DE10254374A1

DE10254374A1 - Adenovirale Vektoren zum Transfer von spezifischen Genen in Körperzellen

Info

Publication number: DE10254374A1
Application number: DE2002154374
Authority: DE
Inventors: Peter Schäfer; Andreas Block
Original assignee: Universitatsklinikum Hamburg Eppendorf
Current assignee: Universitatsklinikum Hamburg Eppendorf
Priority date: 2002-11-21
Filing date: 2002-11-21
Publication date: 2004-06-03
Also published as: AU2003269708A1; WO2004046364A1

Abstract

Die adenoviralen Vektoren dienen in der Gentherapie zum Transfer von spezifischen Genen in Körperzellen, insbesondere zum Transfer von therapeutischen Genen oder Reportergenen. Das spezifische Gen ist mit mindestens einem immunmodulatorischen viralen Gen im gleichen adenoviralen Vektor koexprimiert. Insbesondere ist an eine Verwendung von immunmodulatorischen viralen Genen aus der Familie der Herpesviren oder POX-Viren gedacht.

Description

Die Erfindung betrifft adenovirale Vektoren zum Transfer von spezifischen Genen in Körperzellen hinein.

Gemäß der Erläuterungen in Mountain A (2000), Gene therapy: the first decade, Trends Biotechnol 18: 119–128, sind in den letzten Jahren große Erwartungen in die Gentherapie als neuartigem Ansatz zur Behandlung von Krebs- und Stoffwechselerkrankungen gesetzt worden. Eine zentrale Rolle als Vehikel für den Transfer der therapeutischen Gene in den bisher verfolgten Strategien spielen Viren, bei denen mit Hilfe gentechnologischer Verfahren die Fähigkeit zur Vermehrung in Körperzellen ausgeschaltet wurde, wie dies beispielsweise in Walther W, Stein U (2000), Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human disease, Drugs 60: 249–271, beschrieben ist. Hierbei bietet die Gruppe der in Kozarsky KF, Wilson JM (1993), Gene therapy: adenovirus vectors, Curr Opin Genet Dev 3: 499–503, erläuterten Adenoviren mehrere große Vorteile gegenüber anderen häufig verwendeten viralen Systemen, beispielsweise Retroviren oder Adenoassoziierten Viren.

Adenovirale Vektoren können in vivo sowohl beim Menschen als auch in Versuchstieren, meist der Maus, ein breites Spektrum von Zielzellen hocheffizient befallen. Im Gegensatz zu den Retroviren transfizieren sie auch Zellen, die sich nicht in Teilung befinden, da sie nicht ins Genom integrieren.

Adenovirusvektoren können im Vergleich zu den Adenoassoziierten Viren leicht aufgereinigt und in hohen Titern hergestellt werden, die für in vivo-Applikationen problemlos ausreichen.

Eine wesentliche Einschränkung bei der Verwendung von Adenovirusvektoren ist jedoch, daß die Transgenexpression in den meisten Geweben nach spätestens 4 bis 6 Wochen signifikant abfällt und auch eine zweite Applikation wenig Wirkung zeigt. Derartige Effekte sind in Davidson BL, Allen ED, Kozarsky KF, Wilson JM, Roessler BJ (1993), A model system for in vivo gene transfer into the central nervous system using an adenoviral vector, Nat Genet 3: 219 bis 223, und in Yang Y, Nunes FA, Berencsi K, Furth EE, Gonczol E, Wilson JM (1994), Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy, Proc Natl Acad Sci USA 91: 4407–4411 beschrieben. Die Hauptursache hierfür liegt in einer Immunantwort gegen die ebenfalls exprimierten adenoviralen Proteine. Bei der experimentellen Therapie von Krebserkrankungen ohne wesentliche Relevanz, verhindert dieser Mechanismus jedoch eine längerdauernde Transgenexpression bei der Gentherapie von Stoffwechselkrankheiten.

Um dieses Problem zu beherrschen, sind zwei grundsätzlich verschiedene Wege bereits beschritten worden. Zum einen wurden Vektoren entwickelt, bei denen das adenovirale Gerüst auf das zur Expression der Transgene absolut Notwendige reduziert ist ("gutless vectors"). Die Herstellung dieser Konstrukte ist jedoch technisch äußerst anspruchsvoll, und die Vermehrung ist aufwendig. Darüber hinaus sind die Effizienz der Transfektion und die Genexpression zum gegenwärtigen Zeitpunkt für therapeutische Applikationen unbefriedigend.

Bei einer anderen Strategie werden die Vektorstrukturen ihrer Vorteile wegen belassen. Statt dessen wird die Immunantwort des Wirtsorganismus unterdrückt. Es ist zwar tierexperimentell machbar, die Immunantwort systemisch zu supprimieren, dies ist aber für klinische Studien sehr problematisch, da Infektanfälligkeiten sowie ein Hervorrufen von Tumoren auftreten können. Langfristig kann diese Strategie also nur dann Erfolg haben, wenn Wege gefunden werden, die Immunstimulation lokal zu verhindern, am besten direkt an der Antigen tragenden, adenoviral trans fizierten Zelle.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, adenovirale Vektoren der einleitend genannten Art derart zu erzeugen, daß die Veränderung einer lokalen Immunstimulation unterstützt wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das spezifische Gen mit mindestens einem immunmodulatorischen viralen Gen im gleichen adenoviralen Vektor koexprimiert wird.

