DE69535093T2

DE69535093T2 - Defektive rekombinante adenoviren mit einem inaktivierten gen iv a 2

Info

Publication number: DE69535093T2
Application number: DE69535093T
Authority: DE
Inventors: Cecile Orsini; Michel Perricaudet; Emmanuelle Vigne; Patrice Yeh
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1994-09-27
Filing date: 1995-09-22
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2015-09-23
Also published as: PT783585E; CA2197904A1; ES2268695T3; IL115432A; JPH10506018A; ATE331801T1; WO1996010088A1; MX9701766A; NO319055B1; AU3525095A; KR970706397A; AU712304B2; EP0783585A1; US6200798B1; FR2724945B1; EP0783585B1; ZA958128B; NO971247L; FR2724945A1; FI971275A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue virale Vektoren, ihre Herstellung und ihre Verwendung in der Gentherapie. Sie betrifft außerdem die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese viralen Vektoren enthalten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung rekombinante Adenoviren als Vektoren für die Gentherapie.
Gentherapie besteht in der Korrektur eines Defekts oder einer Anomalie (Mutation, abweichende Expression usw.) durch die Einführung einer genetischen Information in die Zelle oder das betroffene Organ. Diese genetische Information kann entweder in vitro eingeführt werden oder in eine Zelle, die dem Organ entnommen wurde, wobei die modifizierte Zelle wieder in den Körper eingeführt wird, oder direkt in vivo in das entsprechende Gewebe. In diesem zweiten Fall gibt es verschiedene Techniken, darunter verschiedene Transfektionstechniken, die DNA- und ΔEAE-Dextran-Komplexe enthalten (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), DNA- und Nuklearproteinkomplexe (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), DNA- und Lipidkomplexe (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), die Verwendung von Liposomen (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) usw. In jüngster Zeit erscheint die Verwendung von Viren als Vektoren für den Gentransfer als viel versprechende Alternative zu diesen physikalischen Transfektionstechniken. Diesbezüglich wurden verschiedene Viren auf ihre Fähigkeit hin getestet, bestimmte Zellpopulationen zu infizieren. Vor allem die Retroviren (RSV, HMS, MMS usw.), der HSV-Virus, die adeno-assoziierten Viren und die Adenoviren.
Unter diesen Viren weisen die Adenoviren einige interessante Eigenschaften für die Verwendung in der Gentherapie auf. Im Besonderen haben sie ein ziemlich breites Wirtsspektrum, sind in der Lage inaktive Zellen zu infizieren, werden nicht in das Genom der infizierten Zelle eingebaut und wurden bisher noch nicht mit größeren Pathologien beim Menschen in Verbindung gebracht. Adenoviren sind Viren mit einer linearen doppelsträngigen DNA mit einer Größe von etwa 36kb. Ihr Genom umfasst vor allem eine Sequenz inverser terminaler Repetitionen (ITR), eine Verpackungssequenz, frühe und späte Gene (vgl. 1). Die wichtigsten frühen Gene sind die Gene E1 (E1a und E1b), E2, E3 und E4. Die wichtigsten späten Gene sind die Gene L1 bis L5.
Angesichts der Eigenschaften der oben genannten Adenoviren wurden letztere bereits für den Gentransfer in vivo verwendet. Zu diesem Zweck wurden verschiedene von Adenoviren abgeleitete Vektoren hergestellt, in die verschiedene Gene (β-gal, OTC, a-1AT, Cytokine usw.) eingebaut wurden. In jedem dieser Konstrukte wurde der Adenovirus so modifiziert, das er zur Replikation in der infizierten Zelle nicht mehr in der Lage war. Folglich sind die Konstrukte, die auf dem Stand der Technik beschrieben sind, Adenoviren, aus denen die E1- (E1a und/oder E1b) und optional die E3-Regionen deletiert wurden, in deren Bereich die heterologen DNA-Sequenzen insertiert werden (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Dennoch haben die auf dem Stand der Technik beschriebenen Vektoren zahlreiche Nachteile, die ihre Nutzung in der Gentherapie beschränken. Besondere umfassen alle diese Vektoren zahlreiche virale Gene, deren Expression in vivo im Rahmen einer Gentherapie nicht wünschenswert ist. Zudem erlauben diese Vektoren keinen Einbau von sehr langen DNA-Fragmenten, was für bestimmte Anwendungen notwendig sein kann.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, diese Nachteile zu überwinden. Die vorliegende Erfindung beschreibt nämlich neue rekombinante Adenoviren, die in der Gentherapie verwendet werden können, vor allem für den Transfer und die Expression von Genen in vivo. Besonders ermöglichen die Adenoviren der Erfindung einen effizienten Transfer und eine andauernde Expression in vivo eines interessierenden Gens, während sie das Risiko der Produktion viraler Proteine, der Übertragung des Virus, der Pathogenität usw. beschränken.
Die vorliegende Erfindung besteht insbesondere in der Konstruktion rekombinanter Adenoviren, in denen mindestens ein spezifisches virales Gen, genannt IVa2, inaktiviert wurde. Das Gen IVa2 ist ein kleines Gen, das im linken Teil des Adenovirusgenoms liegt. Es überlappt partiell vor im Besonderen mit dem Ende des Gens E2B, was seine Manipulation schwierig macht. Das Gen IVa2 scheint die Rolle des Transkriptionsaktivators der späten Gene im Replikationszyklus des Adenovirus zu spielen. Seine Gegenwart ermöglicht oder fördert daher die Expression der Virusproteine, die für die Bildung viraler Partikel notwendig sind.
