JPH10504193A - グルタチオンペルオキシダーゼをコードする遺伝子を含むアデノウィルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、グルタチオンペルオキシダーゼの全体もしくは活性部分をコードする少なくとも１種のＤＮＡ配列またはその誘導体を含む欠陥組換アデノウィルスに関するものである。さらに、その治療での使用および対応の医薬組成物にも関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 グルタチオンペルオキシダーゼをコードする 遺伝子を含むアデノウィルス 本発明は、グルタチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列を含む組換 アデノウィルスおよび遺伝子治療におけるその使用に関するものである。 グルタチオンペルオキシダーゼは、各種の生理学的もしくは病理学的過程で形 成される酸素由来のフリーラジカルの濃度の調節において積極的に関与する酵素 の一つである。 通常、極めて反応性であるこれらラジカル、たとえばスーパーオキサイドアニ オン、過酸化水素およびヒドロキシルラジカル、の形成は次のように制御される ：スーパーオキサイドアニオンはスーパーオキサイドディスムターゼにより急速 に過酸化水素まで変換され、次いでこの過酸化水素はカタラーゼまたは特にグル タチオンペルオキシダーゼにより酸素と水とに変換される。 一般に、これら酵素はほぼ全ての組織に存在する。 しかしながら或る種の条件下では、これら調節メカニズムは充分には効率的で ない。特に、たとえば可使量のグルタチオン ペルオキシダーゼと比較して過剰のスーパーオキサイドディスムターゼ濃度のよ うに、それぞれの濃度間に平衡異常があることがあり、それによって過酸化水素 およびフリーラジカル（特にヒドロキシルラジカル）の病理学的生成をもたらす 。 これらフリーラジカルは膜脂質の過酸化を直接的に誘発する可能性があり、そ のスルフヒドリル基を過酸化して酵素を失活させ、多糖類を脱重合させ、かつ／ または核酸を損傷して全ての場合に重大な病状をもたらす。したがって、これら は炎症、気腫、腫瘍形成および／または網膜症の原因となりうる。さらに、これ らはアテローム性動脈硬化症、脳虚血、脳神経外傷、呼吸困難症候群、心臓血管 病、糖尿病、肝硬変および白内障形成、並びに老化過程にも関与すると思われる 。さらにフリーラジカルは細胞死滅過程にも関連すると思われ、後天的免疫不全 症候群（ＡＩＤＳ）を伴う細胞死滅に関与しうる［The J．of Biol．Chem．269 ，2(14)，798-801(1994)］。極く最近、これらラジカルの間の反応または神経伝 達物質との反応は内生神経毒素を形成することが示された。したがって、フリー ラジカルはたとえばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ ＡＬＳ）および／またはダウン症候群のような神経学 的病状にも関与する。 したがって、身体におけるグルタチオンペルオキシダーゼ濃度を上昇させ或い は調節しうると共にそれゆえに上記全ての病状の処置に有効である今日的医薬品 を入手可能にすることが、特に有益である。 厳密には本発明は、インビボおよび局部的に、グルタチオンペルオキシダーゼ をコードする特定遺伝子またはその誘導体の１種の治療上活性量を、供給するの に特に効率的であるベクターを開発することである。 対応の出願ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２５１９には、外来遺伝子をインビボにて神 経系中へ移行させると共に対応蛋白質を発現させるためのベクターとしてアデノ ウィルスを使用しうることが示されている。 本発明は、より詳細には、グルタチオンペルオキシダーゼの発現を制御するの に特に適しかつ効率的である新規な構築物に関するものである。 より厳密には本発明は、グルタチオンペルオキシダーゼの発現を制御するＤＮ Ａ配列を含む組換アデノウィルスおよび各種の病状の治療処置および／または予 防のためのその使用に関す るものである。 本出願人は、グルタチオンペルオキシダーゼをコードする配列を含んだ組換ア デノウィルスを構築し、これら組換アデノウィルスをインビボにて投与し、この 投与によりグルタチオンペルオキシダーゼの治療上活性量をインビボにて安定的 かつ局部的に発現させうることを示した。 