KR20080009171A

KR20080009171A - 유전자 벡터의 국소 적용에 의한 백신접종

Info

Publication number: KR20080009171A
Application number: KR1020087001342A
Authority: KR
Inventors: 더-추 크리스토퍼 탕; 도널드 에이치. 막스; 데이빗 티. 커릴; 종카이 쉬
Original assignee: 더 유에이비 리서치 파운데이션
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1998-08-13
Publication date: 2008-01-24
Also published as: AU737717B2; AU8780798A; HK1032753A1; ATE421888T1; WO1999008713A1; CN1274290A; DE69840524D1; EP1015035A4; EP1015035B1; CN100352511C; JP2014101379A; KR20010022863A; JP2001515052A; CA2301328A1; EP1015035A1; JP2011068658A

Abstract

본 발명은 면역학적 유효 농도의 해당 유전자 암호화 유전자 벡터를 피부에 국소 적용함으로써 치료를 요하는 개체의 피부를 접촉시키는 단계를 포함하는, 비-침습적인 방식으로 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 또한, 투여 후 동물에서 항-종양 효과를 유도하는 항원을 암호화하는 유전자 암호화 벡터의 면역학적 유효농도를 피부에 국소 적용함으로써 동물의 피부를 접촉시키는 단계를 포함하는, 치료를 요하는 동물에서 항-종양 면역반응을 비-침습적으로 유도하는 방법이 제공된다. 유전자 벡터는 아데노바이러스 재조합체, DNA/아데노바이러스 복합체, DNA/리포솜 복합체, 또는 트랜스진을 발현할 수 있는 여타 벡터를 포함한다. 유전자 벡터의 국소 적용은 바람직하게는 디자인되는 전달장치를 포함할 수 있다.

비-침습성 백신접종

Description

유전자 벡터의 국소 적용에 의한 백신접종{VACCINATION BY TOPICAL APPLICATION OF GENETIC VECTORS}

본 출원은 1997년 8월 13일자 출원된 미국 임시출원 제60/055,520호 및 1998년 2월 11일자 출원된 미국 임시출원 제60/075,113호의 우선권을 주장한다.

본 발명은 일반적으로 면역학 및 백신 기술 분야에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 면역반응을 도출하기 위한 피부-표적화 비-침습성 유전자 전달 기술 및 이의 용도에 관한 것이다.

척추동물 면역 시스템의 활성화는 병원체 및 악성 종양에 대항하여 동물을 보호하기 위한 중요한 메커니즘이다. 면역 시스템은 체액성 및 세포성 지류를 포함하여 다수의 상호작용하는 성분으로 이루어진다. 체액성 면역은 항원과 직접 결합하는 항체를 수반한다. 체액성 면역의 효능제로서 항체 분자는 B 림프구에 의해 분비된다. 세포성 면역은 비-자기 항원을 생성하는 타 세포를 인식하여 죽이는 특화된 세포독성 T 림프구(CTL)를 수반한다. CTL은 MHC(주 조직적합성 복합체) 클래스 I 분자에 결합된 표적 세포의 표면에 출현하는 분해된 펩타이드 단편에 반응한다. 세포내에 생성된 단백질은 세포 대사의 일부로서 펩타이드로 계속적으로 분해됨이 이해되어 있다. 이러한 단편은 MHC 분자에 결합되어 세포 표면으로 수송된다. 따라서, 세포 면역 시스템은 체내 모든 세포에 생성된 단백질 스펙트럼을 항구히 모니터하고 비-자기 항원을 생성하는 세포의 제거에 대처한다.

백신접종은 항원에 반응하기 위한 동물의 프라이밍 과정이다. 항원은 단백질로서(전통적인) 또는 항원을 발현하게 될 유전자로서(유전자 면역화) 투여될 수 있다. 과정은 T 및 B 림프구, 기타 유형의 림프구성 세포, 및 항원을 프로세싱하고 이를 면역 시스템을 활성화시킬 수 있는 형태로 발현하는 특화 항원 부여 세포(APC)를 포함한다. 유전자 백신 투여를 위한 현행 방식은 바늘 주사, 난절, 및 유전자 건-매개 침습를 포함한 침습성 절차에 역점을 두고 있다. 침습성 방식에서의 백신 접종은 장비와 특수 의학 훈련자가 요구되며 통상적으로 불안 및 잠정적인 위험(출혈, 감염)과 연관되어 있다. 침습성 방식에서 백신 접종이 필수적이지 아닐 수도 있다는 증거가 있다(Tang et al., 1997; Glenn et al., 1998). 피부는 외부 환경과 직접 접촉하며 잠재적인 병원체와 항구적인 접촉상태에 있으므로, 면역 시스템은 잠재적인 감염을 막기 위한 피부 경계를 따라 가동화된 생물학적군을 일정하게 유지하여야 한다. 결과적으로, 피부 외층은 본질적으로 면역 컴피턴트 조직이다. 체액성 및 세포독성 세포 면역 반응 모두의 도출을 위해 피부에 존재하는 면역학적 성분은 표피 랑게르한스 세포(MHC 클래스 II-양성 항원-부여 세포임), 케라틴세포, 및 두

및

림프구를 포함한다. 이들 성분은 피부를 백신 투여를 위한 이상적인 부위로 만든다. 피부의 접근 가능한 큰 면적 및 이의 내구성 은 백신을 이러한 조직에 적용하기 위한 다른 장점이다. 물리적 침습없이 피부 외층에서 소수의 항원 발현은 면역 감시 메커니즘에 경고를 함으로써 강력한 면역 반응을 도출할 수 있다.

백신의 효능은 종양이나 병원체에 의한 추후의 도전에 대한 보호 범위에 의해 측정된다. 효과적인 백신은 접종을 최소한도로 한 후 질병에 대해 표적화된 개입을 위한 고역가 및 장기 지속성 면역을 유도할 수 있는 면역원이다. 예를 들면, 유전자 면역화는 동물 자체 세포에서 단백질을 발현하는 유전자를 발현시킴으로써 특정 단백질에 대한 면역 반응을 도출하기 위한 접근법이다. 생체내 장기 항원 제공으로 생기는 실질적인 항원 증폭 및 면역 자극은 항원에 대해 굳건한 면역을 유도할 수 있다. 유전자 면역화는 특정 단백질에 대한 면역 반응을 생성시키기 위한 백신 프로토콜을 단순화시키는 데, 이유는 단백질 정제 및 보조제와의 결합(둘다 일상적으로 백신 개발에 요구된다) 같은 종종 난해한 단계가 제거되기 때문이다. 유전자 면역화가 단백질의 분리를 요구하지는 않으므로, 생화학적으로 정제하였을 때 형태적인 에피토프를 상실할 수 있는 단백질에 대해 특히 가치가 있다. 유전자 백신은 또한 간섭을 일으키거나 효능에 영향을 줌이 없이 함께 전달될 수 있으며(Tang et al., 1992; Barry et al., 1995) 이는 다중 항원에 대한 백신화 전략을 단순화시킬 수 있다. 본 출원에서 제시되는 바와 같이, 유전자 백신은 피부-표적화 비-침습성 백신으로서 신규 방법으로 접종될 수 있다. 유전자 백신과 비-침습성 전달 양식과의 조합은 특수한 기술이나 투여 장비를 요하지 않는 신부류의 "데모크라틱(democratic)" 백신을 이끌어낼 수 있다.

국소 적용된 단백질-기본 백신이 연구되고는 있지만 유용성이 제한되어 있다. 비록 피부-표적화 비-침습성 유전자 백신이 이미 보여준 것처럼(Tang et al., 1997) 콜레라 독소와 함께 단백질-기본 백신의 국소 적용은 동일한 비-침습성 방식으로 동물을 면역시킬 수 있지만(Glenn et al., 1998), 두 부류의 백신은 상이한 메커니즘을 통해 면역 시스템을 활성화시킨다. 더욱이, 유전자 백신의 효능은 자연 감염과 유사한 항원의 신합성에 기인하여 단백질 백신의 효능보다 일반적으로 우수하다(McDonnell and Askari, 1996). 비록, 미국 특허 제3,837,340호가 피부를 건조시킨 바이러스와 접촉시킴에 의한 동물 백신화 방법을 기술하고 있지만, 이들이 이용하고 있는 바이러스는 트랜스진을 발현할 수 있는 유전자 벡터가 아니다. 아울러, 면역원이 동물 자신의 세포에서 바이러스 유전자의 발현으로 생성된 단백질 대신, 바이러스 코트의 단백질일 수도 있다.