Der Anmelder hat nun gezeigt, dass es möglich ist, dieses Gen im Adenovirusgenom zu inaktivieren. Der Anmelden hat überdies gezeigt, dass diese Inaktivierung die Eigenschaften des Adenovirus als Gentherapievektor nicht beeinträchtigt, das heißt seine große Kraft, Zellen, im Besonderen menschliche Zellen zu infizieren und seine Fähigkeit, ein interessierendes Gen effektiv in die Zellen zu transferieren. Zudem haben die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Vektoren im Vergleich mit den Vektoren des Stands der Technik aufgrund der Inaktivierung durch Deletion das Gens IVa2 eine verbesserte Fähigkeit, die interessierenden Gene einzubauen, und sind vor allem deutlich weniger immunogen, da die Expression der späten Gene, die in den rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung vorhandenen sein können, beträchtlich reduziert oder sogar aufgehoben ist.
Die Vektoren der Erfindung sind daher besonders vorteilhaft, da sie den Einbau von interessierenden Genen mit großer Größe (größer als 8 kb und in der Lage auf bis zu mehr als 11 kb zu wachsen) ermöglichen, ohne die erhaltenen Titer besonders zu beeinträchtigen, und da sie sehr wenige exprimierte virale Regionen besitzen, was die Risiken, die der Verwendung von Viren als Vektoren in der Gentherapie inne wohnen, wie etwa Immunogenität, Pathogenität, Übertragung, Replikation, Rekombination usw.. stark reduziert oder sogar supprimiert. Die vorliegende Erfindung stellt folglich virale Vektoren bereit, die besonders an den Transfer und die Expression in vivo von gewünschten DNA-Sequenzen angepasst sind.
Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft daher einen defektiven rekombinanten Adenovirus, in dem das Gen IVa2 mindestens inaktiviert ist.
Adenoviren werden defektiv genannt, wenn sie nicht in der Lage sind, sich autonom in den infizierten Zellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist das Genom von Adenoviren gemäß der vorliegenden Erfindung also frei von mindestens den Sequenzen, die für die Replikation des Virus in der infizierten Zelle notwendig sind. Diese Regionen können entweder (vollständig oder partiell) entfernt oder inaktiviert sein, oder durch andere Sequenzen und insbesondere durch eine heterologe Nukleinsäuresequenz substituiert sein.
Wie oben angegeben hat der Anmelder nun gezeigt, dass es möglich ist, das Gen IVa2 im Genom des Adenovirus zu inaktivieren ohne die gewünschten Eigenschaften des Virus zu beeinträchtigen. Insbesondere kann das IVa2-Gen für die Herstellung von Vektoren der Erfindung durch verschiedene Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, inaktiviert werden, und zwar vor allem durch Suppression, Substitution, Deletion und/oder Zugabe von einer oder mehreren Basen.
Solche Modifikationen können in vitro (auf isolierter DNA) oder in situ, zum Beispiel mittels Gentechnologie oder alternativ durch die Behandlung mit mutagenen Agenzien erhalten werden. Diese genetische(n) Modifikation(en) kann (können) auf dem kodierenden Teil des Gens angesiedelt sein oder außerhalb der kodierenden Region, und zum Beispiel in den Regionen, die für die Expression und/oder transkriptionale Regulierung dieser Gene verantwortlich sind. Die Inaktivierung des Gens kann sich also durch die Produktion eines inaktiven Proteins aufgrund struktureller oder konformer Modifikationen, durch die Abwesenheit von Produktion, durch die Produktion eines Proteins mit einer veränderten Aktivität, oder alternativ durch die Produktion des natürlichen Proteins auf einem abgeschwächten Niveau oder gemäß einem gewünschten Regulierungsmodus manifestieren.
Unter den mutagenen Agenzien, die für die Inaktivierung verwendet werden können, können zum Beispiel physikalische Agenzien, wie etwa energetische Strahlungen (X-, y- und ultraviolette Strahlen usw.), oder chemische Agenzien genannt werden, die in der Lage sind, mit verschiedenen funktionellen Gruppen der DNA-Basen zu reagieren, und zum Beispiel alkylierende Agenzien [Ethylmethansulfonat (EMS), N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, N-Nitrochinolin-1-oxid (NQO)], bialkylierende Agenzien, interkalierende Agenzien usw..
Die genetischen Modifikationen können auch durch Genunterbrechung erhalten werden, zum Beispiel gemäß dem Verfahren, das zuerst von Rothstein [Meth. Enzymol. 101 (1983) 202] beschrieben wurde. In diesem Fall wird die gesamte oder ein Teil der kodierenden Sequenz vorzugsweise gestört, um das Ersetzen, mittels homologer Rekombination, der Genomsequenz durch eine inaktivierte oder mutierte Sequenz zu ermöglichen.
Vorzugsweise wird in den Adenoviren der Erfindung das Gen IVa2 durch Mutation und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen inaktiviert. Noch mehr bevorzugt wird das Gen IVa2 durch vollständige oder partielle Deletion inaktiviert.
