DE69534165T2

DE69534165T2 - Adenovirus mit glutathion peroxydate gene

Info

Publication number: DE69534165T2
Application number: DE69534165T
Authority: DE
Inventors: Martine Barkats; Jacques Mallet; Frederic Revah
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1994-08-12
Filing date: 1995-07-26
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2015-07-27
Also published as: ZA956678B; AU710727B2; IL114904A0; WO1996005320A1; EP0775213B1; JPH10504193A; CA2197235A1; US7241591B2; FR2723588A1; ATE293700T1; CA2197235C; MX9700851A; AU3082695A; FI970579A0; DE69534165D1; EP0775213A1; NO970282L; US20010029249A1; FR2723588B1; NO970282D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Adenoviren, umfassend eine DNA-Sequenz, die für die Glutathionperoxidase codiert, und ihre Verwendungen in der Gentherapie.
Die Glutathionperoxidase ist eines der Enzyme, die in die Regulation der Konzentrationen freier Radikale aktiv eingreifen, die von Sauerstoff abstammen und bei verschiedenen physiologischen oder pathologischen Prozessen gebildet werden.
Normalerweise ist die Bildung dieser hoch reaktiven Radikale, wie das Superoxidanion, das Wasserstoffperoxid und das Hydroxyl-Radikal folgendermaßen kontrolliert: das Superoxidanion wird durch die Superoxiddismutase schnell in Wasserstoffperoxid umgewandelt, dieses Wasserstoffperoxid wird dann von der Katalase oder insbesondere von der Glutathionperoxidase in Sauerstoff und Wasser umgesetzt.
Normalerweise sind diese Enzyme in fast allen Geweben vorhanden.
Gleichwohl sind unter bestimmten Bedingungen diese Regulationsmechanismen nicht vollständig wirksam. Insbesondere kann ein Ungleichgewicht zwischen ihren jeweiligen Konzentrationen vorliegen, zum Beispiel ein Überschuss an Superoxiddismutase im Vergleich zur verfügbaren Menge an Glutathionperoxidase, was zu einer pathologischen Produktion von Wasserstoffperoxid und von freien Radikalen (insbesondere Hydroxyl-Radikale) führt.
Diese freien Radikale können direkt zu einer Peroxidation von Membran-Lipiden führen, die Enzyme durch Peroxidation ihrer Sulfhydrylgruppen inaktivieren, Polysaccharide depolymerisieren und/oder Nukleinsäuren schädigen und in jedem Fall ernste Krankheiten zur Folge haben. Sie können daher Ursache von Entzündungen, Emphysemen, Neoplasmen und/oder Retinopathien sein. Sie scheinen ebenfalls an Arteriosklerose, zerebraler Ischämie, Schädeltraumata, Atemnotsyndrom, kardiovaskulären Krankheiten, Diabetes, Leberzirrhose und Bildung des grauen Stars wie auch bei Alterung beteiligt sein. Die freien Radikale könnten ebenfalls mit der Apoptose verbunden sein und könnten auch in den Zelltod eingreifen, der die erworbene Immunschwäche (AIDS) begleitet [The J. of Biol. Chem., 269, 2(14), 798–801, (1994)]. Erst kürzlich ist gezeigt worden, dass die Reaktionen dieser Radikale untereinander oder mit Neurotransmittern zur Bildung von endogenen Neurotoxinen führten.
Die freien Radikale sind folglich ebenfalls an neurologischen Krankheiten wie Alzheimer Krankheit, Parkinson Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und/oder Trisomie 21 beteiligt.
Demnach wäre es besonders wertvoll, heute über Medikamente zu verfügen, die die Konzentration von Glutathionperoxidase auf Ebene des Organismus erhöhen oder regulieren könnten und die folglich für die Behandlung aller zuvor genannten Krankheiten wirksam wären.
Erzunum et al., 1993, Nucleic Acids Research, Vol. 21, Nr. 7, beschreibt die Verwendung eines defekten Adenovirus, das die cDNA der humanen Katalase für die Übertragung der Katalase in Endothelzellen trägt.
Die vorliegende Erfindung beruht genau auf der Entwicklung von Vektoren, die für eine in vivo und lokale Übertragung von therapeutisch aktiven Mengen des Gens, das für die Glutathionperoxidase spezifisch codiert, besonders wirksam sind.
