JP2011068658A - 遺伝子ベクターの局所施用によるワクチン接種 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】関心のあるトランスジーンをコードする遺伝子ベクターを皮膚に局所施用することにより治療を必要とする動物の皮膚に該ベクターを接触させる。該遺伝子ベクターの例としては、アデノウイルス組換え体、DNA/アデノウイルス複合体、DNA/リポソーム複合体、またはトランスジーンを発現できるどのような他のベクターもが挙げられる。
【選択図】なし
Description
本発明は、広く、免疫学およびワクチン技術の分野に関する。より詳しくは、本発明は、免疫応答を誘発させる、皮膚を標的とした非侵入遺伝子供給技術およびその使用に関する。
脊椎動物の免疫系の活性化は、病原および悪性腫瘍から動物を防御する重要な機構である。この免疫系は、体液性および細胞性枝を含む多くの相互作用成分からなる。体液性免疫には、抗原に直接結合する抗体が含まれる。体液性免疫のエフェクターとしての抗体分子は、Bリンパ球により分泌される。細胞性免疫には、非自己抗原を産生する他の細胞を認識し殺す特殊な細胞障害性Tリンパ球(CTL)が含まれる。CTLは、MHC(主要組織適合抗原系)I類分子に結合した標的細胞の表面に出現する分解されたペプチド断片に応答する。その細胞内で産生されたタンパク質は、細胞代謝の一部としてペプチドまで連続的に分解されることが理解されている。これらの断片は、MHC分子に結合され、細胞表面まで輸送される。したがって、細胞性免疫系は、体内の全ての細胞中で産生されたタンパク質のスペクトルを絶えずモニタし、非自己抗原を産生するいかなる細胞をも除去するように保たれている。
マウスおよび細胞培養
同系マウスを、バーミンガムのアラバマ大学で育てた。細胞を、2%のウシ胎児血清および6%の子ウシ血清を含有するRPMI 1640またはDMEM中で培養した。
マウスを麻酔し、腹または首の皮膚の限られた領域を覆う毛および角質化上皮を脱毛薬(例えばNAIR)により除去した。遺伝子ベクターをあらかじめ毛をそってNAIR処理した皮膚上にピペットで取り、様々な時間(例えば1時間から18時間まで)裸の皮膚に接触させ続けた。ベクターは直接裸の皮膚上に、または皮膚上に接着されたシリンダー中にピペットで取ってもよい。
高い力価のアデノウイルスのストックを、特異的なアデノウイルス組換え体で感染したヒト293細胞から調製した。溶解産物を、塩化セシウム勾配を通して超遠心分離にかけた。ウイルスのバンドを抜き出し、10mM Tris(pH7.5)/135mM NaCl/5mM KCl/1mM MgCl2に対して透析した。精製されたウイルスを10%まで加えたグリセロールとともにろ過滅菌し、等分して−80℃で保存した。アデノウイルスのストックについての力価をプラーク力価検定法により測定した。
皮膚中のルシフェラーゼの量を、前述のように測定した(Tang,1994)。簡単に言えば、切り取った一片の皮膚を、溶解緩衝剤中でKontesガラス組織研磨機で均質化した。遠心分離により組織の破片を除去した後、皮膚抽出物中のルシフェラーゼ活性を、過剰なATPおよびルシフェラーゼの存在下で集中発光の測定により光度計で測定した。
切り取った一片の皮膚を、液体窒素中でTissue-Tek O.C.T.化合物(Miles Laboratories Inc.)中に素早く凍らせ、使用するまで−80℃で保存した。凍った組織を4μmで切断し、4%のパラホルムアルデヒド中に固定し、前述のようにX-gal染色溶液中のインキュベーションによりβ−ガラクトシダーゼ活性について染色した(Tang et al.,1994)。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで後染色した。
DNA/アデノウイルス複合体を、各施用について凝縮剤のポリリシンの存在下で100μgのプラスミドDNAをアデノウイルスの1×1011の粒子と混合することにより調製した。アデノウイルスの力価を吸光度により測定した。
DNA/リポソーム複合体を、各施用について100μgのプラスミドDNAを100μgのDOTAP/DOPE(1:1;Avanti)と混合することにより調製した。プラスミドを、Qiagen Plasmid Maxi Kitsを使用して調製した。