백신화의 선행기술은 통상적으로 장비, 예를 들면, 주사 바늘 또는 유전자 건, 및 백신 투여를 위한 특수 기술이 요구된다. 의학적 훈련이나 장비없이도 개인에 의한 백신 접종이 당분야에 매우 필요하고 요망되고 있다. 다수의 질환은 잠재적으로 피부상 비-침습성 백신화(NIVS)의 전개를 통해 면역화될 수 있으며, 이유는 절차가 간편하고, 효과적이며, 경제적이며, 무통성이며 잠정적으로 안전하기 때문이다. 결과적으로, NIVS는 의료 자원 공급이 부족한 개발도상국, 및 환자의 안락에 기인한 선진국에서의 백신 커버리지를 증강시킬 수 있다. AIDS 및 flu를 포함한 바이러스에 의해, 테타너스 및 TB를 포함한 박테리아에 의해, 및 말라리아를 포함한 기생충, 및 다양한 각종 암종류를 포함한 악성 종양에 의해 야기된 전염병은 모두 특수 장비 및 의료인을 요구하지 않고도 피부-표적화 비-침습성 백신으로 예방 또는 치료될 수 있다. 본 발명은 당분야에서의 이러한 오랜 필요성과 요망을 충족시킨다.

피부상 비-침습성 백신접종(NIVS)은 백신접종 전략을 향상시킬 수 있는데, 이유는 피부가 면역 컴피턴트 조직이고 이러한 비-침습성 절차는 특수 훈련을 받은 사람을 요하지 않기 때문이다. 피부-표적화 비-침습성 유전자 전달은 피부에서의 국소 트랜스진 발현 및 면역 반응의 도출을 달성할 수 있다(Tang et al., 1997). 이러한 결과는 NIVS가 백신 전달을 위한 새롭고 효율적인 방법임을 시사한다. 본 발명의 간단하고, 효과적이며 경제적인 무통성 면역화 프로토콜은 백신접종을 의료자원에 덜 의존하도록 만들고, 따라서 백신접종의 연간 이용율을 증가시킨다.

본 발명은 유전자 벡터를 포함하는 제제의 피부-표적화 비-침습성 전달을 포함하여, 벡터가 표피 세포에 의해 취해지고 척추동물에 면역원 효과를 보이는 동물 면역화 방법을 제공한다. 또한, 전달 장치에 유전자 벡터를 포함시키고 척추동물의 생 피부를 장치안에 들어있는 균일 용량의 유전물질과 접촉시켜, 벡터가 면역 컴피턴트 피부 조직내 특정 항원을 발현시키기 위한 표피 세포에 의해 취해지는 단계를 포함하는, 전달장치에 의한 동물 면역화 방법도 제공된다. 유전자 벡터는 아데노바이러스 재조합체, DNA/아데노바이러스 복합체, DNA/리포솜 복합체, 또는 척추동물 피부에서 항원을 발현할 수 있는 여타 유전자 벡터일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 피부에 면역학적 유효농도의 해당 유전자를 암호화하는 유전자 벡터를 국소 적용함으로써 치료를 요하는 개인이나 동물의 피부를 접촉시키는 단계를 포함하는, 면역반응 유도방법이 제공된다.

본 발명의 다른 양태에서, 투여 후 개인이나 동물에서 방어 면역 효과를 유도하는 항원을 암호화하는 유전자 암호 벡터의 면역학적 유효농도를 피부에 국소 적용함으로써 동물의 피부를 접촉시키는 단계를 포함하는, 치료를 요하는 개인이나 동물에서 방어 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다.

다른 양태로서, 본 발명은 생 피부를 DNA/아데노바이러스 복합체와 접촉시킴으로써 동일 세포에서 트랜스진을 동시발현하는 방법을 제공한다. 이러한 프로토콜은 동일 세포 환경내 항원으로 사이토킨, 동시자극성 분자, 또는 기타 면역 조절자를 동시 생성함으로써 면역 시스템의 조작을 허용한다.

본 발명은 또한, 피부-표적화 비-침습성 백신의 전달을 위한 전달 장치(밴디지, 접착성 드레싱 등)의 사용을 포함한다.

본 발명은 본원 기재의 방법에 고려되는 모든 용도를 위한 모든 유전자 벡터를 포함한다. 본 발명의 기타 및 추가 일면, 특징, 및 장점은 설명의 목적으로 제시된 본 발명의 바람직한 양태의 하기 설명으로부터 자명해진다.

본 발명은 치료를 요하는 개인이나 동물의 피부 외층을 면역반응 도출에 적당한 기간 동안 물리적 침습없이 면역학적 유효 농도의 해당 유전자 함유 유전자 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 면역반응 유도방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 사용하는 면역반응 생성에 사용될 수 있는 항원의 대표적인 예는 인간 암배아성 항원, HIV gp120, 테타너스 독소 C-단편, 및 인플루엔자 HA 및 NP 등을 포함한다. 가장 바람직하게는, 면역반응은 신생물 또는 감염성 병원체에 대한 방어 효 과를 일으킨다.

본 발명의 실행은 동물 면역을 위한 비-침습성 절차에 의해 척추동물 피부의 외층으로 폴리펩타이드를 작동적으로 암호화하는 유전자 벡터를 전달하는 단계를 요한다. 이러한 유전자 벡터는 어떠한 장치도 사용하지 않고 유전물질을 피부에 직접 전달하거나, 밴디지-유사 장치를 이용하는 생 피부 접촉에 의해 척추동물에 투여될 수 있다. 바람직한 적용에서, 유전자 벡터는 수용액 형태이다. 동결건조 분말로부터 재구성된 벡터도 허용된다. 벡터는 완전한 유전자, 하나의 유전자 또는 수 개 유전자의 단편, 우비퀴틴 같은 면역 조절성 서열과 융합된 유전자 단편 또는 CpG-풍부 합성 DNA를 발현에 필요한 전사/해독 시그널과 함께 암호화할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 벡터는 추가로, 보조자극자 및 사이토킨을 암호화하는 유전자들로 이루어진 그룹 중에서 선택된 유전자를 함유한다. 이러한 방법에서, 유전자는 GM-CSF 유전자, B7-1 유전자, B7-2 유전자, 인터루킨-2 유전자, 인터루킨-12 유전자 및 인터페론 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

아데노바이러스 재조합체의 사용을 요하는 본 발명의 양태에서. 이러한 것들로는 E1-결손, E3-결손, 및/또는 E4-결손 아데노바이러스 벡터, 또는 모든 바이러스 유전자가 결실되는 "것리스(gutless)" 아데노바이러스 벡터가 포함될 수 있다. E1 돌연변이는 벡터의 안정성 여지를 환기시키는 데 이유는 E1-결손 아데노바이러스 돌연변이체가 비-허용성 세포에서 복제능이 없기 때문이다. E3 돌연변이는 메커니즘을 붕괴시킴으로써 항원의 면역원성을 증진시켜 아데노바이러스는 MHC 클래스 I 분자를 하향 조절한다. E4 돌연변이는 후기 유전자 발현을 억제함으로써 아데노 바이러스 벡터의 면역원성을 감소시키고, 따라서 동일 벡터를 이용하여 반복된 재백신접종을 허용할 수 있다. "것리스" 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 계통에 있어서 최신 모델이다. 이의 복제는 헬퍼 바이러스 및 E1a 및 Cre 모두를 발현하는 특수한 인간 293 세포주, 즉 자연 환경에서는 존재하지 않는 상태를 요한다; 벡터는 모든 바이러스 유전자가 박탈되며, 따라서 백신 캐리어로서의 벡터는 비-면역원성이고 재백신접종을 위해 수회 접종시킬 수 있다. "것리스" 아데노바이러스 벡터는 또한 트랜스진 수용을 위한 36 kb 공간을 함유하고 있어, 다수 항원 유전자의 세포 중으로의 동시전달을 허용한다, RGD 모티프 같은 특정 서열 모티프를 아데노바이러스 벡터의 H-I 루프 중으로 삽입시켜 감염력을 증진시킬 수 있다. 아데노바이러스 재조합체는 특정 트랜스진 또는 트랜스진의 단편을 전술한 것들과 같은 아데노바이러스 벡터 중으로 클로닝함으로써 작제된다. 아데노바이러스 재조합체는 면역화제로 사용하기 위한 비-침습성 방식에서 척추동물의 표피 세포 형질도입에 사용된다.