In der entsprechenden Patentanmeldung PCT/EP/93/02519 ist gezeigt worden, dass die Adenoviren wie ein Vektor für die in vivo Übertragung eines Fremdgens in das Nervensystem und die Expression des entsprechenden Proteins verwendet sein konnten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ganz besonders neue Konstruktionen, die besonders für die Kontrolle der Expression der Glutathionperoxidase angepasst und wirksam sind.
Genauer, die Erfindung bezieht sich auf ein rekombinantes Adenovirus, umfassend eine DNA-Sequenz, die zur Kontrolle der Expression einer Glutathionperoxidase geeignet ist, seine Verwendung für therapeutische Behandlungen und/oder Prävention verschiedener Krankheiten.
Die Anmelderin hat folglich gezeigt, dass es möglich ist, rekombinante Adenoviren zu konstruieren, die eine für eine Glutathionperoxidase codierende Sequenz enthalten, diese rekombinanten Adenoviren in vivo zu verabreichen, und dass diese Verabreichung eine stabile und lokale Expression von therapeutisch aktiven Mengen der Glutathionperoxidase in vivo erlaubt.
Ein erster Gegenstand der Erfindung beruht folglich auf einem defekten rekombinanten Adenovirus, umfassend wenigstens eine DNA-Sequenz, die für die ganze oder einen Teil der Glutathionperoxidase codiert.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter der Bezeichnung Glutathionperoxidase jedes Enzym, das die Aktivität der Glutathionperoxidase besitzt. Als ein veranschaulichendes Beispiel dieser Enzyme kann man insbesondere beim Menschen die Glutathionperoxidasen GPX1, GPX2, GPX3 und GPX4 nennen. GPX1 und GPX4 werden in den meisten Geweben mit einem deutlichen Übergewicht in den Erythrocyten, der Leber und der Niere für GPX1 (Chambers et al.; EMBO J 5: 1221–1227 (1986)) und den Hoden für GPX4 exprimiert [Roveri et al.; J. Biol. Chem. 267: 6142–6146 (1992)]. GPX3 wird in der Niere, der Lunge, dem Herzen, der Brust, der Plazenta wie auch in der Leber (Chu et al.; Blood 79: 3233–3238 (1992)) produziert, während für GPX2 eine Produktion hauptsächlich in gastrointestinalen Geweben und in der Leber gezeigt worden ist [Chu et al.; J. Biol. Chem. 268: 2571–257 (1993)].
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung produzierte Glutathionperoxidase kann eine menschliche oder tierische Glutathionperoxidase sein. Es kann sich insbesondere um die bovine Glutathionperoxidase handeln.
Die DNA-Sequenz, die für die Glutathionperoxidase codiert und im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet ist, kann eine cDNA, eine genomische DNA (gDNA) oder eine Hybridkonstruktion sein, die zum Beispiel aus einer cDNA besteht, in die ein oder mehrere Introns inseriert sein könnten. Die für die humane Glutathionperoxidase codierende Nukleinsequenz ist beschrieben worden [Mullenbach et al., Oxy-Radicals in Molecular Biology and Pathology, 313–326, (1988)]. Es kann sich ebenfalls um synthetische oder halbsynthetische Sequenzen handeln.
Von besonderem Vorteil ist die Verwendung von einer cDNA oder einer gDNA.
Gemäß einer bevorzugten Form der Erfindung handelt es sich um eine genomische DNA-Sequenz (gDNA-Sequenz), die für eine Glutathionperoxidase codiert. Ihre Verwendung kann eine bessere Expression in den menschlichen Zellen erlauben.
Es ist gut zu verstehen, dass die DNA-Sequenz vor ihrem Einbau in einen Adenovirus-Vektor gemäß der Erfindung zum Beispiel durch eine gerichtete Mutagenese insbesondere für die Insertion von geeigneten Restriktionsstellen vorteilhafterweise modifiziert sein kann. Die in der älteren Technik beschriebenen Sequenzen sind wirklich nicht für eine Verwendung gemäß der Erfindung konstruiert und vorausgehende Anpassungen können sich als erforderlich erweisen, um beträchtliche Expressionen zu erhalten.
