DE10109780A1 - Episomale Vektoren enthaltend Matrix-Anheftungsregionen zur zellspezifischen Genexpression - Google Patents
Episomale Vektoren enthaltend Matrix-Anheftungsregionen zur zellspezifischen GenexpressionInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Vektoren, die mindestens eine Matrix-Anheftungsregion umfassen und zum episomalen Einbau von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen geeignet sind, eukaryotische Zellen, enthaltend diese Vektoren, sowie die Verwendung dieser Vektoren zur Zell-/Gewebe-spezifischen Expression von Transgenen.
Description
Die Erfindung betrifft episomale Vektoren, umfassend mindestens eine Matrix-
Anheftungsregion als Insulator, eukaryotische Zellen enthaltend diese Vektoren
sowie die Verwendung dieser Vektoren zur Expression von Transgenen.
Zu den erfolgversprechenden Methoden der Gentechnologie zählt die Gentherapie,
deren Ziel es ist, durch das Einschleußen von Erbgut in Zellen und dessen
anschließender Expression Krankheiten, die auf ein defektes Gen zurückzuführen
sind, zu behandeln oder zu verhindern. Zu diesem Zwecke sind mittlerweile
zahlreiche Vektoren entwickelt worden, wobei man hinsichtlich des Einschleußens
des Erbgutes virale von nicht-viralen Transferverfahren unterscheiden kann
(Mulligan (1993), Science 260: 920). Als virale Vektoren kommen hierbei in erster
Linie Retroviren und Adenoviren zum Einsatz.
Während die retrovirale Infektion zu einer stabilen Integration des genetischen
Materials in das zelluläre Genom führt, liegen die Adenoviren in der Zelle episomal
vor, werden also nicht stabil in das zelluläre Genom integriert.
Die Weiterentwicklung adenoviraler Vektoren für die somatische Gentherapie
beinhaltet unter dem Aspekt der Sicherheit der Anwendung eine Verbesserung des
Targeting, wobei man als wesentliche Targetingkonzepte den zellspezifischen
Gentransfer und die zellspezifische Expression nennen kann.
Die Zellspezifität des Gentransfers kann man etwa durch Modifikation des
Tropismus des Adenovirus durch Veränderung der Hüllproteine ermöglichen oder
verbessern, während die Zellspezifität der Transgenexpression durch Inkorporation
zell- oder gewebespezifischer Promotoren (transcriptional targeting) ermöglicht oder
verbessert werden kann.
Zellspezifische Promotoren, die in adenovirale Vektoren inkorporiert werden können,
sind bereits bekannt. Ein grundlegendes Problem besteht jedoch darin, dass
adenovirale Enhancerelemente mit diesen regulatorischen Modulen zur
Transgenexpression interferieren können. Dies wurde insbesonders bei der
Inkorporation zellspezifischer Promotoren und exogen regulierbarer Genschalter
beobachtet.
Adenovirale Enhancersequenzen, die mit der heterologen Transgenexpression
interferieren können, befinden sich im adenoviralen ITR und der Verpackungsregion
(Ad5 Sequenzen 1 bis 340). So hat der adenovirale ITR Bindungsstellen für eine
Reihe von Transkriptionsfaktoren (u. a. SP1, ATF) (Hatfield et al. (1991), Virology
184: 265-76) und weist allein Enhanceraktivität auf (Miralles et al. (1989), J Biol
Chem 264: 10763-72). Der EIA Enhancer überlappt mit den cis-aktiven Sequenzen
für die Verpackung des viralen Genoms (Grable et al. (1992), J. Virol. 66: 723-31).
Diese Verpackungssequenzen sind in allen beschriebenen adenoviralen Vektoren
einschließlich der gutless Vektoren enthalten, so dass für keinen adenoviralen
Vektor transkriptionelle Interferenzen ausgeschlossen werden können.