DNA/아데노바이러스 복합체의 사용을 요구하는 본 발명의 양태에서는, PEI(폴리에틸렌이민) 또는 폴리라이신을 이용하여 아데노바이러스 벡터와 복합체를 이룬 플라스미드 DNA를 요구한다. 복합체내의 아데노바이러스 벡터는 UV선에 의해 "생존"하거나 "사멸"될 수도 있다. DNA-매개 형질감염(Cotten et al., 1992)을 촉진시키는 수용체-결합 리간드와 엔도솜분해제로서 UV-불활성화된 아데노바이러스 벡터는 백신 캐리어의 안전성을 증가시킬 수 있다. DNA/아데노바이러스 복합체는 면역화제로 유용한 비-침습성 양식에 의해 척추동물의 표피 세포를 형질감염하는데 이용된다.

DNA/리포솜 복합체의 사용을 요구하는 본 발명의 양태에서는, 리포솜 형성 물질을 요구하고, DNA/리포솜 복합체가 이들 물질로부터 제조될 것을 요구한다. DNA/리포솜 복합체는 면역화제로 유용한 비-침습성 양식에 의해 척추동물의 표피 세포를 형질감염시키는데 이용된다.

본 발명에 의해 제공된 유전자 벡터는 인간 및/또는 세포 면역 반응을 일으키는 보조제로 작용할 수 있는 면역 조절 분자를 암호화할 수도 있다. 이러한 분자는 사이토킨, 보조자극자, 또는 면역 반응의 진행을 변화시킬 수 있는 임의 분자를 포함한다. 이러한 기술은 항원의 면역원성의 추가 증진을 위해 변형될 수 있다.

NIVS에 이용된 유전자 벡터는 다수의 형태를 취할 수 있고, 본 발명은 특정 폴리펩타이드를 암호화하는 특정 유전 물질에 한정되지 않는다. 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 프로토조아 벡터, 및 DNA 벡터를 포함한 모든 형태의 유전자 벡터가 피부-표적화된 비-침습성 백신 캐리어로 이용될 때 본 발명에서 고려되는 방법에 포함된다.

유전자는 무-장치 국소 적용 또는 패드 또는 밴디지; 예를 들어, 접착 밴디지와 같은 장치에 의해 동물 피부 표면상에 유전자를 코팅하는 것을 포함한 다수의 방법에 의해 전달될 수 있다. 도 11에서, 비-침습성 백신접종 장치가 도시되고 있다. 이러한 백신 전달 장치는 내부에 기포를 지닌 비-알러지성, 피부 접착 패치를 포함한다. 일 양태에서, 패치는 추가로 직경이 대략 1 cm인 플라스틱으로 이루어 진다. 백신은 기포내부에 위치할 수 있다. 또다른 양태에서, 기포는 대략 1 mL의 백신(액상, 재구성 유체를 지닌 동결건조 분말, 및 이의 변형물)을 함유한다. 바람직한 양태에서, 피부와 접촉하는 기포 표면은 의도적으로 마주보는 표면보다 약하게 되어있어, 압력이 마주보는 표면에 적용되면, 하부 표면이 파괴되어 피부상으로 기포의 백신 내용물이 나오게 된다. 플라스틱 패치는 피부 표면으로 나오지 못하게 백신을 막아준다.

본 발명의 유전자 벡터 및 관련 유전자의 국소 투여를 위한 형태는 액상, 연고, 분말, 및 스프레이를 포함할 수 있다. 활성 성분은 멸균 조건하에 생리학적으로 허용가능한 캐리어 및 방부제, 필요한 경우 완충제, 추진제, 또는 흡수 증진제와 함께 혼합될 수 있다.

본원에서 사용된 용어에서, 면역학적 유효량은 동물에 투여시, 관련 유전자 산물에 대해 면역 반응을 유도하는 관련 유전자를 암호화하는 유전자 벡터의 양 또는 농도이다.

각종 항원은 상이한 농도로 국소적으로 전달될 수 있다. 일반적으로, 유용한 아데노바이러스 벡터의 양은 적어도 대략 100 pfu이고 플라스미드 DNA의 경우는 적어도 대략 1 ng DNA이다.

본 발명의 방법을 적절히 적용하여 예방 백신접종으로서 질병을 예방하거나 치료 백신접종으로서 질병을 치료할 수 있다.

본 발명의 백신은 단독 또는 면역 조성물의 일부로서 동물에 투여될 수 있다.

기재된 인간 백신 이외에, 본 발명의 방법은 동물을 면역화하는데 이용될 수 있다. 용어 동물은 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 동물의 예로는 인간, 소, 개, 고양이, 염소, 양, 및 돼지 등이 포함된다. 모든 척추동물의 면역 시스템은 유사하게 작동하기 때문에, 기재된 적용법은 모든 척추동물 시스템에 적용될 수 있다.

본원발명은 비침습적으로 포유동물에서 전신 면역 반응을 유도함으로써 특수한 훈련없이 백신접종이 가능하다. 또한, 본원발명은 간단하고 효과적이며 경제적인 무통성 면역화 프로토콜로서 백신접종을 의료자원에 덜 의존하도록 만들고, 따라서 백신접종의 연간 이용율을 증가시킨다.

하기 실시예는 본 발명의 각종 양태를 구체적으로 예를 들어 설명하고 있으며 어떠한 형태로든 본 발명을 제한할 수는 없다.

프로토콜

마우스 및 세포 배양

근친교배 마우스를 버밍햄의 알라바마 대학에서 유지관리 하고 있다. 세포를 2% 태 소 혈청 및 6% 송아지 혈청을 함유한 RPMI 1640 또는 DMEM 배지에서 배양한다.

유전자 벡터의 국소 적용

*마우스를 마취시켜 배 또는 목 피부의 일정 범위를 덮고있는 털과 각질 상 피를 탈모제(예, NAIR)로 제거한다. 유전자 벡터를 미리 면도되고 NAIR로 처리된 피부상에 피페팅하고 시간을 달리해가며(예, 1시간 내지 8시간) 털이 제거된 피부와 접촉시킨다. 벡터를 털이 제거된 피부상에 직접 피페팅하거나, 피부상에 접착제로 접착시킨 실린더에 피페팅할 수 있다.

아데노바이러스 벡터의 제조

높은 역가의 아데노바이러스를 특정 아데노바이러스 재조합체로 감염된 인간 293 세포로부터 제조한다. 용출물을 세슘 클로라이드 구배를 통해 초원심분리한다. 바이러스 밴드를 추출하고 10 mM Tris(pH 7.5)/135 mM NaCl/5 mM KCl/1 mM MgCl₂로 투석한다. 정제된 바이러스를 10%로 첨가된 글리세롤을 이용하여 필터 멸균하고, 등분하여 -80℃에 보관한다. 아데노바이러스의 역가를 플라크 분석으로 측정한다.

루시퍼라제 분석

피부에서 루시퍼라제의 양을 앞서 기재된 바와같이 측정한다(Tang, 1994). 간단히 말하면, 절개된 피부 조각을 용해 완충액에서 Kontes 유리 조직 그라인더로 분쇄한다. 원심분리로 조직 파편을 제거한 후, 과량의 ATP와 루시페린의 존재하에 총 광 방출을 측정하여 피부 추출물에서 루시퍼라제 활성을 루미노미터를 이용하여 측정한다.