Die DNA-Sequenz, die für eine ganze oder einen Teil einer Glutathionperoxidase codiert, kann ebenfalls eine Antisense-Sequenz sein, deren Expression in der Zielzelle die Expressionskontrolle dieses Enzyms erlaubt. Vorzugsweise umfasst die heterologe DNA-Sequenz ein Gen, das für eine Antisense-RNA codiert, die in der Lage ist, die Translation der entsprechenden mRNA zu kontrollieren. Die Antisense-Sequenz kann die ganze oder nur einen Teil der DNA-Sequenz sein, die für eine Glutathionperoxidase codiert und in inverser Richtung in dem Vektor gemäß der Erfindung inseriert ist.
Gemäß einer Anwendungsform der Erfindung kann die DNA-Sequenz, die für eine Glutathionperoxidase codiert, ein Sekretionssignal mit enthalten, das die Steuerung der synthetisierten Glutathionperoxidase in den Sekretionswegen der infizierten Zellen erlaubt. Auf diese Weise wird die synthetisierte Glutathionperoxidase in den extrazellulären Kompartimenten vorteilhaft freigesetzt.
Von Vorteil ist, wenn die Sequenz, die für die Glutathionperoxidase codiert, unter der Kontrolle von Signalen steht, die ihre Expression in den Zielzellen erlauben. Vorzugsweise handelt es sich um heterologe Expressionssignale, nämlich Signale, die sich von denjenigen unterscheiden, die natürlicherweise für die Expression der Glutathionperoxidase verantwortlich sind. Es kann sich insbesondere um Sequenzen, die für die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder um synthetische Sequenzen handeln. Insbesondere kann es sich um Promotorsequenzen von eukaryotischen oder viralen Genen handeln. Zum Beispiel kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die von dem Genom der Zelle stammen, die man zu infizieren wünscht. Gleichfalls kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die von dem Genom eines Virus, einschließlich des verwendeten Adenovirus, stammen. In dieser Hinsicht kann man zum Beispiel die Promotoren E1A, MLP, CMV, LTR-RSV etc. nennen. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Hinzufügen von Aktivierungssequenzen, von Regulationssequenzen oder von Sequenzen, die eine Gewebe-spezifische Expression erlauben, modifiziert sein. Es kann tatsächlich besonders interessant sein, in den Zielzellen spezifisch oder hauptsächlich aktive Expressionssignale zu verwenden, so dass die DNA-Sequenz nicht exprimiert wird und nur ihre Wirkung besitzt, wenn das Virus eine Zielzelle wirksam infiziert hat.
In einer ersten besonderen Anwendungsform betrifft die Erfindung ein rekombinantes defektes Adenovirus, umfassend eine cDNA- oder gDNA-Sequenz, die für eine bovine Glutathionperoxidase unter der Kontrolle des LTR-RSV Promotors codiert.
In einer anderen besonderen Anwendungsform betrifft die Erfindung ein rekombinantes defektes Adenovirus, umfassend eine gDNA-Sequenz, die für die humane Glutathionperoxidase unter der Kontrolle des LTR-RSV Promotors codiert.
Eine besonders bevorzugte Anwendungsform der vorliegenden Erfindung beruht auf einem rekombinanten defekten Adenovirus, umfassend die ITR-Sequenzen, eine Sequenz, die die Verpackung erlaubt, eine DNA-Sequenz, die für die humane Glutathionperoxidase codiert, unter der Kontrolle eines Promotors, der eine wesentliche Expression in den Zielgeweben erlaubt, und in dem das E1-Gen und wenigstens eines der E2, E4, L1–L5 Gene nicht funktionsfähig ist.
Die defekten Adenoviren gemäß der Erfindung sind Adenoviren, die nicht in der Lage sind, sich auf autonome Weise in der Zielzelle zu replizieren. Im Allgemeinen ist das Genom der im Rahmen der Erfindung verwendeten defekten Adenoviren folglich wenigstens ohne die Sequenzen, die für die Replikation des besagten Virus in der infizierten Zelle erforderlich sind. Diese Bereiche können entweder eliminiert (ganz oder zum Teil) oder nicht funktionsfähig gemacht sein oder durch andere Sequenzen, insbesondere durch die für die Glutathionperoxidase codierende DNA-Sequenz, ersetzt sein.