したがって本発明の第１の課題は、グルタチオンペルオキシダーゼの全体もし くは活性部分をコードする少なくとも１種のＤＮＡ配列またはその誘導体の１種 を含む欠陥組換アデノウィルスよりなっている。 本発明においてグルタチオンペルオキシダーゼは、グルタチオンペルオキシダ ーゼ活性を有するすべての酵素を意味する。これら酵素を例示すれば、特にヒト のグルタチオンペルオキシダーゼＧＰＸ１、ＧＰＸ２、ＧＰＸ３およびＧＰＸ４ を挙げることができる。ＧＰＸ１およびＧＰＸ４は殆どの組織で発現され、ＧＰ Ｘ１については明かに赤血球、肝臓および腎臓にて優勢に存在し［Chambersら、 EMBO J 5:1221-1227（1986）］、またＧＰＸ４については精巣にて優勢に存在す る［Roveriら、J. Biol．Chem．267:6142-6146（1992）］。ＧＰＸ３はＧＰＸ２ の場合と同様に腎臓、肺、心臓、胸部、胎盤、並びに肝臓にて生成され［Chu ら 、Blood 79:3233-3238（1992）］、主として胃腸組織および肝臓にて示されてい る［Chu ら、J．Biol．Chem．268:2571-257（1993）］。 本発明において産生されるグルタチオンペルオキシダーゼは、ヒトもしくは動 物のグルタチオンペルオキシダーゼである。特にウシグルタチオンペルオキシダ ーゼである。 本発明において使用されるグルタチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ 配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）またはたとえば１個もしくはそれ 以上のイントロンが挿入されたｃＤＮＡよりなるハイブリッド構築物である。ヒ トグルタチオンペルオキシダーゼをコードするｃＤＮＡの核酸配列は、［Mullen bachら、Oxy-Radicals in Molecular Biology and Pathology，313-326（1988） ］に記載されている。さらに合成もしくは半合成配列であることもある。 特に有利には、ｃＤＮＡもしくはｇＤＮＡが使用される。 本発明の好適具体例は、グルタチオンペルオキシダーゼをコードするゲノムＤ ＮＡ（ｇＤＮＡ）配列である。その使用により、ヒト細胞における発現を増大さ せうる。 もちろん、本発明によるアデノウィルスベクター中に組み込む前に、ＤＮＡ配 列を、たとえば部位指向突然変異により、特に適正な制限部位に挿入できるよう に、有利に改変することができる。先行技術に記載されている配列は、本発明に より使用できるように構築されておらず、高い発現レベルを得るには事前の処理 が必要であろう。 本発明において誘導体とは、改変により得られると共にグルタチオンペルオキ シダーゼの生物学的性質の少なくとも１つを保持する産生物をコードするすべて の配列を意味する。改変とは、遺伝的および／または化学的性質のすべての突然 変異、置換、欠失、付加もしくは改変を意味すると理解すべきである。これら改 変は当業者に知られた技術によって行うことができる［後記の一般的分子生物学 技術、参照］。本発明による誘導体は、プローブとしてグルタチオンペルオキシ ダーゼの天然配列もしくはその断片を用いて、核酸ライブラリーとのハイブリッ ド化により得ることもできる。 これら誘導体は、特に、その結合部位に対する高い親和性を有する分子、イン ビボにおける発現を増大させうる配列、プロテアーゼに対する高い耐性を有する 分子、高い治療効能もしく は低い副作用を有するか或いはできれば新たな生物学的性質を有する分子である 。 好適誘導体としては、特に、天然変種、１個もしくはそれ以上の残基が置換さ れている分子、考えられる結合部位との相互作用が殆どまたは全くない領域また は望ましくない活性を発現する領域の除去によって得られる誘導体、および天然 配列と比較して追加の残基（たとえば分泌シグナルおよび／または結合性ペプチ ド）を有する誘導体を挙げることができる。 グルタチオンペルオキシダーゼの全体もしくは１部をコードするＤＮＡ配列ま たはその誘導体の１種は、アンチセンス配列とすることもでき、その発現は、標 的細胞においてこの酵素の発現を制御することができる。好ましくは、異種ＤＮ Ａ配列は、対応ｍＲＮＡの翻訳を制御しうるアンチセンスＲＮＡをコードする遺 伝子を含む。 アンチセンス配列は、本発明によるベクターに反対配向で挿入されたグルタチ オンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列の全体もしくは１部のみであるこ ともある。 