WO2001011066A1 - Nicht-humaner adenoviraler vektor für den gentransfer, seine anwendung und seine herstellung - Google Patents

Nicht-humaner adenoviraler vektor für den gentransfer, seine anwendung und seine herstellung

Info

Publication number
WO2001011066A1
WO2001011066A1 PCT/EP2000/007601 EP0007601W WO0111066A1 WO 2001011066 A1 WO2001011066 A1 WO 2001011066A1 EP 0007601 W EP0007601 W EP 0007601W WO 0111066 A1 WO0111066 A1 WO 0111066A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
use according
vector
cells
human
adenovirus
Prior art date
Application number
PCT/EP2000/007601
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter LÖSER
Christian Hofmann
Original Assignee
DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10019006A external-priority patent/DE10019006A1/de
Application filed by DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung filed Critical DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung
Priority to AU62806/00A priority Critical patent/AU6280600A/en
Priority to EP00949457A priority patent/EP1198579A1/de
Publication of WO2001011066A1 publication Critical patent/WO2001011066A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10111—Atadenovirus, e.g. ovine adenovirus D
    • C12N2710/10141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the invention relates to the production of a non-human adenoviral vector for gene transfer in mammalian cells.
  • This vector is particularly suitable for gene transfer into the muscle, in particular into the skeletal muscle, or into cell types that occur in the muscle or skeletal muscle. Areas of application are medicine, biotechnology and genetic engineering. When functional DNA sequences are inserted, the vector is suitable for the treatment of altered, also pathological phenomena in cells or cell complexes, for the production of biological material and for vaccination.
  • vectors derived from retroviruses, adeno-associated viruses (AAV) or human adenoviruses are used for gene transfer e.g. favored with the goal of gene therapy.
  • AAV adeno-associated viruses
  • human adenoviruses are used for gene transfer e.g. favored with the goal of gene therapy.
  • the adenoviral vectors of the so-called first generation have been intensively researched as gene transfer vectors over the past decade (review by: Bramson, JL et al. (1 995). Curr. Op. Biotech. 6, 590-595). They are derived from the human adenovirus of serotype 5 and are, in the essential E1 region, often also deleted in the non-essential E3 region, whereby up to 8 KBp of foreign DNA can be inserted into the virus genome. These vectors can complement E1 deficiency Cells with high titers can be stored well and mediate an effective gene transfer in vitro and in vivo. In vivo, however, there is a rapid loss of expression of the transgenes and of the vector genome.
  • adenoviral vector which can transfer DNA sequences into target cells, in particular mammalian cells, and where there results a preferably transient expression of the transduced gene in the cell or in the organism
  • the non-human adenoviral vector is suitable for efficient gene transfer in vivo, e.g. for transduction of mammalian cell types, which in
  • Muscle occur, or in the skeletal muscles.
  • the field of application is the transfer of genetic material into cells, for example with the goals: therapy of genetically determined and acquired
  • An object of the invention is thus the use of a non-human adenovirus vector for the production of an agent for the transfer of genetic material, comprising the envelope of a non-human adenovirus and genetic material packaged therein, which (a) DNA sequences from a non-human adenovirus and
  • (b) contains one or more DNA sequences which code for peptides or polypeptides which are heterologous to the non-human adenovirus, in operative linkage with expression control sequences.
  • the genetic material of the gene transfer vector according to the invention contains DNA sequences from a non-human adenovirus, i.e. an adenovirus naturally occurring in a non-human species selected, for example, from mammals and birds, as listed in Russell, W.C. and Benkö, M. (1 999), Adenoviruses (Adenoviridae): Animal viruses. In: Granoff, A. and Webster, R.G. (Eds): Encyclopedia of Virology.
  • a non-human adenovirus i.e. an adenovirus naturally occurring in a non-human species selected, for example, from mammals and birds, as listed in Russell, W.C. and Benkö, M. (1 999), Adenoviruses (Adenoviridae): Animal viruses. In: Granoff, A. and Webster, R.G. (Eds): Encyclopedia of Virology.
  • the virus is preferably a sheep or bovine adenovirus.
  • sheep adenoviruses are ovine mastadenoviruses or ovine atadenoviruses such as OAV isolate 287, whose nucleotide sequence is given under Genbank Acc. No. U40389.
  • Suitable bovine adenoviruses are bovine atadenoviruses or bovine mastadenoviruses, negative bovine and ovine atadenoviruses being particularly interesting in the complement fixation assay.
  • the gene transfer vector according to the invention contains one or more DNA sequences which code for peptides or polypeptides which are heterologous with respect to the non-human adenovirus, in operative linkage with
  • Expression control sequences ie an expression cassette for one or several transgenes.
  • the expression cassette for the transgene can, for example, be inserted into a cloning site.
  • the transgene expression cassette preferably contains expression control sequences which allow expression in mammalian cells, for example in human cells.
  • the expression control sequences can be constitutively active and / or regulatable in the desired target cell.
  • the expression control sequences can be of viral or cellular origin or comprise a combination of viral and cellular elements.
  • suitable promoters are viral promoters, e.g. RSV promoter, CMV immediate early promoter / enhancer, SV40 promoter, or tissue-specific, especially liver-specific promoters, e.g. the human albumin promoter (Ponder et al., Hum. Gene Ther.
  • the expression regulation sequences conveniently comprise a polyadenylation signal, for example that of bovine growth hormone gene (Goodwin & Rottman, J. Biol. Chem.
  • the viral gene transfer vector can be used to transfer heterologous nucleic acids into permissive cells, cell groups, organs and organisms, in particular for gene therapy or for vaccination.
  • the genomic sequence or the cDNA of a gene can be used, the product of which is missing in the patient to be treated, occurs in unphysiological amounts or / and is defective. You can also use part of a genomic sequence that a mutation in Target gene spanned and can be homologously recombined with this.
  • various genes can be used, which slow down the growth or kill the tumor cells, possibly in combination with pharmaceuticals or by immunostimulation.
  • One or more, possibly modified genes of a pathogenic organism against which immunization is to be achieved can be used for the purpose of vaccination.
  • the gene transfer vector according to the invention can contain genetic material from other viruses, for example expressed or regulatory sequences of hepatitis B and hepatitis C virus (HBV, HCV), and of bacteria and pathogenic single or multi-cells, for example Plasmodium faiciparum.
  • viruses for example expressed or regulatory sequences of hepatitis B and hepatitis C virus (HBV, HCV), and of bacteria and pathogenic single or multi-cells, for example Plasmodium faiciparum.
  • transgenes for the purpose of substitution gene therapy are genes for secreted serum factors (for example human blood coagulation factors IX (FIX) and VIII (FVIII), erythropoietin (Epo) ⁇ -1 - antitrypsin (AAT)), and genes for proteins which could be used in muscle diseases (e.g. dystrophin, utrophin), and the gene defective in Wilson's disease (ATP7B).
  • preferred specific transgenes are tumor suppressor genes such as p 1 6 or p53 (individually or in combination, e.g. P1 6 / p53), genes for various interleukins (individually or in combination, e.g. IL2 / IL7) and suicide genes, e.g. Herpes simplex virus type I thymidine kinase (HSV-TK).
  • the vector is suitable for gene transfer in cells or cell complexes which have changed, also pathological phenomena, for example for gene therapy, for example for the therapy of inherited or malignant diseases.
  • the vector is also suitable for vaccination, for example for vaccination against pathogens, in particular viruses, bacteria and eukaryotic single or multi-cells, or for vaccination against malignant or non-malignant cells or cell populations.
  • pathogens in particular viruses, bacteria and eukaryotic single or multi-cells
  • efficient expression of the transgene can be achieved even after multiple administration of the vector. This leads to considerable advantages, especially for applications in the field of gene therapy and vaccination.
  • Another advantage is the - compared to human adenovirus vectors - observed reduced expression of vector-inherent genes of the vector after the gene transfer into the target cell, preferably essentially no expression of vector-inherent genes after the gene transfer. This leads to a significantly increased safety for use in the organism, especially in humans.