Vorzugsweise behält das defekte Virus der Erfindung die Sequenzen seines Genoms, die für die Verpackung viraler Partikel erforderlich sind. Noch bevorzugter umfasst das Genom des defekten rekombinanten Virus gemäß der Erfindung, wie oben angegeben, die ITR-Sequenzen, eine Sequenz, die die Verpackung erlaubt, das nicht funktionsfähige E1-Gen und wenigstens eines der nicht funktionsfähigen E2, E4, L1–L5-Gene.
Es gibt verschiedene Adenovirus-Serotypen, deren Struktur und Eigenschaft etwas variieren. Von diesen Serotypen bevorzugt man für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung die humanen Adenoviren vom Typ 2 oder 5 (Ad2 oder Ad5) oder die Adenoviren tierischen Ursprungs (siehe Anmeldung FR 93 05954 ). Von den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Adenoviren tierischen Ursprungs kann man die Adenoviren caninen, bovinen, murinen [Beispiel: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81], ovinen, porcinen, avianen oder auch simianen (Beispiel: SAV) Ursprungs nennen. Vorzugsweise ist das Adenovires tierischen Ursprungs ein canines Adenovirus, bevorzugter ein CAV2 Adenovirus [Stamm Manhattan oder A26/61 (ATCC VR-800) zum Beispiel]. Vorzugsweise verwendet man im Rahmen der Erfindung Adenoviren humanen oder caninen Ursprungs oder Gemische davon.
Die defekten rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung können mit jeder dem Fachmann bekannten Technik hergestellt sein (Levero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Insbesondere können sie durch homologe Rekombination eines Adenovirus und eines Plasmids, das unter anderem die für die Glutathionperoxidase codierende DNA-Sequenz trägt, hergestellt sein. Die homologe Rekombination erfolgt nach Co-Transfektion besagten Adenovires und Plasmids in einer geeigneten Zelllinie. Die verwendete Zelllinie soll vorzugsweise (i) von besagten Elementen transformierbar sein, und (ii) Sequenzen umfassen, die in der Lage sind, den Teil des Genoms des defekten Adenovirus zu komplementieren, vorzugsweise in integrierter Form, um die Rekombinationsrisiken zu vermeiden. Als Beispiel für eine Linie kann man die humane embryonale Nierenzelllinie 293 erwähnen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die insbesondere den linken Teil des Genoms eines Adenovirus Ad5 (12%) in ihrem Genom integriert enthält. Strategien zur Konstruktion von Vektoren, die von Adenoviren abstammen, sind ebenfalls in den Anmeldungen FR 93 05954 und FR 93 08596 beschrieben worden, die in die vorliegende Anmeldung durch Quellenangabe eingefügt sind.
Schließlich werden die Adenoviren, die sich vermehrt haben, nach den klassischen molekularbiologischen Techniken wiedergewonnen und gereinigt, wie es in den Beispielen veranschaulicht ist.
Die besonders vorteilhaften Eigenschaften der Vektoren der Erfindung ergeben sich insbesondere aus der angewandten Konstruktion (defektes Adenovirus, dem bestimmte virale Regionen fehlen), dem Promotor. der für die Expression der die Glutathionperoxidase codierenden Sequenz verwendet ist (vorzugsweise viraler oder Gewebe-spezifischer Promotor), und den Verfahren zur Verabreichung besagten Vektors, was die effiziente Expression des besagten Enzyms und in den geeigneten Geweben erlaubt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls jegliche Verwendung eines Adenovirus, wie es oben beschrieben ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder zur Prävention zuvor genannter Krankheiten. Ganz besonders betrifft die Erfindung jegliche Verwendung dieser Adenoviren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder zur Prävention neurodegenerativer Krankheiten wie zum Beispiel die Parkinson Krankheit, die Alzheimer Krankheit und die amyotrophe Lateralsklerose (ALS).
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere defekte rekombinante Adenoviren, wie sie zuvor beschrieben sind. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können im Hinblick auf die topische, orale, parenterale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intraokuläre, transdermale, etc. Verabreichungen formuliert sein. Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung einen für eine injizierbare Formulierung pharmazeutisch verträglichen Träger, insbesondere für eine direkte Injektion in den Patienten. Es kann sich insbesondere um isotonische, sterile Lösungen oder um getrocknete, insbesondere lyophilisierte, Zusammensetzungen handeln, die nach Zugabe in diesem Fall von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum, die Bildung injizierbarer gelöster Stoffe erlauben.