尾の採血からの血清を、1:250から1:500まで希釈し、SDS-ポリアクリルアミドゲル中で分離されImmobilon-P膜(Millipore)に転移された精製タンパク質と反応させた。反応をECL kit(Amersham)を使用して視覚化した。
本発明は、高性能装置を用いずに、遺伝子ベクターを皮膚標的非侵入供給することにより、単純な様式でマウスの皮膚中に抗原遺伝子を供給できることを示す。図1は、限られた量のAdCMV−luc(ホタルルシフェラーゼをコードするアデノウイルスベクター)(Tang et al., 1994)を皮膚に供給した後に、多量のルシフェラーゼ酵素が産生されたことを示している。Adはアデノウイルスを示し、pfuはプラック形成単位を示し、LUは光単位を示す。結果は、平均対数[1cm2の皮膚当たりのLU]±SE(nが各々の段の頂部に示されている)である。偽施用されたすなわちルシフェラーゼをコードしなかったアデノウイルスベクターで被覆されたマウスは、皮膚中に検出可能なルシフェラーゼ活性を全く示さなかった。この皮膚中のアデノウイルスベクターからのトランスジーン発現のレベルは、このウイルスの力価とは相関関係するようには見えなかった。制限された皮膚の部分において、少数の細胞のみがこのウイルスにより形質導入でき、108プラック形成単位(pfu)のアデノウイルス組換え体が標的細胞を飽和したかもしれない可能性がある。この変動性は、一部には、個々のマウスの違いのためであるかもしれない。さらに、この変動性のある程度は、おそらく、標準化されていなかった角質化した上皮を除去する方法から生じた(Johnson and Tang, 1994)。産生された抗原の量は、もしかすると、より多くのベクターをより広い区域に施用することにより増幅できるであろう。
皮膚上への非侵入ワクチン接種のための主な標的細胞は、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするアデノウイルスベクターを皮膚標的非侵入供給した後X-gal基質を有する凍結切片を染色することにより示されるように、毛胞内の毛基質細胞(図2a)および表皮の最外層内のケラチノサイト(図2b)であると思われる(AdCMV-βgal)(Tang et al.,1994)。治療を受けた皮膚組織中では物理的擦過傷は発見されず、炎症も誘発されなかった。非侵入遺伝子供給を受けた皮膚組織を、皮膚上に108pfuのAdCMV-βgalをピペットで取った1日後に動物から切り取り、切断し、固定し、記載されているようにX-gal基質で染色した(Tang et al.,1994)。図2aは、150倍で、毛胞内にアデノウイルスを形質導入された毛基質細胞を示す。図2bは、150倍で、表皮の最外層内にアデノウイルスを形質導入されたケラチノサイトを示す。偽施用されたまたはAdCMV-lucで被覆された対照動物内では青色の細胞は見られなかった。
アデノウイルス媒介NIVSによる体液性免疫応答の惹起
NIVSは動物にワクチン接種する新しい方法である。この方法により、ベクターによってコードされる抗原に対し特異的な免疫応答が誘発されることを示すために、AdCMV-hcea[ヒト癌胎児性抗原(CEA)をコードするアデノウイルスベクター]をC57BL/6株マウスの皮膚上にピペットで取った。108pfuのAdCMV-hceaの皮膚標的非侵入供給の1ヶ月後のワクチン接種されたマウスからの血清を1:500に希釈し、5%のSDS-ポリアクリルアミドゲル中で分離されImmobilon-P膜(Millipore)に転移された精製されたヒトCEAタンパク質(T.Strongによって提供される)およびアデノウイルスタンパク質と反応させた。図3aには、レーン1に0.5μgのヒトCEA;レーン2に0.5μgのBSA;レーン3に107pfuのアデノウイルスが示されている。図3aは、ワクチン接種された動物からのテスト血清が、ウェスタンブロットにおいて精製されたヒトCEAタンパク質と反応したが、ウシ血清アルブミン(BSA)とは反応しなかったことを示し、このことは皮膚標的非侵入遺伝子供給の結果としてアデノウイルスベクターによりコードされた外因性タンパク質に対して特異的な抗体が産生されたという結論を支持する。