Ein Problem, dass mit der Interferenz der adenoviralen Enhancersequenzen und der
heterologen Transgenexpression verbunden sein kann, ist, dass die Zellspezifität
der eingebauten Promotoren verloren geht. Dies ist vor allem unter dem Aspekt der
Sicherheit der Anwendung der adenoviralen Vektoren für die somatische
Gentherapie unerwünscht.
Eine denkbare Vorgehensweise, diese unerwünschte Beeinflussung der
Transgenexpression durch adenovirale Enhancersequenzen zu verhindern, besteht
im Einsatz von Insulatoren.
Unter Insulatoren versteht man im allgemeinen DNA-Elemente, die integrierte
Reportergene vor chromosomalen Positionseffekten schützen, so dass die
Transgene eine verringerte Positionsabhängigkeit der Genexpression zeigen,
und/oder DNA-Elemente, die die Wirkung eines Enhancers auf einen stromabwärts
liegenden Promotor reduzieren oder ganz verhindern.
Bei Verwendung von Vektoren zum stabilen Einbau von Nukleinsäuren in das
Genom des Wirtes konnte die wirkungsvolle Verwendung von Matrix-
Anheftungsregionen als Insulatoren nachgewiesen werden. So wurde für die MAR
des Lysozymegens gezeigt, dass sie die Positionsabhängigkeit der
Transgenexpression von stabilen Transfektanten in Zellen verschiedener Spezies
(Ratte, Huhn) und unterschiedlicher Differenzierung (Makrophagen, Fibroblasten)
und bei Kontrolle durch unterschiedliche Promotoren reduziert (Stief et al. (1989),
Nature 341: 343-5; Phi-Van et al. (1990), Mol Cell Biol 10: 2302-7).
Die Insulation eines Promotors von der Aktivität eines Enhancers durch eine Matrix-
Anheftungs-Region könnte hierbei an die Integration eines Konstruktes und den
Aufbau einer vollständigen Domäne (mit Zusammenbau von Nucleosomen unter
Einschluß von Histonen) geknüpft sein.
Bezüglich adenoviraler Vektoren sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt lediglich zwei
adenovirale E1-/E3-Vektoren beschrieben, die zur Verbesserung der
Transgenexpression mit Insulatoren ausgestattet wurden. So beschreiben Vassaux
et al. (1999) (Gene Ther. 6: 1192-7) die Tumorzell-spezifische Expression des
ERBB2-Promotors durch Inkorporation des transkriptionellen Stop-Signals aus dem
bovinen Wachstumshormon-Gen (bPA), wobei bPA eigentlich nicht zu den
klassischen Insulatoren zu zählen ist.
Neuere Untersuchungen haben ferner für den HS-4 β-Globin-Insulator aus G. gallus
gezeigt, dass dieser episomal und insbesondere in Adenoviren Insulatorfunktion
aufweist. Recillas-Targa et al. konnten so zeigen, dass für die Aktivität des HS-4
β-Globin Insulators eine Integration in das Genom - und damit vollständiger Aufbau
der Chromatinstruktur - nicht notwendig ist (Recillas-Targa et al. (1999), Proc. Natl
Acad Sci USA 96: 14354-9).
Steinwaerder und Lieber zeigten, dass durch seine Inkorporation hinter die
adenovirale ITR die Induzierbarkeit des Metall-responsiven Promotors MRE in vitro
und in vivo verbessert wird (Steinwaerder und Lieber (2000), Gene Ther. 7, 556-67).