In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, umfassend die Verabreichung eines wie oben beschriebenen rekombinanten Adenovirus an einen Patienten. Ganz besonders betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, umfassend die stereotaktische Verbreichung eines wie oben beschriebenen rekombinanten Adenovirus.
Die Dosen an defektem rekombinanten Adenovires, die für eine Injektion eingesetzt sind, können in Abhängigkeit verschiedener Parameter angepasst sein und insbesondere in Abhängigkeit des angewandten Verabreichungsmodus, der betreffenden Krankheit oder auch der erstrebten Behandlungsdauer angepasst sein. Im Allgemeinen sind die rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung in Dosisformen formuliert und verabreicht, die zwischen einschließlich 10⁴ und 10¹⁴ PFU/ml und vorzugsweise 10⁶ bis 10¹⁰ PFU/ml umfassen. Der Ausdruck PFU („plaque forming unit") entspricht einer Infektiosität einer Virus-Lösung und wird durch Infektion einer geeigneten Zellkultur, dann im Allgemeinen nach 48 Stunden durch Auszählen der Anzahl der Plaques infizierter Zellen bestimmt. Die Techniken zur Bestimmung des PFU-Titers einer viralen Lösung sind in der Literatur beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft jede isolierte Säugerzelle, die von einem oder mehreren wie oben beschriebenen defekten rekombinanten Adenoviren infiziert ist. Ganz besonders betrifft die Erfindung jede Population isolierter Humanzellen, die mit diesen Adenoviren infiziert ist. Insbesondere kann es sich um Fibroblasten, Myoblasten, Hepatocyten, Keratinocyten, Endothelzellen, Glia-Zellen etc. handeln.
Die Zellen gemäß der Erfindung können von Primärkulturen stammen. Diese können mit jeder dem Fachmann bekannten Technik entnommen sein, dann unter Bedingungen, die ihre Proliferation erlauben, kultiviert sein. Es handelt sich ganz bevorzugt um Fibroblasten, diese können ohne weiteres aus Biopsien gewonnen werden, zum Beispiel nach der von Ham beschriebenen Technik [Methods Cell. Biol. 21a (1980) 255). Diese Zellen können direkt für eine Infektion durch die Adenoviren verwendet werden oder durch Einfrieren für eine Etablierung autologer Banken mit der Absicht einer späteren Verwendung konserviert werden. Die Zellen gemäß der Erfindung können ebenfalls Sekundärkulturen sein, die zum Beispiel aus bereits etablierten Banken gewonnen sind.
Die kultivierten Zellen werden dann mit den rekombinanten Adenoviren infiziert, um ihnen die Fähigkeit zur Produktion der Glutathionperoxidase zu verleihen. Die Infektion wird in vitro gemäß dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt. Insbesondere kann entsprechend dem verwendeten Zelltyp und der gewünschten Anzahl an Kopien des Virus pro Zelle der Fachmann die Infektionsmultiplizität anpassen. Es ist gut zu verstehen, dass diese Schritte unter geeigneten Sterilbedingungen durchgeführt werden müssen, wenn die Zellen für eine in vivo Verabreichung bestimmt sind. Die eingesetzten Dosen an rekombinantem Adenovirus für die Infektion der Zellen können vom Fachmann entsprechend des erstrebten Ziels angepasst sein. Die oben beschriebenen Bedingungen für die in vivo Verabreichung können für eine in vitro Infektion angewandt sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Implantat, umfassend Säugerzellen, die mit einem oder mehreren wie oben beschriebenen defekten rekombinanten Adenoviren infiziert sind, und eine extrazelluläre Matrix. Bevorzugt umfassen die Implantate gemäß der Erfindung 10⁵ bis 10¹⁰ Zellen. Bevorzugter umfassen sie 10⁶ bis 10⁸ Zellen.
Ganz besonders umfasst in den Implantaten der Erfindung die extrazelluläre Matrix eine gelbildende Verbindung und eventuell einen Träger, der die Verankerung der Zellen erlaubt.
