replicatives in vivo | |
| CA2158869C (fr) | Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique | |
| JP2005336199A5 (fr) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request | ||
| FZDE | Discontinued |