本発明の１態様によれば、グルタチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ 配列またはその誘導体の１種に分泌シグナル を組み込むこともでき、それによって、この合成されたグルタチオンペルオキシ ダーゼを、感染細胞の分泌経路に向けさせることができる。このようにして、こ の合成されたグルタチオンペルオキシダーゼは、細胞外コンパートメントに有利 に放出される。 有利に、グルタチオンペルオキシダーゼをコードする配列は、標的細胞におけ る発現を可能にするシグナルの制御下に置かれる。好ましくは、これらは、異種 発現シグナル、すなわち自然においてグルタチオンペルオキシダーゼの発現をも たらしうるものとは異なるシグナルである。これらは、特に他の蛋白質または合 成配列の発現をもたらしうる配列である。特に、これらは真核性もしくはウィル ス性遺伝子のプロモータ配列である。これらは、たとえば、感染させようとする 細胞のゲノムから得られるプロモータ配列である。同様に、これらは、使用され るアデノウィルスを含めウィルスのゲノムから得られるプロモータ配列である。 この点に関し、たとえば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ などを挙げることができる。さらに、これら発現配列を、活性化もしくは調節配 列または組織特異性発現を可能にする配列の付加によって、改変すること もできる。標的細胞にて特異的もしくは優先的に作用する発現シグナルを用いれ ば特に有利である。それによって、ウィルスが標的細胞に実際に感染した時のみ ＤＮＡ配列が発現しまたはその効果をもたらす。 第１の特定態様において本発明は、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータの制御下でウシ グルタチオンペルオキシダーゼをコードするｃＤＮＡもしくはＤＮＡ８配列を含 む欠陥組換アデノウィルスに関する。 他の特定態様において本発明は、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータの制御下でヒトグ ルタチオンペルオキシダーゼをコードするｇＤＮＡ配列を含む欠陥組換アデノウ ィルスに関するものである。 特に好適な本発明の態様はＩＴＲ配列と、被包を可能にする配列と、標的組織 において優先的発現を可能にするプロモータの制御下でヒトグルタチオンペルオ キシダーゼをコードするＤＮＡ配列もしくはその誘導体とを含む欠陥組換アデノ ウィルスよりなり、ここでＥ１遺伝子とＥ２、Ｅ４、Ｌ１−Ｌ５遺伝子の少なく とも１種は機能しない。 本発明による欠陥アデノウィルスは、標的細胞にて自律複製 しえないアデノウィルスである。一般に、本発明の範囲内で使用される欠陥アデ ノウィルスのゲノムは、したがって感染細胞における前記ウィルスの複製につき 少なくとも必要な配列を欠如する。これら領域は除去し（完全もしくは部分的） 、或いは非機能的にし或いは他の配列、特にグルタチオンペルオキシダーゼをコ ードするＤＮＡ配列で置換することができる。 好ましくは本発明の欠陥ウィルスは、ウィルス粒子の被包のために必要である ゲノムの配列を保持する。より好ましくは上記のように、本発明による欠陥組換 ウィルスのゲノムは、ＩＴＲ配列と、被包を可能にする配列と、非機能的Ｅ１遺 伝子と、非機能的Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１−Ｌ５遺伝子の少なくとも１種とで構成され る。 構造および性質が若干異なる各種のアデノウィルスの血清型が存在する。これ ら血清型のうち、２型もしくは５型ヒトアデノウィルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５ ）または動物源のアデノウィルスの使用（出願ＦＲ ９３０５９５４号、参照） が、本発明において好適である。本発明において使用しうる動物源のアデノウィ ルスとしては、イヌ、ウシ、ネズミ［たとえば MAV１、Beard ら、Virology 75 （1990）81］、ヒツジ、ブタ、トリま たはサル（たとえばＳＡＶ）源のアデノウィルスを挙げることができる。好まし くは動物源のアデノウィルスはイヌアデノウィルス、特にＣＡＶ２アデノウィル ス［たとえばＭａｎｈａｔｔａｎ株もしくはＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８ ００）］である。好ましくは、ヒトもしくはイヌ源または混成源のアデノウィル スが本発明において使用される。 