β-갈락토시다제 분석

절개된 피부 조각을 액상 질소중의 Tissue-Tek O.C.T. 화합물(Miles Laboratories Inc.)에서 빠르게 동결하고 사용시까지 -80℃에 보관한다. 동결된 조직을 4 ㎛로 절단하고, 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 다음, 앞서와 같이(Tang et al., 1994) X-gal 염색 용액에서 배양시켜 β-갈락토시다제 활성을 위해 염색한다. 단편을 헤마톡실린과 에오신으로 대조염색한다.

DNA/아데노바이러스 복합체의 제조

각 적용을 위한 축합제 폴리라이신의 존재하에 100 ㎍의 플라스미드 DNA를 1 x 10¹¹ 아데노바이러스 입자와 혼합하여 DNA/아데노바이러스 복합체를 제조한다. 아데노바이러스의 역가를 흡광도로 측정한다.

DNA/리포솜 복합체의 제조

각 적용을 위해 100 ㎍의 플라스미드 DNA를 100 ㎍의 DOTAP/DOPE(1:1; Avanti)와 혼합하여 DNA/리포솜 복합체를 제조한다. Qiagen Plasmid Maxi Kit를 이용하여 플라스미드를 제조한다.

웨스턴 블롯 분석

꼬리 출혈에서 나온 혈청은 1:250 내지 1:500으로 희석되고 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리되어 Immobilon-P막(Millipore)으로 옮겨지는 정제 단백질과 반응한다. ECL 키트(Amersham)을 이용하여 반응을 확인한다.

실시예 1

본 발명은 복잡한 장치를 사용하지 않고도 피부-표적화된 비-침습성 유전자 벡터 전달에 의한 간단한 방법으로 항원 유전자를 마우스 피부에 전달할 수 있음을 입증한다. 도 1은 상당량의 루시퍼라제 효소가 피부상으로 제한된 양의 AdCMV-luc(개똥벌레 루시퍼라제를 암호화하는 아데노바이러스 벡터)(Tang et al., 1994)의 전달 후에 생성됨을 도시하고 있다. Ad, 아데노바이러스; pfu, 플라크-형성 단위; LU, 광 단위. 결과는 평균 log[LU/㎠피부]±SE(n은 각 컬럼의 상단에 도시됨)이다. 루시퍼라제를 암호화하지 않는 아데노바이러스 벡터로 모의-적용되거나 코팅된 마우스는 피부에 검출가능한 루시퍼라제 활성을 생성하지 않는다. 피부에서 아데노바이러스 벡터의 트랜스진 발현 수준은 바이러스의 역가와 상관관계가 없어 보인다. 단지 소량의 세포가 한정된 피부에서 바이러스로 형질도입될 수 있고, 아데노바이러스 재조합체의 10⁶ 플라크-형성 단위(pfu)가 표적 세포를 포화시킬 수 있다. 이러한 가변성은 일부는 개개 마우스의 변수로 인한 것일 수도 있다. 또한, 몇몇 가변성은 표준화되지 않은(Johnston and Tang, 1994) 각질 상피를 제거하는 과정에서도 일어난다. 생성된 항원의 양은 가능하게는 좀더 많은 벡터를 적용시켜 대규모로 증폭될 수 있다.

실시예 2

이.콜라이 β-갈락토시다제 유전자(AdCMV-βgal)(Tang et al., 1994)를 암호화하는 아데노바이러스 벡터의 피부-표적화된 비-침습성 전달 이후에 X-gal 기질을 이용한 동결 단편을 염색하여보면 피부상으로 비-침습성 백신접종용 주요 표적 세포는 모낭(도 2a)내의 털 매트릭스와 외피의 가장 바깥층(도 2b)내의 케라틴세포이다. 처리된 피부 조직에서는 어떠한 물리적 마멸도 발견되지 않았고 염증도 없었 다. 피부상에 10⁸ pfu의 AdCMV-βgal을 피페팅한 지 1일만에 비-침습성 유전자 전달을 받은 피부 조직을 동물에서 절개하고, 절단하여, 고정시킨 다음, 기재된 바대로 X-gal 기질로 염색한다(Tang et al., 1994). 도 2a는 모낭내의 아데노바이러스로 형질도입된 털 매트릭스 세포를 150배 확대한 것이다. 도 2b는 외피의 가장 바깥층내의 아데노바이러스-형질도입된 케라티노사이트를 150배 확대하여 도시한 것이다. AdCMV-luc로 모의-적용되거나 코팅된 대조 동물에서는 청색 세포가 발견되지 않았다.

실시예 3

아데노바이러스-매개 NIVS 에 의한 인간 면역 반응 유도

NIVS는 동물에 백신접종하는 신규 방법이다. 이 과정이 벡터에 의해 암호화된 항원에 대해 특정 면역 반응을 유도할 수 있다는 사실을 입증하기 위해, AdCMV-hcea[인간 암배아 항원(CEA)을 암호화하는 아데노바이러스 벡터]를 C57BL/6종 마우스상에 피페팅한다. 10⁸ pfu AdCMV-hcea의 피부-표적화된 비-침습성 전달 후 한달째 백신접종된 마우스에서 나온 혈청을 1:500배로 희석하고, 5% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리되어, Immobilon-P막(Millipore)으로 전달되는 정제된 인간 CEA 단백질(T.Strong에서 제공)과 아데노바이러스 단백질과 반응시킨다. 도 3a에서, 레인 1, 0.5 ㎍ 인간 CEA; 레인 2, 0.5 ㎍ BSA; 레인 3, 10⁷ pfu의 아데노바이러스. 도 3a는 백신접종된 동물에서 나온 시험 혈청이 웨스턴 블롯에서 소 혈청 알부민(BSA)이 아닌, 정제된 인간 CEA와 반응함을 보여주는데, 이는 특정 항체가 피부- 표적화된 비-침습성 유전자 전달로 인해 아데노바이러스 벡터에 의해 암호화된 외생 단백질에 대해 생성된다는 결론을 뒷받침한다.

이러한 기술이 일반적으로 적용가능한지를 시험하기 위해, AdCMV-hgmcsf[인간 과립성 백혈구 마크로파아지 콜로니 자극 인자(hGM-CSF)를 암호화하는 아데노바이러스 벡터]를 피부에 적용한다. 인간 GM-CSF 단백질에 대한 항체를 검출하기 위해, 10⁸ pfu의 AdCMV-hgmcsf의 피부-표적화된 비-침습성 전달에 의해 동물을 백신접종한다. 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리된 정제된 인간 GM-CSF 단백질(CalBiochem)을 막으로 옮겨 희석된 혈청과 반응시킨다. 기타 처리는 도 3a에 기재된 바와같이 수행된다. 도 3b에서, 레인 1, 0.25 ㎍ 인간 GM-CSF; 레인 2, 0.25 ㎍ BSA; 레인 3, 10⁷ pfu 아데노바이러스. 복제-결손 인간 아데노바이러스 혈청형 5에서 유도된 AdCMV-hcea와 AdCMV-hgmcsf를 인간 293 세포에서 생산한다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서-프로모터 요소에 의해 추진되는 인간 CEA 유전자 또는 인간 GM-CSF 유전자를 함유한 카세트를 E1a 결실 부위에 삽입한다. E1a 영역에 있는 서열이 결실되기 때문에, 비허용성 세포에서 자가 복제하는 이들 바이러스의 능력에 손상을 입게된다.

