KR20020038578A - 비-침입성 유전자 면역, 이로부터의 발현 산물, 및 이의용도 - Google Patents

Abstract

동물에서의 비-침입성 유전자 면역방법 및/또는 동물에서의 전신성 면역 또는 치료반응의 유도방법, 이로부터의 산물 및 이로부터의 방법과 산물에 대한 용도가 기술되고 청구됨. 방법은 동물의 피부를 동물에서 전신 면역 또는 치료반응 유도 유효량의 벡토린과 접촉시키는 과정을 포함할 수 있다.

Description

비-침입성 유전자 면역, 이로부터의 발현 산물, 및 이의 용도{NONINVASIVE GENETIC IMMUNIZATION, EXPRESSION PRODUCTS THEREFROM, AND USES THEREOF}

척추동물의 면역 시스템의 활성화는 병원체와 악성 종양으로부터 동물을 보호하는데 있어 중요한 메커니즘이다. 면역 시스템은 체액성 및 세포성 분지를 포함한 다수의 상호작용 성분들로 구성된다. 체액성 면역은 항원에 직접 결합하는 항체를 수반한다. 체액성 면역의 효과기로서 항체 분자는 B 림프구에서 분비된다. 세포성 면역은 비-자기 항원을 생산하는 기타 세포를 인식하여 죽이는 분화된 세포독성 T 림프구(CTL)를 수반한다. CTL은 MHC(주된 조직적합성 복합체) 부류 I 분자에 결합된 표적 세포의 표면에 나타나는 분해된 펩타이드 단편과 반응한다. 세포내에 생성된 단백질은 세포 메커니즘의 일부로서 펩타이드로 연속적으로 분해되는 것으로 이해된다. 이들 단편은 MHC 분자에 결합하여 세포 표면으로 운반된다. 따라서 세포성 면역 시스템은 신체내 모든 세포에서 생성된 폭넓은 단백질을 일정하게 모니터링하여 비-자기 항원 생성 세포를 제거한다.

백신접종은 항원과 반응하는 동물을 프라이밍 하는 과정이다. 항원은 단백질(전통적)로서 또는 항원을 발현시키는 유전자(유전자 면역)로서 투여될 수 있다. 과정은 T 및 B 림프구, 다른 종류의 림프 세포, 및 항원을 처리하여 면역 시스템을 활성화시킬 수 있는 형태로 이를 디스플레이할 수 있는 분화된 항원 제시 세포(APC)를 수반한다. 유전자 백신의 투여를 위한 일반적인 방식은 니들 주사, 난절법, 및 유전자 건-매개 침투를 포함한 침입 과정에 초점이 맞춰져 왔다. 침입 방식에서 백신 접종은 특별한 의료 훈련이 갖춰진 장비와 직원을 요구하고, 보통은 불편과 엄청난 위험(출혈, 감염)을 동반한다.

백신의 효능은 종양 또는 병원체에 의한 후기 공격에 대항한 보호 정도로서 측정된다. 효과적인 백신은 최소 횟수의 접종 후 질환에 대항한 표적화된 개입을 위해 높은 역가 및 장기-지속 보호 면역을 유도할 수 있는 면역원이다. 예를 들어, 유전자 면역은 동물 자신 세포에서 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시켜 특정 단백질에 대항한 면역반응을 유발하도록 하는 접근법이다. 생체내 장기간의 항원 제시로 인한 실질적인 항원 증폭 및 면역 자극은 항원에 대항해 견실한 면역을 유도할 수 있다. 유전자 면역은 특정 단백질에 대항해서 면역반응을 일으키는 백신 접종 프로토콜을 단순화시키는데 그 이유는 단백질 정제와, 백신 개발에 일반적으로 필요한 보조제와의 배합과 같은 종종 어려운 단계가 필요없기 때문이다. 유전자 면역이 단백질의 분리를 요구하지 않기 때문에, 생화학적 정제시에 정합 에피토프를 상실할 수 있는 단백질의 경우에 특히 가치가 있다. 유전자 백신은 또한 간섭을 유발하거나 효능에 영향을 미침이 없이 전달될 수 있어(Tang et al., 1992; Barryet al., 1995), 복수 항원에 대항한 백신접종 방식을 단순화시킬 수 있다.

국소적으로-적용된 단백질계 백신을 연구해 왔지만, 이의 효용은 제한될 수 있다. 콜레라 독소와 관련하여 단백질계 백신의 국소 적용이 비-침입 방식으로 동물을 면역시킬 수 있지만(Glenn et al., 1998), 본 발명에서처럼 피부-표적화된 비-침입성 유전자 백신은 단백질계 백신과 다른 메커니즘에 의해 면역 시스템을 활성화시킨다. 추가로, 유전자 백신의 효능은 일반적으로 천연 감염과 유사한 항원의 새로운 합성으로 인해 단백질 백신의 효능보다 우수하다(McDonnell and Askari, 1996). 미국 특허 3,837,340이 피부를 건조된 바이러스와 접촉시켜 동물에 백신접종하는 방법에 관한 것이지만, 여기서 이용된 바이러스는 트랜스진 또는 이종 또는 외생성 핵산 분자를 발현시킬 수 있는 유전자 벡터가 아니다. 부가적으로, 면역원은 동물 자신 세포에서 바이러스 유전자의 발현으로부터 생성된 단백질 대신 바이러스 코트내 단백질일 수 있는데, 예를 들면 미국 특허 3,837,340에서 유도된 면역학적 반응은 본 발명에 비-유사한 단백질계 백신의 국소 적용에 의해 유도된 면역학적 반응과 유사할 수 있으며 이로 인해 미국 특허 3,837,340은 본 발명과는 비-유사하다.

기존의 백신접종은 보통 시린지 니들 또는 유전자 건과 같은 장치와, 백신 투여를 위한 특별한 기술을 요구한다. 업계에서는 의료 훈련이 되지 않은 직원과 장치에 의한 백신 접종을 상당히 필요로 하고 이를 원한다. 다수의 질환은 피부상에 비-침입성 백신접종(NIVS)의 개발을 통해 잠재적으로 면역될 수 있었는데 그 이유는 과정이 단순하고, 효과적이면서, 경제적이고, 고통이 없으며 잠재적으로 안전하기 때문이다. 그 결과, NIVS는 환자의 편리함을 이유로 선진국뿐만 아니라 의료 자원이 부족한 개발 도상국에서 백신 적용 범위를 높일 수 있다. AIDS와 유행성 감기를 포함한 바이러스에 의해 야기된 감염성 질환, 파상풍과 TB를 포함한 박테리아에 의해 감염된 질환, 및 말라리아를 포함한 기생충에 의해 감염된 질환, 및 광범위한 암 종류를 포함한 악성 종양이 특수 장비 및 의료진 없이도 피부-표적화된 비-침입성 백신으로 예방되거나 치료될 수 있다. 본 발명은 업계에서의 오랜 요구와 바램에 역점을 두고 있다.

발명의 목적 및 요약

피부상으로 비-침입성 백신접종(NIVS)은 피부가 면역적격 조직이고 이러한 비-침입성 과정이 특별히 훈련된 직원을 필요로하지 않기 때문에 백신접종 방식을 개선시킬 수 있다. 피부-표적화된 비-침입성 유전자 전달은 피부내 집중된 트랜스진 발현 및 면역반응의 유발을 달성할 수 있고(Tang et al., 1997) 이들 반응 메커니즘은 콜레라 독소와 관련한 단백질계 백신의 국소 적용 메커니즘과는 다르다(Glenn et al., 1998). 이들 결과는 벡터계 NIVS가 백신 전달에 있어 새롭고 효과적인 방법임을 나타낸다. 본 발명의 단순하고, 효과적이며, 경제적이고 고통이 없는 면역 프로토콜은 백신접종을 의료 장비에 덜 의존적이도록 해주어 백신접종의 연중 이용율을 상승시킨다.

따라서, 본 발명의 목적은 면역반응을 유도하거나 자극하는 유전자 산물을 암호화하는 핵산 분자를 포함하고 발현시키는 벡터를 국소 투여하는 단계를 포함하는, 숙주 또는 동물에서, 예를 들어 포유동물과 같은 척추동물에서 면역반응, 예를들어 보호 면역반응, 및/또는 치료반응을 유도하는 방법; 예를 들면, 핵산 분자가 숙주 측면에서 이종성 및/또는 외생성인 방법; E1 및/또는 E3 및/또는 E4 영역(들)이 결손된, 유리하게는 E1 및 E3 및 E4 영역이 결손된 아데노바이러스, 예를 들면 인플루엔자의 해당 에피토프(예를 들어, 1 이상의 해당 인플루엔자 에피토프 및/또는 1 이상의 인플루엔자 항원)를 암호화하는 외생성 또는 이종 핵산 분자와 같은 외생성 또는 이종 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스의 점막, 예를 들어 비내, 설하, 볼, 경구, 구강 투여; 예를 들면, 보호 면역반응과 같은 면역반응이 유도되는 투여; 이러한 방법을 수행하는 산물; 이러한 방법의 수행에서 나온 산물; 이러한 방법과 산물의 용도 중 하나일 수 있다.

본 발명은 동물에서 면역반응을 유도하기에 효과적인 양의 유전자 벡터를 동물의 피부와 접촉시키는 단계를 포함하는, 동물에서 비-침입성 유전자 면역법을 제공한다. 본 발명은 또한 유전자 벡터를 포함하는 제조물의 피부-표적화된 비-침입성 전달 단계를 포함하는 동물의 면역 방법을 제공하고, 벡터는 내피 세포에 의해 취해지고 척추동물에 면역 효과를 가진다. 본 발명은 또한 전달 장치내에 유전자 벡터를 포함하고 장치내에 한정된 일정한 투여량의 유전 물질을 척추동물의 노출된 피부와 접촉시키는 단계를 포함하는, 전달 장치에 의한 동물의 면역방법을 제공하며, 벡터는 면역적격 피부 조직에서 특정 항원을 발현시키는 내피 세포에 의해 취해진다. 유전자 벡터는 아데노바이러스 재조합체, DNA/아데노바이러스 복합체, DNA/리포솜 복합체, 또는 척추동물의 피부에서 항원을 발현시킬 수 있는 기타 유전자 벡터일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 면역학적으로 효과적인 농도의 해당 유전자를 암호화하는 유전자 벡터를 피부에 국소 적용하여 이러한 치료를 필요로 하는 개체 또는 동물의 피부와 접촉시키는 단계를 포함하는, 면역반응 유도법이 제공된다.

본 발명의 또다른 양태에서, 투여 후 개체 또는 동물에서 보호 면역 효과를 유도하는 항원을 암호화하는 유전자를 암호화하는 면역학적으로 효과적인 농도의 벡터를 피부에 국소 적용하여 동물의 피부와 접촉시키는 단계를 포함하는, 이러한 치료를 필요로 하는 개체 또는 동물에서 보호 면역반응을 유도하는 방법이 제공된다.

또다른 양태에서, 본 발명은 노출된 피부를 DNA/아데노바이러스 복합체와 접촉시켜 동일 세포에서 트랜스진을 함께 발현시키는 방법을 제공한다. 이러한 프로토콜은 동일한 세포 환경에서 항원을 이용하여 사이토킨, 공자극 분자, 또는 기타 면역조절제를 함께 생산함으로써 면역 시스템을 조작할 수 있다.

본 발명은 동물에서 비-침입성 유전자 면역법 및/또는 전신 면역과 같은 면역 또는 동물에서 치료반응을 유도하는 방법, 이의 산물, 및 방법과 산물의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 반응, 예를 들어 동물에서 전신 면역반응과 같은 면역반응 또는 치료반응을 유도하는데 효과적인 양의 벡터를 동물의 피부와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 벡터가 에피토프 또는 해당 유전자 산물을 암호화하는 외생성 핵산 분자를 포함하고 발현시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 전신 면역반응이 에피토프 또는 유전자 산물이거나 이들로부터 유도될 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 핵산 분자가 해당 에피토프 및/또는 해당 항원 및/또는 면역학적 반응을 자극 및/또는 조절하고/조절하거나 전사 및/또는 해독과 같은 발현, 예를 들어 내생성 및/또는 외생성 핵산 분자의 전사 및/또는 해독을 자극 및/또는 조절하고/조절하거나; 치료반응을 유발하는 핵산 분자를 암호화할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명은 부가적으로 핵산 분자가 벡터에 외생성일 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 외생성 핵산 분자가 1 이상의 해당 항원 또는 이의 일부, 예를 들어 병원체의 해당 에피토프; 예를 들어, 이의 1 이상의 해당 에피토프 또는 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2, 파상풍 독소 C-단편, 탄저균 보호 항원, 탄저균 치사 인자, 광견병 당단백질, HBV 표면 항원, HIV gp 120, HIV gp 160, 인간 카시노엠브리오닉 항원, 말라리라 CSP, 말라리아 SSP, 말라리아 MSP, 말라리아 pfg, 및 마이코박테리움 튜버쿨로시스 HSP를 포함한 항원; 및/또는 치료 및/또는 면역조절 유전자, 예를 들어 공-자극 유전자 및/또는 사이토킨 유전자를 암호화하는 방법을 제공한다. 미국 특허 5,990,091, WO 99/60164 및 WO 98/00166과 여기서 인용된 문헌들을 참조하라.

또한, 본 발명은 면역반응이 동물 세포, 예를 들어 내피 세포에서 핵산 분자를 발현하는 벡터에 의해 유도될 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역반응이 병원체 또는 신생물에 대항할 수 있는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 방법들에 사용된 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 예방 백신 또는 치료 백신 또는 국소 적용 및/또는 점막 및/또는 코 및/또는 설하및/또는 볼 및/또는 경구 및/또는 구강 투여에 의해 반응을 유도하거나 자극하는데 유용한 벡터를 포함하는 면역학적 또는 치료 조성물을 제공한다.

본 발명은 부가적으로 동물이 척추동물, 예를 들어 어류, 양서류, 파충류, 조류 또는 포유동물, 예를 들어 인간 또는 반려 또는 길들여지거나 식품- 또는 사료-생산하거나 가축 또는 경기 또는 경주 또는 스포츠 동물, 예를 들어 소, 개, 고양이, 염소, 양, 말 또는 돼지; 또는 칠면조, 오리, 닭과 같은 가금류와 같은 포유동물일 수 있는 방법과 조성물을 제공한다.

본 발명은 추가로 벡터가 결실된 바이러스 유전자 일부 또는 전부를 지닌 바이러스 코트를 포함한 1 이상의 바이러스, 박테리아, 원생동물, 트랜스포손, 레트로트랜스포손, 및 DNA 벡터, 예를 들어 재조합 벡터; 아데노바이러스, 예를 들어 E1 및/또는 E3 및/또는 E4 영역(들)이 결손된 아데노바이러스일 수 있는 방법 및 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 E1 및/또는 E3 및/또는 E4 영역(들)이 결손된 아데노바이러스, 유리하게는 E1 및 E3 및 E4 영역이 결손된 아데노바이러스, 예를 들면 인플루엔자의 해당 에피토프(예를 들어, 1 이상의 해당 인플루엔자 에피토프 및/또는 1 이상의 인플루엔자 항원)을 암호화하는 외생성 또는 이종 핵산 분자와 같은 외생성 또는 이종 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스의 비내 및/또는 점막 및/또는 설하 및/또는 볼 및/또는 경구 및/또는 구강 투여를 제공한다. 이러한 투여는 보호 면역반응과 같은 면역반응을 유도하는 방법일 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스일 수 있다. 아데노바이러스는 또다른 종류의 아데노바이러스, 예를 들면 개과 아데노바이러스일 수 있다. 따라서, 숙주 또는 동물이 인간 이외인 경우, 아데노바이러스는 숙주와 매치될 수 있으며; 예를 들어 숙주 또는 동물이 개와 같은 개과 동물인 척추동물 적용에서, 아데노바이러스는 개과 아데노바이러스일 수 있다.

본 발명은 따라서 추가로 벡터가 동물에서 이종 또는 외생성 및 상동성 해당 유전자 산물 모두를 발현시킬 수 있기 때문에 벡터가 숙주와 매치되거나 숙주 또는 동물 측면에서 이용되는 벡터이거나(예를 들어, 척추동물 적용에서, 이는 동물에 적합한 벡터를 이용하는데 유용할 수 있고, 예를 들어 개과에서 이는 개과 아데노바이러스 일 수 있음); 좀더 일반적으로는 벡터가 방법 수행시 감쇄되거나 불활성화된 숙주 또는 동물의 천연 병원체일 수 있는 방법에 관한 것이다. 업계의 숙련인은 업계의 지식과 정보를 이용하여 과도한 실험 없이도 벡터를 숙주 또는 동물과 매치시킬 수 있다.

본 발명은 또한 동물의 피부에 벡터를 포함한 전달 장치를 적용하는 단계를 포함하는 방법과, 전달 장치내 및/또는 위에 벡터를 배치시키는 추가 단계를 포함하는 방법; 및 이러한 전달 장치를 제공한다.

본 발명은 또한 벡터가 결실된 모든 바이러스 유전자를 가질 수 있는 방법과, 이러한 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 벡터가 예를 들어 종양유전자, 종양-억제자 유전자, 또는 종양-관련 유전자를 발현시켜 동물에서 치료 효과, 예를 들어 항암 효과를 유도할 수 있는 방법을 제공한다.

부가적으로, 본 발명은 유전자 산물, 예를 들어 발현 산물, 및 발현에 의해 생성된 면역학적 산물(예, 항체), 방법에서의 세포, 및 시험관내 및 생체외에서 이의 용도를 제공한다. 발현 산물 및 면역학적 산물은 분석, 진단 등에 이용될 수 있고; 면역학적 산물 및/또는 발현 산물을 발현시키는 세포는 숙주에서 분리되어, 시험관내에서 팽창된 다음 숙주로 재도입될 수 있다.