Burcin et al. (1999) konnten mit dem HS-4 Insulator eine verbesserte Induzierbarkeit
eines Mifepriston-abhängigen Genschalters in einem adenoviralen gutless Vektor in
vitro beobachten, während in vivo, in einem Mausmodell, die absoluten
Expressionshöhen der adenoviralen Vektoren mit HS-4 Insulator reduziert waren
(Burcin et al. (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96: 355-60).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, alternative Möglichkeiten zur Insulation
von episomal in Zellen vorliegendes genetisches Material bereitzustellen, wofür
angesichts der Anwendungsmöglichkeiten von episomalen Nukleinsäuren in der
Gentherapie ein dringender Bedarf besteht.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, zu verhindern, dass es beim
Einbau von Nukleinsäuren, die Zell-spezifische Promotoren umfassen und episomal
in eukaryotische Zellen eingebaut werden, zum Verlust der Zell-Spezifität des
Promotors kommt, wofür unter dem Aspekt der Sicherheit der Anwendung in der
Gentherapie ein dringender Bedarf besteht.
Es zeigte sich nun überraschenderweise, dass Matrix-Anheftungsregionen nicht nur
in stabil in das Genom integrierten, sondern auch in episomal in eukaryotische
Zellen eingebauten Nukleinsäuren Insulatorfunktion ausüben. Man kann also darauf
schließen, daß Matrix-Anheftungsregionen cis-aktiv auf episomale DNA wirken,
ohne dass der Aufbau einer vollständiger Chromatinorganisation - wie sie im Falle
einer Integration der Nukleinsäure ins Genom vorläge - für die Insulatorfunktion
unbedingt notwendig ist. Die Quasi-Chromatin- bzw. Histone einschließende
Nukleosomen-Struktur, die für episomale Nukleinsäuren nachgewiesen wurde
(Daniell et al. (1981), Mol Cell Biol 1: 1094-105; Dery et al. (1985), J Gen Virol
66: 2671-84), könnte hierbei wichtig für die Ausübung der Insulatorfunktion der Matrix-
Anheftungsregion sein.
Ferner zeigte sich überraschenderweise, dass bei Vorlage von Zell-spezifischen
Promotoren unter Verwendung von Matrix-Anheftungsregionen sichergestellt
werden kann, dass die Zell-Spezifität des Promotors erhalten bleibt.
Weiterhin zeigte sich überraschenderweise, dass durch den Einbau der Matrix-
Anheftungsregionen die Expressionsdauer des eingebauten Vektors in einem
replizierenden Zellsystem deutlich höher ist als ohne Einbau des Insulators, der so
erhaltene Vektor also eine verbesserte Expressionspersistenz besitzt.
Der Gedanke, Matrix-Anheftungsregionen in episomale Vektoren einzubauen, wurde
bereits von Sandig et al. (1997) ausgesprochen, wobei dieser allerdings nicht angibt,
aus welchen Gründen die Matrix-Anheftungsregion in den episomalen Vektor
eingebaut werden soll, und weiterhin offensichtlich von diesem auch keine
Experimente in dieser Hinsicht durchgeführt worden sind (WO 97/04117).
Weiterhin wurde von Zaehres et al. (2000) beschrieben, dass durch Einbau einer
Matrix-Anheftungsregion in episomale Vektoren die Expression eines Transgens in
Zellkultur verlängert werden kann, allerdings werden hier weder die verwendeten
Zellen noch der Einbauort der Matrix-Anheftungsregion in den episomalen Vektor
angegeben. Insbesondere ist eine Insulator-Wirkung der Matrix-Anheftungsregion bei
Zaehres et al. nicht beschrieben (Zaehres et al. (2000), J Gene Med 2 (5 Suppl): 57).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Vektoren, die zum episomalen
Einbau von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen verwendet werden können und die
sich dadurch auszeichnen, dass sie mindestens eine Matrix-Anheftungsregion
umfassen, wobei die Matrix-Anheftungsregion vorzugsweise Insulatorfunktion in
Bezug auf in diesen Vektoren enthaltenen und/oder in diese Vektoren einbaubare
Promotoren besitzt.
Unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden kann man in die
erfindungsgemäßen Vektoren eine Nukleinsäure einbauen, die einen Promotor und
eine Transgensequenz umfasst. Die so erhältlichen Vektoren sind ebenfalls
Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren sind durch Infektion und/oder
Transfektion eukaryotische Zellen erhältlich, die eine Nukleinsäure episomal
enthalten, die eine Matrix-Anheftungsregion und einen Promotor umfasst.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb eukaryotische Zellen,
enthaltend eine episomale Nukleinsäure, die eine Matrix-Anheftungsregion und einen
Promotor umfasst, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser eukaryotischen Zellen,
dadurch gekennzeichnet, dass unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors
die erfindungsgemäßen eukaryotischen Zellen hergestellt werden, wobei der Einbau
der episomalen Nukleinsäure erfindungsgemäß bevorzugt durch Infektion oder
Transfektion der eukaryotischen Zellen mit dem erfindungsgemäßen Vektor erfolgt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung der
erfindungsgemäßen Vektoren zur Herstellung von eukaryotischen
Expressionssystemen, insbesondere zur Herstellung von Expressionssystemen mit
einer verbesserten Expressionspersistenz.
Die erfindungsgemäßen Vektoren und/oder eukaryotischen Zellen werden
erfindungsgemäß bevorzugt als Therapeutikum und/oder Diagnostikum eingesetzt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit weiterhin eine Zusammensetzung,
enthaltend einen der erfindungsgemäßen Vektoren und/oder erfindungsgemäße
eukaryotische Zellen und gegebenenfalls weitere Hilfs- und Zusatzstoffe, sowie die
Verwendung dieser Vektoren und/oder eukaryotischen Zellen zur Herstellung einer
Zusammensetzung, wobei es sich bei der Zusammensetzung bevorzugt um ein
Therapeutikum oder ein Diagnostikum handelt.
Besonders bevorzugt handelt es sich erfindungsgemäß um ein Therapeutikum
und/oder Diagnostikum zum Einsatz in der Gen- und Zelltherapie und zur Behandlung
von chronischen Krankheiten und Erbkrankheiten wie Diabetes, Hämophilie, ADA,
Muskeldystrohpie, familiäre Hypercholesterinämie oder Rheuma, oder akuten
Krankheiten wie vaskuläre Erkrankungen - Arteriosklerose oder deren
Folgekrankheiten (Stenose, Restenose, Herzinfarkt) - oder Tumorerkrankungen.
Das sich im Vektor befindliche Transgen, das unter der Kontrolle des insulierten
Promotors steht, umfasst erfindungsgemäß beispielsweise eine Nukleinsäure
kodierend für Insulin, Blutgerinnungsfaktor VIII oder X, eine Isoform der
Stickstoffmonoxid-Synthase (z. B. iNOS: induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase;
eNOS: endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase; nNOS: neuronale Stickstoffmonoxid-
Synthase), hämatopoetische Wachstumsfaktoren wie GM-CSF, M-CSF oder MCP-1
oder Transkriptionsfaktoren wie die Gruppen der Nkx oder Pax oder myogene
Faktoren, die Zellen in ihrem Differenzierungs- und Reifungsprozeß beeinflussen
könnten.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen
Vektoren für die Zell- oder Gewebe-spezifische Expression eines Transgens.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist hierbei insbesondere ein Verfahren zur
Zell-spezifischen Expression einer episomalen Nukleinsäure, das sich dadurch
auszeichnet, dass nach Infektion oder Transfektion mit einem erfindungsgemäßen
Vektor die episomale Nukleinsäure in den infizierten oder transfizierten Zellen
exprimiert wird.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind transgene Säugetiere außer dem Menschen,
die einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Differenzierung und/oder
Selektion von Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, dass ein erfindungsgemäßer
Vektor, der mindestens ein Transgen umfasst, das den Differenzierungsstatus der
Stammzellen beeinflusst, durch Transfektion und/oder Infektion in die Stammzellen
eingebracht wird und die transfizierten und/oder infizierten Zellen gegebenenfalls von
den anderen Zellen getrennt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Differenzierung
und/oder Selektion von Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, dass Stammzellen,
die einen erfindungsgemäßen Vektor umfassen, mit den dem Fachmann bekannten
Methoden aus transgenen Tieren oder deren Embryonen isoliert werden.