결과(Tang et al., 1997)는 C57BL/6 종 마우스의 96%(23/24)가 AdCMV-hcea의 피부-표적화된 비-침습성 전달 후 한달만에 인간 CEA 단백질에 대해 항체를 생산하고, 동일한 균주 마우스의 43%(6/14)가 AdCMV-hgmcsf의 피부-표적화된 비-침습성 전달 후에 인간 GM-CSF 단백질에 대해 항체를 생산함을 보여준다. NIVS 전에 수집 된 예비-면역 혈청과 미경험 동물에서 나온 혈청 모두 인간 CEA와 GM-CSF 단백질과 반응하지 않는다. 그루밍을 통한 벡터 주입에 의한 경구 백신접종 가능성은 (1) 동물이 마취에서 깨어나기 이전에 벡터를 피부에서 세정하고, (2) 면도되지 않은 피부상에 벡터를 피페팅하며, (3) 동일한 우리(cage)에서 미경험 및 백신접종된 동물을 혼합함으로써 제거된다. 미경험 마우스와 백신접종된 마우스 사이의 교차-백신접종이 관찰되지 않고, 면도는 면도 경로를 따라 생긴 각질 상피의 기계적 제거로 인해 NIVS의 경우 필수 요소인 것 같다. 따라서, 아데노바이러스-매개 NIVS는 벡터에 의해 암호화된 항원에 대한 인간 면역 반응을 제거할 수 있다.

실시예 4

본 발명의 기술이 방어 항종양 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증하기 위해, 인간 암배아 항원(CEA) 유전자(MC38-CEA-2)(Conry et al., 1995)를 발현시키는 합성 종양 세포를 미경험의 C57BL/6 종 마우스 및 인간 CEA 유전자(AdCMV-hcea)를 암호화하는 아데노바이러스 벡터의 국소 적용에 의해 백신접종된 동일한 균주 마우스에 접종한다. 종양 공격을 받은 동물의 생존을 확인한다(도 4). 대조 그룹에서, 동물의 90%(9/10)는 손으로 만질 수 있을 정도의 종양혹이 자라고 종양 세포 이식 후 30일 이내에 죽는다. 백신접종된 그룹에서, 단지 10%의 동물만이 죽고, 70%(7/10)는 전체적으로 종양이 없다. 종양이 직경 1 cm를 초과하면 마우스를 안락사시킨다. 종양 세포 주사와 안락사 사이의 간격을 개개 생존 시간으로 이용한다. 도 4에서, 대조 마우스(백신 투여 없음)와 NIVS로 면역된 동물(10⁸ pfu AdCMV- hcea를 한달 전에 국소 적용함)에 종양 공격을 가한다. 괄호안의 숫자는 각 처리에 해당되는 동물의 수를 나타낸다. 결과는 피부상으로 유전자 백신의 비-침습성 전달이 특정 항원을 발현시키는 종양 세포에 대해 방어 면역 반응을 유도할 수 있음을 보여준다.

실시예 5

사이토킨과 보조자극 유전자를 암호화하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 작제

백신접종된 동물에서 면역 프로필을 나타냄에 있어 경피 세포로 항원 유전자와 함께 면역-조절 유전자의 공-전달을 위해 보조자극 및 사이토킨 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 작제한다. 쥐 B7-1 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터 AdCMV-mB7.1과 쥐 GM-CSF 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터 AdCMV-mgmcsf를 인간 293 세포에서 두 형질감염된 플라스미드 간의 상동 재조합에 이은 새로운 아데노바이러스 벡터(Gomez-Foix et al., 1992)를 생성하는 표준 과정에 의해 작제한다. 이들 벡터에서 모든 트랜스진은 CMV 초기 인핸서-프로모터 요소에 의해 전사적으로 추진된다. AdCMV-mB7.1은 형질도입된 인간 폐 암종 SCC-5 세포가 안티-CD80 항체(PharMingen)로 염색된 다음, 유동 혈구계산 분석되는 특징이 있다. AdCMV-mgmcsf는 ELISA 키트(Amersham)를 이용하여 형질도입된 SCC-5에서 분비된 쥐 GM-CSF이 측정되는 특징을 나타낸다.

실시예 6

생체내에서 세포독성 분석에 의한 항종양 면역성의 검출

생체내 세포독성 분석은 표적 세포를 단층으로 마우스의 근육 조직상에 이식시켜 행해진다(Tang et al., 1996). 단층의 표적 세포 이식은 생체내에서 며칠간 생장 후 이들의 운명을 평가하기 위해 표적 세포의 효과적인 회복을 가능케한다. 이러한 분석은 특히 표적 세포를 근절하기에 충분치 않은 약한 면역 반응을 검출해내는데 유용하다. 면역 반응은 이식층의 조직학적 분석으로 특징규명된다. 면역 반응없이, 표적 세포는 자란다. 강력한 면역 반응의 경우, 표적 세포는 아마도 자라는 표적 세포 주변으로 이동하여 그자리에서 감지되어, 이식층에서 다수의 면역 효능제 세포의 존재하에 근절된다. 약한 면역 반응의 경우, 자라고 있는 표적 세포는 이식층에서 침습 면역 효능제 세포와 섞인다. 면역 간섭없이, 생체내 RMI-luc 세포의 증식으로 인해, 미경험 C57BL/6 세포중으로 5 X 10⁵ RMI-luc 세포[루시퍼라제 유전자를 발현하는 RMI 전립선 종양 세포]의 단층 이식이 종양 세포에서 일어난다. 대조 동물과 대조적으로, RMI-luc 세포를 AdCMV-luc의 피부-표적화된 비-침습성 전달에 의해 백신 접종된 동물중의 이식층에서 다수의 면역 효능제 세포와 섞인다.

실시예 7

종양 세포로 보충된 면역 효능제 세포의 특성화

생체내 세포독성 분석은 소량의 표적 세포를 근육에 단층으로 이식시켜 이식 층에서 다량의 면역 효능제 세포를 집중시킬 수 있다. 이식층에서 특정 면역 효능제 세포의 특성화는 세포-매개된 면역 반응이 표적 세포를 사멸시켜 유도된 것인지를 증명해줄 수 있다. AdCMV-luc의 피부-표적화된 비-침습성 전달에 의해 백신 접종된 동물에서 루시퍼라제-발현 종양으로 보충된 T 세포를 특성짓기 위해, 이식층의 조직 절편을 안티-CD3 모노클로날 항체(mAb)로 염색한다. pHBA-luc DNA를 RM1 전립성 종양 세포(Baylor College of Medicine에서 T. Thompson이 제공)로 지질감염시킨 다음, G418을 함유한 배지에서 선별하여 RMI-luc 세포를 생산한다. 루시퍼라제를 발현시키는 클론은 루시퍼라제 분석으로 특징규명된다. 5 x 10⁵ RMI-luc 세포를 10⁸ pfu AdCMV-luc의 피부-표적화된 비-침습성 전달에 의해 백신접종된 마우스로 단층 이식한다. 이식 후 5일째, 인식층을 O.C.T.에서 동결하고 단편을 4 ㎛로 절개하여, 100% 아세톤에서 건조시킨 다음, 색소원으로 디아미노벤지딘을 이용하는 ABC 면역퍼록시다제 과정에 의해, 안티-CD3 mAb(UAB의 P. Bucy에서 제공된 클론 F500A2)로 염색한다.

5에 도시한 것처럼, AdCMV-luc(*150)의 피부-표적 비-침습성 이동에 의해 백신접종된 마우스에서 많은 T 세포가 RM1-luc의 생체 내 성장 5 일 후에 이식층으로 침습하는 반면, 단순한 동물에서는 소량의 T 세포만이 발견되었다. 동일한 수의 RM1-luc 표적 세포가 단순한 동물보다 백신접종된 동물에서 더 많은 T 림프구를 이식층으로 동원할 수 있는 것 같다.

표적 세포에 의해 동원되는 CTLs를 규명하기 위해서, 이식층의 냉동 부위를 탐침으로서 안티센스 그랜자임 A RNA 분자를 사용해 제자리 교배시킨다. 5 * 10⁵ RM1-luc 세포를 단순한 C57BL/6 마우스로 또는 10⁸ pfu AdCMV-luc의 피부-표적 비-침습성 이동에 의해 백신접종된 마우스로 단일층으로 이식시킨다. 이식 후 5일은, 이식층을 O. C. T에서 냉동시키고, 4㎛ 부위로 절단한다. 냉동 부위를 3% 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 내생의 알칼린 포스프타제 활성을 억제하기 위해 0.2M 염산에서 배양시키고, 열-변성된 안티센스 그랜자임 A RNA 탐침과 교배한다. 제자리 교배를 위한 탐침은 박테리오파지 개시제를 포함하는 플라스미드로부터 전사에 의해 생성된 일본쇄 RNA 분자이다. 전사동안 디곡시게닌-UTP는 서열로 직접 동원된다. 센스서열 탐침은 네가티브 조절로서 사용된다. 탐침과 교배 후 부위를 세척하고 알칼린 포스프타제-공유 안티디곡시게닌 항체와 함께 배양하고 그 후에 NBT/BCIP 효소 기질 용액에서 배양한다.