또한, 비-침입성 전달이 투여의 모든 경우에 바람직하지만, 본 발명은 침입성 전달과 함께 이용될 수 있고; 본 발명은 일반적으로 프라임-상승법의 일부로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 프라임-상승법의 일부로서 이용될 경우 비-침입성 본 방법은 동일하거나 상이한 면역학적 또는 치료 성분의 또다른 비-침입성 또는 침입성 투여와 같은 또다른 투여 이전 또는 이후 또는 이와 동시에 투여되며, 예를 들어, 비-침입성 투여 이전, 도중 또는 이후에, 해당 항원 또는 에피토프가 비-침입성 투여에서 벡터에 의해 발현되는 동일하거나 유사한 병원체를 위한 전체 또는 서브유닛 백신 또는 면역학적 조성물과 같거나 유사한 병원체에 대해 상이한 백신 또는 면역학적 조성물의 주사에 의해 투여된다.

본 발명은 또한 피부-표적화되고 기타 비-침입성 백신 또는 면역학적 조성물의 전달을 위한 전달 장치(붕대, 접착 드레싱, 스폿-온(spot-on) 제형 및 이의 적용 장치, 포어-온(pour-on) 제형 및 이의 적용 장치, 롤-온 제형 및 이의 적용 장치, 샴푸 제형 및 이의 적용 장치 따위)와 이의 용도, 및 벡터의 비-침입성 전달을 위한 조성물; 및 벡터의 비-침입성 전달을 위한 조성물 제조를 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는 자체 패키징에서 벡터 및 약학적으로 허용가능하거나 적합한 담체 또는 희석제 및 임의 전달 장치를 포함하며, 패키징은 단일 용기에 포함되거나 패키징은 각각 별개 용기 또는 자체 별개 용기일 수 있으며; 키트는 임의로는 성분 혼합 및/또는 조성물의 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다.

포어-온 및 스폿-온 제형은 미국 특허 6,010,710 및 5,475,005에 기재되어 있다. 롤-온 장치는 미국 특허 5,897,267에 기재되어 있다. 미국 특허 6,010,710, 5,475,005 및 5,897,267의 내용은 본원에서 인용되거나 언급된 문헌과 이러한 문헌에서 인용되거나 언급된 모든 문헌과 함께 본원에서 참조된다. 또한, 숙련인은 샴푸 제형 제조와, 이러한 제형을 동물에게 적용시키는 장치에 관해 숙지하고 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에서 고려된 모든 용도의 모든 유전자 벡터를 포함한다.

본원에서 "구성하다", "구성했다", "구성하는"과 같은 용어는 미국 특허법에서 이것에 속한다는 의미를 가질 수 있으며; 예를 들면, 이들은 "포함하다", "포함했다", "포함하는" 등의 의미일 수 있다.

이들 및 기타 양태는 하기의 상세한 설명에 의해 좀더 분명해질 것이다.

관련 출원

본 출원은 1999년 5월 3일자에 출원된 미국 가출원 60/132,216에 기초하면서 이의 우선권을 주장하고 있다. 본 출원은 (1999년 10월 5일자에 출원된 미국 특허 출원 09/402,527의 일부 계속 출원인) 2000년 3월 23일자에 출원된 미국 특허 출원 09/533,149의 일부 계속 출원이다. 미국 출원 09/402,527은 1998년 8월 13일자에 출원된 PCT/US98/16739의 국제 단계, 일부 계속, 출원이며, 이는 다시 1997년 8월 13일과 1998년 2월 11일에 각각 출원된 미국 가출원 60/055,520과 60/075,113의 우선권을 주장하고 있다. 이들 각각의 출원과 이들 각각의 출원에서 인용된 각각의 문헌("출원 인용된 문헌) 및 출원 인용된 문헌에서 언급되거나 인용된 각각의 문헌, 본문이나 출원의 진행도중 언급되거나 인용된 각각의 문헌, 또는 이러한 수행 도중 발전된 특허권의 지지를 위한 모든 논거가 본원에서 참조된다. 본문에서도 다양한 문헌이 인용된다("출원 인용된 문헌"). 각각의 출원 인용된 문헌과 출원 인용된 문헌에서 인용되거나 언급된 각각의 문헌들도 본원에서 참조된다.

정부 지원

본 발명에서 수행된 조사는 부분적으로 미 국립보건원에서 인가 번호 1-R43-A1-43802로서 지원되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정의 권리를 가진다.

기술분야

본 발명은 일반적으로 면역학과 백신 기술 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역반응을 유발하기 위해 피부-표적화된 비-침입성 유전자 전달 기술 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 동물에서 비-침입성 유전자 면역법 및/또는 동물에서 면역반응, 예를 들어 전신 면역반응 또는 치료반응, 예를 들어 전신 치료반응을 유도하는 방법, 이의 산물 및 이러한 방법과 산물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 동물에서 반응, 예를 들어 전신 면역반응을 유도하는데 효과적인 양의 벡터를 동물의 피부와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 벡터가 에피토프 또는 해당 유전자 산물, 예를 들어 항원 또는 치료제를 암호화하는 외생성 핵산 분자를 포함하고 이를 발현시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 반응, 예를 들어 전신 면역 또는 치료반응이 에피토프 또는 유전자 산물이거나 여기서 유도될 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 핵산 분자가 해당 에피토프 및/또는 해당 항원 및/또는 면역반응을 자극 및/또는 조절하고/조절하거나 발현, 예를 들어 내생성 및/또는 외생성 핵산 분자의 전사 및/또는 해독과 같은 전사 및/또는 해독을 자극 및/또는 조절하는 핵산 분자를 암호화할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 부가적으로 핵산 분자가 벡터에 대해 외생성일 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 외생성 핵산 분자가 1 이상의 항원 또는 이의 일부, 예를 들어 병원체의 1 이상의 해당 에피토프, 예를 들어 알레르기 반응을 변화시키는 에피토프, 항원 또는 유전자 산물,생리적 기능을 변화시키는 에피토프, 항원 또는 유전자 산물, 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2, 파상풍 독소 C-단편, 탄저균 보호 항원, 탄저균 치사 인자, 광견병 당단백질, HBV 표면 항원, HIV gp 120, HIV gp 160, 인간 카시노엠브리오닉 항원, 말라리아 CSP, 말라리아 SSP, 말라리아 MSP, 말라리아 pfg, 및 마이코박테리움 튜버쿨로시스 HSP; 및/또는 치료 또는 면역조절 유전자, 공-자극 유전자 및/또는 사이토킨 유전자를 암호화하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 면역반응이 동물 세포, 예를 들어 내피 세포에서 핵산 분자를 발현시키는 벡터에 의해 유도될 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 면역반응이 병원체 또는 신생물에 대항할 수 있는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 이들 방법에서 사용된 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 예방 백신 또는 치료 백신 또는 벡터를 포함하는 면역학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 부가적으로 동물이 척추동물, 예를 들어 어류, 조류, 파충류, 양서류 또는 포유동물, 유리하게는 인간 또는 반려 또는 길들여지거나 식품- 또는 사료-생산하거나 가축 또는 경기 또는 경주 또는 스포츠 동물, 예를 들어 소, 말, 개, 고양이, 염소, 양 또는 돼지, 또는 닭, 오리, 칠면조와 같은 가금류와 같은 포유동물일 수 있는 방법과 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 벡터가 바이러스 유전자의 일부 또는 전부가 결실된 바이러스 코트를 포함한 1 이상의 바이러스, 박테리아, 원생동물, 트랜스포손, 레트로트랜스포손 및 DNA 벡터, 예를 들어 재조합 벡터; 아데노바이러스, 예를 들어 E1 및/또는 E3 및/또는 E4 영역(들)이 결손된 아데노바이러스일 수 있는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 E1 및/또는 E3 및 E4 영역(들)이 결손된 아데노바이러스, 유리하게는 E1과 E3 영역에서 결실된 아데노바이러스, 예를 들어 인플루엔자의 해당 에피토프(예를 들어, 1 이상의 해당 인플루엔자 에피토프 및/또는 1 이상의 인플루엔자 항원)를 암호화하는 외생성 또는 이종 핵산 분자와 같은 외생성 또는 이종 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스의 점막, 예를 들어 비내, 설하, 볼, 경구, 구강 투여에 관한 것이다. 이러한 투여는 보호 면역반응과 같은 면역학적 반응을 유도하기 위한 방법일 수 있다. 본 발명에서 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스일 수 있다. 아데노바이러스는 또다른 종류의 아데노바이러스, 예를 들면 개과 아데노바이러스일 수 있다. 따라서, 숙주 또는 동물이 인간 이외인 경우, 아데노바이러스는 숙주와 매치될 수 있는데; 예를 들어 숙주 또는 동물이 개와 같은 개과 동물인 척추동물 적용에서, 아데노바이러스는 개과 아데노바이러스일 수 있다.

본 발명은 따라서 추가로 벡터가 동물에서 이종 또는 외생성 및 상동성 해당 유전자 산물 모두를 발현시킬 수 있기 때문에 벡터가 숙주와 매치되거나 숙주 또는 동물 측면에서 이용되는 벡터이거나(예를 들어, 척추동물 적용에서, 이는 동물에 적합한 벡터를 이용하는데 유용할 수 있으며, 예를 들면 개과에서 이는 개과 아데노바이러스 일 수 있음); 좀더 일반적으로는 벡터가 방법 수행시 감쇄되거나 불활성화된 숙주 또는 동물의 병원체일 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 동물의 피부에 벡터를 포함한 전달 장치를 적용시키는 단계를 포함하는 방법과, 전달 장치내 및/또는 위에 벡터를 배치하는 단계를 추가로 포함하는 방법; 및 이러한 전달 장치에 관한 것이다.

본 발명은 또한 벡터가 결실된 모든 바이러스 유전자를 가질 수 있는 방법, 및 이러한 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 종양유전자, 종양-억제 유전자, 또는 종양-관련 유전자를 발현시킴으로써 벡터가 동물에서 항종양 효과를 유도할 수 있는 방법에 관한 것이다.

부가적으로, 본 발명은 발현에 의해 생산된 면역학적 산물, 방법에서 세포, 및 발현 산물, 및 시험관내 및 생체외에서 이의 용도에 관한 것이다.

하기의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 이해될 수 있으며, 예를 들어 기재하고 있지만 본 발명의 범위를 특정 양태에 한정시키고자 함이 아니다.

도 1은 벡터의 국소 적용에 의해 피부에서 아데노바이러스 재조합체로부터 트랜스진 발현을 도시하고 있고;

도 2a와 2b는 국소-적용된 아데노바이러스 재조합체에 의해 형질도입될 수있는 잠재적 표적 세포의 특징분석을 도시하고 있으며;

도 3a와 3b는 아데노바이러스-매개된 NIVS에 의해 면역된 마우스의 혈청에서 특정 항체의 검출을 도시하고 있고;

도 4는 대조 표준 대 치사량의 종양 세포가 투여된 면역된 마우스의 생존 퍼센트를 도시하고 있으며;

도 5는 종양-침투하는 T 림프구의 특징분석을 도시하고 있으며;

도 6은 종양-침투하는 CTL의 특징분석을 도시하고 있으며;

도 7은 백신 붕대의 국소 적용에 의해 면역된 마우스에서 인간 CEA 단백질에 대한 항체의 웨스턴 블롯 분석을 도시하고 있으며;

도 8a는 DNA/아데노바이러스-매개된 NIVS에 의해 면역된 마우스 혈청에서 특정 항체의 검출을 도시하고 있으며;

도 8b는 DNA/리포솜-매개된 NIVS에 의해 면역된 마우스 혈청에서 특정 항체의 검출을 도시하고 있으며;

도 9는 표적 세포에서 DNA-암호화된 및 아데노바이러스-암호화된 트랜스진의 공-발현을 도시하고 있으며;

도 10은 국소-적용된 아데노바이러스 재조합체, DNA/아데노바이러스 복합체, 및 DNA/리포솜 복합체로부터 상대적인 트랜스진 발현을 도시하고 있으며;

도 11은 피부-표적화된 비-침입성 백신의 투여 장치를 도시하고 있으며;

도 12는 마우스에서 피부-표적화된 비침입성 백신에 의해 생성된 항-인플루엔자 항체를 도시하고 있으며;

도 13은 바이러스 투여 후 사망으로부터 마우스의 보호를 도시하고 있으며;

도 14는 인플루엔자 HA를 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 함유한 피부 팻치에 의해 피그테일 짧은꼬리원숭이에서 생성된 ELISA 항체를 도시하고 있으며;

도 15는 아데노바이러스 벡터의 국소 적용 후 피부에서 항원 스폿의 재위치선정을 도시하고 있으며;

도 16은 비침입 방식으로 국소 유전자 전달 후 다양한 조직에서 외래 DNA의 증폭을 도시하고 있으며;

도 17은 NAIR과 같은 탈모제가 NIVS에 필수가 아님을 도시하고 있으며;

도 18은 아데노바이러스계 파상풍 백신의 국소 적용 또는 비내 접종에 의한 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani) 공격에 이어 사망으로부터 보호를 도시하고 있다.

침입 방식의 백신 접종이 불필요할 수 있다(Tang et al., 1997; Glenn et al., 1998). 피부가 외부 환경과 직접 접하여 잠재적 병원체와 일정한 접촉을 하기 때문에, 면역 시스템은 잠재적 감염을 막기 위해 피부 가장자리를 따라 고정된 생물학적군을 일정하게 유지시켜야 한다. 그 결과, 피부 외층은 필수적으로 면역적격 조직이다. 체액 및 세포독성 세포 면역반응의 유발을 위해 피부에 존재하는 면역학적 성분들은 (MHC 부류 II-양성 항원-제시 세포인) 내피 랑게르한스 세포, 케라틴 생성 세포, 및 CD4⁺및 CD8⁺T 림프구를 포함한다. 이들 성분들은 백신 투여를 위해피부를 이상적인 장소로 만든다. 피부의 넓은 허용가능한 영역과 이의 영속성은 이러한 조직에 백신을 적용하는 데 있어 또다른 이점이다. 물리적 침투 없이 피부 외층에서 소량의 항원의 발현은 면역 감시 메커니즘을 가동시켜 강력한 면역반응을 유발할 수 있다.

유전자 백신이 신규한 방식으로 피부-표적화된 비-침입성 백신, 또는 면역원성 또는 면역학적 또는 치료 조성물 형태로 접종될 수 있음이 입증되었다. 비-침입성 전달 방식과 유전자 백신의 조합에 의해 특별한 기술 및 투여 장치가 거의 필요없거나 필요없는 새로운 부류의 "일반 대중적" 백신, 또는 면역원성 또는 면역학적 또는 치료용 조성물이 만들어진다. 이에 따라, 이러한 조성물을 자신의 피부(이러한 투여는 투여량을 알맞게 하기위해 유리하게는 의료진의 지시에 따라 행해질 수 있음) 또는 동물의 피부(예, 유리하게는 동물이 포유동물인 경우 면도된 피부, 본원에서 입증되었지만, 제모가 필수사항은 아님, 좀더 유리하게는 동물이 문지름, 털손질 또는 기타 활동에 의해 투여를 제거하지 않는 영역)에 투여할 수 있고; 본 발명은 이에 따라 백신, 또는 유전자 산물을 발현시키는 벡터를 포함하는 면역원성 또는 면역학적 또는 치료 조성물의 투여, 특히 침입성, 예를 들어 니들 투여가 다소 어렵거나 불편하거나 고통이 따를 수 있는 신생아, 어린 동물, 어린이 등에게 이러한 조성물을 투여할 경우에 이점을 제공한다.

본 발명은 동물에서 면역반응을 유도하기에 효과적인 양의 유전자 벡터를 동물의 피부와 접촉시키는 단계를 포함하는, 동물에서 비-침입성 유전자 면역 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 벡터는 일 환경에서 또다른 환경으로 실재물을 이동시키거나 이의 이동을 촉진하는 수단이다. 예를 들면, 재조합 DNA 기술에 이용된 몇몇 벡터는 DNA 단편과 같은 실재물(예; 이종 cDNA 단편과 같은 이종 DNA 단편)을 표적 세포로 이동시킨다. 유리한 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 원생동물 벡터, DNA 벡터, 또는 이들의 재조합체를 포함한다.

본원에서 사용된 "AdCMV-tetC:IM"은 클로스트리디움 테타니 독소 C-단편을 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 나타내고; "pCMV-tetC"는 클로스트리디움 테타니 독소 C-단편을 암호화하는 플라스미드 발현 벡터를 나타낸다.