  • the vector according to the invention can be used to transfer genetic material into a target cell and preferably to express this genetic material in the target cell and preferably to express this genetic material in the target cell.
  • the target cell is preferably a human cell.
  • non-human target cells in particular non-human mammalian cells, can also be used, for example, for veterinary or research applications.
  • the gene transfer can take place in vitro, ie in cultured cells, but also in vivo, ie in living organisms or specific tissues or organs of such organisms.
  • the vector according to the invention is particularly preferably used for gene transfer into muscle, in particular into the skeletal muscle. This finding is all the more surprising since previously used human adenoviral vectors only poorly infected the skeletal muscle.
  • the muscle cells are preferably selected from myocytes / myotubes / myofibers, fibroblasts, dendritic cells, endothelial cells and combinations thereof.
  • the preferred mode of administration of the vector depends on the intended application.
  • For muscle-directed gene transfer or transfer to a solid tumor for example, local application of the vector by intramuscular / intratumoral injection is preferable.
  • a systemic introduction for example by intra-arterial or intravenous injection, can take place for gene transfer to other target organs or tissues.
  • the directed transfer into special tissues or organs can take place either by a natural or modified tropism of the vector for certain cell types or by selecting vessels which supply the tissue to be found.
  • the dosage can only be decided after more detailed studies on the efficiency of gene transfer by the respective vector. Animal studies typically use 1 0 7 to 1 0 13 , eg 1 0 9 to 10 1 1 viral particles / kg body weight. However, the exact dosage can be modified depending on the type of vector, the type and severity of the disease and the type of administration.
  • a relatively low dose of the vector for example 1 0 7 to 1 0 9 viral particles per kilogram of body weight, is preferably used in the first doses in order to prevent an immune response from developing prevent the vector that could render the administration of subsequent doses ineffective.
  • non-human gene transfer adenovirus vectors can be carried out by inserting transgene expression cassettes and, if appropriate, further genetic elements into a base vector, e.g. B. a natural non-human adenovirus or a variant derived therefrom, e.g. B. a partially deleted variant and propagation of the resulting vector in suitable permissive cells.
  • a base vector e.g. B. a natural non-human adenovirus or a variant derived therefrom, e.g. B. a partially deleted variant and propagation of the resulting vector in suitable permissive cells.
  • Figure 1 Efficient expression of human oyAntitrypsin (hAAT) after injection of OAVhaat into the quadriceps muscle.
  • Blood was drawn three days after infection and the concentration of hAAT in the serum was determined by ELISA. Each pillar represents an individual animal.
  • FIG. 2 The skeletal muscle is the site of OAV infection and the site of OAV-mediated gene expression after intramuscular injection of OAVhaat in mice.
  • Balb / C mice were injected with 1x10 9 infectious particles OAVhaat (2 and 3) or with buffer (1) as described in Figure 1 and killed three days after application.
  • DNA and RNA were prepared from the injected skeletal muscle as well as from liver and spleen according to standard methods, a) Southern blotting of 20 ⁇ g DNA from skeletal muscle, liver and spleen digested with EcoRI. The hybridization was carried out against an OAV-specific probe, the position of the 2399 bp EcoRI fragment from the OAV vector is indicated.
  • OAV DNA digested with EcoRI equivalent to 5 copies per cell, was identified as Positive control used. Identical numbers denote identical animals, b) RNase protection assay with 20 ⁇ g total RNA from skeletal muscle. The hybridization was carried out against a 364 base long probe that spanned the EcoNI fragment of the human aat gene. 20 and 40 pg of a haat mRNA synthesized in vitro were used as a positive control; the position of the band specific to the haat transcript is indicated by the arrow.
  • FIG. 3 Dose-response relationship of OAV-dependent expression and the possibility of intramuscular readministration of OAV vectors in mice.
  • C57 / BI-6 mice received the specified amounts of infectious particles of OAVhaat (10 9 to 3x1 0 7 ) in an intramuscular injection.
  • the expression of the haat gene was determined by measuring the concentration of ⁇ antitrypsin in the serum of the mice three days after infection using an ELISA (dark columns). The second injection took place on day 35 after the first application of the vector, all animals received a dose of 5x10 8 infectious particles.
  • Serum hAAT was determined three days after the second vector administration (light gray columns).
  • HEK-293 cells human embryonic kidney cells ATCC CRL-1 573
  • permissive for E1-deleted human adenoviruses were cultivated in DMEM (Gibco BRL) supplemented with 2 mM glutamine and 10% fetal calf serum at 5% CO 2 .
  • CSL 503 cells fetal ovine lung cells, permissive for OAV, Pye et al, Austr. Vet. J. 66 (1 998), 231-232
  • OAVhAAT was used as the viral vector, which encodes the human ⁇ 1-antitrypsin (hAAT) cDNA under transcriptional control of the Rous Sarcoma virus 3'LTR contains (Hofmann et al., J. Virol 73 (1 999), 6930-6936).
  • Ad ⁇ haat an E1-deleted human Ad5 adenovirus vector, which contains the identical haat expression cassette as OAVhaat was used as a control.
  • the viruses were cultivated in permissive cell lines and purified as previously described (Sandig et al., Gene Therapy 3 (1 996), 1 002 - 1 009). Virus titers were determined by an endpoint dilution assay with permissive cell lines.
  • Typical titers for OAV and Ad5 vectors were 0.5 - 1 x 10 0 and 0.5 - 1 x 1 0 1 1 infectious particles per ml.
  • the ratio of particles to infectious particles for recombinant Ad5 and OAV Vectors was 40: 1.
  • mice Eight week old female Balb / C and C57 / BI-6 mice were purchased from Charles River, Germany. The mice were given intramuscular injections into the quadriceps muscle with a maximum volume of 35 ⁇ per injection. Blood was obtained from the outer tail vein to determine the serum ⁇ i-antitrypsin level. HAAT was determined by ELISA as described in Cichon and Strauss (Gene Therapy 5 (1 998) 85-90).
  • the titer of neutralizing antibodies against viral vectors was determined based on the ability of serum to inhibit infection of 293 cells by human Ad vectors and of CSL503 cells by OAV vectors as described in Hoffmann et al. (1 999), supra.
  • the antibody titer against hAAT in serum was determined by the method of Morral et al. (Hum Gene Ther 8 (1 997), 1 275 - 1 286).
  • RNA and total RNA from mouse tissues and cultured cells was isolated using standard methods. Southern blots for Detection of OAV-specific DNA in mouse organs was carried out as previously described (Hoffmann et al. (1 999), supra) using 20 ⁇ g genomic DNA. RNase protection tests were performed on 20 g of total skeletal muscle RNA using standard procedures. A radiolabeled 362 bp RNA fragment comprising the EcoN 1 fragment of human hAAT cDNA was used as a probe.
  • RT-PCR was performed with 2 ⁇ g total RNA from skeletal muscle using the Titan TM kit (Röche Diagnostics Mannheim, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • the efficient expression of the transgene and the presentation of the antigens encoded by the transgene are required.
  • the efficiency of the vaccination is reflected in the antibody titer against the transgene / antigen.
  • the potential of OAV as a vaccination vector was determined by a simple experiment. Balb / C mice received an intramuscular injection of 5 x 10 8 infectious particles OAVhAAT. On day 30 after infection, the antibody titers against the transgene product, human ⁇ vAntitrypsin, in the serum of the mice were determined as follows: 96-well plates were tested with 100 ⁇ l of an antibody directed against hAAT (DiaSorin, Stillwater, USA, cat. No.
  • the enzyme activity was determined using standard methods using OPD as the substrate, and the absorption was measured at 595 nm.
  • the antibody titer against hAAT was greater than 1 00000 after an injection of approx. 10 9 infectious particles.
  • the antibody titer, according to the administered dose of the vector OAVhaat was between 1 000 000 and 10 (see Table 1).
  • an infection with the human adenovirus Ad 5haat (1 0 10 infectious particles) and a corresponding transcript detection were carried out.
  • IMR 90 cells (Nichols et al., Science 1 96 (1 977), 60-63) were infected with OAVhaat at an MOI of 1. After 3 days, the expression of recombinant hAAT was quantified by an ELISA. The amount of the recombinant protein was determined with 1 mg / ml cell culture supernatant / 1 0 6 cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