本発明による欠陥組換アデノウィルスは、当業者に知られた任意の技術により 作成することができる［Levrero ら、Gene 101（1991）195；EP 185 573号； Gr aham，EMBO J．3（1984）2917］。特に、これらは、アデノウィルスと特にグル タチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列を持ったプラスミドとの間の 相同組換によって作成することができる。相同組換は、適する細胞株への前記ア デノウィルスおよびプラスミドの共形質導入により行われる。使用する細胞株は 好ましくは、（ｉ）前記各要素により形質転換できねばならず、さらに（ｉｉ） 組換の危険性を回避すべく、好ましくは一体化型にて欠陥アデノウィルスゲノム 部分との相補正を有する配列を含まねばならない。細胞株の例としては、ヒト胎 性腎臓株２９３［Grahamら、J．Gen，Virol．36（1977）59］を挙げることがで き、これは 特にゲノム中にＡｄ５アデノウィルスにおけるゲノムの左手部分（１２％）を含 有する。アデノウィルスから得られるベクターを作成する手法も出願ＦＲ ９３ ０５９５４号およびＦＲ ９３０８５９６号に記載されており、これら出願を 参考のため本出願に引用する。 次に、増幅されたアデノウィルスは、実施例で示すような慣用の分子生物学技 術にしたがって回収および精製される。 本発明によるベクターの特に有利な性質は殊に、使用する構築物（或る種のウ ィルス領域が欠失した欠陥アデノウィルス）、グルタチオンペルオキシダーゼを コードする配列の発現のために使用されるプロモータ（好ましくはウィルス性も しくは組織特異性プロモータ）および前記ベクターを投与して適する組織におけ る前記酵素の効率的発現を可能にする方法、から生ずる。 さらに本発明は、上記病状の処置および／または予防を目的とした医薬組成物 を作成するための、上記アデノウィルスの使用にも関するものである。より詳細 には本発明は、たとえばパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化 症（ＡＬＳ）およびダウン症候群のような神経変性病の処置および／または予防 を目的とした医薬組成物を作成するための、前記アデ ノウィルスの使用に関する。さらに、これらは、アテローム性動脈硬化症、心臓 血管病、肝硬変、糖尿病、白内障形成、脳虚血、脳神経外傷、呼吸困難症候群（ ＡＲＤＳ）、免疫不全症に関連する病気、癌、並びに老化過程の処置に有利に使 用することもできる。 さらに本発明は、上記１種もしくはそれ以上の欠陥組換アデノウィルスを含む 医薬組成物にも関するものである。これら医薬組成物は局部、経口、非経口、鼻 腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内もしくは経皮などの各投与につき処方するこ とができる。好ましくは本発明の医薬組成物は注射処方により特に患者へ直接注 射するための医薬上許容しうるベヒクルを含有する。これらは特に、等張性無菌 溶液または乾燥（特に凍結乾燥）組成物とすることができ、これらは場合に応じ 無菌水もしくは生理食塩水を添加すれば注射溶液を作成することができる。 この点に関し、本発明は神経変性病の治療方法にも関し、この方法は患者に上 記組換アデノウィルスを投与することからなっている。より詳細には本発明は、 上記組換アデノウィルスを定位投与することからなる神経変性病の処置法に関す るものである。 注射用に使用する欠陥組換アデノウィルスの投与量は、各種のパラメータにし たがい、特に使用する投与方式、該当する病状または所望の継続処置時間にした がって調整することができる。一般に本発明による組換アデノウィルスは、１０⁴ 〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの投与量として 処方および投与される。ｐｆｕ（プラーク形成単位）と言う用語は、ウィルス溶 液の感染能力に相当し、適する細胞培養物を感染させ、一般に４８時間後に感染 細胞のプラーク数を測定することにより決定される。ウィルス溶液のｐｆｕタイ ターを測定するための技術は刊行物に充分記載されている。 本発明の他の課題は、１種もしくはそれ以上の上記欠陥組換アデノウィルスに より感染した哺乳動物細胞に関するものである。より詳細には本発明は、これら アデノウィルスにより感染したすべてのヒト細胞集団に関するものである。