본 발명의 실시에 이용될 수 있는 발현된 유전자 산물, 항체 및 이의 용도, 외생성 핵산 분자의 생체내 및 시험관내 발현을 위한 벡터, 핵산 분자의 발현을 촉진하거나 발현되는 핵산 분자에 작동가능하게 연결되는 프로모터, 이러한 벡터를 생성하는 방법 및 자료, 백터 또는 핵산 분자 또는 항체를 포함하는 조성물, (점막, 코, 경구, 구강, 볼, 설하 투여용 조성물을 포함하는) 투여량, 및 투여방식 및/또는 투여 경로에 관한 정보를 위해 1999년 11월 23일자에 발행된 미국 특허 5,990,091; Einat et al 또는 Quark Biotech, Inc., 1999년 5월 14일자에 출원된 PCT/US99/11066 1999년 11월 25일자에 공개된 WO99/60164; Fischer 또는 Rhone Merieux, Inc., (미국 출원 08/675,556 및 08/675,566의 우선권을 주장하고 있는) 1997년 6월 30일자에 출원된 PCT/US97/11486 1998년 1월 8일자에 공개된 WO 98/00166; van Ginkel et al., J. Immunol 159(2):685-93(1997)("Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helper cell responses to thevector and to its transgene"), Osterhaus et al., Immunobiology 184(2-3):180-92(1992)("Vaccination against acute respiratory virus infections and measles in man"); Briles et al. 또는 UAB, 1999년 4월 23일자에 출원된 PCT/US99/08895 1999년 10월 28일자에 공개된 WO99/53940 및 Briles et al. 또는 UAB, 2000년 3월 28일자에 발행된 미국 특허 6,042,838, 및 Briles et al. 또는 UAB, 미국 특허 6,004,802가 참조되며; 1999년 11월 23일자에 발행된 미국 특허 5,990,091, Einat et al. 또는 Quark Biotech, Inc., 1999년 5월 14일자에 출원된 PCT/US99/11066 1999년 11월 25일자에 공개된 WO99/60164, Fischer 또는 Rhone Merieux, Inc., 1997년 6월 30일자에 출원된 PCT/US97/11486 1998년 1월 8일자에 공개된 WO98/00166(미국 출원 08/675,556과 08/675,566의 우선권 주장), van Ginkel et al., J. Immunol 159(2):685-93(1997)("Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helper cell responses to the vector and to its transgene"), Osterhaus et al., Immunobiology 184(2-3):180-92(1992)("Vaccination against acute respiratory virus infections and measles in man"), Briles et al. 또는 UAB, 1999년 4월 23일자에 출원된 PCT/US99/08895 1999년 10월 28일자에 공개된 WO99/53940, 및 Briles et al., 또는 UAB, 2000년 3월 28일자에 발행된 미국 특허 6,042,838 및 Briles et al. 또는 UAB, 미국 특허 6,004,802 및 본문에서 인용되거나 언급된 모든 문헌 및 1999년 11월 23일자에 발행된 미국 특허 5,990,091, Einat et al 또는 Quark Biotech, Inc., 1999년 5월 14일자에 출원된 PCT/US99/11066 1999년 11월 25일자에 공개된 WO99/60164, Fischer또는 Rhone Merieux, Inc., 1997년 6월 30일자에 출원된 PCT/US97/11486 1998년 1월 8일자에 공개된 WO98/00166(미국 출원 08/675,556과 08/675,566의 우선권 주장), van Ginkel et al., J. Immunol 159(2):685-93(1997)("Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helper cell responses to the vector and to its transgene"), Osterhaus et al., Immunobiology 184(2-3): 180-92(1992)("Vaccination against acute respiratory virus infections and measles in man"), Briles et al. 또는 UAB, 1999년 4월 23일자에 출원된 PCT/US99/08895 1999년 10월 28일자에 공개된 WO99/53940, 및 Briles et al. 또는 UAB, 2000년 3월 28일자에 공개된 미국 특허 6,042,838, 및 Briles et al. 또는 UAB, 미국 특허 6,004,802 각각에서 언급되거나 인용된 문헌에서 인용되거나 언급된 모든 문헌이 참조된다. 본 발명의 실시를 위해 1999년 11월 23일자에 발행된 미국 특허 5,990,091, WO99/60164, WO98/00166, van Ginkel et al., J. Immunol 159(2):685-93(1997), Osterhaus et al., Immunobiology 184(2-3):180-92(1992), WO99/53940 및 미국 특허 6,042,838과 6,004,802의 정보에 의존할 수 있다(예, 발현된 산물, 항체 및 이의 용도, 외생성 핵산 분자의 생체내 및 시험관내 발현을 위한 벡터, 해당 에피토프 또는 항원 또는 치료제 등을 암호화하는 외생성 핵산 분자, 프로모터, 이러한 벡터 또는 핵산 분자를 포함하는 조성물 또는 발현된 산물 또는 항체, 투여량). 본 발명에 따라 얻어진 면역학적 산물 및/또는 항체 및/또는 발현된 산물이 시험관내에서 발현될 수 있고 면역학적 및/또는 발현된 산물 및/또는 항체가 전형적으로 사용되도록 하고, 면역학적 및/또는 발현된 산물 및/또는 항체를 발현시키는 세포가 시험관내 및/또는 생체외 적용에 이용될 수 있도록 하는 방식으로 이용됨이 주목할 만하며, 예를 들어 이러한 용도 및 적용은 진단, 분석, 생체외 요법(예: 유전자 산물 및/또는 면역학적 반응을 발현시키는 세포가 시험관내에서 팽창한 다음 숙주 또는 동물중으로 재도입됨) 등을 포함할 수 있으며, 미국 특허 5,990,091, WO99/60164, WO98/00166, WO99/53940, 및 미국 특허 6,042,838과 6,004,802, 및 본문에서 인용된 문헌 및 이러한 문헌에서 인용되거나 언급된 문헌을 참고하라. 또한, 본원 방법으로부터 분리되거나 본원 투여법에 이어 시험관내에서 팽창된 세포로부터 분리된 발현된 항체 또는 유전자 산물이 조성물에 투여될 수 있으며, 이는 면역을 유도하고, 치료반응을 자극하고/자극하거나 수동 면역을 자극하기 위해 서브유닛 에피토프 또는 항원 또는 치료제 또는 항체의 투여와 유사하다. 투여량은 환자(숙주)와 치료받을 증세에 따라 달라질 것이고 일 또는 몇 마이크로그램 내지 수백 또는 수천 마이크로그램에 걸쳐 다양할 것이며, 예를 들면, 1㎍ 내지 1 ㎎, 1일 약 100 ng/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중, 바람직하게는 1일 10 pg/kg 내지 10 mg/kg이다. 벡터는 유전자 산물(예, 에피토프, 항원, 치료제, 및/또는 항체) 조성물의 경우 언급된 양을 달성하는 양으로 환자 또는 숙주에 비-침입식으로 투여될 수 있다. 물론, 본 발명은 본원에서 예시된 투여량 이하 및 이상의 투여량을 포함하며, 동물 또는 인간에게 투여되는 이러한 성분들을 포함한 조성물, 및 특정 투여방법의 경우, 적당한 동물 모델, 예를 들어 마우스와 같은 설치류에서 치사량(LD) 및 LD₅₀의 측정에 의한 독성; ELISA 및/또는 혈청중화 분석에 의한 혈청적정 및 이의 분석에 의해 적당한 반응을 유발하는 조성물(들)의 투여량, 성분들의 농도 및 조성물(들)의 투여 시간을 측정함이 바람직하다. 이러한 측정은 숙련인의 지식, 본원에서 인용된 상세한 설명 및 자료에 의하며 과도한 실험을 필요로 하지 않는다. 본 발명은 또한 본 발명 조성물의 순차적 투여 또는 본원 방법의 순차적 수행, 예를 들어 증세의 요법 또는 치료 과정에서 본 발명 조성물의 주기적 투여 및/또는 면역학적 조성물의 상승 투여 및/또는 프라임-상승 방식을 포함하고 있으며; 순차적 투여 시간 및 방식은 과도한 실험 없이도 확인될 수 있다. 또한, 본 발명은 벡터를 제조하고 이용하는 조성물 및 방법(생체내 및/또는 시험관내 및/또는 생체외에서(예, 후자 둘의 예는 세포의 임의 팽창 후 본 발명에 따라 비-침입성 투여된 숙주의 세포로부터 분리된 이후) 유전자 산물 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체를 생산하는 방법을 포함함)과, 진단, 분석, 요법, 치료 등에서 이러한 유전자 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체의 용도를 포함한다. 벡터 조성물은 적당한 담체 또는 희석제와 벡터를 혼합하여 제형되고; 유전자 산물 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체 조성물도 또한 유전자 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체를 적당한 담체 또는 희석제와 혼합하여 제형된다; 예를 들어 미국 특허 5,990,091, WO99/60164, WO98/00166, WO99/53940 및 미국 특허 6,042,838과 6,004,802, 본문에서 인용된 문헌, 및 본문에서 인용된 기타 문헌, 및 본원의 기타 교시(예를 들면, 담체, 희석제 등의 측면에서)를 참조하라.

코 또는 호흡기(점막) 투여를 원한다면, 조성물은 형성되어 압착 스프레이 디스펜서, 펌프 디스펜서 또는 에어로졸 디스펜서에 의해 분배될 수 있다. 이러한디스펜서는 경구 또는 구강(예, 볼 또는 설하) 점막에 조성물을 전달하는데 이용될 수 있다. 에어로졸은 보통 탄화수소의 압력을 받는다. 펌프 디스펜서는 바람직하게는 계량된 투여량 또는 특정 입자 크기를 가진 투여량을 분배할 수 있다.

본 발명의 조성물은 특히 경구(또는 볼 또는 설하) 투여될 경우 좀더 호소력을 지니기 위해 약학적으로 허용가능한 향 및/또는 색을 함유할 수 있고; 이러한 조성물은 입에서 용해되거나 (니트로글리세린 또는 니페디멘과 같은 앙기나용 경구, 설하 또는 볼 약제와 유사한) 볼 또는 설하 흡수용 액체를 방출하도록 씹히는 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다. 점성 조성물은 겔, 로션, 연고, 크림 등의 형태일 수 있고(예, 국소 및/또는 점막 및/또는 코 및/또는 경구 및/또는 구강 및/또는 설하 및/또는 볼 투여의 경우), 점도가 약 2500 내지 6500 cps(10,000 cps에 이르는 좀더 큰 점성의 조성물도 이용될 수 있음)이도록 충분한 양의 증점제를 전형적으로 함유할 것이다. 점성 조성물은 바람직하게는 2500 내지 5000 cps의 점도를 가지는데, 그 이유는 이 범위 이상은 투여하기가 더 어려워지기 때문이다. 그러나, 이 범위 이상의 조성물은 이어서 경구 섭취용으로 삼켜지는 환제 및/또는 구강에 보유하기 위한, 예를 들면 볼 또는 설하 투여용 환제 또는 캡슐 또는 정제로서 용이하게 투여되는 고형물 또는 젤라틴 형태에 접근할 수 있다.

액체 제조물은 통상적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고형 조성물보다 제조하기가 더욱 용이하다. 아울러, 액체 조성물은 특히 주사로 또는 경구로 또는 볼로 또는 설하로 동물, 아동, 특히 소아 및 환제, 정제, 캡슐 등을 삼키는 데 어려움을 가질 수 있는 다른 사람들에게 투여하거나 복합-투여 상황에서 다소 더욱 편리하다. 한편으로는, 점성 조성물은 적당한 점도 범위 내로 제형되어 위점막 또는 비점막의 내막과 같은 점막과의 장시간의 접촉을 제공하거나 설하 또는 볼 또는 구강 흡수를 제공할 수 있다.

명백하게, 적당한 담체 및 다른 첨가제의 선택은 정확한 투여 경로 및 특정 투여량 형태의 특성, 예를 들면 액체 투여량 형태(예, 조성물이 용액, 현탁액, 겔 또는 또다른 액체 형태로 제형될 것인지), 또는 고형 투여량 형태(예, 조성물이 환제, 정제, 캡슐, 캐플릿, 시간 경과에 따라 방출되는 형태 또는 액체-충진 형태로 제형될 것인지)에 따라 좌우될 것이다.

용액, 현탁액 및 겔은 통상적으로 항원, 지단백질 및 임의의 보조제 외에 다량의 물(바람직하게는 정제수)을 함유한다. pH 조절제(예, NaOH와 같은 염기), 유화제 또는 분산제, 완충제, 방부제, 습윤제, 젤리형성제(예, 메틸셀룰로스), 착색제 및/또는 향미제와 같은 소량의 다른 성분 또한 존재할 수 있다. 조성물은 등장성일 수 있는데, 즉 혈액 및 누액과 동일한 삼투압을 가질 수 있다.

본 발명 조성물의 목적하는 등장성은 나트륨 클로라이드 또는 덱스트로스, 붕산, 나트륨 타르트레이트, 프로필렌 글리콜 또는 다른 무기 또는 유기 용질과 같은 다른 약학적으로 허용가능한 제제를 사용하면 달성될 수 있다. 특히 나트륨 이온을 함유하는 완충제를 위해서는 나트륨 클로라이드가 바람직하다.

조성물의 점도는 약학적으로 허용가능한 증점제를 사용하면 선택된 수준으로 유지될 수 있다. 용이하게 경제적으로 입수가능하고 작업하기가 용이하기 때문에 메틸셀룰로스가 바람직하다. 다른 적당한 증점제는 예를 들면, 잔탄 고무, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 카보머 등을 포함한다. 증점제의 바람직한 농도는 선택된 제제에 따라 좌우될 것이다. 중요한 점은 선택된 점도를 달성할 양을 사용하는 것이다. 점성 조성물은 통상적으로 이러한 증점제의 첨가에 의해 용액으로부터 제조된다.

약학적으로 허용가능한 방부제는 조성물의 저장수명을 연장시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 파라벤, 티메로살, 클로로부탄올 또는 벤즈알코늄 클로라이드를 포함하는 다양한 방부제 또한 이용될 수 있지만, 벤질 알콜이 적당할 수 있다. 방부제의 적당한 농도는 선택된 제제에 따라 감지가능한 변동이 있을 수 있지만 전체 중량을 기준으로 0.02% 내지 2%일 것이다.

당업자는 조성물의 성분이 해당 벡터 또는 항원 또는 에피토프 및 임의의 보조제 또는 다른 활성 또는 면역-증대 성분에 대해 화학적으로 불활성인 것이 선택되어야 함을 인지할 것이다. 이는 화학 및 약학 원리의 숙련인에게는 문제가 안되거나, 문제는 본 특허기술 및 본원에 인용되는 문헌으로부터의 표준 텍스트 또는 간단한 실험(과도한 실험을 포함하지 않음)을 참조로 용이하게 회피될 수 있다.

본 발명의 면역학적으로 효과적인 조성물은 일반적으로 허용되는 과정을 따라 성분을 혼합함으로써 제조된다. 예를 들면, 선택된 성분은 블렌더 또는 다른 표준 장치로 간단하게 혼합되어 이어서 물 또는 증점제 및 가능하게는 pH를 조절하기 위한 완충제 또는 긴장성을 조절하기 위한 추가의 용질 첨가에 의해 최종 농도 및 점도로 조절될 수 있는 진한 혼합물을 생성할 수 있다. 일반적으로 pH는 약 3 내지 7.5일 수 있다. 조성물은 특정 환자 또는 동물의 연령, 성별, 체중 및 상태와 같은요인과, 투여를 위해 사용되는 조성물 형태(예, 고형물 대 액체)를 고려하여 의학 및 수의학 분야의 숙련인에게 익히 알려진 투여량 및 기술로 투여될 수 있다. 인간 또는 다른 포유동물을 위한 투여량은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 본 특허기술, 본원에 인용되는 문헌, 하기의 실시예와 본원에 인용되는 출원, 특허 및 다른 문헌과 본원에 인용되는 문헌에 인용되거나 언급되는 문헌(모두 본원에 참조로 인용)으로부터 결정될 수 있다.

초기 투여 및 부스터 투여 또는 연속 투여를 위한 적당한 방법 또한 다양하고, 초기 투여에 이은, 후속 투여를 포함할 수 있지만; 그럼에도 불구하고, 본 특허기술, 본원에 인용되는 출원과 특허를 포함하는, 본원에 참조로 인용되고 도입되는 문헌 및 본원에 인용되는 문헌에 인용되거나 언급되는 문헌(모두 본원에 참조로 인용)과 하기의 실시예로부터 당업자에 의해 확인될 수 있다. 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 본 발명의 다른 조성물 또는 다른 예방용 또는 치료용 조성물과 함께 동시-투여 또는 연속 투여될 수 있다.

또다른 유리한 양태에서, 벡터는 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2, 파상풍 독소 C-단편, 탄저균 보호 항원, 탄저균 치사 인자, 광견병 당단백질, HBV 표면 항원, HIV gp 120, HIV gp 160, 인간 카시노엠브리오닉 항원, 말라리아 CSP, 말라리아 SSP, 말라리아 MSP, 말라리아 pfg, 마이코박테리윰 튜버쿨로시스 HSP 또는 이들의 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 발현한다.

본 발명의 양태에서, 동물의 면역반응은 동물의 세포에서 해당 항원을 암호화하는 유전자를 발현하는 유전자 벡터에 의해 유도된다. 본 발명의 또다른 양태에서, 해당 항원은 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2, 파상풍 독소 C-단편, 탄저균 보호 항원, 탄저균 치사 인자, 광견병 당단백질, HBV 표면 항원, HIV gp 120, HIV gp 160, 인간 카시노엠브리오닉 항원, 말라리아 CSP, 말라리아 SSP, 말라리아 MSP, 말라리아 pfg 및 마이코박테리윰 튜버쿨로시스 HSP를 포함하는 그룹 중에서 선택된다. 방법의 또다른 양태에서, 동물의 세포는 표피세포이다. 방법의 또다른 양태에서, 면역반응은 병원체 또는 신생물에 대한 면역반응이다. 방법의 또다른 양태에서, 유전자 벡터는 예방용 백신 또는 치료용 백신으로서 사용된다. 본 발명의 또다른 양태에서, 유전자 벡터는 동물의 세포에서 해당 항원을 발현할 수 있는 유전자 벡터를 포함한다. 방법의 추가 양태에서, 동물은 척추동물이다.