The invention relates to the production of a non-human adenoviral vector for gene transfer into mammal cells. This vector is especially suited for the gene transfer into muscle, in particular, into the skeletal muscle, or into cell types found in the muscle or skeletal muscle. Areas of application include the fields of medicine, biotechnology and genetic engineering. When functional DNA sequences are inserted, the vector is suited for treating modified as well as pathological symptoms in cells or cell complexes, for producing biological materials and for vaccinating.

Description

NICHT-HUMANER ADENOVIRALER VEKTOR FÜR DEN GENTRANSFER, SEINE ANWENDUNG UND SEINE HERSTELLUNG
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines nicht humanen adenoviralen Vektors für den Gentransfer in Säugerzellen. Insbesondere eignet sich dieser Vektor für den Gentransfer in den Muskel, insbesondere in den Skelettmuskel, bzw. in Zelltypen, die im Muskel oder Skelettmuskel vorkommen . Anwendungsgebiete sind die Medizin, die Biotechnologie und die Gentechnik. Bei Einfügung funktioneller DNA-Sequenzen eignet sich der Vektor zur Behandlung von veränderten, auch krankhaften Erscheinungen in Zellen oder Zellkomplexen, zur Produktion biologischen Materials und zur Vakzinierung.
In den vergangenen Jahren sind zahlreiche Methoden und Vektoren für den Gentransfer mit dem Ziel einer Gentherapie oder Vakzinierung entwickelt worden (Übersicht bei: Verma, M.l . und Somia, N . ( 1 997) . Nature 389, 239-242) . Dabei werden vor allem Vektoren, die von Retroviren, Adeno- assoziierten Viren (AAV) oder humanen Adenoviren abgeleitet sind, für einen Gentransfer z.B. mit dem Ziel einer Gentherapie favorisiert. Diese Vektortypen haben ein breites Spektrum effizient infizierbarer Zelltypen und sind daher für den Gentransfer in verschiedene Gewebe geeignet.
Die adenoviralen Vektoren der sogenannten ersten Generation wurden über das letzte Jahrzehnt intensiv als Gentransfer-Vektoren erforscht (Übersicht bei: Bramson, J.L. et al. ( 1 995) . Curr. Op. Biotech. 6, 590-595) . Sie leiteten sich vom humanen Adenovirus des Serotyps 5 ab und sind , in der essentiellen E1 -Region, oft auch in der nicht-essentiellen E3-Region deletiert, wodurch bis zu 8 KBp Fremd-DNA in das Virusgenom inseriert werden können. Diese Vektoren können auf die E1 -Defizienz komplementierenden Zellen zu hohen Titern produziert werden, lassen sich gut lagern und vermitteln in vitro und in vivo einen effektiven Gentransfer. In vivo kommt es aber zu einem schnellen Verlust der Expression der Transgene sowie zum Verlust des Vektorgenoms. Ferner wurde teilweise massive Gewebe- Toxizität nach Applikation hoher Vektor-Dosen beobachtet. So führt beispielsweise die Verabreichung von humanen Adenovirusvektoren der ersten Generation in den Skelettmuskel von Mäusen zu einer Leukozyteninfiltration des infizierten Gewebes und zur Aktivierung einer T- Zell-Subklasse (Vilquin et al., Hum. Gene Ther. 6 ( 1 995), 1 391 -1401 ; Yang et al., Hum. Mol. Genet. 5 ( 1 996), 1 703-1 71 2) . Beides wird zumindest zum Teil durch immunologische Reaktionen auf die im Vektor verbliebenen viralen Gene verursacht. Es wurde daher versucht, vor allem weitere frühe virale Gene auszulagern, eine entscheidende Verbesserung des in vivo- Gentransfers konnte damit aber nicht erreicht werden.
Neuerdings entwickelte, vollständig rekombinante humane Adenovirus- Vektoren (Kochanek, S. et al. (1 996) . Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93; 5731 - 5736) zeigten in Tiermodellen einen effektiven Gentransfer bei reduzierter Toxizität und eine verlängerte Transgenexpression (Morral, N. et al. (1 998), Hum. Gen. Ther. 9: 2709-271 6) . Da aber auch diese Vektoren die normale Hülle des humanen Adenovirus sowie im Vektorgenom die für Replikation und Verpackung notwendigen cis-Elemente - die Inverted Terminal Repeats (ITRs) und das Verpackungssignal - aufweisen, bleiben auch bei diesen Vektoren zwei Limitierungen bestehen, die als die Hauptprobleme humaner Adenovirus-Vektoren gelten können. Beide liegen im menschlichen Ursprung der verwendeten Adenovirusvektoren und der weiten Verbreitung dieser Viren in der menschlichen Bevölkerung begründet: (1 ) Die zumeist vorhandene Immunität gegen humane Adenoviren führt zu weitgehender Neutralisierung und Opsonisierung des Vektors. Aktuelle Studien in Tiermodellen haben gezeigt, daß ein effizienter Gentransfer bei Vorhandensein dieser Immunität nur durch Einsatz hoher Vektor-Dosen möglich ist (Nunes, F.A. et al. (1 999), Hum. Gen. Ther. 10, 251 5-2526), was jedoch zu starken toxischen Nebenwirkungen, unter anderem auch gravierenden hämatologischen Nebeneffekten führen kann (Cichon, G. et al. (1 999), J . Gene Med. 1 , 360-371 ) . (2) Zudem besteht die Gefahr einer Koreplikation des rekombinanten Vektors bei einer natürlichen Infektion mit einem Wildtyp-Adenovirus mit nicht einschätzbaren Folgen. Derzeit beschriebene humane Adenovirus-Vektoren können daher für eine Anwendung zur Gentherapie beim Menschen nur eingeschränkt in Betracht gezogen werden. Ein Ansatz zur Überwindung des Problems der Immunität gegen humane Adenoviren wurde in neuerer Zeit durch die Entwicklung adenoviraler Vektoren nicht humanen Ursprungs gefunden. Das virale Genom ist bei diesen Vektoren weitgehend unverändert, in der Regel wurden kleinere, für die Virus-Propagierung nicht-essentielle Regionen durch ein Transgen ersetzt (WO 97/06826; Mittal, S. K. et al. ( 1 995), J.Gen. Virol. 76, 93-1 02; Klonjkowski, B. et al. ( 1 997), Hum. Gen. Ther. 8: 21 03-21 1 5; Michou, I . et al. ( 1 999) . J . Virol. 72, 1 399-1410) . Ein effizienter Gentransfer mit nicht humanen adenoviralen Vektoren in vivo wurde bisher jedoch noch nicht experimentell gezeigt.
Die sich bei bisher bekannten adenoviralen Vektoren ergebenden Probleme können durch den Einsatz eines nicht humanen adenoviralen Vektors gelöst werden, der DNA-Sequenzen in Zielzellen, insbesondere Säugerzellen, transferieren kann und dort eine vorzugsweise transiente Expression des transduzierten Gens in der Zelle bzw. im Organismus bewirkt. Insbesondere eignet sich der nicht humane adenovirale Vektor für den effizienten Gentransfer in vivo, z.B. zur Transduktion von Säugerzelltypen, die im
Muskel vorkommen, bzw. in der Skelettmuskulatur. Vorrangiges