Insbesondere ist unter Deletion jede Suppression des gesamten oder eines Teils des betrachteten Gens zu verstehen. Dies kann im Besonderen die gesamte oder ein Teil der kodierenden Region des Gens sein, und/oder die gesamte oder ein Teil der Promoterregion für die Transkription des Gens. Die Suppression kann durch Verdauung mittels geeigneter Restriktionsenzyme und nachfolgender Ligation gemäß den herkömmlichen molekularbiologischen Techniken durchgeführt werden, wie in den Beispielen illustriert.
Ganz besonders bevorzugt wird die Inaktivierung der Gene so ausgeführt, dass sie nur das betrachtete Gen und keine anderen viralen Gene, vor allem benachbarte Gene, betrifft. Da einige Veränderungen, wie etwa Punktmutationen, überdies von Natur aus durch zelluläre Mechanismen korrigiert oder abgeschwächt werden können, ist es besonders bevorzugt, dass die Inaktivierung segregational und/oder irreversibel vollkommen stabil ist.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Form wird das Gen IVa2 in den rekombinanten Adenoviren der vorliegenden Erfindung durch die Deletion eines BssMII-BstEII-Fragments inaktiviert, das von Nukleotid 4106 bis Nukleotid 5186 auf der Ad5-Adenovirussequenz reicht. Diese Sequenz ist in der Literatur und auch in einer Datenbank zugänglich (vgl. vor allem Genebank Nr. M73260).
Die rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung umfassen vorteilhafterweise die ITR-Sequenzen und eine Region, die die Verpackung ermöglicht.
Die Sequenzen der inversen Repetition (ITR) stellen den Replikationsstartpunkt der Adenoviren dar. Sie liegen auf den 3'- und 5'-Enden des viralen Genoms (vgl. 1), von wo sie gemäß herkömmlicher molekularbiologischer Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, leicht isoliert werden können. Die Nukleotidsequenz der ITR-Sequenzen menschlicher Adenoviren (insbesondere der Ad2- und Ad5-Serotypen) wird in der Literatur beschrieben, ebenso wie die der Adenoviren vom Hund (vor allem CAV1 and CAV2). Beim Ad5-Adenovirus entspricht zum Beispiel die linke ITR-Sequenz der Region, die die Nukleotide 1 bis 103 des Genoms umfasst.
Die Verpackungssequenz (auch Psi-Sequenz genannt) ist zur Verpackung des viralen Genoms notwendig. Diese Region sollte daher vorhanden sein, um die Herstellung defektiver rekombinanter Adenoviren gemäß der Erfindung zu ermöglichen. Die Verpackungssequenz liegt im Genom von Adenoviren, zwischen dem linken (5')-ITR- und dem E1-Gen (vgl. 1). Es kann künstlich durch herkömmliche molekularbiologische Techniken isoliert oder synthetisiert werden. Die Nukleotidsequenz der Verpackungssequenz menschlicher Adenoviren (insbesondere der Ad2- und Ad5-Serotypen) wird in der Literatur beschrieben, ebenso wie die der Adenoviren vom Hund (vor allem CAV1 and CAV2). Beim Ad5-Adenovirus ist zum Beispiel eine funktionelle Verpackungssequenz zwischen den Nukleotiden 194 und 358 des Genoms vorhanden.
In einer ersten besonderen Ausführungsform tragen die rekombinanten Adenoviren der Erfindung eine Deletion der vollständigen Gene E1 und IVa2 oder von Teilen dieser.
In anderen besonderen Ausführungsform tragen die rekombinanten Adenoviren der Erfindung eine Deletion der vollständigen Gene E4 und IVa2 oder von Teilen dieser.
Immer noch gemäß einer bevorzugten Ausführungsform tragen die rekombinanten Adenoviren der Erfindung eine Deletion der vollständigen Gene E1 und IVa2 und E3 oder von Teilen dieser.
In einer besonders vorteilhaften Variante tragen die rekombinanten Adenoviren der Erfindung eine Deletion der vollständigen Gene E1 und IVa2 und E4 oder von Teilen dieser.
Rekombinante Adenoviren gemäß der Erfindung mit Eigenschaften, die besonders attraktiv sind für die Verwendung in der Gentherapie, sind jene, die eine Deletion der vollständigen Gene E1, IVa2, E3, E4 und eventuell L5 oder von Teilen dieser tragen. Diese Vektoren kombinieren nämlich sehr gute Eigenschaften hinsichtlich Infektion, Sicherheit und Gentransfervermögen.
Vorteilhafterweise umfassen die rekombinanten Adenoviren der Erfindung ferner eine heterologe Nukleinsäuresequenz, deren Transfer und/oder Expression in eine Zelle, ein Organ oder einen Organismus gewünscht wird.
Insbesondere kann die heterologe DNA-Sequenz ein oder mehrere therapeutische Gene und/oder ein oder mehrere Gene umfassen, die antigene Peptide kodieren.
Die therapeutischen Gene, die so übertragen werden können, sind alle Gene, deren Transkription und mögliche Translation in die Targetzelle Produkte erzeugt, die eine therapeutische Wirkung haben.