これ は特に繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、グリア細胞 などである。 本発明による細胞は一次培養物から得ることができる。これら細胞は、当業者 に知られた任意の技術により得て、次いで増 殖を可能にする条件下で培養することができる。より詳細には繊維芽細胞に関し 、これらはたとえばＨａｍにより記載された技術［Methods Cell．Biol，21a（1 980）255］にしたがって生検組織から容易に得ることができる。これら細胞は、 アデノウィルスによる感染のために直接に使用することができ、或いはその後の 使用のための同一ライブラリーを確立するために、たとえば凍結によって保存す ることもできる。さらに本発明による細胞は、たとえば事前に確定されているラ イブラリーから得られる二次培養物とすることもできる。 次いで培養細胞に組換アデノウィルスを感染させて、これらにグルタチオンペ ルオキシダーゼを産生する能力を付与する。感染は当業者に知られた技術により インビトロで行われる。特に、使用する細胞の種類および細胞１個当りの所望の ウィルスのコピー数に応じ、当業者は感染の多重度を調整することができる。こ れら工程は、細胞をインビボにて投与しようとする場合、適切な無菌条件下で行 うべきことが明かに理解される。細胞の感染につき使用する組換アデノウィルス の投与量は、所望の目的にしたがい当業者によって調節することができる。イン ビボでの投与について述べた上記条件は、インビトロでの感染 についても適用することができる。 本発明の他の課題は、１種もしくはそれ以上の上記欠陥組換アデノウィルスで 感染された哺乳動物細胞と細胞外マトリックスとからなる移植体に関するもので ある。好ましくは、本発明による移植体は１０⁵〜１０¹⁰個、より好ましくは１ ０⁶〜１０⁸個の細胞を含む。 より詳細には、本発明の移植体において細胞外マトリックスは、ゲル形成化合 物と必要に応じ細胞の固定を可能にする支持体とからなっている。 本発明による移植体を作成するには各種のゲル化剤を使用することができる。 ゲル化剤は、ゲルの構成を有するマトリックスに細胞を含ませると共に必要に応 じ支持体に対する細胞の固定を増大させるべく使用される。したがって各種の細 胞付着剤をゲル化剤として使用することができ、たとえば特にコラーゲン、ゼラ チン、グルコサミノグリカン、フィブロネクチン、レクチン、アガロースなどが 挙げられる。 上記したように、本発明による組成物は有利には細胞の固定を可能にする支持 体を含む。固定と言う用語は、生物学的および／または化学的および／または物 理的に相互作用して支持体 に対する細胞の付着および／または結合をもたらすすべての形態を意味する。さ らに、細胞は使用した支持体を覆ったり或いはこの支持体内に浸入したり或いは その両者とすることもできる。固体、無毒性かつ／または生物適合性の支持体の 使用が本発明の範囲内にて好適である。特にポリテトラフルオロエチレン（ＰＴ ＦＥ）繊維または生物源の支持体を使用することができる。 本発明による移植体は、身体における種々異なる部位に移植することができる 。特に移植は腹腔、皮下組織（恥骨領域、腸骨窩もしくは鼠径窩など）、器官、 筋肉、腫瘍、中枢神経系、或いは粘膜下に行うことができる。本発明による移植 体は、これらが身体における治療用物質の放出を制御しうる意味で特に有利であ る。この放出は先ず最初に感染の多重度および移植細胞の個数によって決定され る。次いで、放出は、処置を恒久的に停止させるような移植体の除去により、或 いは治療用遺伝子の発現を誘発もしくは再発現させうる調節可能な発現系の使用 により、制御することができる。 したがって本発明は、遺伝子治療に直接使用し得て、グルタチオンペルオキシ ダーゼをインビボにて発現させるのに特に適 しかつ効率的である、ウィルスベクターを提供する。かくして本発明は、たとえ ば上記したような多くの病状の処置および／または予防につき特に有利である新 規な手法を提供する。 本発明によるアデノウィルスベクターは、標的細胞を極めて高い効率で感染さ せることができ、小容量のウィルス懸濁物により感染を達成しうるという、大き な利点をさらに有する。さらに本発明のアデノウィルスによる感染は、感染部位 に高度に局在して、近隣の脳構造への拡散の危険性を防止する。この処置は人間 およびすべての動物、たとえばヒツジ、ウシ、ネズミ、家庭動物（イヌ、ネコな ど）、ウマ、魚などにも適用しうる。 