Einsatzgebiet ist der Transfer von genetischem Material in Zellen, beispielsweise mit den Zielen: Therapie genetisch bedingter und erworbener
Erkrankungen, Produktion rekombinanter Proteine sowie Vakzinierung von Tieren und Menschen. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung eines nichthumanen Adenovirusvektors zur Herstellung eines Mittels für den Transfer von genetischem Material, umfassend die Hülle eines nicht humanen Adenovirus und darin verpacktes genetisches Material, das (a) DNA-Sequenzen von einem nicht humanen Adenovirus und
(b) eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die für bezüglich des nicht humanen Adenovirus heterologe Peptide oder Polypeptide kodieren, in operativer Verknüpfung mit Expressionskontrollsequenzen, enthält.
Das genetische Material des erfindungsgemäßen Gentransfervektors enthält DNA-Sequenzen von einem nicht humanen Adenovirus, d.h. eines Adenovirus, das natürlicherweise in einer nicht humanen Spezies vorkommt, die beispielsweise ausgewählt ist aus Säugern und Vögeln, wie aufgeführt in Russell, W.C. und Benkö, M. ( 1 999), Adenoviruses (Adenoviridae) : Animal viruses. In: Granoff, A. und Webster, R.G. (Eds): Encyclopedia of Virology. Academic Press, London, und zwar vor allem Adenoviren aus Affen (SAV, verschiedene Serotypen), Ziegen (caprine, verschiedene Serotypen) , Hunden (CAV, verschiedene Serotypen), Schweinen (PAV, verschiedene Serotypen), Rindern (BAV, verschiedene Serotypen, Schafen (OAV1 -6 und OAV287) und Hühnern (FAV, verschiedene Serotypen) und EDS-Virus. Vorzugsweise ist das Virus ein Adenovirus vom Schaf oder Rind. Beispiele für geeignete Schafadenoviren sind ovine Mastadenoviren oder ovine Atadenoviren wie etwa das OAV-Isolat 287, dessen Nukleotidsequenz unter der Genbank Acc. No. U40389 angegeben ist. Geeignete Rinder- Adenoviren sind bovine Atadenoviren oder bovine Mastadenoviren. Dabei sind im Komplement-Fixierungsassay negative bovine und ovine Atadenoviren besonders interessant.
Weiterhin enthält der erfindungsgemäße Gentransfervektor eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die für bezüglich des nicht humanen Adenovirus heterologe Peptide oder Polypeptide kodieren, in operativer Verknüpfung mit
Expressionskontrollsequenzen, d.h. eine Expressionskassette für ein oder mehrere Transgene. Die Expressionskassette für das Transgen kann beispielsweise in eine Klonierungsstelle inseriert werden.
Die Transgen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Expressionskontrollsequenzen, die eine Expression in Säugerzellen, beispielsweise in humanen Zellen, erlauben. Die Expressionskontrollsequenzen können konstitutiv in der gewünschten Zielzelle aktiv oder/und regulierbar sein. Die Expressionskontrollsequenzen können viralen oder zellulären Ursprungs sein oder eine Kombination viraler und zellulärer Elemente umfassen. Beispiele für geeignete Promotoren sind virale Promotoren, z.B. RSV-Promotor, CMV Immediate Early Promotor/Enhancer, SV40-Promotor, oder gewebespezifische, dabei vor allem leberspezifische Promotoren, z.B. der humane Albumin-Promotor (Ponder et al., Hum. Gene Ther. 2 (1991), 41-52), der humane σ-1- Antitrypsin Promotor/Enhancer (Shen etal., DNA 8 (1989), 101-108), der PEPCK-Promotor (Ponder et al., Hum. Gene Ther. 2 (1991), 41-52) oder HBV-abgeleitete Hybrid-Promotoren, z.B. EilmCMV-Promotor (Löser et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 377 (1996), 187-193). Weiterhin umfassen die Expressionsregulationssequenzen günstigerweise ein Polyadenylierungssignal, beispielweise das des Rinder-Wachstumshormongens (Goodwin & Rottman, J. Biol. Chem.267 (1992); 16330-16334), das der frühen Transkriptionseinheit von SV40 (van den Hoff et al., Nucleic Acids Res.21 (1993), 4987-4988) oder das des Herpes Simplex Thymidin- Kinase-Gens (Schmidt et al., Mol. Cell. Biol. 10, (1990), 4406-4411.
Der virale Gentransfervektor kann zum Transfer heterologer Nukleinsäuren in permissive Zellen, Zellverbände, Organe und Organismen, insbesondere zur Gentherapie oder zur Vakzinierung eingesetzt werden. Zum Ziel einer Gentherapie kann die genomische Sequenz oder die cDNA eines Gens verwendet werden, dessen Produkt in dem zu behandelnden Patienten fehlt, in unphysiologischen Mengen auftritt oder/und defekt ist. Man kann auch einen Teil einer genomischen Sequenz einsetzen, die eine Mutation im Zielgen überspannt und mit dieser homolog rekombiniert werden kann. Zum Ziel einer Tumorgentherapie können verschiedene Gene, die ein verlangsamtes Wachstum oder ein Abtöten der Tumorzellen gegebenenfalls in Kombination mit Pharmaka oder durch Immunstimulation bewirken, eingesetzt werden. Zum Ziel einer Vakzinierung können ein oder mehrere, gegebenenfalls veränderte Gene eines pathogenen Organismus, gegen den eine Immunisierung erreicht werden soll, eingesetzt werden.
Weiterhin kann der erfindungsgemäße Gentransfervektor genetisches Material von anderen Viren enthalten, beispielsweise exprimierte oder regulatorische Sequenzen von Hepatitis B und Hepatitis C Virus (HBV, HCV), sowie von Bakterien und pathogenen Ein- oder Mehrzellern, beispielsweise Plasmodium faiciparum.
Bevorzugte konkrete Beispiele für Transgene zum Ziel einer Substitutions- Gentherapie sind Gene für sekretierte Serumfaktoren (z.B. humane Blutgerinnungsfaktoren IX (FIX) und VIII (FVIII), Erythropoietin (Epo) σ-1 - Antitrypsin (AAT)), sowie Gene für Proteine, die bei Muskelerkrankungen einsetzbar sein könnten (z.B. Dystrophin, Utrophin), und das bei Morbus Wilson defekte Gen (ATP7B) . Zum Ziel einer Tumortherapie sind bevorzugte konkrete Transgene Tumorsuppressorgene wie p 1 6 oder p53 (einzeln oder in Kombination, z.B. P1 6/p53), Gene für verschiedene Interleukine (einzeln oder in Kombination, z.B. IL2/IL7) sowie Suizid-Gene, z.B. Herpes Simplex Virus Typ I Thymidin-Kinase (HSV-TK) .