벡터에서 발현을 위한 외생성 DNA(예, 해당 에피토프 및/또는 항원 및/또는 치료 물질을 암호화)를 제공하는 문헌과, 핵산 분자의 발현을 증가시키기 위한 전사 및/또는 해독 인자의 발현, 및 그 중에서도 특히 "해당 에피토프", "치료", "면역반응", "면역학적 반응", "보호 면역반응", "면역학적 조성물", "면역원성 조성물" 및 "백신 조성물"과 같은 용어에 대해서는 1999년 11월 23일자로 발행된 U.S. 특허 제5,990,091호 및 WO 98/00166과 WO 99/60164, 및 본원에 인용되는 문헌과 이 특허 및 PCT 출원의 수행 중에 기록된 문헌(이들 모두는 본원에 참조로 인용)을 참조로 한다. 따라서, U.S. 특허 제5,990,091호와 WO 98/00166 및 WO 99/60164와 본원에 인용되는 문헌과 특허와 PCT 출원의 수행 중에 기록된 문헌 및, 본원에 인용되는 다른 문헌 또는 그렇지 않으면 본원에 참조로 인용되는 문헌은 본 발명의 실행에서 참고될 수 있고; 본원에 인용되는 모든 외생성 핵산 분자, 프로모터 및 벡터가 본 발명의 실행에서 이용될 수 있다. 이러한 측면에서, 또한 U.S. 특허 제6,004,777호, 제5,997,878호, 제5,989,561호, 제5,976,552호, 제5,972,597호, 제5,858,368호, 제5,863,542호, 제5,833,975호, 제5,863,542호, 제5,843,456호, 제5,766,598호, 제5,766,597호, 제5,762,939호, 제5,756,102호, 제5,756,101호, 제5,494,807호, 제6,042,838호, 제6,004,802호 및 WO 99/53940이 언급될 수 있다.

본 발명의 또다른 양태에서, 동물은 유리하게는 포유동물, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류와 같은 척추동물이고; 더욱 유리하게는 인간 또는 소, 개, 고양이, 염소, 양 또는 돼지 또는 말과 같은 반려 또는 길들여지거나 식품을 생산하거나 사료를 생산하거나 가축 또는 경기 또는 경주 또는 스포츠 동물, 또는 칠면조, 오리 또는 닭과 같은 가금이다. 본 발명의 특히 유리한 또다른 양태에서, 척추동물은 인간이다. 본 발명의 또다른 양태에서, 유전자 벡터는 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 원생동물 벡터, 레트로트랜스포손, 트랜스포손, 바이러스 외피 또는 DNA 벡터이다. 본 발명의 또다른 양태에서, 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 원생동물 벡터 및 DNA 벡터는 재조합 벡터이다. 본 발명의 또다른 양태에서, 면역반응은 인플루엔자 A에 대한 면역반응이다. 본 발명의 또다른 양태에서, 인플루엔자 A에 대한 면역반응은 동물의 세포에서 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자를 발현하는 유전자 벡터에 의해 유도된다. 본 발명의 또다른 양태에서, 유전자 벡터는 바이러스 벡터 및 플라스미드 DNA로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 본 발명의 또다른 양태에서, 유전자 벡터는아데노바이러스이다. 본 발명의 또다른 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 이의 E1 영역이 결손되었다. 본 발명의 또다른 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 이의 E3 영역이 결손되었다. 본 발명의 또다른 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 이의 E1 및 E3 영역이 결손되었다. 본 발명의 또다른 양태에서, DNA는 플라스미드 형태이다. 본 발명의 또다른 양태에서, 접촉 단계는 해당 유전자를 함유하는 유전자 벡터를 전달 장치에 배치하고 해당 유전자를 함유하는 유전자 벡터를 가지는 장치를 동물의 피부에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또다른 양태에서, 유전자 벡터는 면역조절 유전자, 공-자극 유전자 또는 사이토킨 유전자를 암호화한다. 본 발명의 또다른 양태에서, 벡터는 결실된 모든 바이러스 유전자를 가진다. 본 발명의 또다른 양태에서, 유전자 벡터는 동물에게 항-종양 효과를 유도한다. 본 발명의 추가 양태에서, 유전자 벡터는 종양유전자, 종양-억제 유전자 또는 종양-관련 유전자를 발현한다.

본 발명은 또한: 동물의 피부를 동물에게 면역반응을 유도하는 유효량의 유전자 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 동물의 비-침입성 유전자 면역 방법을 제공한다.

본 발명의 방법을 사용하여 면역반응을 일으키는 데 사용될 수 있는 항원의 대표 예는 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2, 파상풍 독소 C-단편, 탄저균 보호 항원, 탄저균 치사 인자, 광견병 당단백질, HBV 표면 항원, HIV gp 120, HVI gp 160, 인간 카시노엠브리오닉 항원, 말라리아 CSP, 말라리아 SSP, 말라리아 MSP, 말라리아 pfg 및 마이코박테리윰 튜버쿨로시스 HSP 등을포함한다. 가장 바람직하게는, 면역반응은 신생물 또는 감염성 병원체에 대한 보호능을 유발한다.

본 발명의 실행은 동물을 면역시키거나 치료용 조성물을 투여하기 위한 비-침입성 과정으로 폴리펩타이드를 작동적으로 암호화하는 유전자 벡터를 척추동물의 외피에 전달하는 단계를 포함한다. 이러한 유전자 벡터는 임의의 장치를 이용하지 않고 피부에 유전 물질을 직접 전달하거나, 붕대 또는 붕대-유사 장치를 이용하여 노출된 피부와 접촉시킴으로써 척추동물에 투여될 수 있다. 바람직한 적용에서, 유전자 벡터는 수용액이다. 동결건조된 분말로부터 재구성된 벡터 또한 허용가능하다. 벡터는 완전한 유전자, 유전자 또는 여러 유전자의 단편, 유비퀴틴 또는 CpG-풍부 합성 DNA와 같은 면역 조절 서열과 융합된 유전자 단편을, 발현을 위해 필요한 전사/해독 시그널과 함께 암호화할 수 있다.

본 발명의 또다른 양태에서, 벡터는 공-자극 유전자 및 사이토킨 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 유전자를 추가로 함유한다. 이 방법에서 유전자는 GM-CSF 유전자, B7-1 유전자, B7-2 유전자, 인터류킨-2 유전자, 인터류킨-12 유전자 및 인터페론 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명의 추가의 양태에서, 반응은 파상풍균 감염에 대한 반응이고 벡터는 AdCMV-tetC:IM 또는 pCMV-tetC를 포함한다. 방법의 또다른 양태에서, 외생성 핵산 분자는 파상풍 독소 C-단편 또는 파상풍 독소의 항원 또는 에피토프를 암호화한다.

본 발명은 또한: 통상적으로 투여 후에 동물에게 항-인플루엔자 효능을 유도하는 인플루엔자-특이적 항원 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자 벡터의 면역학적 유효량을 피부에 적용함으로써 이러한 치료를 필요로 하는 환자의 피부와 접촉시키는 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스에 대한 면역반응의 비-침입성 유도방법을 제공한다. 방법의 일 양태에서, 유전자 벡터는 바이러스 벡터 및 플라스미드 DNA로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 방법의 또다른 양태에서, 유전자 벡터는 아데노바이러스이다. 방법의 또다른 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 이의 E1 및 E3 영역 결손이다. 방법의 추가 양태에서, DNA는 플라스미드 형태이다. 방법의 또다른 양태에서, 접촉 단계는 해당 유전자를 포함하는 유전자 벡터를 전달 장치에 배치하고 해당 유전자를 함유하는 유전자 벡터를 가지는 장치를 동물의 피부에 적용하는 단계를 추가로 포함한다.

아데노바이러스 재조합체를 이용하는 본 발명의 양태는 E1-결손, E3-결손, 및/또는 E4-결손 아데노바이러스 벡터 또는 모든 바이러스 유전자가 결실된 "것트리스(gutless)" 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. E1 돌연변이는 벡터의 안정성 마진을 증가시키는데 그 이유는 E1-결손 아데노바이러스 돌연변이체가 비-허용 세포에서 복제 불능이기 때문이다. E3 돌연변이는 메커니즘을 파괴함으로써 항원의 면역원성을 증가시켜 아데노바이러스는 MHC 부류 1 분자를 하향조절한다. E4 돌연변이는 후기 유전자 발현을 억제함으로써 아데노바이러스 벡터의 면역원성을 감소시켜, 동일한 벡터를 이용하는 반복 재-백신접종을 허용할 수 있다. "것트리스" 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 부류의 최근 모델이다. 이의 복제는 헬퍼 바이러스 및 자연적인 환경에서는 존재하지 않는, E1a 및 Cre를 모두 발현하는 특별한 인간 293 세포주를 요하고; 벡터는 모든 바이러스 유전자가 결실되어,백신 담체로서의 벡터가 비-면역원성이고 재-백신접종을 위해 수차례 접종될 수 있다. "것트리스" 아데노바이러스 벡터는 또한 트랜스진을 수용하기 위한 36 kb 공간을 포함하여, 다수의 항원 유전자의 세포로의 동시-전달을 허용한다. RGD 모티프와 같은 특이적 서열 모티프가 아데노바이러스 벡터의 H-1 루프에 삽입되어 이의 감염성을 증가시킬 수 있다. 아데노바이러스 재조합체는 특정 트랜스진 또는 트랜스진의 단편을 전술한 바와 같은 임의의 아데노바이러스 벡터로 클로닝함으로써 작제된다. 아데노바이러스 재조합체는 면역제로서 사용하기 위해 비-침입성 방식으로 척추동물의 표피세포를 형질도입시키는 데 사용된다.

DNA/아데노바이러스 복합체를 사용하는 본 발명의 양태는 PEI(폴리에틸렌이민) 또는 폴리라이신과 같은, 이를 위한 적당한 제제를 이용하여 아데노바이러스 벡터와 복합체를 형성하는 플라스미드 DNA를 가질 수 있다. 복합체내 아데노바이러스 벡터는 UV 또는 감마선 조사에 의해 "생존" 또는 "사멸"할 수 있다. 수용체-결합 리간드 및 DNA-매개 형질감염(Cotten et al., 1992)을 촉진하기 위한 침투제로서의 조사-불활성화된 아데노바이러스 벡터가 백신 담체의 안정성 마진을 증가시킬 수 있다. DNA/아데노바이러스 복합체는 면역제로 사용하기 위해 비-침입성 방식으로 척추동물의 표피세포를 형질감염시키는 데 사용된다.

DNA/리포솜 복합체를 사용하는 본 발명의 양태는 리포솜을 형성하기 위한 물질을 가질 수 있고, DNA/리포솜 복합체는 이러한 물질로부터 제조될 수 있다. DNA/리포솜 복합체는 면역제로 사용하기 위해 비-침입성 방식으로 척추동물의 표피세포를 형질감염시키는 데 사용된다.

본 발명에 의해 제공되는 유전자 벡터는 또한 체액성 및/또는 세포성 면역반응을 유발하기 위한 보조제로 작용할 수 있는 면역조절 분자를 암호화할 수 있다. 이러한 분자는 사이토킨, 공-자극 분자 또는 면역반응의 과정을 변화시킬 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 당사자는 이 기술이 항원의 면역원성을 추가로 증가시키도록 변형될 수 있는 방법을 이해할 수 있다.

NIVS를 위해 사용되는 유전자 벡터는 여러 형태를 취할 수 있고, 본 발명은 임의의 특정 폴리펩타이드를 암호화하는 특정 유전 물질로 한정하지 않는다. 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 원생동물 벡터, 트랜스포손, 레트로트랜스포손, 바이러스-유사-입자 및 DNA 벡터를 포함하는 모든 형태의 유전자 벡터는, 피부-표적화된 비-침입성 백신 담체로서 사용되면 본 발명에 의해 계획되는 방법 내에 있다.

유전자는 장치-없이 국소 적용 또는 패드 또는 붕대, 예를 들면 반창고와 같은 장치로 동물의 피부 표면에 유전자 코팅함을 포함하는 다양한 방법으로 전달될 수 있다. 도 11에 있어서, 비-침입성 백신접종을 위한 장치가 도시되었다. 이 백신 전달 장치는 그 안에 기포가 배치된 비-알레르겐성, 피부 접착 팻치를 포함한다. 일 양태에서, 팻치는 추가로 직경 대략 1 cm의 플라스틱으로 이루어진다. 백신은 기포 내에 분포될 수 있다. 또다른 양태에서, 기포는 백신(액체, 유체로 재구성되는 동결건조된 분말 및 이의 변형물) 대략 1 ㎖를 함유한다. 바람직한 양태에서, 피부와 접촉하는 기포 표면을 반대 표면보다 고의로 약하게 하여, 압력이 반대 표면에 적용되면, 하면이 파괴되어 기포의 백신 성분을 피부에 방출하도록 한다. 플라스틱 팻치는 피부 표면에 대해 백신을 트랩핑한다.

본 발명의 해당 유전자 벡터 및 유전자의 국소 투여를 위한 투여량 형태는 액체, 연고, 분말 및 스프레이를 포함할 수 있다. 활성 성분은 멸균 조건하에서 생리학적으로 허용가능한 담체 및 필요하거나 바람직할 수 있는 방부제, 완충제, 포사약 또는 흡수 증가제와 혼합될 수 있다. 벡터 작제방법과 국소 적용을 위한 조성물, 예를 들면 크림 또는 연고일 수 있는 점성 조성물과 비강 및/또는 점막 및/또는 구강 및/또는 볼 및/또는 설하 투여용 조성물에 대해서는 본원에 인용되는 문헌, 예를 들면, U.S. 특허 제5,990,091호, 제6,042,838호 및 제6,004,802호와 WO 98/00166 및 WO 99/60164, 및 WO 99/53940과, 거기에 인용되는 문헌을 참조로 한다.

본원에서 술어학적으로 사용된 용어 중에서, 면역학적 유효량은 동물에게 투여되면, 해당 유전자 산물에 대한 면역반응을 유발하는 해당 유전자를 암호화하는 유전자 벡터의 양 또는 농도이다.

다양한 에피토프, 항원 또는 치료 물질은 상이한 농도로 이의 발현에 의해 국소적으로 전달될 수 있다. 일반적으로, 아데노바이러스 벡터를 위한 유용한 양은 적어도 대략 100 pfu이고 플라스미드 DNA의 경우는 적어도 대략 1 ng의 DNA이다. 다른 양이 과도한 실험 없이 본원에 참조로 인용되고 도입되는 문헌을 포함하는, 본 특허기술과 당분야의 지식으로 확인될 수 있다.

본 발명의 방법은 예방용 백신접종으로서 질환을 예방하거나 치료용 백신접종으로 질환을 치료하기 위해 적당하게 적용될 수 있다.

본 발명의 백신은 단독으로 또는 면역학적 조성물의 일부로서 동물에게 투여될 수 있다.

설명된 인간 백신 외에, 본 발명의 방법이 동물 스톡을 면역시키는 데 사용될 수 있다. 용어 동물은 인간을 포함하는 모든 동물을 의미한다. 동물의 예는 인간, 소, 개, 고양이, 염소, 양, 말, 돼지, 칠면조, 오리 및 닭 등을 포함한다. 모든 척추동물의 면역 시스템이 유사하게 작동하기 때문에, 설명된 적용은 모든 척추동물계에서 실행될 수 있다.

하기의 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 설명하기 위해 제시되었고 어떤 식으로든 본 발명을 한정하지 않는다.

프로토콜

마우스 및 세포 배양액

동종번식된 마우스를 University of Alabama at Birmingham에 유지시킨다. 세포를 2% 태 소 혈청 및 6% 송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 또는 DMEM 배지에서 배양한다.

유전자 벡터의 국소 적용

마우스를 마취시켜 복부 또는 목 피부의 한정된 영역을 덮고 있는 털과 각화 상피를 브러쉬 또는 탈모제(예, NAIR)로 제거한다. 유전자 벡터를 사전 면도한 피부에 피펫팅하고 다양한 시간(예, 1시간 내지 18시간) 동안 노출된 피부와 접촉시킨다. 벡터는 노출된 피부에 직접 또는 피부에 밀착된 실린더로 피펫팅될 수 있다.

아데노바이러스 벡터의 제조

고 역가 아데노바이러스 스톡을 특정 아데노바이러스 재조합체로 감염된 인간 293 세포로부터 제조한다. 용해물을 세슘 클로라이드 구배를 통한 초원심분리에 가한다. 바이러스 밴드를 추출하고 10 mM 트리스(pH 7.5)/135 mM NaCl/5 mM KCl/1 mM MgCl₂로 투석한다. 정제된 바이러스를 10%까지 첨가된 글리세롤로 멸균 여과하고 -80℃에서 분획으로 저장한다. 아데노바이러스 스톡의 역가는 플라크 분석으로 측정된다.

루시퍼라제 분석

피부의 루시퍼라제의 양을 이미 설명된 것처럼 측정한다(Tang, 1994). 간략하게 설명하면, 절개된 피부 조각을 용해 완충제내 Kontes 유리 조직 분쇄기로 균질화한다. 원심분리로 조직 파편을 제거한 후에, 피부 추출물의 루시퍼라제 활성을 과량의 ATP 및 루시페린의 존재하에 적산 광 방출의 측정으로 광도계로 측정한다.

β-갈락토시다제 분석

절개된 피부의 피스를 액화 질소내 Tissue-Tek O.C.T. 화합물(Miles Laboratories Inc.)로 신속하게 동결하여 사용할 때까지 -80℃에서 저장한다. 동결된 조직을 4 ㎛로 가로 절단하여 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고, β-갈락토시다제 활성을 위해 이미 설명된 것처럼(Tang et al., 1994) X-gal 염색 용액에 배양함으로써 염색한다. 단편은 헤마톡실린과 에오신으로 대비염색된다.

DNA/아데노바이러스 복합체의 제조

DNA/아데노바이러스 복합체를 각 적용을 위해 플라스미드 DNA 100 ㎍과 아데노바이러스의 입자 1 ×10¹¹를 응축제 폴리라이신의 존재하에 혼합함으로써 제조한다. 아데노바이러스의 역가는 흡광도로 측정된다.