Die aus diesen Stammzellen differenzierten Zellen können zur zellvermittelten
Transplantation und für den somatischen Gentransfer in vivo eingesetzt werden.
Bei den erfindungsgemäßen Vektoren, die eine Matrix-Anheftungsregion umfassen,
handelt es sich bevorzugt um adenovirale Vektoren, besonders bevorzugt um E1-/E3-
Vektoren oder Gutless-Vektoren, insbesondere handelt es sich um den adenoviralen
Vektor pAd-SAR1-X/pASX gemäß SEQ ID 1, der als Basisvektor zur Konstruktion
unterschiedlicher adenoviraler Vektoren verwendet werden kann.
Matrix-Anheftungsregionen sind dem Fachmann bekannt. Unter Matrix-
Anheftungsregionen wird erfindungsgemäß insbesondere auch verstanden, was im
englischen Sprachgebrauch unter "scaffold attachment regions" bekannt ist.
Die Matrix-Anheftungsregion wird erfindungsgemäß mit den dem Fachmann
bekannten molekularbiologischen Methoden in den episomalen Vektor eingebaut. Bei
Verwendung von adenoviralen Vektoren erfolgt der Einbau hierbei bevorzugt
stromabwärts (in 3'-Richtung) von den adenoviralen Verpackungs- und
Enhancersequenzen, die beispielsweise bei dem adenoviralen Vektor pd1E1Sp1A
von Position 1 bis 360 lokalisiert sind, sowie stromaufwärts (in 5'-Richtung) von der
Position, an der sich der zu insulierende Promotor befindet oder an der der zu
insulierende Promotor mit molekularbiologischen Standardmethoden eingebaut
werden kann.
Die Matrix-Anheftungsregion wird hierbei bevorzugt so eingebaut, dass sich der
Promotor bzw. der einzubauende Promotor unmittelbar an das 3'-Ende der Matrix-
Anheftungsregion anschließt oder maximal 1000 Baseneinheiten vom 3'-Ende der
Matrix-Anheftungsregion entfernt ist, und/oder dass sich die Verpackungsregion des
adenoviralen Vektors unmittelbar an das 5'-Ende der Matrixanheftungsregion
anschließt oder maximal 1000 Baseneinheiten vom 5'-Ende der
Matrixanheftungsregion entfernt ist.
Optional kann zusätzlich eine zweite Matrix-Anheftungsregion stromabwärts (3') vom
internen, Zell-spezifischen Promotor eingebaut werden.
Als Promotor wird erfindungsgemäß bevorzugt ein Zell- oder Gewebe-spezifischer
Promotor verwendet, besonders bevorzugt ein Endothelzell-spezifischer Promotor,
insbesondere ein Promotor des VE-Cadherin 1 oder 2 oder des VEGF-Rezeptors
(FLT-1, KDR/FLK-1), ein Cardiomyocyten-spezifischer Promotor, insbesondere der
cardiac myosin light chain (MLC) 2 gene-Promotor oder der cardiac myosin heavy
chain (MHC) gene-Promotor, ein für glatte Muskelzellen spezifischer Promotor,
insbesondere der smooth muscle alpha-actin-Promotor, oder ein für Pankreas/β-
Zellen spezifischer Promotor, insbesondere der Insulin-, PDX-, NKx- oder Beta2-
Promotor. Der Promotor ist erfindungsgemäß bevorzugt durch eine Matrix-
Anheftungsregion insuliert.