Der Vektor ist geignet für den Gentransfer in Zellen oder Zellkomplexen, die veränderte, auch krankhafte Erscheinungen aufweisen, z.B. für die Gentherapie, beispielsweise zur Therapie von ererbten oder malignen Erkrankungen. Der Vektor eignet sich ebenso für die Vakzinierung, z.B. für die Vakzinierung gegen Pathogene, insbesondere Viren, Bakterien sowie eukaryontische Ein- oder Mehrzeller oder für die Vakzinierung gegen maligne oder nichtmaligne Zellen bzw. Zellpopulationen. Überraschenderweise kann eine effiziente Expression des Transgens selbst nach einer mehrfachen Verabreichung des Vektors erreicht werden. Dies führt zu erheblichen Vorteilen gerade auch für Anwendungen auf dem Gebiet der Gentherapie und der Vakzinierung. Ein weiterer Vorteil ist die - im Vergleich mit humanen Adenovirusvektoren - beobachtete verringerte Expression von vektoreigenen Genen des Vektors nach dem Gentransfer in die Zielzelle, wobei vorzugsweise im wesentlichen überhaupt keine Expression von vektoreigenen Genen nach dem Gentransfer erfolgt. Dies führt zu einer deutlich erhöhten Sicherheit für die Anwendung im Organismus, insbesondere im Menschen.
Ein wichtiges Anwendungsgebiet ist der Einsatz des Gentransfervektors zur Gewinnung von Proteinen durch Überexpression in kultivierten Zellen. Aufgrund der sehr effizienten Expression der mittels des Vektors transduzierten Gene in Zellkulturen, z.B. in IMR-90 und humanen leberabgeleiteten Zellen, wird eine innovative Basis zur Produktion von rekombinanten Proteinen im industriellen Maßstab ermöglicht, die mit der bisher hauptsächlich verwendeten Produktion in CHO Zellen konkurrieren kann.
Der erfindungsgemäße Vektor kann zum Transfer von genetischem Material in eine Zielzelle und vorzugsweise zur Expression dieses genetischen Materials in der Zielzelle und vorzugsweise zur Expression dieses genetischen Materials in der Zielzelle verwendet werden. Die Zielzelle ist bevorzugt eine humane Zelle. Es können jedoch auch nicht humane Zielzellen, insbesondere nicht humane Säugerzellen, beispielsweise für veterinärmedizinische Anwendungen oder Anwendungen in der Forschung, verwendet werden. Der Gentransfer kann in vitro, d.h. in kultivierten Zellen, aber auch in vivo, d.h. in lebenden Organismen oder spezifischen Geweben oder Organen derartiger Organismen erfolgen. Besonders bevorzugt wird der erfindungsgemäße Vektor zum Gentransfer in Muskel, insbesondere in den Skelettmuskel, eingesetzt. Dieser Befund ist umso überraschender, da bisher verwendete humane adenovirale Vektoren den Skelettmuskei nur schlecht infizierten. Die Muskelzellen sind bevorzugt ausgewähltaus Myozyten/Myotubes/Myofibers, Fibroblasten, dendritischen Zellen, Endothelzellen und Kombinationen davon.
Die bevorzugte Verabreichungsform des Vektors hängt von der geplanten Anwendung ab. Für muskelgerichteten Gentransfer oder Transfer in einen soliden Tumor ist beispielsweise eine lokale Applikation des Vektors durch intramuskuläre/intratumorale Injektion vorzuziehen. Zum Gentransfer in andere Zielorgane oder -gewebe kann eine systemische Einbringung, beispielsweise durch intraarterielle oder intravenöse Injektion erfolgen. Der gerichtete Transfer in spezielle Gewebe oder Organe kann im letzteren Fall entweder durch einen natürlichen bzw. modifizierten Tropismus des Vektors für betimmte Zelltypen oder durch Auswahl von Gefäßen, die das zu treffende Gewebe versorgen, erfolgen.
Die Dosierung kann erst nach genaueren Studien zur Effizienz des Gentransfers durch den jeweiligen Vektor entschieden werden. In tierexperimentellen Studien werden typischerweise 1 07 bis 1 013, z.B. 1 09 bis 101 1 virale Partikel/Kg Körpergewicht eingesetzt. Die genaue Dosierung kann jedoch je nach der Art des Vektors, der Art und Schwere der Erkrankung und der Art der Verabreichung modifiziert werden.
Für den Fall, dass mehrere Dosierungen des Vektors in zeitlichen Abständen verabreicht werden sollen, wird bei den ersten Dosierungen vorzugsweise eine relativ geringe Dosierung des Vektors, z.B. 1 07 bis 1 09 virale Partikel pro Kilogramm Körpergewicht eingesetzt, um das Entstehen einer Immunantwort gegen den Vektor zu verhindern, durch welche die Verabreichung nachfolgender Dosierungen unwirksam gemacht werden könnte. Überraschenderweise wurde gefunden, dass selbst bei der Vera b re ich ung g eri n ge r Vektordo s ieru n gen ein e effiziente Transgenexpression gefunden wird .
Die Herstellung nicht humanerGentransfer-Adenovirus-Vektoren kann durch Insertion von Transgen-Expressionskassetten und gegebenfalls weiterer genetischer Elemente in einen Basisvektor, z. B. einen natürlichen nicht humanen Adenovirus oder eine davon abgeleitete Variante, z. B. eine partiell deletierte Variante und Vermehrung des resultierenden Vektors in geeigneten permissiven Zellen erfolgen.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele erläutert werden. Es zeigen:
Abbildung 1 : Effiziente Expression von humanem oyAntitrypsin (hAAT) nach Injektion von OAVhaat in den Quadriceps-Muskel. Je 5 Tiere aus zwei Mausstämmen (Balb/C und C57/BI-6) erhielten Injektionen von insgesamt ca. 1 x 1 09 infektiösen Partikeln OAVhaat in einem Volumen von insgesamt 1 50 μ\ (75 μ\ pro Hinterbein) . Drei Tage nach Infektion wurde Blut entnommen und die Konzentration von hAAT im Serum mittels ELISA bestimmt. Jede Säule repräsentiert ein individuelles Tier.
Abbildung 2: Der Skelettmuskel ist Ort der Infektion durch OAV und Ort der OAV-vermittelten Genexpression nach intramuskulärer Injektion von OAVhaat in Mäuse. Balb/C-Mäuse wurden mit 1 x109 infektiösen Partikeln OAVhaat (2 und 3) oder mit Puffer ( 1 ) wie in Abbildung 1 beschrieben injiziert und drei Tage nach Applikation getötet. DNA und RNA wurden aus dem injizierten Skelettmuskel sowie aus Leber und Milz nach Standardmethoden präpariert, a) Southern Blotting von 20 μg mit EcoRI verdauter DNA aus Skelettmuskel, Leber und Milz. Die Hybridisierung erfolgte gegen eine für OAV spezifische Sonde, die Position des 2399 bp großen EcoRI-Fragmentes aus dem OAV-Vektor ist angezeigt. Mit EcoRI verdaute OAV-DNA, äquivalent zu 5 Kopien pro Zelle, wurde als Positivkontrolle benutzt. Identische Nummern bezeichnen identische Tiere, b) RNase-Schutz-Assay mit 20 μg Gesamt-RNA aus Skelettmuskel. Die Hybridisierung erfolgte gegen eine 364 Basen lange Sonde, die das EcoNI- Fragment des humanen aat-Gens überspannt. 20 und 40 pg einer in vitro synthetisierten haat-mRNA wurden als Positivkontrolle benutzt; die Position der für das haat-Transkript spezifischen Bande wird durch den Pfeil angezeigt.