Dies können insbesondere Gene sein, die Proteinprodukte mit einer therapeutischen Wirkung kodieren. Das so kodierte Proteinprodukt kann ein Protein, ein Peptid, eine Aminosäure usw. sein. Dieses Proteinprodukt kann homolog zur Targetzelle sein (das heißt ein Produkt, das normalerweise in der Targetzelle exprimiert, wenn letztere keine Pathologie aufweist). In diesem Fall macht es die Expression eines Proteins zum Beispiel möglich, eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines aufgrund einer Modifikation inaktiven oder schwach aktiven Proteins abzuschwächen, oder alternativ, dieses Protein zu überexprimieren. Das therapeutische Gen kann auch einen Mutanten eines zellulären Proteins kodieren, der eine erhöhte Stabilität, eine modifizierte Aktivität usw. hat. Das Proteinprodukt kann auch heterolog zur Targetzelle sein. In diesem Fall kann ein exprimiertes Protein zum Beispiel eine Aktivität ergänzen oder bereitstellen, die in der Zelle defekt ist, welche diese befähigt, eine Pathologie zu bekämpfen.
Unter den therapeutischen Produkten für die Zwecke der vorliegende Erfindung können insbesondere Enzyme, Blutderivate, Hormone, Lymphokine: Interleukine, Interferone, TNF usw. ( FR 9203120 ), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder deren Vorläufer oder synthetische Enzyme, trophische Faktoren: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 usw.; Apolipoproteine: ApoAI, ApoAIV, ApoE usw. ( FR 93 05125 ), Dystrophin oder Minidystrophin ( FR 9111947 ), Tumoursuppressorgene: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev usw. ( FR 93 04745 ), genkodierende Faktoren, die in die Coagulation involviert sind: die Faktoren VII, VIII, IX usw., Suizidgene: Thymidinkinase, Cytosindeaminase usw. genannt werden.
Das therapeutische Gen kann auch ein (e) Antisense-Gen oder -sequenz sein, dessen Expression in der Targetzelle es ermöglicht, die Expression von Genen oder die Transkription zellulärer mRNRs zu kontrollieren. Solche Sequenzen können zum Beispiel in der Targetzelle in RNAs transkribiert werden, die komplementär zu den zellulären mRNAs sind, und folglich deren Translation in Protein, gemäß der in der Patentschrift EP 140 308 beschriebenen Technik, blockieren.
Wie oben angegeben kann die heterologe DNA-Sequenz auch ein oder mehrere Gene umfassen, die ein antigenes Peptid kodieren, das in der Lage ist, beim Menschen eine Immunantwort zu erzeugen. In dieser besonderen Ausführungsform ermöglicht die Erfindung daher die Produktion von Vakzinen, die es möglich machen, Menschen vor allem gegen Mikroorganismen oder Viren zu immunisieren. Dies können vor allem antigene Peptide sein, die spezifisch für den Epstein-Barr-Virus, den HIV-Virus, den Hepatitis-B-Virus ( EP 185 573 ), den Pseudorabiesvirus oder alternativ spezifisch für Tumore ( EP 259 212 ) sind.
Im Allgemeinen umfasst die heterologe Nukleinsäuresequenz auch eine Promoterregion für die funktionelle Transkription in der infizierten Zelle. Dies kann eine Promoterregion sein, die von Natur aus für die Expression des betrachteten Gens verantwortlich ist, wenn diese Region in der Lage ist, in der infizierten Zelle zu funktionieren. Es können auch Regionen verschiedenen Ursprungs sein (für die Expression anderer Proteine verantwortliche oder sogar synthetische). Es können insbesondere Promotersequenzen eukaryotischer oder viraler Gene sein. Es können zum Beispiel Promotersequenzen sein, die vom Genom der Zelle abgeleitet sind, die infiziert werden soll. Es können ebenfalls Promotersequenzen sein, die vom Genom eines Virus, einschließlich des verwendeten Adenovirus, abgeleitet sind. Diesbezüglich können zum Beispiel die Promoter der Gene E1A, MLP, CMV, RSV usw. genannt werden. Außerdem können diese Promoterregionen durch die Zugabe aktivierender Sequenzen, regulierender Sequenzen oder Sequenzen modifiziert werden, die eine prädominante gewebespezifische Expression ermöglichen. Wenn die heterologe Nukleinsäuresequenz keine Promotersequenzen umfasst, kann sie zudem in das Genom des defektiven Virus stromabwärts einer solchen Sequenz insertiert werden.
Zudem kann die heterologe Nukleinsäuresequenz auch, insbesondere stromaufwärts des therapeutischen Gens, eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische Produkt in die sekretorischen Pfade der Targetzelle lenkt. Diese Signalsequenz kann eine natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produkts sein, aber sie kann auch jede andere funktionelle Signalsequenz oder eine künstliche Signalsequenz sein.
Noch immer in einer ganz besonders vorteilhaften Ausführungsform besitzen die Vektoren der Erfindung außerdem ein funktionelles E3-Gen unter Kontrolle eines heterologen Promoters. Mehr bevorzugt besitzen die Vektoren einen Teil des E3-Gens, der die Expression des gp19K-Proteins ermöglicht. Dieses Protein ermöglicht es nämlich, zu vermeiden, dass der Adenovirusvektor Gegenstand einer Immunreaktion ist, die (i) dessen Aktion begrenzt und (ii) unerwünschte Nebenwirkungen haben könnte.