DNA/리포솜 복합체의 제조

DNA/리포솜 복합체를 각 적용을 위해 플라스미드 DNA 100 ㎍과 DOTAP/DOPE(1:1; Avanti) 100 ㎍을 혼합함으로써 제조한다. 플라스미드는 Qiagen Plasmid Maxi Kit를 사용하여 제조된다.

웨스턴 블롯 분석

미부 출혈로부터의 혈청을 1:250 내지 1:500으로 희석하고 SDS-폴리아크릴아미드 겔로 분리된 정제 단백질과 반응시켜 Immobilon-P 막(Millipore)에 옮긴다. 반응은 ECL 키트를 사용하여 가시화된다(Amersham).

실시예 1

본 발명은 복잡한 장치를 사용하지 않는 유전자 벡터의 피부-표적화된 비-침입성 전달에 의한 간단한 방법으로 항원 유전자가 마우스의 피부에 전달될 수 있음을 보여준다. 도 1은 루시퍼라제 효소의 상당량이 AdCMV-luc(개똥벌레 루시퍼라제를 암호화하는 아데노바이러스 벡터)(Tang et al., 1994) 한정량의 피부에의 전달 후에 생성될 수 있음을 나타낸다. Ad, 아데노바이러스; pfu, 플라크-형성 단위; LU, 광 단위. 결과는 평균 로그[㎠ 피부당 LU] ±SE(n은 각 칼럼의 상단에 나타나있다)이다. 루시퍼라제를 암호화하지 않는 아데노바이러스 벡터가 모의-적용되거나 코팅된 마우스는 피부에서 검출가능한 루시퍼라제 활성을 초래하지 않았다. 피부에서 아데노바이러스 벡터로부터의 트랜스진 발현 수준은 바이러스의 역가와 상관관계가 없는 것 같다. 세포 소량만이 피부의 제한된 서브세트에서 바이러스에 의해 형질도입될 수 있고, 아데노바이러스 재조합체의 10⁸플라크-형성 단위(pfu)가 표적 세포를 포화시킬 수 있음이 가능하다. 이러한 변동은 또한 부분적으로, 각 마우스의 차이 때문일 수 있다. 또한, 일부 변동은 아마도 표준화되지 않은 각화 상피를 제거하는 과정 때문이다(Johnston and Tang, 1994). 생성되는 항원의 양은 잠재적으로 더욱 많은 벡터를 더욱 넓은 영역에 적용함으로써 증폭될 수 있다.

실시예 2

피부에의 비-침입성 백신접종을 위한 주요 표적 세포는 대장균 β-갈락토시다제 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터(AdCMV-βgal)의 피부-표적화된 비-침입성 전달 후에 X-gal 기질로 동결 단편을 염색함으로써 보여지는 것처럼 모낭의 헤어 매트릭스 세포(도 2a) 및 표피의 최외각층의 각질세포(도 2b)인 것 같다(Tang et al., 1994). 물리적 마손은 처리를 가한 피부 조직에서 발견되지 않았고, 염증도 유도되지 않았다. 비-침입성 유전자 전달에 가해진 피부 조직을 가로 절단된 피부에 AdCMV-βgal 10⁸pfu를 피펫팅하고 고정시킨 다음, 설명된 것처럼(Tang et al., 1994) X-gal 기질로 염색하고 하루 후에 동물로부터 절개한다. 도 2a는 모낭의 아데노바이러스-형질도입된 헤어 매트릭스 세포를 도시한다(150배). 도 2b는 표피의 최외각층의 아데노바이러스-형질도입된 각질세포를 도시한다(150배). 청색 세포는 AdCMV-luc가 모의-적용되거나 코팅된 대조 동물에서는 발견되지 않았다.

실시예 3

아데노바이러스-매개 NIVS에 의한 체액성 면역반응의 도출

NIVS는 동물의 신규 백신접종 방법이다. 과정이 벡터에 의해 암호화되는 항원에 대한 특이적 면역반응을 도출할 수 있음을 입증하기 위해, AdCMV-hcea(인간 카시노엠브리오닉 항원(CEA)을 암호화하는 아데노바이러스 벡터)를 C57BL/6 계통 마우스의 피부에 피펫팅한다. AdCMV-hcea 10⁸pfu의 피부-표적화된 비-침입성 전달 1개월 후에 백신접종된 마우스로부터의 혈청을 1:500으로 희석하고 정제된 인간 CEA 단백질(T. Strong에 의해 제공) 및 5% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 분리된 아데노바이러스 단백질과 반응시키고, Immobilon-P 막(Millipore)에 옮긴다. 도 3a에 있어서, 레인 1, 인간 CEA 0.5 ㎍; 레인 2, BSA 0.5 ㎍; 레인 3, 아데노바이러스 10⁷pfu. 도 3a는 웨스턴 블롯에서 백신접종된 동물로부터의 시험 혈청이 정제된 인간 CEA 단백질과는 반응하지만, 소 혈청 알부민(BSA)과는 반응하지 않음을 나타내는데, 이는 피부-표적화된 비-침입성 유전자 전달의 결과로서 아데노바이러스 벡터에 의해 암호화되는 외생성 단백질에 대한 특이적 항체가 생성된다는 결론을 지지한다.

이 기술이 일반적으로 적용가능한지를 시험하기 위해, AdCMV-hgmcsf(인간 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(hGM-CSF)를 암호화하는 아데노바이러스 벡터)를 피부에 적용한다. 인간 GM-CSF 단백질에 대한 항체를 검출하기 위해, 동물을 AdCMV-hgmcsf 10⁸pfu의 피부-표적화된 비-침입성 전달로 백신접종한다. 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 분리된 정제 인간 GM-CSF 단백질(CalBiochem)을 막에 옮기고 희석된 혈청과 반응시킨다. 다른 처리는 도 3a에 설명된 것처럼 수행된다. 도 3b에 있어서, 레인 1, 인간 GM-CSF 0.25 ㎍; 레인 2, BSA 0.25 ㎍; 레인 3, 아데노바이러스 10⁷pfu. 복제-결손 인간 아데노바이러스 혈청형 5 유도된 AdCMV-hcea 및 AdCMV-hgmcsf가 인간 293 세포에서 생성된다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서-프로모터 요소에 의해 유도된, 인간 CEA 유전자 또는 인간 GM-CSF 유전자를 함유하는 카세트가 E1a 결실 대신 삽입된다. E1a 영역의 서열이 결실되었기 때문에, 비허용 세포에서 자발적으로 복제하는 이러한 바이러스의 능력은 손상된다.

결과(Tang et al., 1997)는 C57BL/6 계통 마우스의 96%(23/24)가 AdCMV-hcea의 피부-표적화된 비-침입성 전달 1개월 후에 인간 CEA 단백질에 대한 항체를 생성하고, 동일한 계통의 마우스의 43%(6/14)가 AdCMV-hgmcsf의 피부-표적화된 비-침입성 전달 후에 인간 GM-CSF 단백질에 대한 항체를 생성함을 나타낸다. NIVS 전에 수집된 예비-면역 혈청과 나이브(naive) 동물로부터의 혈청은 모두 인간 CEA 및 GM-CSF 단백질과 반응하지 않았다. 벡터를 그루밍을 통해 흡입함에 의한 경구 백신접종의 가능성은 (1) 동물이 마취에서 회복되기 전에 벡터를 피부로부터 세정하고, (2) 벡터를 비-면도 피부에 피펫팅하며, (3) 나이브 및 백신접종된 동물을 동일 우리에서 혼합함으로써 배제된다. 나이브 및 백신접종된 마우스 간의 교차-백신접종은 관찰되지 않았고, 면도는 아마도 면도 경로를 따르는 각화 상피의 기계적 제거 때문에 NIVS를 위한 필수 요소인 것 같다. 따라서, 아데노바이러스-매개 NIVS는 벡터에 의해 암호화된 항원에 대한 체액성 면역반응을 도출할 수 있다.

실시예 4

본 발명의 기술이 보호성 항종양 면역반응을 도출할 수 있는지를 입증하기 위해, 인간 카시노엠브리오닉 항원(CEA) 유전자(MC38-CEA-2)(Conry et al., 1995)를 발현하는 유전적 동계의 종양 세포를 나이브 C57BL/6 계통 마우스 및 인간 CEA 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터(AdCMV-hcea)의 국소 적용으로 백신접종된 동일한 계통의 마우스에 접종한다. 종양 챌린지에 가해진 동물이 생존하는지를 관찰한다(도 4). 대조 그룹에서, 동물의 90%(9/10)가 촉진할 수 있는 종양 혹을 발달시켰고 종양 세포 이식 30일 후에 사망하였다. 백신접종된 그룹에서, 동물의 10%(1/10)만이 사망하였고, 70%(7/10)는 종양이 전혀 없었다. 종양이 직경 1 cm를 초과하면 마우스를 마취한다. 종양 세포 주입과 마취 사이의 간격이 각 생존 시간으로 사용된다. 도 4에 있어서, 대조 마우스(백신이 투여되지 않음) 및 NIVS로 면역된 동물(AdCMV-hcea 10⁸pfu가 전체적으로 1개월 전에 적용됨)을 종양 챌린지에 가한다. 괄호의 숫자는 각 처리의 동물 마리수를 나타낸다. 결과는 유전자 벡터의 피부에의 비-침입성 전달이 특이적 항원을 발현하는 종양 세포에 대한 보호성 면역반응을 도출할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5

사이토킨 및 공-자극 유전자를 암호화하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 작제

공-자극 및 사이토킨 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터가 백신접종된 동물에서 면역 프로파일을 안내하고자 항원 유전자와 이러한 면역-조절 유전자를 피부 세포에 동시-전달하기 위해 작제된다. 쥐 B7-1 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터 AdCMV-mB7.1 및 쥐 GM-CSF 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터 AdCMV-mgmcsf를 인간 293 세포에서 두 형질감염된 플라스미드 간의 상동성 재조합, 이어서 신규 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 표준 과정으로 작제한다(Gomez-Foix et al., 1992). 이러한 벡터에서 모든 트랜스진은 CMV 초기 인핸서/프로모터 요소에 의해 전사 유도된다. AdCMV-mB7.1은 형질도입된 인간 폐 암종 SCC-5 세포를 항-CD80 항체(PharMingen)로 염색한 다음, 플로우 사이토메트리 분석함으로써 특징규명된다. AdCMV-mgmcsf는 형질도입된 SCC-5 세포로부터 분비된 쥐 GM-CSF를 ELISA 키트(Amersham)로 측정함으로써 특징규명된다.

실시예 6

시험관내 세포독성 분석에 의한 항종양 면역의 검출

표적 세포가 단층으로 마우스의 근육 조직에 이식되는 시험관내 세포독성 분석이 개발되었다(Tang et al., 1996). 단층으로 표적 세포의 이식은 시험관내 성장 며칠 후에 이들의 사멸을 평가하기 위한 표적 세포의 효율적인 회복을 허용한다. 이 분석은 표적 세포를 근절하기에 충분한 효능이 없는 약한 면역반응을 검출하기에 특히 유용하다. 면역반응은 이식층의 조직학적 분석으로 특징규명될 수 있다. 면역반응이 없으면, 표적 세포가 성장할 것이다. 잠재적인 면역반응으로, 표적 세포는 아마도 성장하는 표적 세포로의 이동 및 이 주위에서의 현장 감작화에 의해, 이식층에서 다수의 면역 효과기 세포의 존재하에 근절될 것이다. 약한 면역반응으로, 성장하는 표적 세포는 이식층에서 침윤성 면역 효과기 세포와 혼합될 것이다. 나이브 C57BL/6 마우스에 5 ×10⁵RMI-luc 세포(루시퍼라제 유전자를 발현하는 RMI 전립선 종양 세포)의 단층으로의 이식은 면역 개입의 증거 없이, 시험관내 RMI-luc 세포의 증식 때문에 종양 층을 초래한다. 대조 동물과 반대로, RMI-luc 세포는 AdCMV-luc의 피부-표적화된 비-침입성 전달에 의해 백신접종된 동물의 이식층에서 다수의 면역 효과기 세포와 혼합된다.

실시예 7

종양 세포에 의해 보충된 면역 효과기 세포의 특징규명

시험관내 세포독성 분석은 소수의 표적 세포를 근육에 단층으로 이식함으로써 이식층에서 다수의 면역 효과기 세포를 농축할 수 있다. 이식층에서 특정 면역 효과기 세포의 특징규명은 세포-매개 면역반응이 사멸 표적 세포에 대해 도출되는지에 대한 증거를 제공할 수 있다. AdCMV-luc의 피부-표적화된 비-침입성 전달에 의해 백신접종된 동물에서 루시퍼라제-발현 종양 세포에 의해 보충되는 T 세포를 특징규명하기 위해, 이식층의 조직 단편을 항-CD3 모노클로날 항체(mAb)로 염색한다. RMI-luc 세포를 pHBA-luc DNA를 RMI 전립선 종양 세포(Baylor College ofMedicine의 T. Thompson에 의해 제공)로 리포펙팅한 다음, G418을 함유하는 배지에서 선택함으로써 생성한다. 루시퍼라제를 발현하는 클론은 루시퍼라제 분석으로 특징규명된다. 5 ×10⁵RMI-luc 세포를 AdCMV-luc 10⁸pfu의 피부-표적화된 비-침입성 전달에 의해 백신접종된 마우스에 단층으로 이식한다. 이식 5일 후에, 이식층을 색원체로서 디아미노벤지딘으로의 ABC 면역퍼옥시다제 과정을 통해, O.C.T.에서 동결하고 단편을 4 ㎛로 절단하여, 100% 아세톤으로 건조시킨 다음, 항-CD3 mAb(UAB의 P. Bucy에 의해 제공된 클론 F500A2)로 염색한다.

도 5에 도시된 것처럼, 다수의 T 세포가 AdCMV-luc의 피부-표적화된 비-침입성 전달에 의해 백신접종된 마우스에서 RMI-luc 세포의 생체내 성장 5일 후에 이식층으로 침윤하고(150배) 반면 나이브 동물에서는 소수의 T 세포만이 발견되었다. 동수의 RMI-luc 표적 세포가 나이브 동물에서보다는 백신접종된 동물에서 이식층에 더욱 많은 T 림프구를 보충할 수 있는 것 같다.

표적 세포에 의해 보충되는 CTL을 특징규명하기 위해, 이식층의 동결 단편을 탐침으로서 안티센스 그랜자임 A RNA 분자를 사용하는 현장 하이브리드화에 가한다. 5 ×10⁵RMI-luc 세포를 나이브 C57BL/6 마우스 또는 AdCMV-luc 10⁸pfu의 피부-표적화된 비-침입성 전달에 의해 백신접종된 마우스에 단층으로 이식한다. 이식 5일 후에, 이식층을 O.C.T.에서 동결하고 단편을 4 ㎛로 절단한다. 동결 단편을 3% 파라포름알데하이드로 고정시키고, 내생성 알칼리성 포스파타제 활성을 억제하기 위해 0.2 M HCl에서 배양하며, 열-변성 안티센스 그랜자임 A RNA 탐침과 하이브리드화시킨다. 현장 하이브리드화를 위한 탐침은 박테리오파지 프로모터를 함유하는 플라스미드로부터 전사에 의해 생성된 일본쇄 RNA 분자이다. 전사 중에, 디작시게닌-UTP는 서열에 직접 도입된다. 센스 서열 탐침이 음성 대조로서 사용된다. 탐침과의 하이브리드화 후에, 단편을 세척하고 알칼리성 포스파타제-접합 항-디작시게닌 항체와 함께 배양한 다음, NBT/BCIP 효소 기질 용액에서 배양한다.

그랜자임 A를 발현하는 CTL은 활성화된 CTL이고 이식 중에 조직 거부반응을 위한 예견 마커로 사용된다. 그랜자임-양성 CTL은 AdCMV-luc의 피부-표적화된 비-침입성 전달에 의해 백신접종된 동물에서만 RMI-luc 이식층에서 발견된다(도 6). 층에 이의 존재는 특정 항원을 발현하는 종양 세포에 대한 세포-매개 면역반응이 NIVS에 의해 유도될 수 있음을 설명해준다.

실시예 8

반창고에 의한 유전자 백신의 국소 적용

붕대가 백신의 투여를 위해 사용될 수 있음이, 최초로 입증되었다. 이 발견은 개인이 의학적 훈련 없이 비-침입성 백신의 균일량을 피부에 전달함을 허용할 수 있다. 피부를 붕대로 형질도입하기 위해, 실시예 7에 설명된 AdCMV-luc 벡터 50 ㎕를 반창고의 패드에 피펫팅한다(Johnson & Johnson). 벡터-함유 붕대를 이어서 마우스의 사전-면도 피부에 부착한다. 벡터를 18시간 동안 노출된 피부와 접촉시킨다. 붕대에 의해 전달된 유전자 벡터로부터의 트랜스진 발현을 검출하기 위해, 피부를 루시퍼라제에 대해 분석한다(표 1). 결과는 상당한 차이를 보이지만, 피부에서의 트랜스진 발현은 반창고를 사용하여 달성된다.

동물이 비-침입성 반창고로 백신접종될 수 있음을 입증하기 위해, 미부 출혈로부터의 혈청을 AdCMV-hcea를 함유하는 붕대를 마우스의 피부에 부착하고 2개월 후에 항-CEA 항체에 대해 분석한다. 도 7에서 나타난 것처럼, 항-CEA 항체는 반창고를 통해 비-침입성 백신을 투여받은 마우스의 100%(10/10)에서 검출된다.