Abbildung 3: Dosis-Wirkungs-Beziehung von OAV-abhängiger Expression und Möglichkeit der intramuskulären Readministration von OAV-Vektoren in Mäusen. C57/BI-6-Mäuse erhielten in einer intramuskulären Injektion die angegebenen Mengen infektiöser Partikel von OAVhaat (109 bis 3x1 07 ). Die Expression des haat-Gens wurde durch Messung der Konzentration von σ Antitrypsin im Serum der Mäuse drei Tage nach Infektion mittels ELISA bestimmt (dunkle Säulen) . Die zweite Injektion erfolgte am Tag 35 nach der ersten Applikation des Vektors, alle Tiere erhielten eine Dosis von 5x108 infektiösen Partikeln. Die Bestimmung von Serum-hAAT erfolgte drei Tage nach der zweiten Vektorgabe (hellgraue Säulen) .
Beispiele:
1 . Material und Methoden 1. 1 Zellen und Viren
HEK-293 Zellen (humane embryonale Nierenzellen ATCC CRL-1 573), permissiv für E1 -deletierte humane Adenoviren) wurden in DMEM (Gibco BRL) supplementiert mit 2 mM Glutamin und 1 0% foetalem Kälberserum bei 5% C02 kultiviert. CSL 503 Zellen (foetale ovine Lungenzellen, permissiv für OAV, Pye et al, Austr. Vet. J . 66 ( 1 998), 231 - 232) wurden unter den gleichen Bedingungen, aber in 1 5 % foetalem Kälberserum kultiviert.
Als viraler Vektor wurde OAVhAAT verwendet, der die humane σ1 - Antitrypsin (hAAT) cDNA unter transkriptioneller Kontrolle der Rous Sarcoma-Virus 3'LTR enthält (Hofmann et al., J . Virol 73 (1 999), 6930 - 6936) . Als Kontrolle wurde Adδhaat verwendet, ein E1 -deletierter humaner Ad5 Adenovirusvektor, welcher die identische haat-Expressionskassette wie OAVhaat enthält. Die Viren wurden in permissiven Zelllinien kultiviert und wie zuvor beschrieben aufgereinigt (Sandig et al., Gene Therapy 3 ( 1 996), 1 002 - 1 009) . Virustiter wurden durch einen Endpunkt-Verdünnungs-Assay mit permissiven Zelllinien bestimmt. Typische Titer für OAV- und Ad5- Vektoren waren 0,5 - 1 x 1 010 bzw. 0,5 - 1 x 1 01 1 infektiöse Partikel pro ml. Das Verhältnis von Partikeln zu infektiösen Partikeln für rekombinante Ad5- und OAV-Vektoren war 40: 1 .
1.2 Versuchstiere
Acht Wochen alte weibliche Balb/C und C57/BI-6 Mäuse wurden von Charles River, Deutschland, bezogen. Den Mäusern wurden intramuskuläre Injektionen in den Quadricepsmuskel mit einem Maximalvolumen von 35 μ\ pro Injektion verabreicht. Das Blut wurde aus der äußeren Schwanzvene gewonnen, um den Serum αi-Antitrypsin-Spiegel zu bestimmen . Die Bestimmung von hAAT erfolgte durch ELISA wie bei Cichon und Strauss (Gene Therapy 5 (1 998) 85 - 90) beschrieben.
Der Titer von neutralisierenden Antikörpern gegen virale Vektoren wurde aufgrund der Fähigkeit von Serum zur Hemmung der Infektion von 293 Zellen durch humane Ad-Vektoren und von CSL503 Zellen durch OAV- Vektoren wie bei Hoffmann et al. (1 999), supra, beschrieben bestimmt. Der Antikörpertiter gegen hAAT in Serum wurde nach dem Verfahren von Morral et al. (Hum Gene Ther 8 ( 1 997), 1 275 - 1 286) bestimmt.
1.3 Analyse von DNA und RNA
DNA und Gesamt-RNA aus Mausgeweben und kultivierten Zellen wurde unter Verwendung von Standardmethoden isoliert. Southern Blots zum Nachweis OAV-spezifischer DNA in Mausorganen wurde wie zuvor beschrieben (Hoffmann et al . ( 1 999), supra) unter Verwendung von 20 μg genomischer DNA durchgeführt. RNase-Protektionstests wurden mit 20 g Gesamt-RNA aus Skelettmuskel unter Verwendung von Standardprozeduren durchgeführt. Ein radiomarkiertes 362 bp RNA-Fragment umfassend das EcoN 1 -Fragment von humaner hAAT cDNA wurde als Sonde verwendet.
RT-PCR wurde mit 2 μg Gesamt-RNA aus Skelettmuskel unter Verwendung des Titan™ Kits (Röche Diagnostics Mannheim, Deutschland) nach den Instruktionen des Herstellers durchgeführt.
2. Ergebnisse
2.1 Hochexpression von Serumproteinen nach Injektion eines von OA V abgeleiteten Vektors in den Skelettmuskel von Mäusen
Injektion von ca. 1 09 infektiösen Partikeln des Vektors OAVhaat in den M. quadriceps von Balb/C-bzw. C57/BI-6-Mäusen erbrachte Konzentrationen des Transgens (hAAT) im Mausserum, die zwischen 2,6 und 5,9 μg/ml (Balb/C) und 9,8 und 20,0 vg/ml (C57/BI-6) lagen.
Um nachzuweisen, dass der Muskel tatsächlich der Ort sowohl der Infektion durch den Vektor als auch der Expression der hAAT-cDNA ist, wurden die Präsenz für den Vektor spezifischer DNA mittels Southern Blotting (Abbildung 2a) und für das hAAT-Transkript spezifischer RNA mittels RNase-Protektions-Assay (Abbildung 2b) durchgeführt. Wie aus Abbildung 2a ersichtlich ist, war für OAV spezifische DNA zwar im Skelettmuskel nachweisbar, nicht aber in Leber und Milz, den Organen, die bei Ausschwemmung des Vektors in den Kreislauf primäres Ziel einer Infektion wären. Es ist daher davon auszugehen, dass kein größerer Anteil des verabreichten Vektors nach intramuskulärer Injektion in das System gelangt ist. Abbildung 2b zeigt deutlich, dass im Skelettmuskel hohe Konzentrationen für das Transgenprodukt hAAT spezifischer RNA nachzuweisen sind, was den Skelettmuskel als Ort der hAAT-Genexpression nach intramuskulärer Vektorgabe ausweist.
Die hohe Effizienz des muskelspezifischen Gentransfers mit OAV- abgeleiteten Vektoren wird aus Abbildung 3 erkennbar. Die Injektion abnehmender Dosen von OAVhAAT in den Skelettmuskel (1 09 bis 3x1 07 infektiöse Partikel pro Injektion) ergab zwar abnehmende hAAT- Konzentrationen im Serum der entsprechenden Mäuse, jedoch wurde mit der geringsten Dosis (3 x 107 infektiöse Partikel) noch immer eine hAAT- Konzentration von mehr als 1 00 ng/ml erreicht. Dies ist eine Konzentration, die über den für die meisten therapeutischen Serumproteine (z.B. Koagulationsfaktoren) notwendigen therapeutischen Konzentrationen liegt. Bei geringen verabreichten Dosen war darüber hinaus eine wiederholte intramuskuläre Injektion desselben Vektors möglich, die bei einer zweiten Verabreichung von 5 x 108 infektiösen Partikeln 35 Tage nach der ersten Verabreichung moderate Serumkonzentrationen an hAAT ergaben (250 - 2300 ng/ml, dunkle Balken in Abbildung 3) . Die Ursache für diese Phänomen liegt offensichtlich in der Induktion einer nur geringfügigen Immunantwort gegen den Vektor, insbesondere bei Nutzung einer kleinen Vektordosis.
2.2 Induktion einer humoralen Immunantwort gegen das Transgenprodukt nach Injektion eines von OA V-abgeleiteten Vektors in den Skelettmuskel von Mäusen