Die rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung können verschiedenen Ursprungs sein. Es gibt verschiedene Adenovirus-Serotypen, deren Struktur und Eigenschaften etwas variieren, die aber eine vergleichbare genetische Organisation aufweisen. Aus diesem Grund können die in der vorliegendem Patentanmeldung beschriebenen Lehren von Fachleuten für jede Art von Adenovirus leicht reproduziert werden.
Die Adenoviren der Erfindung können insbesondere menschlichen, tierischen oder gemischten (menschlichen und tierischen) Ursprungs sein.
Für die Adenoviren menschlichen Ursprungs ist die Verwendung jener bevorzugt, die in Gruppe C klassifiziert sind. Unter den verschiedenen menschlichen Adenovirus-Serotypen ist vorzugsweise die Verwendung von Adenoviren des Typs 2 oder 5 (Ad2 oder Ad5) im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Wie oben angegeben können die Adenoviren der Erfindung auch tierischen Ursprungs sein oder Sequenzen umfassen, die von Adenoviren tierischen Ursprungs abgeleitet sind. Der Anmelder hat nämlich gezeigt, dass die Adenoviren tierischen Ursprungs in der Lage sind, menschliche Zellen mit hoher Wirksamkeit zu infizieren, und dass sie nicht in der Lage sind, sich in den menschlichen Zellen, in denen sie getestet wurden, auszubreiten (vgl. Anmeldung FR 93 05954 ). Der Anmelder hat auch gezeigt, dass die Adenoviren tierischen Ursprungs überhaupt nicht durch Adenoviren menschlichen Ursprung transkomplementiert werden, was jedes Risiko der Rekombination und der Ausbreitung in vivo in Gegenwart eines menschlichen Adenovirus eliminiert, der zur Bildung eines infektiösen Partikels führen kann. Die Verwendung von Adenoviren oder von Adenovirusregionen tierischen Ursprungs ist daher besonders vorteilhaft, da sie die Risiken, die der Verwendung von Viren als Vektoren in der Gentherapie inne wohnen sogar noch verringern.
Die Adenoviren tierischen Ursprungs, die im Rahmen der vorliegende Erfindung verwendet werden können, können vom Hund, vom Rind, von der Maus, (Beispiel: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), vom Schaf, vom Schwein oder vom Vogel stammen oder alternativ vom Affen (Beispiel: SAV). Unter den Adenoviren vom Vogel können insbesondere die Serotypen 1 bis 10 genannt werden, die bei der ATCC erhältlich sind, wie zum Beispiel etwa die Stämme Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-11 (ATCC VR-921) oder alternativ die Stämme mit den ATCC-Referenznummern VR-831 bis 835. Unter den Adenoviren vom Rind können die verschiedenen bekannten Serotypen verwendet werden und vor allem jene, die bei der ATCC (Typen 1 bis 8) unter den ATCC-Referenznummern VR-313, 314, 639-642, 768 und 769 erhältlich sind. Es können auch die Adenoviren von der Maus FL (ATCC VR-550) und E20308 (ATCC VR-528), der Adenovirus vom Schaf vom Typ 5 (ATCC VR-1343) oder vom Typ 6 (ATCC VR-1340) genannt werden; der Adenovirus vom Schwein (5359) oder die Adenoviren vom Affen, wie vor allem etwa die Adenoviren, die bei der ATCC unter den Nummern VR-591-594, 941-943, 195-203 usw. eingetragen sind.
Unter den verschiedenen Adenoviren tierischen Ursprungs werden vorzugsweise Adenoviren oder Adenovirusregionen, die vom Hund stammen und vor allem alle CAV2-Adenovirusstämme [zum Beispiel Manhattan oder A26/61-Stamm (ATCC VR-800)] im Rahmen der Erfindung verwendet. Die Adenoviren vom Hund waren Gegenstand zahlreicher Strukturuntersuchungen. Folglich wurden komplette Restriktionskarten der CAV1- und CAV2-Adenoviren auf dem Stand der Technik beschrieben (Spibey et al., J. Gen. Virol, 70 (1989) 165), und die Gene E1a und E3 sowie die ITR-Sequenzen wurden kloniert und sequenziert (vgl. vor allem Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linne, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525).
Die defektiven rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung können auf verschiedene Weise hergestellt werden.
Ein erstes Verfahren besteht in der Transfektion der DNA des defektiven rekombinanten Virus, die in vitro (entweder durch Ligation oder in Plasmidform) hergestellt wurde, in eine entsprechende Zelllinie, das heißt, die in trans alle Funktionen trägt, die für die Komplementation des defektiven Virus notwendig sind. Diese Funktionen werden bevorzugt in das Genom der Zelle integriert, was die Rekombinationsrisiken reduziert und der Zelllinie eine höhere Stabilität verleiht. Die Herstellung solcher Zelllinien wird in den Beispielen beschrieben.
Ein zweiter Ansatz besteht im Cotransfizieren in einer geeignete Zelllinie der DNA des defektiven rekombinanten Virus, die in vitro (entweder durch Ligation oder in Plasmidform) hergestellt wurde, und der DNA von einem oder mehreren Helferviren oder Plasmiden. Gemäß diesem Verfahren ist es nicht notwendig, eine entsprechende Zelllinie zu haben, die in der Lage ist, alle defektiven Funktionen des rekombinanten Adenovirus zu komplementieren. Ein Teil dieser Funktionen wird nämlich durch den (die) Helfervirus (Helferviren) komplementiert. Das Helfervirus oder die Helferviren sind selbst defektiv. Die Herstellung der defektiven rekombinanten Adenoviren der Erfindung gemäß diesem Verfahren wird ebenfalls in den Beispielen illustriert.