Für die Herstellung der Implantate gemäß der Erfindung können verschiedene Gelbildner eingesetzt sein. Die Gelbildner sind zum Einschluss der Zellen in einer Matrix mit der Beschaffenheit eines Gels und gegebenenfalls zur Förderung der Verankerung der Zellen auf dem Träger verwendet. Verschiedene Zelladhäsionsmittel können folglich verwendet sein, wie Gelbildner wie insbesondere Kollagen, Gelatine, Glucosaminoglycane, Fibronektin, Lektine, Agarose etc.
Wie oben angegeben, umfassen die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung vorteilhaft einen Träger, der die Verankerung der Zellen erlaubt. Der Ausdruck Verankerung bezeichnet jegliche Form der biologischen und/oder chemischen und/oder physikalischen Wechselwirkung, die die Adhäsion und/oder die Anlagerung der Zellen auf dem Träger bewirkt. Zudem können die Zellen entweder den verwendeten Träger bedecken oder in diesen Träger eindringen oder beides. Man bevorzugt im Rahmen der Erfindung einen nicht toxischen und/oder biokompatiblen festen Träger. Insbesondere kann man Polytetrafluorethylen-(PFTE)-Fasern oder einen Träger biologischen Ursprungs verwenden.
Die Implantate gemäß der Erfindung können an verschiedenen Stellen des Organismus implantiert sein. Insbesondere kann die Implantierung in der Peritonealhöhle, in subkutanen Geweben (oberhalb des Schambeins, Fossa iliaca oder inguinalis, etc.), in einem Organ, einem Muskel, einem Tumor, dem Zentralnervensystem oder auch unter einer Mukosa erfolgen. Die Implantate gemäß der Erfindung sind insofern besonders vorteilhaft, als sie die Kontrolle der Freisetzung des therapeutischen Produkts im Organismus erlauben: Diese Freisetzung ist zuallererst durch die Infektionsmultiplizität und durch die Anzahl an implantierten Zellen bestimmt. Außerdem kann die Freisetzung entweder durch die Entnahme des Implantats, was die Behandlung definitiv beendet, oder durch die Verwendung regulierbarer Expressionssysteme kontrolliert sein, die eine Induktion oder Repression der Expression therapeutischer Gene erlauben.
Die vorliegende Erfindung stellt folglich virale Vektoren bereit, die direkt in einer Gentherapie verwendet sein können und besonders angepasst und wirksam sind, um die Expression der Glutathionperoxidase in vivo zu steuern. Die vorliegende Erfindung bietet folglich einen neuen besonders vorteilhaften Versuchsansatz zur Behandlung und/oder zur Prävention zahlreicher Krankheiten, wie sie zuvor genannt sind.
Die adenoviralen Vektoren gemäß der Erfindung weisen außerdem bedeutende Vorteile auf, die insbesondere mit ihrer sehr hohen Infektionseffizienz von Zielzellen verbunden sind, was eine Durchführung der Infektionen mit geringen Volumina viraler Suspensionen erlaubt. Zudem ist die Infektion mit den Adenoviren der Erfindung sehr lokal an der Injektionsstelle, was die Diffusionsrisiken in benachbarte zerebrale Strukturen vermeidet. Diese Behandlung kann den Menschen ebenso gut wie auch jedes Tier wie beispielsweise Schafe, Rinder, Murinae, Haustiere (Hunde, Katzen, etc.), Pferde, Fische, etc. betreffen.
Man kann außerdem selbstverständlich in Betracht ziehen, eine gemeinsame Verabreichung eines Adenovirus gemäß der Erfindung mit wenigstens einem zweiten Adenovirus vorzunehmen, umfassend ein Gen, das für eine der Formen der Superoxiddismutase oder die Katalase codiert.
Die Beispiele und die einzige Figur sind nachstehend als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung des Erfindungsbereichs angeführt.
FIGUR
1: Darstellung der Enzymaktivität der Glutathionperoxidase, die aus 293-Zellen gewonnen ist, die mit 0 bis 500 PFU/Zelle rekombinantem Adenovirus infiziert sind, das für GPx (AdGPx) oder β-Galactosidase (Adβgal) codiert.