本発明の技術が防御抗腫瘍免疫応答を誘発できることを示すために、ヒト癌胎児性抗原(CEA)遺伝子(MC38-CEA-2)(Conry et al.,1995)を発現する同系の腫瘍細胞を、実験を受けたことがないC57BL/6株マウスおよびヒトCEA遺伝子をコードするアデノウイルスベクター(AdCMV-hcea)の局所施用によってワクチン接種された同株のマウス内に接種した。腫瘍抗原投与を受けた動物を、生存について観察した(図4)。対照群では、動物の90%(9/10)が触知可能腫瘍小節を発現させ、腫瘍細胞の移植後30日以内に死んだ。ワクチン接種された群では、動物の10%(1/10)のみが死に、70%(7/10)は完全に腫瘍がないままであった。腫瘍が直径1cmを超えた場合はマウスを安楽死させた。腫瘍細胞の注入と安楽死との間の間隔を、個々の生存時間として使用した。図4には、腫瘍抗原投与を受けた、対照マウス(ワクチンを投与されていない)およびNIVSにより免疫化された動物(108pfuのAdCMV-hceaが1ヶ月前に局所施用された)が示されている。括弧内の数字は、それぞれの処理についての動物の数を示す。結果は、皮膚上への遺伝子ワクチンの非侵入供給により、特異的な抗原を発現する腫瘍細胞に対して防御免疫応答が誘発され得ることを示す。
サイトカインおよび共刺激性遺伝子をコードする組換えアデノウイルスベクターの作成
皮膚細胞中にこれらの免疫修飾遺伝子と抗原遺伝子とを共供給して、ワクチン接種された動物中で免疫特性を示すために、共刺激性およびサイトカイン遺伝子をコードするアデノウイルスベクターを作成した。ネズミのB7-1遺伝子をコードするアデノウイルスベクターAdCMV-mB7.1およびネズミのGM-CSF遺伝子をコードするアデノウイルスベクターAdCMV-mgmcsfを、新しいアデノウイルスベクターを産生するための標準方法に従い、ヒト293細胞中の2つのトランスフェクションされたプラスミド間の相同組換えによって作成した(Gomez-Foix et al.,1992)。これらのベクター中の全てのトランスジーンを、CMVの初期のエンハンサー−プロモーターエレメントにより転写で誘導した。AdCMV-mB7.1を、抗CD80抗体(PharMingen)で形質導入されたヒト肺癌SCC-5細胞を染色することにより特徴付け、続いてフローサイトメトリで分析した。AdCMV-mgmcsfを、ELIZA kit(Amersham)を使用して、形質導入されたSCC-5細胞から分泌されたネズミのGM-CSFを測定することにより特徴付けた。
インビボの細胞障害性分析による抗腫瘍免疫の検出
標的細胞を単層としてマウスの筋肉組織上に移植する場合に、インビボの細胞障害性分析が発達した(Tang et al.,1996)。単層としての標的細胞の移植により、インビボの発育の数日後に発育の結果を分析するための標的細胞の有効な回復が見込まれる。この分析は、標的細胞を根絶するのに十分な効力のない弱い免疫応答の検出に特に有用であった。免疫応答は、移植床の組織学的分析により特徴付けられる。免疫応答がなければ、標的細胞は生育するであろう。強い免疫応答によれば、おそらく生育中の標的細胞への移動およびそのまわりのインサイチュの感作によって、移植床における多数の免疫エフェクター細胞の存在下で標的細胞は根絶されるであろう。弱い免疫応答によれば、生育中の標的細胞は移植床における浸潤免疫エフェクター細胞と混ざり合うであろう。実験を受けたことがないC57BL/6マウス中への単層としての5×105RM1-luc細胞[ルシフェラーゼ遺伝子を発現させるRM1前立腺腫瘍細胞]の移植により、インビボでRM1-luc細胞が増殖するために腫瘍層が生じ、免疫介入の形跡はなかった。対照動物と対照的に、AdCMV-lucの皮膚標的非侵入供給によりワクチン接種された動物内の移植床において、RM1-luc細胞は多数の免疫エフェクター細胞と混合された。
腫瘍細胞により誘導される免疫エフェクター細胞の特徴付け