Viele Viren, die klassischerweise zu persistierenden Infektionen führen, sind geradezu darauf spezialisiert, das lokale Netzwerk zwischen immunologischen Abwehrzellen, insbesondere Natürlichen Killer [NK]-Zellen und T-Lymphozyten, und ihren Botenstoffen, beispielsweise Chemokinen und Cytokinen, zu durchbrechen. Besonders interessant sind hierbei verschiedene Vertreter der Herpesviren, beispielsweise die Cytomegaloviren (CMV), bei denen verschiedene Genprodukte immunmodulatorische Eigenschaften zeigen, sogar dann, wenn sie isoliert exprimiert werden.

Der erfindungsgemäße Lösungsansatz besteht darin, adenovirale Vektoren zusätzlich zu dem zu exprimierenden spezifischen Gen, beispielsweise einem therapeutischen Transgen oder einem Reportergen, mit einem einzelnen oder mehreren immunmodulatorischen viralen Genen auszustatten, um ihre Elimination zu vermeiden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, therapeutische Gene oder Reportergene mit immunmodulatorischen Genen der Familie der Herpes- und POX-Viren im gleichen adenoviralen Vektor zu koexprimieren. Mit derartigen Vektoren ist es möglich, eine signifikant verlängerte Expression der therapeutischen Gene oder der Reportergene zu erzielen sowie erneute Virusgaben zu ermöglichen. Im Hinblick auf die großen Ähnlichkeiten etwa zwischen dem Maus-CMV und dem humanen CMV in der Funktion einiger homologer Gene können sich daraus grundsätzlich neue Ansätze zur Unterstützung einer längerfristigen therapeutischen Genexpression bei der Therapie von Stoffwechsel- oder Autoimmunerkrankungen des Menschen ergeben.

Die nötigen Techniken zur Herstellung rekombinanter Adenovirusvektoren der Serogruppe 5 (Ad5) sind im Labor etabliert. Wegen einer deletierten E1-Region des Virusgenoms sind diese Vektoren nicht replikationsfähig (nur in 293-Zellen). Eine weitere Deletion liegt in der E3-Region. Die Viruskonstruktion erfolgt gemäß einem von Graham et al. entwickelten Protokoll. Die zu exprimierenden Transgene werden in ein pAd-Shuttleplasmid kloniert, wobei die Expressionskassette von homologen Sequenzen des Ad-5 flankiert wird. Dieses Plasmid wird mit pBHG 10, welches wesentliche Anteile des Ad5-Genoms enthält, nach der Calciumchlorid-Präzipitationsmethode in 293-Zellen kotransfiziert, eine humane embryonale Nieren-Zelllinie, die stabil mit ca. 11% des Ad5-Genoms transfiziert ist. Durch homologe Rekombination wird die Expressionskassette in die deletierte E1-Region des Virusgenoms integriert, und es entstehen rekombinante infektiöse Viruspartikel.

Die Aufreinigung der Viren aus dem Kulturüberstand erfolgt durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation. Der Virus-titer wird mittels Plaque-Assay in 293-Zellen ermittelt.