Die Matrix-Anheftungsregion hat erfindungsgemäß bevorzugt eine Basenlänge
zwischen 500 und 5000, besonders bevorzugt zwischen 1000 und 3000, ganz
besonders bevorzugt zwischen 1500 und 2500, insbesondere eine Basenlänge von
etwa 2000.
Bei der Matrix-Anheftungsregion handelt es sich beispielsweise um eine Matrix-
Anheftungsregion aus Wirbeltieren, insbesondere aus Säugern, besonders bevorzugt
handelt es sich um eine humane Matrix-Anheftungsregion, insbesondere um diejenige
des humanen Interferon β-Locus. Die Matrix-Anheftungsregion fungiert
erfindungsgemäß bevorzugt als Insulator.
Die Matrix-Anheftungsregion kann erfindungsgemäß sowohl 5'-3'- als auch in 3'-5'-
Richtung in den episomalen Vektor eingebaut werden.
Bei den eukaryotischen Zellen handelt es sich erfindungsgemäß bevorzugt um Zellen
von Wirbeltieren, insbesondere um Säuger-Zellen, besonders bevorzugt um
menschliche Zellen, insbesondere um Endothel-Zellen, Cardiomyocyten, glatte
Muskelzellen oder um Pankreas/β-Zellen.
In den folgenden Ausführungsbeispielen wird die Erfindung beispielhaft
veranschaulicht.
In Vorexperimenten wurde eine Deletionsanalyse des humanen VE-Cadherin1
Promotors durchgeführt: Verschiedene Promotorfragmente von -14Sbp bis -1355
bp stromaufwärts vom hVE1-Transkriptionsstartpunkt wurden mit einem
Reportergen (Luciferase) gekoppelt. Diese Reportergenkonstrukte wurden in
a.) Endothelzelllinien (BAEC) und in b.) Zellen nicht endothelialen Ursprungs
(NIH3T3) transfiziert. In diesen Experimenten zeigten alle untersuchten
Promotorfragmente eine endothelspezifische Expression: In den Endothelzellinien
lag die Luciferaseaktivität der Reportergenkonstrukte 70-110-fach über dem
Hintergrund, in den NIH3T3 wurden lediglich Aktivitäten bis zu 10-fach über dem
Hintergrund gemessen.
Zur Konstruktion des adenoviralen Vektors Ad-VE1-IacZ wurde das -3500 bp
hVE-Cadherin1 Promotor Fragment, das in den Transfektionsexperimenten
Endothelzell-spezifische Expression zeigte, vor dem IacZ Gen in die EcoRV
Schnittstelle von pΔE1asp1A inseriert. Dieses shuttle Plasmid wurde mit pBHG10 in
293 kotransfiziert. Es wurden rekombinante Adenoviren mit Virustitern um 10e8
generiert.
Zur Analyse der zellspezifischen Expression von Ad-VE1-IacZ wurden
Endothelzellen (HUVEC) und Glatte Muskelzellen (SMC) mit dem Vektor sowie als
weiterer Kontrolle dem Vektor Ad-CMV-GFP in einer MOl von 50 für zwei Stunden
in I2-Medium infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurden Zellextrakte aufbereitet
und die β-Galaktosidaseaktivität sowie der Proteingehalt der Zellextrakte bestimmt.
In Vorexperimenten konnte mit Ad-CMV-IacZ und Ad-CMV-GFP Adenoviren
vergleichbare Gentransfereffizienzen in HUVEC und SMC nachgewiesen werden.
Der Vektor Ad-VE1-IacZ exprimierte sowohl in den Endothelzellen als auch in den
Glatten Muskelzellen gleichermaßen stark. (Abb. 3) Die Expression vom hVE-
Cadherin1 Promotor Fragment ist in diesem Kontext also nicht Endothelzell
spezifisch.
Auch Adenovirale gutless Vektoren mit einem humanen VE-Cadherin 1 Promotor-
Fragment zeigten keine Endothelzell-spezifische Expression.