インビボにおける細胞障害性分析は、筋肉上に単層として少数の標的細胞を移植することにより移植床に多数の免疫エフェクター細胞を集中することができる。移植床における特異的な免疫エフェクター細胞の特徴付けにより、標的細胞を殺すために細胞媒介免疫応答が誘発されるか否かに関しての証拠が提供されるかもしれない。AdCMV-lucの皮膚標的非侵入供給によりワクチン接種された動物中でルシフェラーゼ発現腫瘍細胞により誘導されるT細胞を特徴付けるために、移植床の組織切片を、抗CD3モノクローナル抗体(mAb)で染色した。RM1-luc細胞を、pHBA-luc DNAをRM1前立腺腫瘍細胞中にリポ移入することにより産生し(Baylor医科大学においてT.Thompsonにより提供された)、続いてG418を含有する培地中で選択した。ルシフェラーゼを発現するクローンをルシフェラーゼ分析により特徴付けた。5×105のRM1-luc細胞を、108pfuのAdCMV-lucの皮膚標的非侵入供給によりワクチン接種されたマウス中に単層として移植した。移植の5日後、移植床をO.C.T.中で凍結させ、4μmで切片を切断し、100%のアセトン中で乾燥させ、色原体としてジアミノベンジジンを用いるABC免疫ペルオキシダーゼ法によって抗CD3 mAb(UABにおいてP.Bucyにより提供されたクローンF500A2)で染色した。
接着ガーゼ包帯による遺伝子ワクチンの局所施用
包帯をワクチンの投与に使用できるということが初めて示された。この発達により、医療訓練を積んでいない職員が皮膚上に画一的な投与量の非侵入ワクチンを供給することが可能になるかもしれない。包帯により皮膚を形質導入するために、実施例7に記載されるAdCMV-lucベクターの50μlを接着ガーゼ包帯(ジョンソンアンドジョンソン)のパッド中にピペットで取った。続いてベクター含有包帯を、マウスのあらかじめ毛をそった皮膚に接着した。ベクターを18時間裸の皮膚と接触させ続けた。包帯により供給された遺伝子ベクターからトランスジーン発現を検出するために、皮膚をルシフェラーゼについて分析した(表1)。結果は相当な変動を示すが、皮膚中のトランスジーン発現は接着ガーゼ包帯を使用して達成できた。
DNA/アデノウイルス媒介NIVS
アデノウイルスに基づくベクターを、プラスミドDNAをアデノウイルスの外部に結合させることによってより用途を広くすることができる。生じたベクター系により、様々の標的細胞への高い効率の遺伝子供給が媒介される。この方法により、外来遺伝子のサイズおよび形の点で柔軟性が大きく高まる。従ってDNA/アデノウイルス複合体により、より柔軟性を有する同じアデノウイルスレセプター媒介エンドサイトーシス経路によって抗原遺伝子を皮膚中に供給できるかもしれない。
DNA/リポソーム媒介NIVS
非侵入ワクチンのキャリアとしてアデノウイルスを含む発達中の遺伝子ベクターに加えて、ウイルス性エレメントのないDNA/リポソーム複合体の局所施用によりマウスにワクチン接種できることが示された。多くの異なるベクターを、皮膚標的非侵入ワクチンを投与するために独創的な方法で施用できることが明らかである。図8bにおいて、レーン1にはhGH(0.5μg);レーン2にはhGHと反応したがBSAとは反応しなかったhGHをコードするDNA/リポソーム複合体の局所施用により免疫化されたマウスからのテスト血清であるBSA(0.5μg)が示されている。DNA/リポソーム複合体によりワクチン接種された10匹のマウスのうち、5ヶ月以内に9匹(90%)の治療されたマウスにおいてテスト血清は精製されたhGHと反応した。従って、DNA/リポソーム複合体は、アデノウイルスおよびDNA/アデノウイルス複合体と同様に、NIVSに適切な別のベクター系であると思われる。
DNAコードされたおよびアデノウイルスコードされたトランスジーンの共発現
免疫系の応答を増加させる方法により、ワクチンの臨床上の成果を改善できるかもしれない。リンパ球母集団の活性化および拡大に関連する免疫修飾分子の局所産生により、ワクチン接種の効力が大きく改善されるかもしれない。ネズミのB7-1およびGM-CSF遺伝子をコードするアデノウイルスベクターが作成されている。従って、DNA/アデノウイルス複合体の局所施用により、抗原に対する免疫応答を高めるために個々の皮膚細胞中で、DNAコードされた抗原または免疫修飾分子とアデノウイルスコードされた抗原または免疫修飾分子とを共発現できるかもしれない。
局所施用による異なる遺伝子ベクターからの皮膚中の相対的なトランスジーン発現