Allgemeine molekularbiologische Techniken
Die in der Molekularbiologie herkömmlich verwendeten Verfahren wie präparative Extraktionen von Plasmid-DNA, Zentrifugation von Plasmid-DNA in einem Cäsiumchlorid-Gradienten, Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, Reinigung von DNA-Fragmenten mit Hilfe der Elektroelution, Extraktion der Proteine mit Phenol oder mit Phenol/Chloroform, DNA-Fällung mit Ethanol oder mit Isopropanol bei hohen Salzkonzentrationen, Transformation in Escherichia coli, etc... sind dem Fachmann gut bekannt und in der Literatur ausgiebig beschrieben [Maniatis, T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel, F. M. et al. (eds.), „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Die Plasmide vom Typ pBR322, pUC und die Phagen der Reihe M13 sind kommerziell erhältlich (Bethesda Research Laboratories).
Für die Ligationen können die DNA-Fragmente nach ihrer Größe mittels Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen aufgetrennt, mit Phenol oder einer Mischung aus Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt, dann in Gegenwart von DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) gemäß Herstellerempfehlung inkubiert werden.
Das Auffüllen von überhängenden 5'-Enden kann mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I (Biolabs) gemäß Herstellerangaben erfolgen. Der Abbau der überhängenden 3'-Enden erfolgt in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs), die gemäß Herstellerempfehlung verwendet wird. Der Abbau der überhängenden 5'-Enden erfolgt durch eine schonende Behandlung mit der S1-Nuklease.
Die in vitro gerichtete Mutagenese mit synthetischen Oligodesoxynukleotiden kann nach dem von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham erhältlichen Kits durchgeführt werden.
Die enzymatische Amplifikation von DNA-Fragmenten mit der als PCR Polymerasecatalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis K. B. et Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] bezeichneten Technik kann unter Verwendung eines „DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) gemäß Herstellerangaben erfolgen.
Die Verifizierung der Nukleotidsequenzen kann mit dem von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463–5467] entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham erhältlichen Kits durchgeführt werden.
Beispiele
Beispiel 1: Protokoll der Konstruktion des Vektors pLTRIX-bGPx
Dieser Vektor enthält die für die bovine GPx codierende Sequenz unter der Kontrolle der LTR des RSV-Virus wie auch die in vivo Rekombination erlaubenden Adenovirus-Sequenzen. Die verwendete cDNA ist beschrieben [Mullenbach et al., Oxy-Radicals in Molecular Biology und Pathology, 313–326, (1988)].
Die DNA wird in die BamHI-Stelle eines Bluescript-Plasmids inseriert. Eine Polyadenylierungssequenz ist in die XhoI-Stelle dieses Plasmids eingeführt worden. Diese letztere Stelle wird von SK-bGPx-PolyA erkannt.
Der pLTRIX-bGPx Vektor wird mittels Einführen eines Inserts, das durch Schneiden von SK-bGPx-PolyA erhalten wird, in die EcoRV-Stelle des Plasmids pLTRIX erhalten.
Beispiel 2: Konstruktion rekombinanter Adenoviren, die eine für die bovine Glutathionperoxidase codierende Sequenz enthalten
Der pLTRIX-bGPx Vektor wird linearisiert und mit einem defizienten Adenovirus-Vektor in Helferzellen (Linie 293) co-transfiziert, die in trans die von den E1-Regionen des Adenovirus (E1A und E1B) codierten Funktionen tragen.
Genauer, das Ad-bGPx Adenovirus ist durch in vivo homologe Rekombination der Adenovirus-Mutante Ad-dl1324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) mit dem pLTRIX-bGPx Vektor nach folgendem Protokoll erhalten worden: das pLTRIX-bGPx-Plasmid und der mit dem ClaI-Enzym linearisierte Ad-dl1324 Vektor sind in der Linie 293 in Gegenwart von Calciumphosphat co-transfiziert worden, um eine homologe Rekombination zu erlauben. Die so erzeugten rekombinanten Adenoviren sind mittels Plaques-Aufreinigung selektioniert worden. Nach Isolierung ist die DNA der rekombinanten Adenoviren in der 293-Zelllinie amplifiziert worden, was zu einem Kulturüberstand führt, der nicht aufgereinigtes rekombinantes defektes Adenovirus mit einem Titer von ungefähr 10¹⁰ PFU/ml enthält.
Die viralen Partikel werden anschließend mittels Gradientenzentrifugation gereinigt.