さらに、好ましくは本発明によるアデノウィルスを、スーパーオキサイドディ スムターゼもしくはカタラーゼなどの１つをコードする遺伝子を含有した少なく とも第２のアデノウィルスと同時に投与することも全く可能である。 以下、本発明の範囲を限定するものでないが、指針として実施例および単一の 図面につき説明する。図面 第１図：ＧＰｘ（ＡｄＧＰｘ）もしくはβ−ガラクトシダーゼ（Ａｄβｇａｌ ）をコードする０〜５００ｐｆｕ／組換アデ ノウィルス細胞で感染された細胞２９３より得られたグルタチオンペルオキシダ ーゼの酵素活性を示す図面。一般的分子生物学技術 分子生物学にて常用される方法、たとえばプラスミドＤＮＡの調製用抽出、塩 化セシウム濃度勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースもしくは アクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、蛋白質のフェ ノールもしくはフェノール−クロロホルム抽出、生理食塩水中ＤＮＡのエタノー ルもしくはイソプロパノール沈澱、大腸菌における形質転換などは当業者に周知 であり、刊行物に広く記載されている［Maniatis T．ら、“ Molecular Cloning ，a Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harb or，N.Y,，1982; Ausubel F．M．ら、(eds),“ Current Protocols in Molecula r Biology”，John Wiley & Sons，New York，1987］。 ｐＢＲ３２２−およびｐＵＣ−型プラスミド、並びにＭ１３シリーズのファー ジは市販のものである［Bethesda Research Laboratories］。 連結は、ＤＮＡ断片をアガロースもしくはアクリルアミドゲ ル電気泳動により大きさにしたがって分離し、フェノールもしくはフェノール／ クロロホルム混液により抽出し、エタノールで沈澱させ、次いで供給業者の推奨 にしたがいファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Biolabs）の存在下にインキュベート することによりできる。 突出５′末端の充填は、供給業者の指針にしたがいE．coli ＤＮＡポリメラー ゼＩ（Biolabs）のクレノウ断片で行うことができる。突出３′末端の破壊は、 製造業者の推奨にしたがって使用されるファージＫ４ＤＮＡポリメラーゼ（Biol abs）の存在下に行われる。突出５′末端の破壊は、Ｓ１ヌクレアーゼでの調節 処置によって行われる。 合成オリゴデオキシヌクレオチドによるインビトロでの部位指向突然変位は、 Taylar 等により開発された方法［Nucleic Acids Res. 13（1985）8749-8764］ にしたがい、Amershamにより供給されるキットを用いて行うことができる。 いわゆるＰＣＲ技術［ポリメラーゼ触媒連鎖反応、Saiki R. K．ら、Science 230（1985）1350-1354; Mullis K．B．and Faloona F．A.，Meth．Enzym. 15 5 （1987）335-350］によるＤＮＡ断片の酵素増幅は、製造業者の指針にしたがい ＤＮＡサ ーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus）を用いて行うことができる。 ヌクレオチド配列の決定は、Sanger等により開発された方法［Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，74（1977）5463-5467］により、Amershamにより供給されるキッ トを用いて行うことができる。実施例 実施例１：ベクターｐＬＴＲＩＸ−ｂＧＰｘの作成手順 このベクターはＲＳＶ ウィルスＬＴＲの制御下にウシＧＰｘをコードする配列と、インビボにて組換を 可能にするアデノウィルスからの配列とを含有する。使用したｃＤＮＡは［Mull enbachら、Oxy-Radicals in Molecular Biology and Pathalogy，313-326（1988 ）］に記載されている。 ＤＮＡをプラスミド Bluescript のＢａｍＨＩ部位に挿入する。ポリアデニル 化配列をこのプラスミドのＸｈｏＩ部位に導入した。これをＳＫ−ｂＧＰｘ−ポ リＡとする。 ベクターｐＬＴＲＩＸ−ｂＧＰｘは、ＳＫ−ｂＧＰｘ−ポリＡの切断によって 得られた挿入物をプラスミドｐＬＴＲＩＸのＥｃｏＲＶ部位に導入して得られる 。 