Für die Nutzung eines Vektors für die Vakzinierung ist die effiziente Expression des Transgens und die Präsentation der durch das Transgen kodierten Antigene erforderlich. Die Effizienz der Vakzinierung spiegelt sich im Antikörpertiter gegen das Transgen/Antigen wider. Das Potential von OAV als Vakzinierungsvektor wurde durch ein einfaches Experiment bestimmt. Balb/C-Mäuse erhielten eine intramuskuläre Injektion von 5 x 1 08 infektiösen Partikeln OAVhAAT. Am Tag 30 nach Infektion wurden die Antikörpertiter gegen das Transgenprodukt, humanes αvAntitrypsin, im Serum der Mäuse folgendermaßen bestimmt: 96-Well Platten wurden mit 1 00 μ\ eines gegen hAAT gerichteten Antikörpers (DiaSorin, Stillwater, USA, Kat.-Nr. 80852) für 1 h bei 37 °C beschichtet, über Nacht mit Blockpuffer (5 % Magermilchpulver in TBS, 0.05 % Tween 20) bei 4°C und anschließend mit einem hAAT-Standard (100 ng/ml in 1 00 μl) für 2 h bei 37 ° C inkubiert. Auf die Platte wurden dann Verdünnungen der entsprechenden Mausseren ( 1 : 1 0 bis 1 : 100000, in einem Volumen von 1 00 μ\) gegeben und die Platten für 2 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 100 μl eines gegen Maus-IgG gerichteten, Peroxidase-gekoppelten Antikörpers aus Kaninchen (Pierce, Rockford, USA) zugegeben, und die Inkubation wurde für 2 h fortgesetzt. Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte nach Standardmethoden unter Nutzung von OPD als Substrat, die Messung der Absorption wurde bei 595 nm durchgeführt. Im Serum aller untersuchten Mäusen des Stammes Balb/C (n = 5) war der Antikörpertiter gegen hAAT nach einer Injektion von ca. 1 09 infektiösen Partikeln größer als 1 00000. Im Serum von Mäusen des Stammes C57/BI-6 (n = 5) lag der Antikörpertiter, entsprechend der verabreichten Dosis des Vektors OAVhaat, zwischen 1 00000 und 1 0 (siehe Tabelle 1 ) . Die Induktion von gegen hAAT gerichteten Antikörpern in letzgenanntem Mausstamm ist bemerkenswert, da dieser Stamm nach Infektion mit humanen adenoviralen Vektoren, die das hAAT-Gen transduzieren, keine Antikörper gegen das Transgenprodukt bildeten (Michou et al., Gene Therapy 4 (1 997), 473 - 482; Morral et al., ( 1 997) supra) . Tabelle 1 . Antikörpertiter gegen hAAT im Serum von Mäusen (C57/BI-6), die eine intramuskuläre Injektion der angegebenen Dosis von OAVhaat erhielten.
Figure imgf000016_0001
2.3 Keine nachweisbare Expression von OA V-Genen nach Infektion.
Um nachzuweisen, ob die Injektion von OAV im Skelettmuskel von Mäusen zur Expression von frühen oder späten OAV-Genen führt, wurde 20 und 40 h nach Infektion Gesamt-RNA aus dem Skelettmuskel gewonnen und auf OAV-spezifische Transkripte durch RT-PCR analysiert. In Kontrolltieren wurde eine Infektion mit dem humanen Adenovirus Ad 5haat ( 1 010 infektiöse Partikel) und ein entsprechender Transkriptnachweis durchgeführt.
In mit OAVhaat infizierten Maus-Skelettmuskelzellen konnten weder frühe OAV-Gene (E4-Gen, DNA-Bindungsprotein-Gen) noch späte OAV-Gene (Hexon-Gen und pVII-Gen) nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnten in mit Adδhaat infizierten Skelettmuskelzellen PCR-Produkte des E4orf6 Gens (20 und 40 h nach Infektion) und des DNA-Bindungsprotein- Gens (20 h nach Infektion) nachgewiesen werden.
Während somit virale Gene des Ad5-Vektors im Maus-Skelettmuskel exprimiert werden, konnte eine Expression von viralen Genen des OAV nicht nachgewiesen werden. 2.4 Effiziente Expression von mittels eines nicht humanen Adenovirusvektors transduzierten Genen im Zellkultursystem
IMR 90-Zellen (Nichols et al., Science 1 96 ( 1 977), 60-63) wurden mit OAVhaat bei einer MOI von 1 infiziert. Nach 3 Tagen wurde die Expression von rekombinantem hAAT durch einen ELISA quantitativ bestimmt. Die Menge des rekombinanten Proteins wurde mit 1 mg/ml Zellkulturüberstand/1 06 Zellen bestimmt.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines nicht humanen Adenovirusvektors zur Herstellung eines Mittels für den Transfer von genetischem Material, umfassend die Hülle eines nicht humanen Adenovirus und darin verpacktes genetisches Material, das
(a) DNA-Sequenzen von einem nicht humanen Adenovirus und
(b) eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die für bezüglich des nicht humanen Adenovirus heterologe Peptide oder Polypeptide kodieren, in operativer Verknüpfung mit Expressionskontrollsequenzen enthält.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein Adenovirus aus einer nicht humanen Spezies, ausgewählt aus Säugern und Vögeln, ist.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein Adenovirus von Schaf oder Rind ist.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein ovines oder bovines Mastadenovirus oder
Atadenovirus ist.
5. Verwendung nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Adenovirus vom Schaf das OAV-Isolat 287 ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für den Gentransfer in Zellen oder Zellkomplexe, die veränderte, auch krankhafte Erscheinungen aufweisen.
7. Verwendung nach Anspruch 6 zur Therapie von ererbten, erworbenen oder malignen Erkrankungen.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die DNA- Vakzinierung .
9. Verwendung nach Anspruch 8 für die Vakzinierung gegen Pathogene, insbesondere Viren, Bakterien sowie eukaryontische Ein- oder Mehrzeller.
1 0. Verwendung nach Anspruch 8 für die Vakzinierung gegen maligne oder nichtmaligne Zellen bzw. Zellpopulationen.
1 1 . Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Produktion rekombinanter Proteine.
1 2. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 zum Transfer von genetischem Material in Säugerzellen.
1 3. Verwendung nach Anspruch 1 2 zum Transfer von genetischem Material in humane Zellen.
14. Verwendung nach Anspruch 1 2 oder 1 3 zum Transfer von genetischem Material in den Muskel, insbesondere in den Skelettmuskel.
1 5. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet. dass die Muskelzellen ausgewählt sind aus Myozyten/Myotubes/Myofibers, Fibroblasten, dendritischen Zellen, Endothelzellen und Kombinationen davon.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Gentransfer durch Injektion erfolgt.
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine mehrfache Verabreichung des Vektors erfolgt.
PCT/EP2000/007601 1999-08-06 2000-08-04 Nicht-humaner adenoviraler vektor für den gentransfer, seine anwendung und seine herstellung WO2001011066A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU62806/00A AU6280600A (en) 1999-08-06 2000-08-04 Non-human adenoviral vector for gene transfer, its use and the production thereof
EP00949457A EP1198579A1 (de) 1999-08-06 2000-08-04 Nicht-humaner adenoviraler vektor für den gentransfer, seine anwendung und seine herstellung