그랜자임 A를 발현하는 CTLs는 CTLs를 활성화하고 전사동안 조직 거부 반응을 예언하는 표시로서 이용된다. 그랜자임-포지티브 CTLs는 AdCMV-luc(도6)의 피부-표적 비-침습성 이동에 의해 백신접종된 동물에서만 RM1-luc 이식층에서 발견된다. 베드에서의 그들의 존재는 특정 항원를 발현하는 암 세포에 대한 세포-조정 면역반응은 NIVS에 의해 유도될지도 모른다는 것을 제안한다.

실시예 8

점착 밴드에 의한 유전 백신의 국소 적용

처음으로, 밴드가 백신의 투여에 이용될 수 있다는 것이 설명되었다. 이 발 견은 개인이 의학적인 훈련없이 피부에 비-침습성 백신 일정량을 투여할 수 있게 한다. 밴드에 의해 피부를 형질 도입하기 위해 실시예 7에서 기재된 AdCMV-luc 벡터 50㎕를 점착 밴드(Johnson & Johnson)의 패드로 피펫팅한다. 벡터-함유 밴드는 마우스의 미리 절단된 피부에 점착된다. 벡터는 18시간동안 네이키드 피부에 점착된다. 밴드에 의해 운반된 유전 벡터로부터의 트랜스진 발현을 검출하기 위해, 피부는 루시퍼라제로 분석된다.(도 1) 결과가 실질적인 변수로 나타났고, 피부에서 트랜스진 발현은 점착 밴드를 사용해 이루어진다.

동물이 비-침습성 밴드로 백신접종 될 수 있음을 설명하기 위해, 말단 혈의 림프액은 AdCMV-hcea를 포함하는 밴드를 마우스의 피부에 점착시킨 후 2달동안 안티-CEA 항체로 분석된다. 도 7에 도시한 것처럼, 안티-CEA 항체는 점착 밴드를 통해 비-침습성 백신을 받은 마우스의 100% (10/10)에서 검출된다.

실시예 9

DNA/아데노바이러스-조정 NIVS

아데노바이러스-기본 벡터는 아데노바이러스의 외부에 플라스미드 DNA를 결합시킴으로써 더 다기능이 된다. 결과의 벡터 시스템은 다양한 표적 세포로의 유전자 이동을 고-효율로 중재한다. 이 접근은 외부 유전자의 크기와 모양에 있어서 유동성을 증가하게 한다. 그래서 DNA/아데노바이러스 복합체는 같은 아데노바이러스 수용체-조정 엔도시토시스 경로를 통해 항원 유전자를 피부로 더 유동적으로 이동할 수 있다.

DNA/아데노바이러스-조정 NIVS의 가능성을 설명하기 위해, 인간 성장 호르 몬(pCMV-GH)(Tang et al.)을 암호화하는 플라스미드 DNA를 E4-방어 아데노바이러스와 결합시킨다. 마우스(쇄 C57BL/6)는 하루동안 네이키드 피부와 함께 DNA/아데노바이러스 복합체를 포함함으로써 백신접종된다. 후에 면역된 동물이 인간 성장 호르몬 단백질(hGH)에 대한 항체를 생산하는지를 말단-혈의 림프액을 분석함으로써 모니터한다. 도 8, 레인 1, hGH(0.5㎍); 레인 2, BSA(0.5㎍)에 도시한 것처럼, 시험 림프액은 웨스턴 블롯에서 관계없는 단백질이 아닌 정제된 hGH와 반응한다. DNA/아데노바이러스 복합체에 의해 백신접종된 10마리 마우스중에서, 8마리(80%)는 3 달안에 hGH에 대한 항체를 만들어내고, 이는 특정 항체가 아데노바이러스와 결합하고 비-침습성 양태로 침습하는 플라스미드 DNA에 의해 암호화되는 외생의 단백질에 의해 만들어 질 수 있음을 설명한다. 처리전에 수집된 예비-면역 림프액, 처리되지 않은 동물의 림프액, 및 관계없는 벡터로 백신접종된 동물의 림프액 모두는 hGH와 반응하지 않는다. 그래서, 아데노바이러스 재조합처럼, DNA/아데노바이러스 복합체는 NIVS를 위한 진정한 벡터 시스템으로 여겨진다.

실시예 10

DNA/리포솜-조정 NIVS

비-침습성 담체로서 아데노바이러스를 포함하는 유전 벡터의 개발과 더불어 마우스가 바이러스 요소 없이 DNA/리포솜 복합체의 국소 적용에 의해 백신접종될 수 있음이 설명된다. 많은 다양한 벡터가 피부-표적 비-침습성 백신의 침습를 위한 창조적인 방법으로 이용될 수 있음이 분명하다. 도 8b, 레인 1, hGH(0.5㎍); 레인 2, BSA(0.5㎍)에 도시한 것처럼, hGH를 암호화하는 DNA/리포솜 복합체의 국소 적용 에 의해 면역된 마우스의 실험 림프구는 BSA가 아니라 hGH와 반응한다. DNA/리포솜 복합체에 의해 백신접종된 10마리 마우스중에서, 실험 림프액은 5개월안에 9마리(90%)의 처리된 동물에서 정제된 hGH와 반응한다. 그래서, 아데노바이러스 및 DNA/아데노바이러스 복합체처럼, DNA/리포솜 복합체가 NIVS를 위한 진정한 벡터 시스템으로 여겨진다.

실시예 11

DNA-암호화 및 아데노바이러스 -암호화 트랜스진의 보조-발현

면역 시스템의 반응을 증대시키는 방법은 잠재적으로 백신의 임상 효과를 증진시킬 수 있다. 림프구 개체 증가와 활성화에 관여하는 면역-조절 분자의 국소적인 생산은 백신접종 효과를 상당히 증진시킨다. 마우스와 B7-1 및 GM-CSF 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터가 만들어진다. DNA/아데노바이러스 복합체의 국소 적용은 각각의 피부 세포에서 아데노바이러스-암호화 항원 또는 면역 조절 분자와 함께 DNA-암호화 항원 또는 면역 조절 분자를 보조-발현시켜 항원에 대한 면역반응을 증진시킬 수 있다.

도 9는 표적 세포에서 플라스미드 DNA로부터 트랜스진의 발현이 아데노바이러스의 존재와 관계있고, 그래서 플라스미드-암호화 및 아데노바이러스-암호화 트랜스진이 같은 세포에서 보조-발현할 수 있게 한다는 것을 도시한다. pVR-1216 플라스미드 DNA(Vical로부터 제공된), AdCMV-β gal 입자 및 폴리라이신이 도면에서 제시된대로 특정 비율로 혼합된다. 복합체는 웰에서 2*105 SCC-5 세포에 이용되고, 2시간동안 배양한다. 그리고 나서 복합체는 제거하고 세포는 다음 날 루시퍼라제와 β-갈락토시다스 분석을 위해 회수한다. 오픈 컬럼: 루시퍼라제 활성; 고체 컬럼: β-갈락토시다제 활성. 결과는 DNA-암호화 트랜스진이 아데노바이러스의 부재하에서는 표적 세포에서 발현되지 않고, 아데노바이러스-암호화 트랜스진은 DNA의 존재하에서 발현된다는 것을 설명한다. 또한 DNA가 표적으로 하는 상이한 세포 유형울 위한 다른 바이러스의 표면에 합체될 수도 있다. 따라서, 이 프로토콜은 바이러스 재조합 및 외부-결합 플라스미드로부터 트랜스진을 동시에 발현시킬 수 있는 간단하지만 다양한 유전자 운반 시스템을 제공한다.