アデノウイルス組換え体、DNA/アデノウイルス複合体、DNA/リポソーム複合体、およびおそらく多くの他の遺伝子ベクターは全て、非侵入ワクチンのためのキャリアとして施用できることが示されている。トランスジーン発現についての効力が高くなるほど、キャリアはより強力になると考えられる。利用されるベクターについての相対的な有効性を明らかにするために、アデノウイルス組換え体、DNA/アデノウイルス複合体、またはDNA/リポソーム複合体を、局所施用によりマウスの皮膚に18時間接触させた。その後、処理された皮膚を動物から取り、Promega社のルシフェラーゼ分析システムを使用して2分間の集中発光の測定により光度計でルシフェラーゼ活性について分析し、バックグランドを記録から引いた。図10に示されるように、アデノウイルス組換え体は、皮膚標的非侵入遺伝子供給に最も有効なベクター系であるとわかった。偽処理されたマウスは、皮膚中で検出可能なルシフェラーゼ活性を産生しなかった。LU、光単位;Ad、AdCMV-luc;DNA/Ad、Ad dl1014と複合されたpVR-1216DNA;DNA/リポソーム、DOTAP/DOPEと複合されたpVR-1216DNA。結果は、平均対数[1cm2の皮膚当たりのLU]±SE(nが各々の段の頂部に示されている)である。DNA/アデノウイルス複合体の有効性はアデノウイルス組換え体の有効性より低いが、DNA/リポソーム複合体の有効性よりは著しく高い。さらに、アデノウイルスは、生存能力のあるウイルス粒子が播種するのを防ぐためDNAと複合体を形成する前にUV照射することにより不活性化され得る。従って、DNA/アデノウイルス複合体は、有効性および安全性因子の両方をワクチンの新世代の調製において考慮する場合に、非侵入ワクチンの供給に最も有望なキャリア系であると思われる。
Claims (38)
- 免疫応答を非侵入的に誘発するための組成物であって、関心のあるトランスジーンをコードする遺伝子ベクターを含有し、免疫学的効果量の該遺伝子ベクターを皮膚に局所施用することにより治療を必要とする動物の皮膚に該ベクターを接触させることを特徴とする組成物。
- 抗腫瘍免疫応答を非侵入的に誘発するための組成物であって、投与後に動物において抗腫瘍効果を誘発する抗原またはその断片をコードするトランスジーンを含むベクターを含有し、免疫学的に効果的な濃度の該ベクターを皮膚に局所施用することにより動物の皮膚に該ベクターを接触させることを特徴とする組成物。
- 前記遺伝子ベクターが、トランスジーンを発現できる遺伝子ベクターを含むことを特徴とする請求項1または2記載の組成物。
- 前記遺伝子ベクターが、ウイルスベクターおよびプラスミドDNAからなる群より選択されることを特徴とする請求項3記載の組成物。
- 前記遺伝子ベクターが、アデノウイルスであることを特徴とする請求項3記載の組成物。
- 前記トランスジーンが、抗原またはその断片をコードすることを特徴とする請求項1記載の組成物。
- 前記抗原またはその断片が、病原または新生物に対する免疫応答をもたらすことができることを特徴とする請求項6記載の組成物。
- 前記抗原が、ヒト癌胎児性抗原、HIV gp120抗原、破傷風毒素C断片およびインフルエンザNPとHA抗原から実質的になる群より選択されることを特徴とする請求項6記載の組成物。
- 前記トランスジーンが、抗原またはその断片をコードすることを特徴とする請求項2記載の組成物。
- 前記抗原またはその断片が、新生物に対する免疫応答をもたらすことができることを特徴とする請求項9記載の組成物。
- 前記抗原をコードする前記トランスジーンが、オンコジーン、腫瘍サプレッサ遺伝子、および腫瘍関連遺伝子を含むことを特徴とする請求項9記載の組成物。
- 前記遺伝子ベクターの免疫学的効果量が、アデノウイルスベクターについて少なくとも約100プラーク形成単位(pfu)およびプラスミドについて少なくとも1ngのDNAであることを特徴とする請求項1または2記載の組成物。
- 前記ベクターが、免疫修飾遺伝子をコードすることを特徴とする請求項3記載の組成物。
- 前記ベクターがさらに、共刺激性遺伝子およびサイトカイン遺伝子をコードすることを特徴とする請求項13記載の組成物。