실시예 9

DNA/아데노바이러스-매개 NIVS

아데노바이러스계 벡터를 플라스미드 DNA를 아데노바이러스의 외피에 결합시킴으로써 더욱 융통적으로 제조할 수 있다. 생성 벡터 시스템은 다양한 표적 세포에의 고-효율 유전자 전달을 매개한다. 이 접근법은 외래 유전자의 크기 및 디자인 측면에서 상당히 증가한 융통성을 허용한다. DNA/아데노바이러스 복합체는 따라서 더욱 융통적으로 동일한 아데노바이러스 수용체-매개 엔도사이토시스 경로를 통해 피부에 항원 유전자를 전달할 수 있다.

DNA/아데노바이러스-매개 NIVS의 가능성을 입증하기 위해, 인간 성장 호르몬을 암호화하는 플라스미드 DNA(pCM-G11)(Tang et al., 1992)를 E4-결손 아데노바이러스와 복합체를 형성하게 한다. 마우스(계통 C57BL/6)를 DNA/아데노바이러스 복합체와 노출된 피부를 하루 동안 접촉시킴으로써 백신접종한다. 면역된 동물은 이어서 미부-출혈로부터의 혈청을 평가함으로써 인간 성장 호르몬 단백질(hgH)에 대한 항체의 생성이 모니터된다. 도 8a에 나타난 것처럼, 레인 1, hGH(0.5 ㎍); 레인 2, BSA(0.5 ㎍), 웨스턴 블롯에서 시험 혈청은 정제된 hGH와 반응하지만, 상관없는 단백질과는 반응하지 않는다. DNA/아데노바이러스 복합체로 백신접종된 10 마리의 마우스 중에서, 8마리(80%)가 3개월 내에 hGH에 대한 항체를 생성하였고, 이는 아데노바이러스와 복합체를 형성하는 플라스미드 DNA에 의해 암호화되고 비-침입성 방식으로 투여되는 외생성 단백질에 대한 특이적 항체가 생성될 수 있음을 의미한다. 처리 전에 수집된 예비-면역 혈청, 비처리 동물로부터의 혈청 및 상관없는 벡터로 백신접종된 동물로부터의 혈청 모두 hGH와 반응하지 않았다. 따라서, 아데노바이러스 재조합체처럼, DNA/아데노바이러스 복합체도 NIVS를 위한 정당한 벡터 시스템인 것 같다.

실시예 10

DNA/리포솜-매개 NIVS

비-침입성 백신을 위한 담체로서 아데노바이러스를 포함하는 유전자 벡터의 개발 외에, 또한 마우스가 바이러스 성분 없이 DNA/리포솜 복합체의 국소 적용에 의해 백신접종될 수 있음이 입증되었다. 다수의 상이한 벡터가 피부-표적화된 비-침입성 백신의 투여를 위한 독창적인 방법으로 적용될 수 있음이 명백하다. 도 8b에 나타난 것처럼, 레인 1, hGH(0.5 ㎍); 레인 2, BSA(0.5 ㎍), hGH를 암호화하는 DNA/리포솜 복합체의 국소 적용에 의해 면역된 마우스로부터의 시험 혈청은 hGH와는 반응하지만 BSA와는 반응하지 않는다. DNA/리포솜 복합체로 백신접종된 10 마리의 마우스 중에서, 9마리(90%)의 처리된 동물의 시험 혈청이 5개월 내에 정제된 hgH와 반응한다. 따라서, 아데노바이러스 및 DNA/아데노바이러스 복합체처럼, DNA/리포솜 복합체도 NIVS를 위한 또다른 정당한 벡터 시스템인 것 같다.

실시예 11

DNA-암호화된 및 아데노바이러스-암호화된 트랜스진의 동시-발현

면역 시스템의 반응을 증대시키기 위한 전략은 잠재적으로 백신의 임상적 결과를 개선할 수 있다. 림프구 모집단의 활성화 및 확장에 관여하는 면역-조절 분자의 국소적 생성은 백신접종 효능을 상당히 개선할 수 있다. 쥐 B7-1 및 GM-CSF 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터가 작제되었다. 따라서 DNA/아데노바이러스 복합체의 국소 적용은 항원에 대한 면역반응을 증대시키기 위해 각 피부 세포에서 DNA-암호화 항원 또는 면역 조절 분자와 아데노바이러스-암호화 항원 또는 면역 조절 분자를 동시-발현할 수 있다.

도 9는 표적세포내 플라스미드 DNA로부터의 트랜스진 발현이 아데노바이러스의 존재에 의존하며, 따라서 플라스미드-암호화 및 아데노바이러스-암호화 트랜스진이 표적세포에서 동시 발현되게 함을 보여준다. pVR-1216 플라스미드 DNA(Vical 제공), AdCMV-βgal 입자 및 폴리라이신을 도면에 나타낸 바와 같이 특정 비로 혼합한다. 복합체를 웰 중의 2 X 10⁵SCC-5 세포에 적용한 다음 2시간 동안 배양한다. 이어서, 복합체를 제거하고 세포를 익일에 루시퍼라제 및 β-갈락토시다제 분석을 위해 수거한다. 흰색 칼럼: 루시퍼라제 활성; 사선 칼럼: β-갈락토시다제 활성. 결과는 DNA-암호화된 트랜스진이 아데노바이러스의 부재하에서는 표적세포에서 발현되지 않고, 반면에 아데노바이러스-암호화된 트랜스진은 DNA의 존재하에 발현될 수 있음을 보여준다. DNA를 상이한 세포형의 표적화를 위해 타 바이러스의 표면 상에 응축시킬 수 있다는 것도 가능하다. 따라서, 이러한 프로토콜은 바이러스 재조합 및 외부-결합 플라스미드 양자 모두로부터의 트랜스진의 발현을 동시에 허용하는 간단하지만 다용도의 유전자 전달 시스템을 제공한다.

실시예 12

국소 적용에 의한 상이한 유전자 벡터로부터 피부에서의 상대적인 트랜스진 발현

아데노바이러스 재조합체, DNA/아데노바이러스 복합체, DNA/리포솜 복합체, 및 아마도 다수의 타 유전자 벡터 모두가 비-침입성 백신을 위한 담체로서 적용될 수 있는 것으로 나타났다. 트랜스진 발현에 대한 효율이 높을수록, 담체가 더 강력해질 것임을 상상할 수 있다. 사용된 벡터, 아데노바이러스 재조합체에 대한 상대 효율을 정의하기 위하여, DNA/아데노바이러스 복합체, 또는 DNA/리포솜 복합체를 18시간 동안 국소 적용에 의해 마우스 피부에 접촉되게 한다. 이어서, 처리된 피부를 동물로부터 제거하고 Promega 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하여 2분간 적산 광 방출의 측정에 의해 루미노미터로 루시퍼라제 활성에 대해 분석한 다음. 백그라운드를 판독치로부터 감한다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 아데노바이러스 재조합체는 피부-표적화된 비-침입성 유전자 전달에 가장 효율적인 벡터인 것으로 나타났다. 모의-처리된 마우스는 피부에서 검출가능한 루시퍼라제 활성을 생성하지 않았다. L.U. 광 단위; Ad. AdCMV-luc; DNA/Ad, Ad dl1014와 복합체를 형성한 pVR-1216 DNA; DNA/리포솜, DOTAP/DOPE와 복합체를 형성한 pVR-1216 DNA. 결과는 평균로그(LU/cm²피부)±SE(n은 각 칼럼의 상단에 표시)이다. 비록 DNA/아데노바이러스 복합체의 효율이 아데노바이러스 재조합체의 것보다 낮지만, DNA/리포솜 복합체의 것보다는 현저히 더 높다. 또한, 아데노바이러스는 생존 가능한 바이러스 입자가 전파되는 것을 막기 위해 DNA와 복합체를 형성하기 전에 UV 또는 감마선으로 불활성화시킬 수 있다. 따라서, 신세대 백신의 조제시 효율과 안전성 인자 모두가 고려될 경우에 DNA/아데노바이러스 복합체는 비-침입성 백신의 전달을 위한 가장 유망한 담체 시스템인 것으로 보일 수 있다.

실시예 3

인플루엔자 항원을 암호화하는 발현 벡터의 작제

A/PR/8/34 HA 유전자를 암호화하는 E1/E3-결손 아데노바이러스 재조합체(AdCMV-PR8.ha)는 문헌(Gomez-Foix et al., 1992)에 기재된 바와 같이 작제한다. 간단히 말해서, HA에 대한 전체 암호화 서열을 함유하는 1.8 kb BamH1 단편을 플라스미드 pDP122B[아메리칸 타입 컬춰 컬렉션(ATCC)]로부터 절단한 다음 pACCMV.PLPA의 BamH1 부위에 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터의 전사 조절하에 정확한 배향으로 삽입시킨다. HA를 암호화하는 생성되는 플라스미드를 플라스미드 pJM17과 함께 인간 293 세포 중으로 공-형질감염시켜 E1/E3-결손 아데노바이러스 재조합체를 생성시킨다. A/PR/8/34 핵 단백질(NP) 유전자를 암호화하는 E1/E3-결손 아데노바이러스 재조합체(AdCMV-PR8.np)는 NP 유전자(Merck 제공)를 pACCMV.PLPA 중으로 클로닝시킨 다음, 전술한 바와 같이 293 세포에서 상동 재조합에 의해 작제된다.

HA 및 NP 유전자를 각각 pVR1012(Vical 제공) 중으로 클로닝시킴으로써 HA를 암호화하는 플라스미드 발현 벡터(pCMV-PR8.ha) 및 NP를 암호화하는 다른 하나(pCMV-PR8.np)를 작제한다.

실시예 14

마우스에 아데노바이러스계 백신의 국소 적용 및 비내 접종에 의해 생성된 항-인플루엔자 항체

도 12에 나타낸 바와 같이, BALB/c 마우스(3개월령)를 DNA의 근육내 주사, 아데노바이러스 벡터의 비내 접종, 및 아데노바이러스계 백신 팻치의 국소 적용을 포함한 다양한 백신접종 양식으로 면역시킨다. 피부-표적화된 비-침입성 백신접종은 아데노바이러스 벡터를 미리 면도한 복부 피부에 피펫팅한 다음 벡터를 박막으로서 노출된 피부에 Tegaderm 팻치(3M) 조각으로 피복함으로써 수행된다. 흡수되지 않은 벡터를 1시간 후에 씻어 낸다. 모든 동물을 3주마다 3회 면역시킨다. 최종 부스트 1주일 후에 혈청 샘플을 항-인플루엔자 항체에 대해 분석한다. 포획 항원으로서 정제된 A/PR/8/34 바이러스를 사용하여 문헌(12)에 기술된 바와 같이 ELISA로 항-인플루엔자 IgG의 역가를 측정한다. 혈청 샘플과 퍼옥시다제-접합 염소 항-마우스 IgG(Promega)를 각각의 배양 사이에 철저한 세척과 함께 실온에서 1시간 동안 플레이트 상에서 순차적으로 배양시킨다. 종점은 예비면역 혈청의 1/100 희석비와 동일한 OD₄₉₀을 생성하는 혈청의 희석비로서 계산된다. 시험된 최저 희석비에서 음성인 혈청을 종점 역가 100으로 부여한다. 후-면역 혈청도 저 수준에서 대조 항원(예를 들면, BSA)과 반응하였다. 아마도 세포 표면 결합 차단에 의한 것으로 보이는, 바이러스에 의한 적혈구(RBC) 응집 억제를 위한 항-HA 항체의 능력을 측정하기 위하여 혈구응집 억제(HI) 분석을 수행한다. 닭 RBC로 미리 흡수한 혈청 샘플을 희석시킨 다음 4 HA 단위의 인플루엔자 A/PR/8/34와 혼합한다. 이어서, 닭 RBC를 최종 농도 0.5%로 가한다. 가시적인 검사에 의해 응집을 측정한다. 역가는 억제 한계인 희석비로 정의된다. 모든 예비면역 혈청은 역가가 20 이하이다. 그룹 1, 2.5 X 10⁷pfu 야생형 아데노바이러스 혈청형 5의 비내 접종에 이은 2주 후 10⁸pfu AdCMV-PR8.ha 및 10⁸pfu AdCMV-PR8.np의 국소 적용(n=9); 그룹 2, 2.5 X 10⁷pfu 야생형 아데노바이러스 혈청형 5의 비내 접종에 이은 2주 후 100 ㎍ pCMV-PR8.ha DNA 및 100 ㎍ pCMV-PR8.np DNA의 근육내 주사(n=10); 그룹 3, 2.5 X 10⁷pfu 야생형 아데노바이러스 혈청형 5의 비내 접종에 이은 2주 후 2.5 X 10⁷pfu AdCMV-PR8.ha 및 2.5 X 10⁷pfu AdCMV-PR8.np의 비내 접종(n=8); 그룹 4, 10⁸pfu AdCMV-PR8.ha 및 10⁸pfu AdCMV-PR8.np의 국소 적용(n=10); 그룹 5, 10⁸pfu AdCMV-PR8.np의 국소 적용(n=10); 그룹 6, 10⁸pfu AdCMV-PR8.ha의 국소 적용(n=10); 그룹 7, 100 ㎍ pCMV-PR8.ha DNA 및 100 ㎍ pCMV-PR8.np DNA의 근육내 주사(n=10); 그룹 8, 2.5 X 10⁷pfu AdCMV-PR8.ha 및 2.5 X 10⁷pfu AdCMV-PR8.np의 비내 접종(n=9). 데이터는 기하 평균 종점 역가로 플로팅하였다. 나이브한 대조군에서(n=7), 항-인플루엔자 항체는 검출 불가였다. 분산(ANOVA) 조사의 분석을 이용하여 ELISA와 HI 역가의 차이를 비교한다. 전체 알파 수준을 0.05로 고정한 Tukey 절차로 다양하게 쌍을 이뤄 비교한다. 분석은 ANOVA 조사에 의해 요구된 일정 분산 가정을 충족하도록 측정의 로그 스케일로 수행된다. 8 그룹 간에 ELISA와 HI 역가의 차이는 유의하다(P＜0.0001). 그룹 8에서의 ELISA 역가는 타 그룹에서의 것보다 현저히 더 높았다(P＜0.02). 그룹 1에서의 평균 ELISA 역가는 최저였지만 그룹 5 또는 6에서의 것과는 상당히 상이하지 않았다. 그룹 8에서의 HI 역가는 최대였고 그룹 3에서는 두번째로 최대였다. 그룹 1, 2, 4, 5, 및 6에서의 HI 역가치는 유의미할 정도로 상이하지 않았다.

실시예 15

바이러스 챌린지에 따른 사망으로부터 마우스의 보호

도 13에 나타낸 바와 같이, BALB/c 마우스(3개월령)를 DNA의 근육내 주사, 아데노바이러스 벡터의 비내 접종, 및 아데노바이러스계 백신 팻치의 국소 적용을 포함한 다양한 백신접종 양식으로 면역시킨다. 피부-표적화된 비-침입성 백신접종은 아데노바이러스 벡터를 미리 면도한 복부 피부에 피펫팅한 다음 벡터를 박막으로서 노출된 피부에 Tegaderm 팻치(3M) 조각으로 피복함으로써 수행된다. 흡수되지 않은 벡터를 1시간 후에 씻어 낸다. 모든 동물을 3주마다 3회 면역시킨다. 최종 부스트 1주일 후에 마우스를 치사량의 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34(1,000 HA 단위)로 챌린지시킨 다음 매일 생존에 대해 모니터한다. 데이터는 챌린지 후 % 생존 바이러스로서 플로팅하였다. Naive Control, 아데노바이러스에 노출시키지 않은 나이브 마우스; 그룹 1, 2.5 X 10⁷pfu 야생형 아데노바이러스 혈청형 5의 비내 접종에 이은 2주 후 10⁸pfu AdCMV-PR8.ha 및 10⁸pfu AdCMV-PR8.np의 국소 적용; 그룹 2, 2.5 X 10⁷pfu 야생형 아데노바이러스 혈청형 5의 비내 접종에 이은 2주 후 100 ㎍ pCMV-PR8.ha DNA 및 100 ㎍ pCMV-PR8.np DNA의 근육내 주사; 그룹 3, 2.5 X 10⁷pfu 야생형 아데노바이러스 혈청형 5의 비내 접종에 이은 2주 후 2.5 X 10⁷pfu AdCMV-PR8.ha 및 2.5 X 10⁷pfu AdCMV-PR8.np의 비내 접종; 그룹 4, 10⁸pfu AdCMV-PR8.ha 및 10⁸pfu AdCMV-PR8.np의 국소 적용; 그룹 5. 10⁸pfu AdCMV-PR8.np의 국소 적용; 그룹 6, 10⁸pfu AdCMV-PR8.ha의 국소 적용; 그룹 7, 100 ㎍ pCMV-PR8.ha DNA 및 100 ㎍ pCMV-PR8.np DNA의 근육내 주사; 그룹 8, 2.5 X 10⁷pfu AdCMV-PR8.ha 및 2.5 X 10⁷pfu AdCMV-PR8.np의 비내 접종. AdCMV-PR8.ha, A/PR/8/34 헤마글루티닌을 암호화하는 아데노바이러스 벡터; AdCMV-PR8.np, A/PR/8/34 핵 단백질을 암호화하는 아데노바이러스 벡터; pCMV-PR8.ha, A/PR/8/34 헤마글루티닌을 암호화하는 플라스미드 발현 벡터; pCMV-PR8.np, A/PR/8/34 핵 단백질을 암호화하는 플라스미드 발현 벡터. 괄호 안의 수는 각각의 처리에 대한 동물수를 나타낸다.