실시예 12

상이한 유전자 벡터로부터 피부에서의 국소적인 적용에 의한 상대적인 트랜스진 발현

*아데노바이러스 재조합, DNA/아데노바이러스 복합체, DNA/리포솜 복합체, 및 아마도 많은 유전 벡터가 비-침습성 백신을 위한 담체로 이용될 수 있음이 설명됐다. 트랜스진 발현의 더 높은 효율, 더 강력한 담체가 가능할 수 있다. 이용되는 벡터, 아데노바이러스 재조합, DNA/아데노바이러스 복합체, 또는 DNA/리포솜 복합체의 상대적인 효율을 정의하기 위해, 18시간동안 국소 적용을 통해 쥐 피부와 접촉시킨다. 처리된 피부는 동물로부터 제거되고, 프로메가의 루시퍼라제 분석 시스템을 이용해 2분동안 완전한 빛 방출의 측정에 의해 루미네이터로 루시퍼라제 활성을 위해 분석되고 백그라운드를 판독치로부터 감한다. 도 10에 도시한 것처럼, 아데노바이러스 재조합은 피부-표적 비-침습성 유전자 이동을 위한 가장 효율적인 벡터 시스템임이 설명된다. 모엑-처리된 쥐는 피부에서 검출가능한 루시퍼라제 활성 을 생산하지 않는다. LU, 빛 단위; Ad, AdCMV-luc; DNA/Ad, Ad dl1014 와 결합한 pVR-1216 DNA; DNA/리포솜, DOTAP/DOPE와 결합한 pVR-1216 DNA. 결과는 평균 log(피부 ㎠ 당 LU)±SE(n은 각 컬럼의 정상에서 나타난다.)로 나타난다. DNA/아데노바이러스 복합체의 효율이 아데노바이러스 재조합보다는 낮음에도 불구하고, DNA/리포솜 복합체의 효율보다는 상당히 높다. 게다가, 아데노바이러스는 생존 가능한 바이러스 입자의 산포를 방지하기 위해 DNA와 결합하기 전에 UV 방사에 의해 블활성된다. 그래서, DNA/아데노바이러스 복합체는 효율성과 안전 인자가 새로운 세대의 백신을 제형하는 것으로 고려될 경우, 비-침습성 백신의 운반을 위한 가장 훌륭한 담체 시스템으로 여겨진다.

본 명세서에 언급된 어느 특허와 공개도 본 발명이 속하는 분야의 업자 수준의 척도이다. 본 특허와 공개는 각 공개가 명확하고 개별적으로 참조문헌에 인용되는 것과 같은 정도로 참조문헌에 인용된다.

당 분야의 업자는 본 발명이 여기에서 본래의 목적뿐만 아니라 언급된 장점과 목표를 성취하고 목적을 실행하는데 잘 적용되었다고 평가할 것이다. 여기에 기재된 방법, 과정, 처리, 분자 및 특정 화합물에 따른 실시예는 바람직하고 모범적인 양태의 예시이고 본 발명의 범위에 제한을 두고자 하지 않는다. 여기에서의 변화와 다른 용도는 청구항의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 취지내에 포함되는 당 분야의 업자에게 일어날 수 있다.

참조 문헌

하기의 참조 문헌은 여기에 인용되었다.

배양 시간(시간)	피부 ㎠당 LU
1	0
1	2,100
2	0
2	0
2	6,200
2	7,300
2	13,000
2	48,000
2	1,800
2	13,000
18	830
18	2,400
18	260
18	630
18	1,300,000
18	24,000
18	2,700
18	280

본 발명의 전술한 특징, 장점 및 목적, 및 자명해지는 기타의 것들은 달성되고 상세하게 이해될 수 있는 사안이므로, 상기에 간단히 요약된 본 발명의 좀더 구체적인 설명은 첨부 도면에서 도시되는 특정 양태를 참조할 수도 있다. 이러한 도면은 명세서의 일부를 구성한다. 그러나, 첨부 도면이 본 발명의 바람직한 양태를 설명하며 따라서 발명의 범위를 제한하지 않음을 주지하여야 한다.

도 1은 벡터의 국소 적용에 의한 피부내 아데노바이러스 재조합체로부터의 트래스진 발현을 보여준다.

도 2a 및 2b는 국소 적용된 아데노바이러스 재조합체에 의해 형질도입될 수 있는 잠재적 표적 세포의 성상확인을 보여준다.

도 3a 및 3b는 아데노바이러스-매개 NIVS에 의해 면역화된 마우스의 혈청내 특정 항체의 검출을 보여준다.

도 4는 치사량의 종양 세포에 노출된 대조군 : 면역화 마우스의 % 생존율을 도시한다.

도 5는 종양-침윤성 T 림프구의 성상확인을 보여준다.

도 6은 종양-침윤성 CTL의 성상확인을 보여준다.

도 7은 백신 밴디지의 국소 적용에 의해 면역화된 마우스내 인간 CEA 단백질에 대한 항체의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.

도 8a는 DNA/아데노바이러스-매개 NIVS에 의해 면역화된 마우스 혈청내 특정 항체의 검출을 보여준다.

도 8b는 DNA/리포솜-매개 NIVS에 의해 면역화된 마우스 혈청의 특정 항체 검출을 보여준다.

도 9는 표적 세포내 DNA-암호화 및 아데노바이러스-암호화 트랜스진의 공-발현을 보여준다.

도 10은 국소 적용된 아데노바이러스 재조합체, DNA/아데노바이러스 복합체, 및 DNA/리포솜 복합체로부터의 상대적인 트랜스진 발현을 보여준다.

도 11은 피부-표적화 비-침습성 백신의 투여 장치를 보여준다.

Claims

해당 유전자를 암호화하고 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA 및 리포솜 복합 벡터를, 상기 단백질에 대해 전신 면역반응(systemic immune response)을 유도하기에 유효한 양으로, 포유동물의 피부에 국소적으로 및 비침습적으로 투여하는 단계를 포함하고,

상기 단백질에 대한 전신 면역 반응이 포유동물에서 유도되는,

비침습적 전신 면역반응 유도방법.
제 1 항에 있어서, 상기 포유동물은 국소 투여되는 위치에서 면도처리되는 방법.
해당 유전자를 암호화하고 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 DNA 벡터를, 상기 단백질에 대해 전신 면역반응(systemic immune response)을 유도하기에 유효한 양으로, 포유동물의 피부에 국소적으로 및 비침습적으로 투여하는 단계를 포함하고,

상기 단백질에 대한 전신 면역 반응이 포유동물에서 유도되며,

상기 단백질은 항원 또는 그의 면역원성 단편을 포함하는,

비침습적 전신 면역반응 유도방법.
해당 유전자를 암호화하고 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터를, 상기 단백질에 대해 전신 면역반응(systemic immune response)을 유도하기에 유효한 양으로, 포유동물의 피부에 국소적으로 및 비침습적으로 투여하는 단계를 포함하고,

상기 단백질에 대한 전신 면역 반응이 포유동물에서 유도되는,

비침습적 전신 면역반응 유도방법.
제 4 항에 있어서, 상기 단백질은 항원 또는 그의 면역원성 단편을 포함하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 항원 또는 이의 면역원성 단편이 발현되어 병원체 또는 신생물에 대해 전신 면역 반응을 생성하는 방법.
제 5 항에 있어서, 항원이 인간 암배아성 항원, HIV gp120 항원, 테타너스 독소 C-단편 및 인플루엔자 NP 항원, 및 인플루엔자 HA 항원으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제 5 항에 있어서, 항원이 종양-관련 항원을 포함하는 방법.
제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터의 양이 약 100 플라크 형성 단위(plaque forming unit) 이상인 방법.
제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 면역 조절 유전자를 추가로 포함하고 이를 발현하는 방법.
제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 보조자극분자(co-stimulatory molecule) 및 사이토킨을 암호화하는 유전자를 추가로 포함하고 이를 발현하는 방법.
제 10 항에 있어서, 면역 조절 유전자가 GM-CSF 유전자, B7-1 유전자, B7-2 유전자, 인터루킨-2 유전자, 인터루킨-12 유전자 및 인터페론 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 E1 영역 결손인 방법.
제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 E4 영역 결손인 방법.
제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 E3 영역 결손인 방법.
제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 모든 바이러스 유전자 결실인 방법.
제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 E1 및 E3 영역 결손인 방법.
제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 E1, E3 및 E4 영역 결손인 방법.
제 4 항에 있어서, 전신 면역 반응이 전신성 방어 면역 반응인 방법.
제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터를 전달장치 상에 두고, 전달장치를 포유동물의 피부에 국소 적용함으로써 아데노바이러스 벡터를 국소적으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 전달장치가 패드를 포함하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 전달장치가 접착성 밴디지-유사 장치를 포함하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 전달장치가