Die vorliegende Anwendung beschreibt diesbezüglich auch die Konstruktion von Plasmiden, die den modifizierten linken Teil des Ad5-Adenovirusgenoms (Plasmide pCO1 und pCO2) tragen. Diese Plasmide sind besonders nützlich für die Konstruktion defektiver rekombinanter Adenoviren als Vektoren für die Gentherapie. Folglich trägt das Plasmid pCO1 die linke Region des Adenovirusgenoms, von der linken ITR bis zu Nukleotid 6316, mit einer Deletion der Region zwischen den Nukleotiden 382-3446, die dem Gen E1 entspricht. Dieses Plasmid ist besonders vorteilhaft, da es, verglichen mit den anderen Plasmiden dieses Typs, die auf dem Stand der Technik beschrieben sind, eine größere Deletion im E1-Gen trägt, was eine größere Klonierungskapazität und, vor allem, geringere Rekombinationsrisiken bietet. Das Plasmid pCO2 wird durch Deletion einer zusätzlichen Region zwischen den Nukleotiden 4106-5186 vom Plasmid abgeleitet und entspricht einem Teil des IVa2-Gens. Diese Deletion hat den Vorteil, dass sie das E2-Gen nicht beeinträchtigt. Das Plasmid pCO6 wird vom Plasmid PCO1 durch Insertion eines Stoppcodons in den Leserahmen des IVa2-Gens abgeleitet. Die Plasmide pCO1, pCO2 und pCO6 umfassen überdies eine multiple Klonierungsstelle, die den Einbau einer interessierenden heterologen Nukleinsäuresequenz ermöglicht. Das resultierende Konstrukt kann dann verwendet werden, um den defektiven rekombinanten Adenovires durch Cotransfektion mit einer DNA, die dem rechten Teil des Adenovirusgenoms entspricht, in eine kompetente Zelllinie, herzustellen. Letztere kann vom Genom eines Wildtyp-Virus, oder eines Virus, der selbst defektiv ist, wie etwa Addl324, bei dem die E3-Region deletiert ist, und Addl808, bei dem die E4-Region deletiert ist (Weinberg et al., J. Virol. 57 (1986) 833), usw. abgeleite sein. (vgl. Beispiele). Unter den Zelllinien, die verwendet werden können, können vor allem die menschliche embryonale Nierenlinie 293, KB-Zellen, Hela-Zellen, NiDCK, GHK usw. genannt werden, und allgemeiner jede Zelllinie, die die deletierten Regionen komplementiert (vgl. Beispiele).
Dann werden die rekombinanten Viren, die sich multipliziert haben, gemäß herkömmlicher Virologietechniken wiedergewonnen, gereinigt und amplifiziert.
Das Plasmid pCO1 ermöglicht folglich die Konstruktion defektiver rekombinanter Adenoviren, die eine Deletion im E1-Gen haben, die sich von Nukleotid 382 bis Nukleotid 3446 erstreckt.
Das Plasmid pCO2 ermöglicht die Konstruktion von defektiven rekombinanten Adenoviren, die eine Deletion im E1-Gen tragen, die von Nukleotid 382 bis Nukleotid 3446 reicht, und eine Deletion im IVa2-Gen, die von Nukleotid 4106 bis Nukleotid 5186 reicht.
Das Plasmid pCO6 ermöglicht die Konstruktion von defektiven rekombinanten Adenoviren mit einer Deletion im E1-Gen, die von Nukleotid 382 bis Nukleotid 3446 reicht, und dessen IVa2-Gen durch die Insertion eines Stoppcodons in dessen Leserahmen, im Bereich der Sph1-Stelle, die der Base 5141 des Ad5-Adenovirus entspricht, inaktiviert wurde.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch eine Reihe von Plasmiden, die die Konstruktion von Zelllinien ermöglichen, die die defektiven rekombinanten Adenoviren transkomplementieren. Insbesondere das Plasmid pAC5, das das IVa2-Gen unter Kontrolle seines eigenen Promoters besitzt, und die Plasmide pGY37-TK-IVa2 und pGY37-CMV-IVa2, die das IVa2-Gen unter Kontrolle des TK- bzw. des CMV-Promoters tragen. Diese Plasmide tragen auch die EBNA1/OriP-Sequenzen, die es ihnen ermöglichen, sich in eukaryotischen Zellen zu replizieren. Diese Plasmide ermöglichen daher die Konstruktion von Zelllinien, die die defektiven rekombinanten Adenoviren für das IVa2-Gen transkomplementieren ohne dass ein Helfervirus verwendet werden muss.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch jede pharmazeutische Zusammensetzung, die einen oder mehrere defektive rekombinante Adenoviren, wie oben beschrieben, umfasst. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können für eine topische, orale, parenterale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intraokulare und transdermale usw. Verabreichung formuliert sein.
Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung Träger, die für eine injizierbare Formulierung pharmazeutisch akzeptabel sind. Diese können insbesondere Salzlösungen (Mononatrium oder Dinatriumphosphat, Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumchlorid usw. oder Mischungen solcher Salze), sterile oder isotonische Lösungen, oder trockene, vor allem gefriergetrocknete Zusammensetzungen sein, die durch Zugabe gegebenenfalls von sterilisiertem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung die Bildung von injizierbaren Lösungen ermöglichen.