야생형 아데노바이러스에의 사전 노출은 이러한 양식의 백신접종을 방해하지 않았다. 상 1 최종 리포트에서 알 수 있는 바와 같이, 인플루엔자 A/PR/8/34에 대한 고수준의 중화 항체는 아데노바이러스에 사전 노출시킨 동물에서도 이들 벡터의 비내 접종에 의해 도출될 수 있다. 결과는 동물이 아데노바이러스 재조합체의 비내 접종에 의해 면역될 때 주로 체액성 면역반응에 의해 보호가 매개될 수 있음을 암시한다. 비내 경로와는 대조적으로, AdCMV-PR8.ha 및 AcCMV-PR8.np의 국소 적용에 의해 면역된 동물에게는 챌린지로부터 71% 보호가 제공되었다. 그러나, 아데노바이러스에 사전 노출시킨 동물은 NIVS(피부에의 비-침입성 백신 접종)에 의해 보호하는 데 실패하였다. 상 1 최종 리포트에서 알 수 있는 바와 같이, NIVS에 의해 면역된 동물은 인플루엔자 A/pR/8/34에 대한 비교적 저수준의 중화 항체를 생성하였다. 비내 백신에 의해 유도된 항체와 마찬가지로, NIVS에 의해 초래된 항-인플루엔자 항체의 생성은 아데노바이러스에의 사전 노출에 의해 방해되지 않았다. 결과는 동물이 NIVS로 면역될 때 보호 면역이 세포성 면역반응에 의해 매개될 수 있고, 이러한 면역학적 메커니즘이 벡터에 대한 기존 면역성에 의해 억제될 수 있음을 암시한다. 호흡기 문제로 인한 합병증 없이 비내 백신을 투약할 수 있는 환자의 경우, 면역 시스템의 양팔 모두를 동시에 활성화하기 위한 일환으로 아데노바이러스계 외피 백신을 이의 비내 카운터파트와 함께 공동 투여하는 것이 적절할 수도 있다. 또한, 아데노바이러스에 대한 기존 면역성이 있는 동물을 백신접종하기 위하여 NIVS에 대한 비-면역원성 백신 담체를 개발하는 것 역시 긴급 요망된다.

실시예 16

NIVS에 의한 피그테일 짧은꼬리원숭이에서의 항-HA 항체 분비

비록 NIVS가 마우스에서 전신 면역반응을 재현가능하게 도출할 수 있지만(도 12 및 13), 벡터의 경피 확산이 백신접종을 위해 요구될 경우, 인간 피부가 쥐 피부보다 두껍기 때문에, NIVS가 인간을 면역시킬 수 없을 수도 있다. 그러나, 요구되는 모든 것이 피부의 외층내 세포에서의 항원 발현의 일시적이지만 생산적인 파동일 뿐이라면 비-침입성 백신 팻치는 두꺼운 피부의 인간이나 타 동물도 면역시킬 수 있다. 이러한 이슈에 역점을 두어 다루기 위해, 피그테일 짧은꼬리원숭이를 비-침투식으로 AdCMV-PR8.ha로 면역시켰다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 면역된 동물은 4주 후 HA에 대한 항체를 생성하였다. 결과는 비-침입성 백신 팻치가 마우스 외에도 다수의 상이한 종을 면역시킬 수 있다는 증거를 제공한다.

도 14에서, 10¹⁰pfu의 AdCMV-PR8.ha를 미리 면도한 복부 피부에 피펫팅한 다음 벡터를 박막으로서 노출된 피부 위에 Tegaderm 팻치(3M)로 피복함으로써 피그테일 짧은꼬리원숭이를 면역시킨다. 비흡수 벡터를 5시간 후에 씻어 낸다. 혈청 샘플을 접종 4주 후 항-HA 항체에 대해 분석한다. 항-HA IgG의 역가는 포획 항원으로서 정제된 A/PR/8/34 바이러스를 사용하여 ELISA로 측정한다. 혈청 샘플과 퍼옥시다제-접합 염소 항-원숭이 IgG(Bethyl Laboratories, Inc.)를 각각의 배양 사이에 철저히 세척하면서 실온에서 1시간 동안 플레이트 상에서 순차적으로 접종한다. 종점은 예비면역 혈청의 1/100 희석비와 동일한 OD₄₉₀을 생성하는 혈청의 희석비로서 계산된다. 시험된 최저 희석비에서 음성인 혈청을 종점 역가 1로 할당한다.

실시예 17

비-침입성 양식으로 국소 유전자 전달 후 피부에서 루시퍼라제 스폿의 재위치선정

피부 표면으로 전달된 항원 유전자가 심부 조직 중으로 확산하여 표피 밑의 세포에서 발현할 수 있는 지를 측정하기 위한 일환으로, 목의 피부를 AdCMV-luc(루시퍼라제를 암호화하는 아데노바이러스 벡터)(Tang et al., 1997)와 배양한다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 루시퍼라제 활성이 목의 피부 상으로 AdCMV-luc의 비-침입성 전달 1일 후 일부 처리된 동물의 귀에서(또는 피부의 타 지역에서 불연속 루시퍼라제 스폿으로서) 검출될 수 있다. 루시퍼라제는 림프절, 간, 비장, 심장, 폐 및 신장을 포함한 내부 장기에서 검출 불가였다.

도 15에서, 1 X 10⁸pfu의 AdCMV-luc를 목의 피부와 1시간 배양한다. 목의 피부 및 귀를 접종한지 1일 후에 기술된 바와 같이(Tang et al., 1994) 루시퍼라제 분석을 위해 수거한다. 수치는 판독치로부터 백그라운드를 감한 광 단위를 나타낸다.

국소-적용된 아데노바이러스 벡터로부터 트랜스진을 발현할 수 있는 표적 세포, 및 트랜스진으로부터 발현된 단백질을 함유하는 추정상의 이동성 세포를 동정하고 성상확인하기 위한 추가의 일환으로, AdCMV-βgal(β-갈락토시다제를 암호화하는 아데노바이러스 벡터)(Tang et al., 1994)의 국소 적용 후 피부 절편을 X-gal로 염색한다. 암청색 세포의 연구에서 조직학적 절편을 검사함으로써, 벡터를 비-침입성 양식으로 접종하였을 때 모낭내 표지된 헤어 매트릭스 세포 및 표피 최외각층내 표지된 케라틴 생성 세포를 아데노바이러스-매개 형질도입을 위한 주 표적세포로서 동정하였다(요청시 사진 입수가능). 피부 섬유아세포 어느 것도 이러한 절차에 의해 형질도입되지 않았지만, AdCMV-βgal이 니들을 이용하여 피내 주사하였을 때 이들 세포는 매우 형질도입 가능하였다(요청시 사진 입수가능). 결과는 국소 적용된 소수의(있을 경우) 아데노바이러스 입자가 표피의 외층 밑의 진피 중으로 침투할 수 있음을 암시한다. 조직학적 절편의 현미경 검사로는 형질도입된 피부의 어떠한 물리적 마손도 밝혀내지 못하였다. 거시적으로는, 처리된 피부와 관련된 어떠한 염증도 존재하지 않았다. 그러나, 형질도입된 세포는 접종 지역(예를 들면, 목의 피부) 내에서만 관찰될 수 있을 뿐이었다. 루시퍼라제 활성이 귀 또는 피부내 타 영역에서 검출될 수 있을 때 이러한 영역내에서 암청색 세포를 동정할 수 없었는데(도 4), 아마도 루시퍼라제 분석이 X-gal-매개 β갈락토시다제 분석보다 더 민감하기 때문인 것 같다. 본 출원인은 일부 항원-제시 세포(APC)가 항원을 획득함으로써 피부 표면에서 발현된 항원에 반응할 수 있으리라 가정하였다. 단백질은 신속히 분해될 수 있으므로, 림프절을 포함한 내부 장기로부터 검출될 수 없다. 피부내 항원의 이러한 재위치선정의 조직학적 중요성은 알려져 있지 않다.

실시예 18

비-침입성 양식으로 국소 유전자 전달 후 각종 조직에서 외래 DNA의 증폭

아데노바이러스 벡터의 국소 적용이 접종 지역 밑으로 외생성 DNA도 전달할수 있는지를 측정하기 위한 일환으로, 각종 조직으로부터 DNA를 추출한 다음, AdCMV-PR8.ha의 피부 중으로의 비-침입성 전달 후 PCR에 의해 아데노바이러스 유형 5 섬유 유전자 및 트랜스진을 증폭시켰다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 완전한 길이의 HA 및 섬유 유전자는 접종 3시간 후 피부로부터 증폭시킬 수 있다. 1일 후 피부 DNA 또는 타 조직으로부터 추출한 DNA에서는 통상적으로 완전한 길이의 유전자는 검출 불가였다. 그러나, HA 및 섬유 유전자 모두의 아단편을 간, 완전 혈액, 귀, 복부 피부, 또는 모아진 림프절로부터 상이한 프라이머 세트를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 접종 4주 후 조직 어디에서도 외래 DNA가 검출되지 않았다. 결과는 아데노바이러스 벡터의 국소 적용이 외생성 DNA를 피부내 국소 지역 중으로 전달할 수 있지만, 외래 DNA는 일부 추정상의 항원-제시 세포에 의해 신속히 획득되고, 분해된 다음, 심부 조직 중으로 재위치선정될 수 있음을 암시한다. 4주 뒤 외래 DNA의 제거는 NIVS의 안전성을 두드러지게 한다. 도 16에서, AdCMV-PR8.ha 및 AdCMV-luc를 사전에 면도한 피부에 비-침입성 양식으로 접종한다. DNA를 DNAZOL(GIBCOBRI)로 추출한 다음, 하기의 프라이머 세트로 증폭시킨다:

Ha5.1: 5′-ATGAAGGCAAACCTACTGGT-3′(서열번호 1)

Ha3.1: 5′-GATGCATATTCTGCACTGCA-3′(서열번호:2)

Ha5.2: 5′-GTGGGGTATTCATCACCCGT-3′(서열번호 3)

Ha3.2: 5′-TGCATAGCCTGATCCCTGTT-3′(서열번호 4)

Luc5.1: 5′-GCGCCATTCTATCCTCTAGA-3′(셔얼번호 5)

Luc3.1: 5′-ACAATTTGGACTTTCCGCCC-3′(서열번호 6)

Luc5.2: 5′-GTACCAGAGTCCTTTGATCG-3′(서열번호 7)

Luc3.2: 5′-CCCTCGGGTGTAATCAGAAT-3′(서열번호 8)

Fb5.1: 5′-CCGTCTGAAGATACCTTCAA-3′(서열번호 9)

Fb3.1: 5′-ACCAGTCCCATGAAAATGAC-3′(서열번호 10)

Fb5.2: 5′-GGCTCCTTTGCATGTAACAG-3′(서열번호 11)

Fb3.2: 5′-CCTACTGTAATGGCACCTGT-3′(서열번호 12)

Ha5.1 및 Ha3.1은 거의 완전한 길이의 1.7 kb HA 유전자를 증폭하고; Ha5.2 및 Ha3.2는 HA 유전자의 33%를 포함하는 0.6 kb 아단편을 증폭하며; Luc5.1 및 Luc3.1은 거의 완전한 길이의 1.7 kb 루시퍼라제 유전자를 증폭하며; Luc5.2 및 Luc3.2는 루시퍼라제 유전자의 30%를 포함하는 0.52 kb 아단편을 증폭하며; Fb5.1 및 Fb3.1은 거의 완전한 길이의 1.7 kb 아데노바이러스 유형 5 섬유 유전자를 증폭하며; Fb5.2 및 Fb3.2는 섬유 유전자의 32%를 포함하는 0.55 kb 아단편을 증폭한다. 레인 M, 분자량 마커(HindIII로 절단한 람다 DNA); 레인 1, NIVS 3시간 후 피부 DNA로부터 Luc5.1 및 Luc3.1에 의해 증폭된 거의 완전한 길이의 루시퍼라제 유전자; 레인 2, NIVS 1일 후 피부 DNA로부터 Luc5.1 및 Luc3.1에 의해 증폭된 거의 완전한 길이의 루시퍼라제 유전자; 레인 3, NIVS 1일 후 마우스의 귀 DNA로부터 Luc5.2 및 Luc3.2에 의해 증폭된 루시퍼라제 DNA의 아단편; 레인 4, NIVS 1일 후 림프절 DNA로부터 Luc5.2 및 Luc3.2에 의해 증폭된 루시퍼라제 DNA의 아단편; 레인 5, NIVS 1일 후 간 DNA로부터 Luc5.2 및 Luc3.2에 의해 증폭된 루시퍼라제 DNA의 아단편; 레인 6, NIVS 1일 후 완전 혈액으로부터 추출한 DNA로부터 Luc5.2 및 Luc3.2에 의해 증폭된 루시퍼라제 DNA의 아단편; 레인 7, NIVS 3시간 후 피부 DNA로부터 Ha5.1 및 Ha3.1에 의해 증폭된 거의 완전한 길이의 HA 유전자; 레인 8, NIVS 1일 후 피부 DNA로부터 Ha5.2 및 Ha3.2에 의해 증폭된 HA 유전자의 아단편; 레인 9, NIVS 1일 후 림프절 DNA로부터 Ha5.2 및 Ha3.2에 의해 증폭된 HA 유전자의 아단편; 레인 10, NIVS 1일 후 간 DNA로부터 Ha5.2 및 Ha3.2에 의해 증폭된 HA 유전자의 아단편; 레인 11, NIVS 1일 후 신장 DNA로부터 Ha5.2 및 Ha3.2에 의해 증폭된 HA 유전자의 아단편; 레인 12, NIVS 1일 후 완전 혈액으로부터 추출한 DNA로부터 Ha5.2 및 Ha3.2에 의해 증폭된 HA 유전자의 아단편; 레인 13, NIVS 3시간 후 피부 DNA로부터 Fb5.1 및 Fb3.1에 의해 증폭된 거의 완전한 길이의 섬유 유전자; 레인 14, NIVS 1일 후 피부 DNA로부터 Fb5.1 및 Fb3.1에 의해 증폭된 거의 완전한 길이의 섬유 유전자; 레인 15, NIVS 1일 후 피부 DNA로부터 Fb5.2 및 Fb3.2에 의해 증폭된 섬유 유전자의 아단편; 레인 16, NIVS 1일 후 귀 DNA로부터 Fb5.2 및 Fb3.2에 의해 증폭된 섬유 유전자의 아단편; 레인 17, NIVS 1일 후 림프절 DNA로부터 Fb5.2 및 Fb3.2에 의해 증폭된 섬유 유전자의 아단편; 레인 18, NIVS 1일 후 간DNA로부터 Fb5.2 및 Fb3.2에 의해 증폭된 섬유 유전자의 아단편; 레인 19, NIVS 1일 후 완전 혈액으로부터 추출한 DNA로부터 Fb5.2 및 Fb3.2에 의해 증폭된 섬유 유전자의 아단편. 서혜, 경부, 및 기관지 림프절을 DNAZOL 용액에 모음으로써 림프절로부터의 DNA를 추출한다. DNA를 35 사이클 동안 최적화된 어닐링 온도에서 Stratagene Robocycler 그래디언트 40 열 사이클러에서 증폭시킨다. 증폭된 DNA 단편을 1% 아가로스 겔에서 분별하여 에티듐 브로마이드로 염색한다.

실시예 19

탈모제는 NIVS에 요구되지 않음

NAIR(Tang et al., 1997)와 같은 탈모제가 NIVS에 필수적인지를 측정하기 위하여, NAIR를 이용하여 예비 처리하거나 하지 않은 백신 팻치로 도출된 항체 역가를 비교하였다. 도 17은 NAIR 예비처리 하지 않은 마우스에서의 항체 역가가 NAIR 예비처리한 카운터파트만큼 높음을 보여준다. NAIR의 제거는 NIVS 절차를 간소화시킨다.

도 17에서, 마우스를 10⁸pfu의 용량으로 피내(ID) 주사하거나, 10⁸pfu의 AdCMV-hcca(Tang et al., 1997)을 복부 피부에 피펫팅한 다음 벡터를 박막으로서 노출된 피부 위에 Tegaderm 팻치(3M) 조각으로 피복함으로써 비-침입성 양식(NIVS)으로 면역시킨다. 비흡수 벡터를 씻어 낸다. 혈청 샘플을 접종 4주 후에 항-CEA 항체에 대해 분석한다. 포획 항원으로서 정제된 인간 CEA(CalBiochem)을 사용하여 ELISA로 항-CEA IgG의 역가를 측정한다. 혈청 샘플과 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 IgG(Promega)를 각각의 배양 사이에 철저히 세척하면서 실온에서 1시간 동안 플레이트 상에서 순차적으로 배양한다. 종점은 예비면역 혈청의 1/100 희석비와 동일한 OD₄₉₀를 생성하는 혈청의 희석비로서 계산된다. 시험된 최저 희석비에서 음성인 혈청을 종점 역가 1로 할당한다. 데이터는 기하 평균 종점 ELISA 역가로서 플로팅하며, ID에 대해 n-4, 1시간에 대해 n-14, NAIR(-)에 대해 n-10, 및 NAIR/클립(-)에 대해 N-15, ID, 피내 주사; 1 hr, 벡터를 면도 및 NAIR 예비처리하여 1시간 동안 피부 외층과 접촉시킴; NAIR(-), 벡터를 면도를 하되 NAIR 예비처리 없이 밤새 피부 외층과 접촉시킴; NAIR/클립(-), 벡터를 면도와 NAIR 예비처리 없이 밤새 피부 외층과 접촉시킴.