実施例２：ウシグルタチオンペルオキシダーゼをコードする配列を持った組換ア デノウィルスの作成 ベクターｐＬＴＲＩＸ−ｂＧＰｘを線状化させ、欠陥アデノウィルスベクター と共にヘルパー細胞（細胞株２９３）中に共形質投導入させて、アデノウィルス ＥＩ領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）によりコードされる機能をトランスに与える。 より厳密には、Ａｄ−ｂＧＰｘアデノウィルスを、突然変異アデノウィルスＡ ｄ−ｄｌ１３２４［Thimmappaya ら、Cell 31（1982）543］とベクターｐＬＴＲ ＩＸ−ｂＧＰｘとの間のインビボにおける相同組換により次の手順にしたがって 得た。酵素ＣｌａＩにより線状化されたプラスミドｐＬＴＲＩＸ−ｂＧＰｘおよ びＡｄ−ｄｌ１３２４アデノウィルスを燐酸カルシウムの存在下に細胞株２９３ に共形質導入させて相同組換を生じせしめた。このように発生させた組換アデノ ウィルスをプラーク精製により選択した。分離後、組換アデノウィルスＤＮＡを 細胞株２９３にて増幅させることにより、約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌのタイターを有 する未精製の組換欠陥アデノウィルスを含有する培養上澄液を得た。 次いでウィルス粒子を濃度勾配遠心分離により精製した。 実施例３：ＧＰｘのインビトロ発現の制御 各試験につき抽出物（０．５％トリトン）を、ＧＰｘもしくはβ−ガラクトシ ダーゼをコードする０〜５００ｐｆｕ／組換アデノウィルス細胞で感染された３ ００，０００個の細胞２９３から作成した。グルタチオンペルオキシダーゼの酵 素活 Enzymology，Vol．105，pp.114-121］の手順にしたがって評価された。ＧＰｘ反 応の際に生成した酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）は、一定レベルの還元型グル タチオン（ＧＳＨ）につき過剰のグルタチオンレダクダーゼ活性により常に還元 される。ＮＡＤＰＨの同時酸化を分光測光法によりモニターする。 第１図は得られた結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 9/08 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 9/08 ＡＤＵ 31/70 ＡＣＳ 31/70 ＡＣＳ 35/76 ＡＢＬ 35/76 ＡＢＬ 38/44 ＡＢＸ 47/36 Ｂ 47/36 47/42 Ｂ 47/42 48/00 ＡＡＭ 48/00 ＡＡＭ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 9/08 7/00 5/00 Ｂ 9/08 Ａ６１Ｋ 37/50 ＡＢＸ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ルバ，フレデリツク フランス国、エフ−92160・アントニー、 リユ・ドウ・シヤトウネ、49、バテイマ ン・フランドウル・２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． グルタチオンペルオキシダーゼの全体もしくは活性部分をコードする少な くとも１種のＤＮＡ配列またはその誘導体の１種を含む欠陥組換アデノウィルス 。 ２． ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲第１項に記 載のアデノウィルス。 ３． ＤＮＡ配列がｇＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲第１項に記 載のアデノウィルス。 ４． ＤＮＡ配列がウシグルタチオンペルオキシダーゼをコードすることを特徴 とする請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載のアデノウィルス。 ５． ＤＮＡ配列がヒトグルタチオンペルオキシダーゼをコードすることを特徴 とする請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載のアデノウィルス。 ６． ＤＮＡ配列がアンチセンス配列であって、その発現がグルタチオンペルオ キシダーゼをコードする遺伝子の発現を制御しうることを特徴とする請求の範囲 第１項に記載のアデノウィルス。 ７． グルタチオンペルオキシダーゼのためのｍＲＮＡの翻訳を制御しうるアン チセンスＲＮＡをコードする遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第６項に 記載のアデノウィルス。 ８． ＤＮＡ配列が、標的細胞における発現を可能にするシグナルの制御下に置 かれることを特徴とする請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に記載のアデノウ ィルス。 ９． 発現シグナルがウィルスプロモータ、好ましくはＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ およびＲＳＶ−ＬＴＲプロモータから選択されることを特徴とする請求の範囲第 ８項に記載のアデノウィルス。 １０． ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータの制御下でウシグルタチオンペルオキシダー ゼをコードするｇＤＮＡもしくはｃＤＮＡ配列を含む請求の範囲第１項に記載の アデノウィルス。 １１． ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータの制御下でヒトグルタチオンペルオキシダー ゼをコードするｇＤＮＡもしくはｃＤＮＡ配列を含む請求の範囲第１項に記載の アデノウィルス。 １２． 標的細胞における複製に必要であるゲノムの領域を欠如していることを 特徴とする請求の範囲第１ないし１１項のいずれか一項に記載のアデノウィルス 。 １３． ＩＴＲおよび被包を可能にする配列を含むと共に、Ｅ １遺伝子とＥ２、Ｅ４、Ｌ１−Ｌ５遺伝子の少なくとも１種とが機能しないこと を特徴とする請求の範囲第１２項に記載のアデノウィルス。 １４． Ａｄ２もしくはＡｄ５型ヒトアデノウィルスまたはＣＡＶ−２型イヌア デノウィルスであることを特徴とする請求の範囲第１２項または第１３項に記載 のアデノウィルス。 １５． 神経変性病の処置および／または予防を目的とした医薬組成物を作成す るための請求の範囲第１ないし１４項のいずれか一項に記載のアデノウィルスの 使用。 １６． ダウン症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、ダウン症 候群、アテローム性動脈硬化症、心臓血管病、肝硬変、糖尿病、白内障形成、脳 虚血、脳神経障害、呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、癌および老化過程の処置およ び／または予防を目的とした医薬組成物を作成するための請求の範囲第１５項に 記載の使用。 １７． 請求の範囲第１ないし１５項のいずれか一項に記載の１種もしくはそれ 以上の欠陥組換アデノウィルスを含む医薬組成物。 １８． 注射型であることを特徴とする請求の範囲第１７項に 記載の医薬組成物。 １９． １０⁴ないし１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶ないし１０¹⁰ｐｆｕ ／ｍｌの欠陥組換アデノウィルスを含むことを特徴とする請求の範囲第１７項ま たは第１８項に記載の医薬組成物。 ２０． 請求の範囲第１ないし１４項のいずれか一項に記載の１種もしくはそれ 以上の欠陥組換アデノウィルスで感染された哺乳動物細胞。 ２１． ヒト細胞であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の細胞。 ２２． 網膜、繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、内皮細胞、グリア細胞もしくは ケラチノサイト型のヒト細胞であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載 の細胞。 ２３． 請求の範囲第２０ないし２２項のいずれか一項に記載の感染細胞と細胞 外マトリックスとを含む移植体。 ２４． 細胞外マトリックスが、好ましくはコラーゲン、ゼラチン、グルコサミ ノグリカン、フィブロネクチン、アガロースおよびレクチンから選択されるゲル 生成化合物からなることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の移植体。 ２５． 細胞外マトリックスが、感染細胞の固定を可能にする支持体をも含むこ とを特徴とする請求の範囲第２３項または第２４項に記載の移植体。 ２６． 支持体が好ましくはポリテトラフルオロエチレン繊維よりなることを特 徴とする請求の範囲第２５項に記載の移植体。