Die Virusdosen, die für die Injektion verwendet werden, können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern angepasst werden, und vor allem in Abhängigkeit von der verwendeten Verabreichungsart, der relevanten Pathologie, dem zu exprimierenden Gen oder alternativ der gewünschten Behandlungsdauer. Im Allgemeinen werden die rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung in Form von Dosen zwischen 10⁴ und 10¹⁴ pfu, und vorzugsweise zwischen 10⁶ und 10¹⁰ pfu formuliert und verabreicht. Der Begriff pfu ("Plaque Forming Unit") entspricht der Infektiosität einer Viruslösung und wird bestimmt durch die Infektion einer geeigneten Zellkultur und dem Messen, im Allgemeinen nach 5 Tagen, der Anzahl von Plaques infizierter Zellen. Die Techniken zur Bestimmung des pfu-Titers einer viralen Lösung sind in der Literatur gut dokumentiert.
Abhängig von der insertierten heterologen DNA-Sequenz können die Adenoviren der Erfindung zur Behandlung oder Prävention zahlreicher Pathologien verwendet werden, einschließlich genetischer Erkrankungen (Dystrophy, zystische Fibrose usw.), neurodegenerative Erkrankungen (Alzheimer, Parkinson, ALS usw.), Krebsformen, Pathologien im Zusammenhang mit Gerinnungsstörungen oder mit Dyslipoproteinämien, Pathologien im Zusammenhang mit viralen Infektionen (Hepatitis, AIDS usw.) usw.
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben, die als illustrativ und nicht als beschränkend zu verstehen sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Genetische Organisation des Ad5-Adenovirus. Die vollständige Sequenz von Ad5 ist als Datenbank verfügbar und ermöglicht es Fachleuten, jede Restriktionsstelle auszuwählen oder zu schaffen und folglich jede Region des Genoms zu isolieren.
2: Restriktionskarte des CAV2-Adenovirus Manhattan-Stamm (gemäß Spibey et al., oben zitiert).
3: Restriktionskarte des HindIII-Fragments, das im Plasmid pCO1 enthalten ist.
4: Restriktionskarte des HindIII-Fragments, das im Plasmid pCO2 enthalten ist.
5: Konstruktion und Darstellung des Plasmids pPY32.
6: Darstellung des Plasmids pPY55.
7: Konstruktion des Plasmids pE4Gal.
8: Restriktionskarte des Hind3-Fragments, das im Plasmid pCO6 enthalten ist.
9: Restriktionskarte des Plasmids pAC2.
10: Restriktionskarte des Plasmids pAC5.
11: Restriktionskarte des Plasmids pGY37-TK-IVa2.
12: Restriktionskarte des Plasmids pGY37-CMV-IVa2.
Allgemeine Techniken der Molekularbiologie
Die herkömmlichen in der Molekularbiologie verwendeten Verfahren, wie etwa präparative Extraktionen von Plasmid-DNA, Zentrifugation von Plasmid-DNA im Cäsiumchloridgradienten, Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, Reinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, Proteinextraktionen mit Phenol oder Phenolchloroform, DNA-Präzipitation in Salzmedium mit Ethanol oder Isopropanol, Transformation in Escherichia coli usw., sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Die Plasmide vom Typ pBR322 und pUC und die Phagen der Serie M13 sind kommerziellen Ursprungs (Bethesda Research Laboratories).
Für die Ligationen können die DNA-Fragmente gemäß ihrer Größe mittels Agarose- oder Acrylamidgel-Elektrophorese separiert, mit Phenol oder mit einem Phenol/Chloroformgemisch extrahiert, mit Ethanol präzipitiert werden und dann in Gegenwart der DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten inkubiert werden.
Das Füllen der vorstehenden 5'-Enden kann mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) gemäß den Spezifikationen des Lieferanten ausgeführt werden. Die Zerstörung der vorstehenden 3'-Enden wird in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs) durchgeführt, die gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird. Die Zerstörung der vorstehenden 5'-Enden wird durch eine kontrollierte Behandlung mit S1-Nuklease durchgeführt.
Die ortsgerichtete Mutagenese in vitro mit synthetischen Oligodeoxynukleotiden kann gemäß dem von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits durchgeführt werden.
Die enzymatische Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die so genannte PCR-Technik [Polymerase-katalysierte Kettenreaktion, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis K. B. and Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] kann unter Verwendung eines "DNA Thermal Cyclers" (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt werden.
Die Verifikation der Nukleotidsequenzen kann durch ein Verfahren, das von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] entwickelt wurde, unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits durchgeführt werden.
Verwendete Zelllinien
In den folgenden Beispielen wurden die folgenden Zelllinien verwendet oder können verwendet werden:

– Menschliche embryonale Nierenlinie 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Diese Linie enthält vor allem, integriert in ihr Genom, den linken Teil des Genoms des menschlichen Adenovirus Ad5 (12 %).
– Menschliche Zelllinie KB: Diese von einem menschlichen Epidermiskarzinom abgeleitete Linie ist bei der ATCC (Ref. CCL17), ebenso wie die Bedingungen, die ihre Kultur ermöglicht, erhältlich.