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19938332 1999-08-06
DE19938332.4 1999-08-06
DE10019006.5 2000-04-17
DE10019006A DE10019006A1 (de) 1999-08-06 2000-04-17 Neuartiger adenoviraler Vektor für den Gentransfer, seine Anwendung und seine Herstellung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001011066A1 true WO2001011066A1 (de) 2001-02-15

Family

ID=26005350

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2000/007601 WO2001011066A1 (de) 1999-08-06 2000-08-04 Nicht-humaner adenoviraler vektor für den gentransfer, seine anwendung und seine herstellung

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1198579A1 (de)
AU (1) AU6280600A (de)
WO (1) WO2001011066A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7091030B2 (en) 2001-12-12 2006-08-15 Kerrie Setiawan Composition for the preservation of viruses

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997006826A1 (en) * 1995-08-14 1997-02-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Gene therapy using ovine adenoviral vectors
US5820868A (en) * 1993-12-09 1998-10-13 Veterinary Infectious Disease Organization Recombinant protein production in bovine adenovirus expression vector system
FR2763959A1 (fr) * 1997-06-02 1998-12-04 Transgene Sa Nouveaux vecteurs adenoviraux recombinants comprenant une sequence d'epissage
EP1001030A1 (de) * 1998-09-22 2000-05-17 Boehringer Ingelheim International GmbH Rekombinantes CELO-Virus und CELO-Virus-DNA

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5820868A (en) * 1993-12-09 1998-10-13 Veterinary Infectious Disease Organization Recombinant protein production in bovine adenovirus expression vector system
WO1997006826A1 (en) * 1995-08-14 1997-02-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Gene therapy using ovine adenoviral vectors
FR2763959A1 (fr) * 1997-06-02 1998-12-04 Transgene Sa Nouveaux vecteurs adenoviraux recombinants comprenant une sequence d'epissage
EP1001030A1 (de) * 1998-09-22 2000-05-17 Boehringer Ingelheim International GmbH Rekombinantes CELO-Virus und CELO-Virus-DNA

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN H.-H. ET AL.: "DNA FROM BOTH HIGH-CAPACITY AND FIRST-GENERATION ADENOVIRAL VECTORSREMAINS INTACT IN SKELETAL MUSCLE", HUMAN GENE THERAPY, vol. 10, no. 3, February 1999 (1999-02-01), pages 365 - 373, XP000891934, ISSN: 1043-0342 *
HOFMANN C. ET AL.: "Ovine adenovirus vectors overcome preexisting humoral immunity against human adenoviruses in vivo.", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 73, no. 8, 20 July 1999 (1999-07-20), pages 6930 - 6936, XP002153161, ISSN: 0022-538X *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7091030B2 (en) 2001-12-12 2006-08-15 Kerrie Setiawan Composition for the preservation of viruses

Also Published As

Publication number Publication date
EP1198579A1 (de) 2002-04-24
AU6280600A (en) 2001-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69534618T2 (de) Verfahren zur herstellung rekombinanter adeno-associated viren (aav) und deren verwendung
DE69534166T2 (de) Rekombinanter adenovirus und methoden zu dessen verwendung
DE69434781T2 (de) Defektive rekombinante adenoviren zur tumor-gentherapie
DE69534902T2 (de) Rekombinanter viraler DNS Vektor zur Transfektion tierischer Zellen
DE60035124T2 (de) Ein oncolytisches adenovirus
DE69636055T2 (de) Adenovirale vektoren, die nicht von gruppe c adenovirus typen abgeleitet sind
DE69429260T3 (de) Adenovirale vektoren tierischen ursprungs und ihre verwendung bei der gentherapie
DE69914382T2 (de) Verwendung der Leserahmen der adenoviralen E4-Region zur Verbesserung der Genexpression
DE69839071T2 (de) Adenovirale vektoren spezifisch für zellen, welche alpha-fetoprotein exprimieren, sowie methoden zu deren verwendung
DE69333886T2 (de) Adenovirus-gelenkter Gen-Transfer zum Herz-und glattem vaskulären Muskel
DE69518910T3 (de) Verfahren zur herstellung von viralen vektoren von mindestens 20kb durch intermolekulare homologe rekombination in einer prokaryotischen zelle
DE69531387T2 (de) Von Adenovirus abgeleitete rekombinante Vektoren, für Gentherapie
DE69633565T2 (de) Verpackungssysteme für humane rekombinante adenoviren, zur vewendung in der ge ntherapie
DE69230993T3 (de) Rekombinante viren vektoren zur expression in muskelzellen
DE69434594T2 (de) Rekombinante adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
EP3132043B1 (de) Viraler vektor für den zielgerichteten gentransfer in gehirn und rückenmark
DE60115070T2 (de) Expressionsvektoren mit hybriden ubiquitin-promotoren
DE60129229T2 (de) Adeno-assoziierte virus-vermittelte übertragung von angiogenesefaktoren
DE69925134T2 (de) Rekombinante adenovirus für gewebespezifische genexpression ins herz
DE69634300T2 (de) Gentherapie mit hilfe von schaf-adenoviralen vektoren
DE69535155T2 (de) Für gdnf-kodierende rekombinante adenoviren
DE69534165T2 (de) Adenovirus mit glutathion peroxydate gene
DE69836139T2 (de) Verfahren zur behandlung von vaskulären proliferativen erkrankungen mit p27 und fusionen davon
DE69828167T2 (de) Rekombinante adenovirale vektoren, die eine spleissequenz enthalten
DE60114006T2 (de) Replikationsdefizienter adenoviraler tnf-vektor

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000949457

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000949457

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10049301

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2000949457

Country of ref document: EP