In den Zeichnungen sind Ausführungsbeispiele der Erfindung schematisch dargestellt. Es zeigt:
1 Eine schematische Darstellung rekombinanter Adenoviren. Als Transgen ist das Reportergen Luciferase gewählt, das in die deletierte E1-Region des Adenovirus Serotyp 5 kloniert und dort unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert wurde.
Erstes Ausführungsbeispiel: Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem MHC I-homologen Protein m144 des Maus-CMV Das m144-Gen des murinen CMV (MCMV) kodiert für ein Membranprotein, welches Homologie zu den MHC Klasse I-Molekülen der Wirtszellen aufweist und auf diese Weise die NK-Zellfunktion in vitro und in vivo beeinträchtigt. Auch das humane CMV besitzt ein ähnliches Gen (UL18), dem entsprechende Eigenschaften zugeschrieben werden.
Es wurde ein Adenovirusvektor konstruiert, welcher das luc-Markergen zusammen mit dem m144-Protein des Maus-CMV unter der Kontrolle eines CMV-Promotors exprimiert. Zwi schen die beiden Transgene ist eine interne Ribosomenbindungsstelle (IRES) geschaltet, die auf RNA-Ebene eine effiziente Translation zweier Gene ermöglicht. Dies ist in 1 dargestellt.
Aus dem Plasmid pcDNA3m144 (von Dr. Helen Farrell, Animal Health Trust, Newmarket, Suffolk, UK) wurde ein Fragment isoliert, welches die cDNA des m144-Gens des Maus-CMV enthält. Dieses wurde vor das 5'-Ende der kodierenden IRES-Sequenz im Plasmid pIRES (Fa. Clontech) kloniert. 5' der IRES wurde dann das aus dem Vektor pluc (Fa. Promega) isolierte Luciferase-Markergen in pIRES-m144 eingefügt.
Zur Konstruktion des adenoviralen Expressionsvektors wurde dann die Expressionskassette lucIRES-m144 unter der Kontrolle des konstitutiven CMV-Promotors in das adenovirale Expressionsplasmid kloniert. Dies ist ebenfalls in 1 veranschaulicht. So entstand das für die Kopräzipitation verwendbare pAd.luc-IRES-m144.
Durch Kotransfektion von pAd.luc-IRES-m144 und pBHG10 in 293-Zellen wurde das rekombinante Adenovirus Ad.luc-IRES-m144 generiert. Die Richtigkeit der einzelnen Klonierungsschritte wurde durch Sequenzanalyse der aus dem Überstand extrahierten Virus-DNA bestätigt. Die Expression des luc-Reportergens wurde in einem Standardassay nachgewiesen.
Zweites Ausführungsbeispiel: Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem CC-Chemokin-homologen Protein m131/129 des Maus-CMV
Es wurde ein Adenovirusvektor konstruiert, welcher die Luciferase zusammen mit dem m131/129-Protein des Maus-CMV unter der Kontrolle eines CMV-Promotors exprimiert. Das m131/129 gehört zu den Homologen der CC-Chemokine und trägt signifikant zur Etablierung einer persistenten Infektion von Maus-CMV in der Leber bei. Auch beim humanen CMV sind Chemokin-homologe Gene bekannt.
Die cDNA des m131/129-Gens aus dem Plasmid pcDNA3m131/129 (von Dr. Helen Farrell, Animal Health Trust, Newmarket, Suffolk, UK) wurde durch geeignete Restriktionsenzyme isoliert und zunächst in pIRES einkloniert. In das resultierende pIRESm131/129 wurde anschließend das luc-Markergen eingefügt. Aus dem entstandenen Plasmid pluc-IRES-m131/129 wurde die vollständige Expressionskassette isoliert und unter der Kontrolle des CMV -Promotors in das adenovirale Expressionsplasmid kloniert, so daß der für die Kopräzipitation verwendbare Vektor pAd.luc-IRESm131/129 entstand.
In den obigen Ausführungsbeispielen erfolgt die Expression bicistronisch, dies bedeutet, daß die Luciferase und das immunmodulatorische Gen auf der gleichen messenger-RNA transkribiert werden. Eine interne Ribosomenbindungsstelle (IRES) erlaubt die effiziente Translation beider Proteine.
Mögliche Realisierungsmöglichkeiten sind in der nachfolgenden Aufstellung zusammengefaßt.
A) NK-Zell-Inhibition
B) Chemokin-homologe Agonisten / Antagonisten
C) Chemokinrezeptor-homologe Proteine
In der obigen tabellarischen Zusammenstellung bedeuten:
MCMV: Murines Cytomegalovirus
HCMV: Humanes Cytomegalovirus
HHV-6: Humanes Herpesvirus 6
HHV-7: Humanes Herpesvirus 7
HHV-8: Humanes Herpesvirus 8
MCV: Molluscum contagiosum-Virus
Die obige tabellarische Zusammenfassung stellt keine abschließende Auflistung dar, sondern es werden lediglich beispielhaft Realisierungsmöglichkeiten zusammengefaßt.

Claims

Adenovirale Vektoren zum Transfer von spezifischen Genen in Körperzellen hinein, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Gen mit mindestens einem immunmodulatorischem viralen Gen im gleichen adenoviralen Vektor koexprimiert wird.
Adenovirale Vektoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das immunmodulatorische virale Gen zur Familie der Herpesviren gehört.
Adenovirale Vektoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das immunmodulatorische virale Gen zur Familie der POX-Viren gehört.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die adenoviralen Vektoren zur Serogruppe 5 gehören.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Gen als ein therapeutisches Gen ausgebildet ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Gen als ein Reportergen ausgebildet ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Realisierung einer NK-Zell-Inhibition vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem MHC I-homologen Protein m144 des Maus-CMV vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem MHC I-homologen Protein UL18 des Humanen CMV vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem HLA-E induzierten Protein UL40 des Humanen CMV vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem ICAM-1/B7-2 downregulierenden Protein K5 des HHV-8 vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Expression eines chemokin-homologen Agonisten verwendet wird.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Expression eines chemokin-homologen Antagonisten verwendet wird.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem CC-Chemokin-homologen Protein m131/129 des Maus-CMV vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem vCXCL-1-homologen Protein UL146 des Humanen-CMV vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem Protein vMIP-II des HHV-8 vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem Protein MC148 des Molluscum contagiosum-Virus vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und einem chemokinrezeptor-homologen Protein vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem Protein M33 des Maus-CMV vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem Protein US28 des Humanen CMV vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem Protein vGPCR des HHV-8 vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem Protein U12 des HHV-6 vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem Protein U51 des HHV-6 vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem Protein U12 des HHV-7 vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus zur Koexpression von Luciferase und dem Protein U51 des HHV-7 vorgesehen ist.
Adenovirale Vektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus statt des Luciferase-Genes mindestens ein anderes Reportergen oder mindestens ein therapeutisches Gen beinhaltet.