- 前記免疫修飾遺伝子が、GM-CSF遺伝子、B7-1遺伝子、B7-2遺伝子、インターロイキン-2遺伝子、インターロイキン-12遺伝子およびインターフェロン遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項13記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターが、E1領域で欠損していることを特徴とする請求項5記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターが、E4領域で欠損していることを特徴とする請求項5記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターが、E3領域で欠損していることを特徴とする請求項5記載の組成物。
- 前記ベクターが、全てのウイルス遺伝子を欠失していることを特徴とする請求項5記載の組成物。
- 前記ベクターが、DNA/ウイルス複合体を含むことを特徴とする請求項4記載の組成物。
- 前記DNAがプラスミド形態であることを特徴とする請求項20記載の組成物。
- 前記ベクターが、DNA/リポソーム複合体を含むことを特徴とする請求項4記載の組成物。
- 前記ベクターが、抗原またはその断片をコードする組換えアデノウイルスを含むことを特徴とする請求項4記載の組成物。
- 前記免疫応答が、感染性の病原または新生物に対する防御効果をもたらすことを特徴とする請求項1記載の組成物。
- 前記免疫応答が、抗腫瘍効果をもたらすことを特徴とする請求項2記載の組成物。
- 関心のある遺伝子を含有する遺伝子ベクターをデバイス上に配置し、内部に関心のある遺伝子を含有する遺伝子ベクターを有する該デバイスを動物の皮膚に施用することを特徴とする請求項1または2記載の組成物。
- 前記デバイスが、パッドを含むことを特徴とする請求項26記載の組成物。
- 前記デバイスが、接着ガーゼ包帯様デバイスを含むことを特徴とする請求項26記載の組成物。
- DNA/ウイルス複合体を調製する方法であって、
適切なウイルスベクターを提供し、
前記ウイルスベクターと複合させるDNAサンプルを提供し、
ポリ−L−リシンの存在下で該ウイルスベクターと該DNAサンプルとを混合する、
各工程を含むことを特徴とする方法。 - 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスであることを特徴とする請求項29記載の方法。
- 前記DNAサンプルが、関心のある遺伝子を含むことを特徴とする請求項29記載の方法。
- 前記遺伝子が、抗原またはその断片をコードすることを特徴とする請求項31記載の方法。
- 前記ポリ−L−リシン(PLL)対前記DNAサンプルの割合が、約0.9μg PLL:1.0μg DNAから約9.0μg PLL:1μg DNAまでの範囲であることを特徴とする請求項29記載の方法。
- 前記ポリ−L−リシン(PLL)対前記アデノウイルスベクターの割合が、約6.0μg PLL:108pfuアデノウイルスから約6.0μg PLL:1010pfuアデノウイルスまでの範囲であることを特徴とする請求項29記載の方法。
- 遺伝子ベクターを動物の皮膚の表面に供給するためのデバイスであって、
動物の皮膚の表面への接触に適合させた第1の側面と第2の側面とを有する第1の材料シート、および前記第1のシートの第1の側面と反対側に配置された第1の側面を有する第2の材料シートを有してなる皮膚接触手段を含み、
前記第1のシートと前記第2のシートが外縁で互いに結合して、それらの間に遺伝子ベクターを含有するための中央包囲空間を定め、
前記第1のシートを構成する材料が、前記第2のシートを構成する材料より構造上弱く、それによって、遺伝子ベクターが前記空間内に配置されさらに前記第2のシートの第1の側面に力が加えられると、前記第2のシートより前に前記第1のシートが破壊されて、前記遺伝子ベクターを前記動物の皮膚に接触させることを特徴とするデバイス。 - 前記デバイスを前記動物の皮膚の表面に接着させるために前記第1のシートの第1の側面が外辺に配置された接着剤を含み、前記空間上に重なる前記第1のシートの一部が実質的に接着剤を有しないことを特徴とする請求項35記載のデバイス。
- 前記シートが、遺伝子ベクターに非浸透性の材料からなることを特徴とする請求項35記載のデバイス。
- 前記シートが、高分子材料からなることを特徴とする請求項35記載のデバイス。
Applications Claiming Priority (2)
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