Beispiel 3: Kontrolle der in vitro Expression der GPx
Für jeden Test wird ein Extrakt (0,5% Triton) aus 300.000 293-Zellen verwendet, die mit 0 bis 500 PFU/ml rekombinantem Adenovirus, das für die GPx oder die β-Galactosidase codiert, infiziert sind. Die Enzymaktivität der Glu wird nach dem Protokoll von Flohé und Günzler (1984, Methods in Enzymology, Vol. 105, Seiten 114–121) ermittelt. Oxidiertes Glutathion (GSSG), das im Verlauf der GPx-Reaktion gebildet wird, wird ständig durch einen Überschuss der Glutathionreduktase-Aktivität auf ein konstantes Niveau von reduziertem Glutathion (GSH) reduziert. Die gleichzeitige Oxidation von NADPH wird spektrophotometrisch verfolgt.
Die 1 stellt die erhaltenen Ergebnisse dar.

Claims

Defektes rekombinantes Adenovirus, umfassend wenigstens eine DNA-Sequenz, die für eine ganze oder einen aktiven Teil einer Glutathionperoxidase codiert.
Adenovirus gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine cDNA-Sequenz ist.
Adenovirus gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine genomische DNA-Sequenz ist.
Adenovirus gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für eine bovine Glutathionperoxidase codiert.
Adenovirus gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für eine humane Glutathionperoxidase codiert.
Adenovirus gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine Antisense-Sequenz ist, deren Expression die Kontrolle der Expression des Gens erlaubt, das für die Glutathionperoxidase codiert.
Adenovirus gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Gen handelt, das für eine Antisense-RNA codiert, die in der Lage ist, die Translation der mRNA einer Glutathionperoxidase zu kontrollieren.
Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz unter der Kontrolle von Signalen steht, die ihre Expression in Zielzellen erlauben.
Adenovirus gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionssignale aus viralen Promotoren, vorzugsweise aus den Promotoren E1A, MLP, CMV und LTR-RSV, ausgewählt sind.
Adenovirus gemäß Anspruch 1, umfassend eine genomische DNA- oder cDNA-Sequenz, die für eine bovine Glutathionperoxidase unter der Kontrolle eines LTR-RSV-Promotors codiert.
Adenovirus gemäß Anspruch 1, umfassend eine genomische DNA- oder cDNA-Sequenz, die für eine humane Glutathionperoxidase unter der Kontrolle eines LTR-RSV-Promotors codiert.
Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es ohne Genombereiche ist, die für seine Replikation in der Zielzelle erforderlich sind.
Adenovirus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es die ITR und eine Sequenz umfasst, die die Verpackung erlauben, und in dem das E1-Gen und wenigstens eines der E2-, E4-, L1–L5-Gene nicht funktionsfähig sind.
Adenovirus gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein humanes Adenovirus vom Typ Ad2 oder Ad5 oder um ein canines Adenovirus vom Typ CAV-2 handelt.
Verwendung eines Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder zur Prävention neurodegenerativer Krankheiten.
Verwendung eines Adenovirus gemäß Anspruch 15 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prävention der Parkinson Krankheit, der Alzheimer Krankheit und der amyotrophen Lateralsklerose (ALS).
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere defekte rekombinante Adenoviren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie in injizierbarer Form ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie zwischen 10⁴ und 10¹⁴ PFU/ml und vorzugsweise 10⁶ bis 10¹⁰ PFU/ml defekte rekombinante Adenoviren umfasst.
Isolierte Säugerzelle, die mit einem oder mehreren defekten rekombinanten Adenoviren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 infiziert ist.
Zelle gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine humane Zelle handelt.
Zelle gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine humane Zelle wie Retinazelle, Fibroblast, Myoblast, Hepatozyt, Endothelzelle, Gliazelle oder Keratinozyt handelt
Implantat, umfassend infizierte Zellen gemäß Ansprüchen 20 bis 22 und eine extrazelluläre Matrix.
Implantat gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die extrazelluläre Matrix eine gelbildende Verbindung umfasst, die vorzugsweise aus Kollagen, Gelatine, Glucosaminoglycanen, Fibronektin, Agarose und Lektinen ausgewählt ist.
Implantat gemäß Ansprüchen 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die extrazelluläre Matrix ebenfalls einen Träger umfasst, der die Verankerung infizierter Zellen erlaubt.
Implantat gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger vorzugsweise aus Polytetrafluorethylen-Fasern besteht.