실시예 20

도 18에 나타낸 바와 같이, BALB/c 마우스(3개월령)를 DNA의 근육내 주사, 아데노바이러스계 파상풍 백신의 국소 적용 또는 비내 접종을 포함한 다양한 백신접종 양식으로 면역시킨다. 피부-표적화된 비-침입성 백신접종은 대략 10⁸pfu AdCMV-tetC를 미리 면도한 복부 피부에 피펫팅한 다음 벡터를 박막으로서 노출된 피부에 Tegaderm 팻치(3M) 조각으로 피복함으로써 수행된다. 흡수되지 않은 벡터를 1시간 후에 씻어 낸다. 대략 10⁷pfu AdCMV-tetC를 비강 중으로 피펫팅함으로써 비내 백신을 투여한다. 모든 동물을 3주마다 3회 면역시킨다. 최종 부스트 1주일 후에 마우스에 치사량의 클로스트리디움 테타니를 발바닥에 주사하여 챌린지시킨 다음 생존에 대해 매일 모니터한다. 데이터를 챌린지 후의 % 생존 대 일수로 플로팅한다. Naive Control, 챌린지에 앞서 백신접종 하지 않은 나이브 마우스, AdtetC:NIVS, AdCMV-tetC의 국소 적용에 의해 면역된 마우스; Ad-tetC:IN, AdCMV-tetC의 비내 접종에 의해 면역된 마우스; pCMV-tetC:IM, 100 g pCMV-tetC DNA의 근육내 주사에 의해 면역된 마우스. AdCMV-tetC, 클로스트리디움 테타니 독소 C-단편을 암호화하는 아데노바이러스 벡터; pCMV-tetC, 클로스트리디움 테타니 독소 C-단편을 암호화하는 플라스미드 발현 벡터. 괄호 안의 수는 각각의 처리에 대한 동물수를 나타낸다.

비내 투여를 수반하는 본원의 실시예는 점막 투여를 통한 적당한 반응을 달성할 수 있고; 구강에서와 같은 점막이 투여 경로로 사용될 수 있으며, 예를 들면, 볼 및 설하 투여가 본 발명에 의해 구상되며 비내 투여를 수반하는 본 실시예를 통해 및 일반적인 교시에 의해 증명되고 논의됨을 좀더 자세히 설명한다.

따라서, 본 발명은 해당 항원 또는 에피토프 또는 면역 자극을 암호화하는 하나 이상의 유전자 삽입물을 함유하는 재조합 벡터 백신, 또는 재조합 백신으로부터의 유전자 산물을 구강의 볼 표면에 적용하는 것을 포함하며, 이에 따라 삽입된 유전자에 의해 암호화된 산물은 전염병에 대해 보호 또는 치료책일 수 있는 면역반응을 생성한다. 본 발명은 또한, 매트릭스 상으로, 내부로 혼입되거나 이에 부착되어, 면역을 위한 산물이 볼의 표면이나 구강 중으로 방출될 수 있는 담체 메커니즘을 형성하는, 그러한 재조합 벡터 백신 또는 재조합 백신의 유전자-산물을 포함한다. 본 발명은 또한, 면역을 위한 산물이 혼입되는 매트릭스가 생물학적 활성이거나 불활성일 수 있고 면역을 위한 산물의 보전성을 유지하는 물질로 이루어진 양태를 포함하며; 예를 들면, 매트릭스 물질은 생분해성인 글루코스나 기타 당류와 같은 중합체 물질, 또는 다른 생분해성 물질, 또는 폐기 가능하지만 생분해성이 아닐 수 있는 물질로 이루어질 수 있다.

붕대에 의해 전달된 유전자 벡터로부터의 트랜스진 발현의 검출(피부는 루시퍼라제에 대해 분석)

배양 시간(시간)	피부 1 cm2당 LU
1	0
1	2,100
2	0
2	0
2	6,200
2	7,300
2	13,000
2	48,000
2	1,800
2	13,000
18	830
18	2,400
18	260
18	630
18	1,300,000
18	2,4000
18	2,700
18	280

국소 적용 후 AdCMV-PR8.ha DNA 복제의 요약

시점 귓바퀴 복부 피부a림프절b비장 간 신장 혈액 근육c

I.거의 완전한 길이의 HA 유전자3시간 0/2 2/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/21일 0/3 2/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/21개월 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2II.HA 유전자의 아단편3시간 0/2 2/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/21일 1/3 3/3 3/3 1/3 2/3 2/3 2/3 2/31개월 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2III.거의 완전한 길이의 섬유 유전자3시간 0/2 2/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/21일 1/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/31개월 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2IV.섬유 유전자의 아단편3시간 0/2 2/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/21일 1/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/31개월 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2

마우스를 상기 실시예와 도면에, 예를 들면 도 1에 관한 설명에 기술된 바와 같이 AdCMV-PR8.ha의 국소 적용에 의해 마우스를 면역시킨다. 지정 시점에서, 전체 DNA를 조직으로부터 추출하여 상기 실시예와 도면에, 예를 들면 도 3에 관한 설명에서 기술된 바와 같이 특정 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭시킨다. 데이터는 분석된 동물의 총수당 특정 조직에 대한 검출 가능한 시그널을 함유하는 동물수로 제시하였다.^a투여 부위;^b모아진 림프절;^c뒷다리 대퇴 사두근.

근육내 주사 후 pCMV-PR8.ha DNA 재위치선정의 요약

시점 귓바퀴 복부 피부 림프절a비장 간 신장 혈액 근육b

I.거의 완전한 길이의 HA 유전자3시간 2/3 0/3 3/3 1/3 0/3 0/3 1/3 3/31일 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 1/3 0/3 0/31개월 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2II.HA 유전자의 아단편3시간 3/3 1/3 3/3 2/3 3/3 2/3 3/3 3/31일 2/3 1/3 2/3 1/3 3/3 2/3 2/3 3/31개월 1/2 1/2 2/2 1/2 1/2 0/2 0/2 1/2

마우스를 상기 실시예와 도면에, 예를 들면 도 1에 관한 설명에 기술된 바와 같이 pCMV-PR8.ha DNA의 근육내 주사에 의해 마우스를 면역시킨다. 지정 시점에서, 전체 DNA를 조직으로부터 추출하여 상기 실시예와 도면에, 예를 들면 도 3에 관한 설명에서 기술된 바와 같이 특정 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭시킨다. 데이터는 분석된 동물의 총수당 특정 조직에 대한 검출 가능한 시그널을 함유하는 동물수로 제시하였다.^a모아진 림프절;^b뒷다리 대퇴 사두근(투여 부위).

열-불활성화 아데노바이러스 벡터의 투여 후 AdCMV-PR8.ha DNA의 요약

시점 귓바퀴 복부 피부a림프절b비장 간 신장 혈액 근육c

I.거의 완전한 길이의 HA 유전자1일 0/3 1/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/2(3/7) (7/7) (1/7) (0/7) (0/7) (0/7) (0/7) (0/7)II.HA 유전자의 아단편1일 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3(4/7) (7/7) (2/7) (1/7) (1/7) (0/7) (0/7) (0/7)III.거의 완전한 길이의 섬유 유전자1일 0/3 2/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3(2/7) (6/7) (1/7) (0/7) (1/7) (0/7) (0/7) (0/7)IV.섬유 유전자의 아단편1일 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3(2/7) (7/7) (2/7) (0/7) (2/7) (1/7) (1/7) (0/7)

국소 적용 후 AdCMV-PR8.ha DNA 재위치선정의 요약:

AdCMV-PR8.ha 입자를 95℃에서 10분간 가열하여 불활성화시킨다. 상기 실시예와 도면에, 예를 들면 도 1에 관한 설명에서 기재된 바와 같이 국소 적용에 의해, 또는 니들을 사용하는 동등량의 벡터의 피내 주사에 의해 마우스에 벡터를 투여한다. 국소 유전자 전달 1일 뒤에, 전체 DNA를 각종 조직으로부터 추출한다. 거의 완전한 길이의 HA 및 섬유 유전자와 이들의 아단편을 도 3의 설명에 기재된 바와 같은 특정의 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 데이터는 분석된 동물의 총수당 특정 조직에 대한 검출 가능한 시그널을 함유하는 동물의 수로 제시하였다. 괄호가 없는 수는 국소 적용을 나타내고; 괄호 안의 수는 피내 주사를 나타낸다.

^a투여 부위;^b모아진 림프절;^c뒷다리 대퇴 사두근. 유의성: 벡터 DNA는 3종의 상이한 메커니즘에 의해 국소 적용 뒤 말단 조직으로 재위치선정할 수 있다:(1)확산에 의해 피부를 가로지른 전좌에 이어 순환에 의한 재위치선정, (2) 피부를 가로지른 전좌에 이어 항원-제시 세포(APC) 중으로 후속 세포흡수작용에 의한 흡수. (3)케라틴 생성 세포의 형질도입에 이은 APC 중으로 외생성 생체분자의 세포간 전달. 비록 열-불활성화 아데노바이러스 벡터가 아마도 필수 리간드(예를 들면, CAR 및 RGD 모티프)의 변성에 기인한 인간 293 세포에서의 세포병변 효과(CPE) 생성 실패에 의해 보여지는 바와 같이 세포를 형질도입할 수 없지만, 확산이 일어난다면 생 벡터가 확산되듯 이들도 여전히 피부 중으로 확산될 수 있어야 한다. 결과는 NIVS 후에 벡터 DNA 복제를 매개하는 주된 메커니즘이 확산에 의한 피부를 가로지른 전좌에 기인하는 것 같지는 않음을 보여준다. 따라서, 아데노바이러스 벡터의 국소 적용은 경피 백신접종식이라기 보다는 비-침투식을 나타낼 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태를 상세히 기술한 바, 첨부 특허청구범위로 정의된 본 발명은 이의 취지와 범위로부터 일탈함이 없이 다양하게 변화시킬 수 있는 바와 같이 상기 설명에 기재된 특정의 세부사항에 의해 제한되지 않는다.

참조문헌

Claims (57)

1. 동물의 피부, 또는 비강, 구강, 설하 또는 볼의 점막을 유전자 산물을 암호화하는 핵산 분자를 함유하고 발현하는 벡터와 반응 유도 유효량으로 접촉시키는 단계를 포함하는, 동물에서 비-침입성 유전자 면역방법 및/또는 동물에서 유전자 산물에 대한 전신 면역반응 또는 전신 치료반응의 유도방법.
2. 제 1 항에 있어서, 동물의 피부를 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 비점막을 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 구강 또는 볼 또는 설하 점막을 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 벡터에 대해 외생성 또는 이종성인 방법.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 반응이 전신 면역반응을 포함하는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 해당 에피토프를 암호화하는 외생성 핵산 분자를 포함하고 발현하는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 항원을 포함하고 발현하는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 치료 산물을 포함하고 발현하는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 해당 에피토프 및/또는 해당 항원 및/또는 면역반응을 자극하고/하거나 조절 및/또는 전사 및/또는 해독을 포함한 발현을 자극하고/하거나 조절하는 핵산 분자 및 내생성 및/또는 외생성 핵산 분자를 암호하하는 방법.
11. 제 5 항에 있어서, 외생성 핵산 분자가 병원체로부터의, 하나 이상의 항원 또는 이의 일부, 또는 하나 이상의 해당 에피토프를 암호화하는 방법.
12. 제 5 항에 있어서, 외생성 핵산 분자가 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2, 파상풍 독소 C-단편, 탄저균 보호 항원, 탄저균 치사 인자, 광견병 당단백질, HBV 표면 항원, HIV gp 120, HIV gp 160, 인간 카시노엠브리오닉 항원, 말라리아 CSP, 말라리아 SSP, 말라리아 MSP, 말라리아 pfg, 및 마이코박테리움 튜버쿨로시스 HSP 중 하나 이상을 암호화하는 방법.
13. 제 5 항에 있어서, 외생성 핵산 분자가 면역조절자를 암호화하는 방법.
14. 제 10 항에 있어서, 반응이 동물세포에서 핵산 분자를 발현하는 벡터에 의해 유도되는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 세포가 표피세포를 포함하는 방법.
16. 제 10 항에 있어서, 반응이 병원체 또는 신생물에 대한 면역반응을 포함하는 방법.
17. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 척추동물인 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 척추동물이 조류 또는 포유동물인 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 조류 또는 포유동물이 인간 또는 반려 또는 길들인 또는 식품- 또는 사료-생산 또는 가금 또는 경기 또는 경주 또는 스포츠 동물인 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 동물이 소, 말, 개, 고양이, 염소, 양, 돼지, 또는 닭, 또는 오리, 또는 칠면조인 방법.
21. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터, 바이러스 유전자가 일부 또는 전부 결실된 바이러스를 포함하는 바이러스 코트, 박테리아 벡터, 원생동물 벡터, 트랜스포손, 레트로트랜스포손, 및 DNA 벡터 중 하나 이상을 포함하는 방법.
22. 제 21 항에 있어서, 벡터가 재조합 벡터를 포함하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스를 포함하는 방법.
24. 제 23 항에 있어서, 아데노바이러스가 E1 및/또는 E3 및/또는 E4 영역 결손 또는 결실인 방법.
25. E1 및/또는 E3 및/또는 E4 영역이 결손된 아데노바이러스를 포함하는 벡터를 비내 및/또는 점막 및/또는 볼 및/또는 설하 및/또는 경구 투여하는 단계를 포함하고, 아데노바이러스가 반응을 위한 유전자 산물을 암호화하는 핵산 분자를 함유하고 발현하는, 동물에서 유전자 산물에 대한 전신 면역반응 또는 전신 치료반응의유도방법.
26. 제 25 항에 있어서, 비내 투여를 포함하는 방법.
27. 제 25 항에 있어서, 볼 투여를 포함하는 방법.
28. 제 25 항에 있어서, 설하 투여를 포함하는 방법.
29. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 E1 및 E3 영역 결손 또는 결실인 방법.
30. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 반응을 위한 유전자 산물을 암호화하는 외생성 또는 이종 핵산 분자를 포함하는 방법.
31. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 외생성 또는 이종성이고 해당 에피토프를 암호화하며 방법이 전신 면역반응 유도를 위한 방법.
32. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 외생성 또는 이종성이고 하나 이상의 해당 인플루엔자 에피토프 및/또는 하나 이상의 인플루엔자 항원을 암호화하는 방법.
33. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스인 방법.
34. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 개 아데노바이러스를 포함하는 방법.
35. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 동물에 매칭되거나, 동물의 자연 병원체에 매칭되는 방법.
36. 제 1 항 또는 제 25 항에 있어서, 벡터를 포함하는 전달 장치를 동물 피부에 적용하는 단계를 포함하는 방법.
37. 제 36 항에 있어서, 벡터를 전달 장치 안에 및/또는 위에 배치하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
38. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 모든 바이러스 유전자가 결실된 바이러스 벡터를 포함하는 방법.
39. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 종양 유전자, 종양-억제 유전자, 또는 종양-관련 유전자를 발현함으로써 동물에서 항-종양 효과를 유도하는 방법.
40. 벡터를 국소 또는 점막 또는 비내 또는 볼 또는 설하 또는 경구 투여하기 위해 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제에 벡터를 포함하는 제 1 항 내지 제 4 항, 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 약학적, 백신, 면역원성, 면역학적 또는 치료 조성물.
41. 벡터를 국소 또는 점막 또는 비내 또는 볼 또는 설하 또는 경구 투여하기 위해 제 1 용기에 벡터를 및 제 2 용기에 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하고, 용기가 임의로 동일 패키지에 또는 분리된 패키지에 존재하고, 키트는 임의로 벡터와 담체 또는 희석제의 혼합 및/또는 투여를 위한 사용 설명서를 포함하는, 제 1 항 내지 제 4 항, 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 약학적, 백신, 면역원성, 면역학적 또는 치료 조성물 제조를 위한 키트.
42. 제 41 항에 있어서, 제 3 용기에 전달 장치를 추가로 포함하고; 제 3 용기가 제 1 및 제 2 용기 중 하나 또는 둘 모두로서 동일 패키지에 또는 제 1 및 제 2 용기와 분리된 패키지에 임의로 존재하며; 키트는 임의로 벡터 또는 벡터와 담체 또는 희석제를 전달 장치 안에 또는 위에 설치하기 위한 및/또는 전달 장치를 투여하거나 적용하기 위한 사용 설명서를 포함하는 키트.
43. 제 13 항에 있어서, 면역조절제가 공-자극제 및/또는 사이토킨을 포함하는 방법.
44. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 반응이 클로스트리디움 테타너스 감염에 대한 반응인 방법.
45. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 AdCMV-tetC:IM 또는 pCMV-tetC를 포함하는 방법.
46. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 외생성 핵산 분자가 파상풍 독소 C-단편을 암호화하는 방법.
47. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 외생성 핵산 분자가 파상풍 독소의 항원 또는 에피토프를 암호화하는 방법.
48. 치료를 요하는 대상의 피부 또는 비강 또는 볼 또는 설하 점막을 투여 후 동물에서 항-인플루엔자 효과를 유도하는 인플루엔자-특이성 항원 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하고 발현하는 해당 유전자를 포함하는 면역학적 유효량의 유전자벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스에 대한 면역반응을 비-침입적으로 유도하는 방법.
49. 제 48 항에 있어서, 피부를 유전자 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
50. 제 48 항에 있어서, 비점막을 유전자 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
51. 제 48 항에 있어서, 볼의 점막을 유전자 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
52. 제 48 항에 있어서, 설하 점막을 유전자 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
53. 제 48 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 벡터가 바이러스 벡터와 플라스미드 DNA로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
54. 제 53 항에 있어서, 유전자 벡터가 아데노바이러스인 방법.
55. 제 54 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 E1 및 E3 영역 결손인 방법.
56. 제 55 항에 있어서, DNA가 플라스미드 형태인 방법.
57. 제 49 항에 있어서, 접촉단계가 해당 유전자를 함유하는 유전자 벡터를 전달 장치 위에 배치하고 그 안에 해당 유전자를 함유하는 유전자 벡터가 있는 장치를 동물의 피부에 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.