제 1 사이드와 제 2 사이드를 가지며, 상기 제 1 사이드는 포유 동물의 피부 표면과 접촉되도록 적용되는 물질의 제 1 시이트, 및

상기 제 1 시이트의 제 1 사이드와 반대 배치된 제 1 사이드를 갖는 물질의 제 2 시이트로 이루어진 피부 접촉 수단을 포함하고

상기에서, 제 1 시이트 및 제 2 시이트가 이들의 외부 근방에서 서로 결합되어 그 내부에 아데노바이러스 벡터를 함유하는 중앙 밀폐 공간을 사이에 형성하며,

제 1 시이트를 포함하는 물질이 제 2 시이트를 포함하는 물질보다 구조적으로 취약하여, 벡터가 상기 공간에 배치되고 힘이 제 2 시이트의 제 1 사이드에 가해질 때, 제 2 시이트가 아데노바이러스 벡터를 포유 동물의 피부와 접촉하도록 허용하기 전에 제 1 시이트가 파괴되는 장치인 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 전달장치에서 제 1 시이트의 제 1 사이드가 포유 동물 피부 표면에 상기 전달장치를 붙이기 위해 주위 부근에 배치된 접착제를 포함하며, 공간 위에 겹쳐놓인 제 1 시이트 부분이 접착제를 실질적으로 함유하지 않는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 전달장치에서 시이트가 아데노바이러스 벡터 불투과성 물질로 이루어지는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 전달장치에서 시이트가 중합체 물질로 이루어지는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 포유동물은 국소 투여되는 위치에서 면도처리되는 방법.
해당 유전자를 암호화하고 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질을 생체내에서(in vivo) 발현하는 DNA 바이러스 벡터 복합체를, 상기 단백질에 대해 전신 면역 반응을 유도하기에 유효한 양으로, 포유동물의 피부에 국소적으로 및 비침습적으로 투여하는 단계를 포함하고,

단백질에 대한 전신 면역 반응이 포유동물에서 유도되는,

비침습적 전신 면역반응 유도방법.
제 28 항에 있어서, 상기 바이러스가 아데노바이러스인 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터 복합체가 하기의 단계를 포함하여 제작되는 방법:

적당한 바이러스 벡터를 제공하는 단계;

바이러스 벡터와 복합체를 이루게 될 해당 유전자를 암호화하는 DNA 샘플을 제공하는 단계; 및

바이러스 벡터와 DNA 샘플을 다가양이온의 존재하에 함께 혼합하는 단계.
제 30 항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스인 방법.
제 30 항에 있어서, 해당 유전자가 항원 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 방법.
제 30 항에 있어서, 다가양이온이 폴리-L-라이신을 포함하고, 폴리-L-라이신(PLL) : DNA 샘플의 비가 대략 0.9 ㎍ PLL : 1.0 ㎍ DNA 내지 9.0 ㎍ PLL : 1 ㎍ DNA 범위인 방법.
제 31 항에 있어서, 다가양이온이 폴리-L-라이신을 포함하고, 폴리-L-라이신(PLL) : 아데노바이러스 벡터의 비가 6.0 ㎍ PLL : 10⁸ 플라크 형성 단위 아데노바이러스 내지 6.0 ㎍ PLL : 10¹⁰ 플라크 형성 단위 아데노바이러스인 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 포유동물은 국소 투여되는 위치에서 면도처리되는 방법.
해당 유전자를 암호화하고 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 DNA 바이러스 벡터를, 단백질에 대해 전신 면역 반응을 유도하기에 유효한 양으로, 포유동물의 피부에 국소적으로 및 비침습적으로 투여하는 단계를 포함하고,

단백질에 대한 전신 면역 반응이 포유동물에서 유도되는,

비침습적 전신 면역반응 유도 방법.
제 36 항에 있어서, 단백질이 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 방법.
제 37 항에 있어서, 항원 또는 이의 면역원성 단편이 병원체 또는 신생물에 대해 전신 면역 반응을 생성하는 방법.
제 37 항에 있어서, 항원이 종양-관련 항원인 방법.
제 37 항에 있어서, 항원이 인간 암배아성 항원, HIV gp120 항원, 테타너스 독소 C-단편 및 인플루엔자 NP 항원, 및 인플루엔자 HA 항원으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제 36 항에 있어서, 벡터가 면역 조절 유전자를 추가로 포함하고 이를 발현하는 방법.
제 36 항에 있어서, 벡터가 보조자극분자(co-stimulatory molecule) 및 사이 토킨을 암호화하는 유전자를 추가로 포함하고 이를 발현하는 방법.
제 41 항에 있어서, 면역조절 유전자가 GM-CSF 유전자, B7-1 유전자, B7-2 유전자, 인터루킨-2 유전자, 인터루킨-12 유전자 및 인터페론 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제 36 항에 있어서, 상기 포유동물은 국소 투여되는 위치에서 면도처리되는 방법.
제 36 항에 있어서, 벡터를 전달장치 상에 두고, 전달장치를 포유동물의 피부에 국소 적용함으로써 벡터를 국소적으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 전달장치가 패드를 포함하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 전달장치가 접착성 밴디지-유사 장치를 포함하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 전달장치가

제 1 사이드와 제 2 사이드를 가지며, 상기 제 1 사이드는 포유 동물의 피 부 표면과 접촉되도록 적용되는 물질의 제 1 시이트, 및

상기 제 1 시이트의 제 1 사이드와 반대 배치된 제 1 사이드를 갖는 물질의 제 2 시이트로 이루어진 피부 접촉 수단을 포함하고

상기에서, 제 1 시이트 및 제 2 시이트가 이들의 외부 근방에서 서로 결합되어 그 내부에 아데노바이러스 벡터를 함유하는 중앙 밀폐 공간을 사이에 형성하며,

제 1 시이트를 포함하는 물질이 제 2 시이트를 포함하는 물질보다 구조적으로 취약하여, 벡터가 상기 공간에 배치되고 힘이 제 2 시이트의 제 1 사이드에 가해질 때, 제 2 시이트가 아데노바이러스 벡터를 포유 동물의 피부와 접촉하도록 허용하기 전에 제 1 시이트가 파괴되는 장치인 방법.
제 48 항에 있어서, 상기 전달장치에서 제 1 시이트의 제 1 사이드가 포유 동물 피부 표면에 상기 전달장치를 붙이기 위해 주위 부근에 배치된 접착제를 포함하며, 공간 위에 겹쳐놓인 제 1 시이트 부분이 접착제를 실질적으로 함유하지 않는 방법.
제 48 항에 있어서, 상기 전달장치에서 시이트가 벡터 불투과성 물질로 이루어지는 방법.
제 48 항에 있어서, 상기 전달장치에서 시이트가 중합체 물질로 이루어지는 방법.
해당 유전자를 암호화하고 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 DNA 바이러스 벡터를 단백질에 대해 전신성 방어 면역 반응을 유도하기에 유효한 양으로 인간을 제외한 포유동물의 피부에 국소적으로 및 비침습적으로 투여하는 단계를 포함하고,

단백질에 대한 전신 면역 반응이 인간을 제외한 포유동물에서 유도되며, 상기 단백질이 항원 및 이의 면역 단편을 포함하는,

비침습적 전신성 방어 면역 반응 유도 방법.