3) Wiederherstellung der Zell-Spezifität durch Herstellung des adenoviralen Vektors Ad-SAR1-VE1-IacZ durch Inkorporation der Matrix-Anheftungsregion.
3) Wiederherstellung der Zell-Spezifität durch Herstellung des adenoviralen Vektors Ad-SAR1-VE1-IacZ durch Inkorporation der Matrix-Anheftungsregion.
Zur Konstruktion des adenoviralen Vektors Ad-SAR1-VE1-IacZ (Abb. 2) wurde das
-700 bp hVE-Cadherin1 Promotor - Fragment vor dem IacZ Gen in die EcoRV
Schnittstelle von pAd-SAR1-x inseriert. Dieses shuttle Plasmid wurde mit dem
Plasmid pJM17 in 293 kotransfiziert. Es wurden rekombinante Adenoviren mit
Virustitern um 10e8 generiert.
Zur Analyse der zellspezifischen Expression von Ad-SAR1-VE1-IacZ wurden
Endothelzellen (HUVEC) und Glatte Muskelzellen (SMC) mit dem Vektor sowie als
weiterer Kontrolle dem Vektor Ad-CMV-GFP in einer MOl von 50 für zwei Stunden in
I2-Medium infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurden Zellextrakte aufbereitet
und die β-Galaktosidaseaktivität sowie der Proteingehalt der Zellextrakte bestimmt.
In Vorexperimenten konnte mit Ad-CMV-IacZ und Ad-CMV-GFP Adenoviren
vergleichbare Gentransfereffizienzen in HUVEC und SMC nachgewiesen werden.
Der Vektor Ad-SAR1-VE1-IacZ exprimierte in Endothelzellen, die Expression in den
Glatten Muskelzellen war deutlich reduziert (Abb. 3). Dieses Resultat konnte in
mehreren Experimenten und auch durch morphologische Betrachtung transduzierter
und β-Gal gefärbter Zellen verifiziert werden. In Kombination mit dem S/MAR-Modul
war vom hVE-Cadherin1 Promotor eine Endothelzell-spezifische Expression im
adenoviralen Vektor möglich.
In Abb. 1 ist die Expression der Deletionskonstrukte des humanen VE-
Cadherin1 Promotors mit Luciferase als Reportergen in vitro dargestellt. Während in
Endothelzellen (BAEC) Expression nachweisbar ist (a), ist in Fibroblasten keine
Expression nachweisbar (b).
In Abb. 2 ist beispielhaft der erfindungsgemäße adenovirale shuttle Vektor
pAd-SAR1-x/pASX (8401 bp) schematisch dargestellt. Er setzt sich zusammen aus
- - der Sequenz des adenoviralen shuttle Vektors pd1E1Sp1A (6409 bp)
(Bett et al. PNAS 91: 8802-8806, 1994)
Sequenz 1-364 - - der Sequenz der humanen Interferonß - Scaffold-Attachment-Region
(NCBI-Nukleotid-Datenbank Nr.: M83137)
Sequenz 218-2201 + Sequenz AATT - - der Sequenz des adenoviralen shuttle Vektors pd1E1Sp1A
Sequenz 361-6409
Dem adenoviralen Inverted Terminal Repeat (ITR) folgt die adenovirale
Verpackungsregion, an diese schließt sich die Matrix-Anheftungsregion an, der eine
multiple Klonierungsstelle folgt, in die erfindungsgemäß eine Nukleinsäure
eingebaut werden kann, die einen Promotor und ein Transgen umfasst.
Die vollständige Sequenz des Vektors pAd-SAR1-x/pASX ist im Sequenzprotokoll
als SEQ ID No. 1 angegeben.
In Abb. 3 ist die Expression der adenoviralen Vektoren Ad-SAR1-VE1-IacZ und
Ad-VE1-IacZ nach Transduktion (MOl 50) von Endothelzellen (HUVEC) und glatten
Muskelzellen (SMC) dargestellt (s. auch Tabelle 1).
Claims (28)
1. Vektor zum episomalen Einbau von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen,
dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine Matrix-Anheftungsregion
umfasst.
2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen
adenoviralen Vektor handelt.
3. Vektor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es
sich bei der Matrix-Anheftungsregion um eine humane Matrix-
Anheftungsregion handelt.
4. Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den
Vektor pAD-SAR1-X/pASX gemäß SEQ ID No. 1 handelt.
5. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass er
zusätzlich mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die einen Promotor und ein
Transgen enthält.
6. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich
die Matrix-Anheftungsregion in 5'-Richtung vom Promotor und in 3'-Richtung
von der viralen Verpackungsregion befindet.
7. Vektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstände
zwischen 3'-Ende der Verpackungsregion und 5'-Ende der Matrix-
Anheftungsregion sowie 3'-Ende der Matrix-Anheftungsregion und 5'-Ende
des Promotors jeweils nicht mehr als 1000 Baseneinheiten betragen.
8. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die
Matrix-Anheftungsregion den Promotor insuliert.
9. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass die Matrix-Anheftungsregion eine Basenlänge zwischen 500 und 5000
Baseneinheiten besitzt.
10. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass er
einen Gewebe- oder Zell-spezifischen Promotor umfasst.
11. Vektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem
Promotor um einen Endothelzell-spezifischen Promotor handelt.
12. Eukaryotische Zelle, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis
11.
13. Eukaryotische Zelle, enthaltend eine episomal vorliegende Nukleinsäure,
dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Matrix-Anheftungsregion
umfasst.
14. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder eukaryotische Zelle nach
einem der Ansprüche 12 oder 13 als Therapeutikum.
15. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder eukaryotische Zelle nach
einem der Ansprüche 12 oder 13 als Diagnostikum.
16. Zusammensetzung, enthaltend mindestens einen Vektor gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 11 und/oder eine Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13
sowie gegebenenfalls weitere Hilfs- und Zusatzstoffe.
17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich
bei der Zusammensetzung um ein Therapeutikum handelt.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich
bei der Zusammensetzung um ein Diagnostikum handelt.
19. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18 zur Behandlung
oder Diagnose einer der folgenden Krankheiten: Diabetes, Hämophilie, ADA,
Muskeldystrohpie, familiäre Hypercholesterinämie, Rheuma, Arteriosklerose
oder deren Folgekrankheiten, Tumorerkrankungen.
20. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder einer
Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13 zur Herstellung eines
Therapeutikums.
21. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder einer
Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13 zur Herstellung eines
Diagnostikums.
22. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur
Herstellung eines eukaryotischen Expressionssystems.
23. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Gewebe-
oder Zell-spezifischen Expression eines Transgens.
24. Verfahren zur Gewebe- oder Zell-spezifischen Expression einer episomalen
Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen mit einem Vektor nach
einem der Ansprüche 1 bis 11 infiziert und/oder transfiziert werden und die
episomale Nukleinsäure anschließend exprimiert wird.
25. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder
einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 in der Gen- und/oder
Zelltherapie.
26. Transgene Säugetiere außer dem Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass
sie einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11 enthalten.
27. Verfahren zur Differenzierung und/oder Selektion von Stammzellen, dadurch
gekennzeichnet, dass ein Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, der
mindestens ein Transgen umfasst, das den Differenzierungsstatus der
Stammzellen beeinflusst, durch Transfektion und/oder Infektion in die
Stammzellen eingebracht wird und die transfizierten und/oder infizierten Zellen
gegebenenfalls von den anderen Zellen getrennt werden.
28. Verfahren zur Differenzierung und/oder Selektion von Stammzellen, dadurch
gekennzeichnet, dass Stammzellen, die einen erfindungsgemäßen Vektor
umfassen, aus transgenen Tieren oder deren Embryonen isoliert werden.
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