– Menschliche Zelllinie Hela: Diese von einem menschlichen Epithelkarzinom abgeleitete Linie ist bei der ATCC (Ref. CCL2), ebenso wie die Bedingungen, die ihre Kultur ermöglicht, erhältlich.
– Hundezelllinie MDCK: Die Kulturbedingungen der MDCK-Zellen wurden vor allem von Macatney et al., Science 44 (1988)9 beschrieben.
– Zelllinie gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624). Diese Linie besteht aus Hela-Zellen, die das Adenovirus-E2-Gen unter Kontrolle der LTR des MMTV tragen.

BEISPIELE
Beispiel 1 – Konstruktion des Plasmids pCO1 (3)
A – Konstruktion des Plasmids pCE
Das EcoRI-XbaI-Fragment, das dem linken Ende des Ad5-Adenovirusgenoms entspricht, wurde zuerst zwischen den Stellen EcoRI und XbaI des Vektors pIC19H kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pCA. Das Plasmid pCA wurde dann mit HinfI abgeschnitten, seine vorstehenden 5'-Enden wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli gefüllt und dann wurde es mit EcoRI geschnitten. Das so erzeugte Fragment des Plasmids pCA, das das linke Ende des Ad5-Adenovirusgenom enthält, wurde dann zwischen den Stellen EcoRI und SmaI des Vektors pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481) kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pCB. Das Plasmid pCB wurde dann mit EcoRI geschnitten, seine vorstehenden 5'-Enden wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli gefüllt und dann wurde es mit BamHI geschnitten. Das so aus dem Plasmid pCB erzeugte Fragment, das das linke Ende des Ad5-Adenovirusgenom enthält, wurde dann zwischen den Stellen NruI und BglII des Vektors pIC20H kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pCE mit dem vorteilhaften Merkmal, dass es die ersten 382 Basenpaare des Ad5-Adenovirus, gefolgt von einer multiplen Klonierungsstelle, besitzt.
B – Konstruktion des Plasmids pCD'
Das Sau3A (3346)-SstI(3645)-Fragment und das SstI(3645)-NarI(5519)-Fragment des Ad5-Adenovirusgenoms wurden zuerst zwischen den Stellen ClaI und BamHI des Vektors pIC20H ligiert und kloniert, was das Plasmid pPY53 erzeugt. Das SalI-Taq-I-Fragment des Plasmids pPY53, hergestellt aus einem dam--Kontext, das den Teil des Ad5-Adenovirusgenoms zwischen den Stellen Sau3A (3346) und TagI (5207) enthält, wurde dann zwischen den Stellen SalI und ClaI des Vektors pIC20H kloniert, was das Plasmid pCA' erzeugt. Das TaqI(5207)-NarI(5519)-Fragment des Ad5-Adenovirusgenoms, hergestellt aus einem dam--Kontext und dem SalI-TaqI-Fragment des Plasmids pCA' wurde dann zwischen den Stellen SalI und NarI des Vektors pIC20H ligiert und kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pCC'. Das Fragment NarI(5519)-NruI(6316) des Ad5-Adenovirusgenoms, hergestellt aus einem dam--Kontext und dem SalI-NarI-Fragment des Plasmids pCC', wurde dann zwischen den Stellen SalI und NruI des Vektors pIC20R ligiert und kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pCD'.
C – Konstruktion des Plasmids pCO1
Eine partielle Verdauung mit XhoI und dann eine vollständige Verdauung mit SalI des Plasmids pCD' erzeugt ein Restriktionsfragment, das die Ad5-Adenovirussequenz enthält, von der Sau3A-(3446)-Stelle bis zur NruI-(6316)-Stelle. Dieses Fragment wurde in die SalI-Stelle des Plasmids pCE kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pCO1 (3), das den linken Teil des Ad5-Adenovirus bis zur HinfI-Stelle (382), eine multiple Klonierungsstelle und das Fragment Sau3A(3446)-NruI(6316) des Ad5-Adenovirus enthält.
Beispiel 2 – Konstruktion des Plasmids pCO2 (4)
A – Konstruktion des Plasmids pCD''
Das BssHII-BstEII-Fragment, das dem Fragment BssHII(4106)-BstEII(5186) des Ad5-Adenovirusgenoms entspricht, wurde zuerst aus dem Plasmid pCA' entfernt. Dies erzeugt das Plasmid pCB'' mit dem vorteilhaften Merkmal, dass es eine Deletion eines Teils der Sequenz des IVa2-Gens besitzt. Das Fragment TagI(5207)-NarI(5519) des Ad5-Adenovirusgenoms, hergestellt aus einem dam--Kontext und dem SalI-TagI-Fragment des Plasmids pCB'' wurden dann zwischen den Stellen SalI und NarI des Vektors pIC20H ligiert und kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pCC''. Das Fragment NarI(5519)-NruI(6316) des Ad5-Adenovirusgenoms, hergestellt aus einem dam--Kontext und dem SalI-NarI-Fragment des Plasmids pCC'' wurde dann zwischen den Stellen SalI und NruI des Vektors pIC20R ligiert und kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pCD''.
B – Konstruktion des Plasmids pCO2.
Eine partielle Verdauung mit XhoI und dann eine vollständige Verdauung mit SalI des Plasmids pCD'' erzeugt ein Restriktionsfragment, das die Ad5-Adenovirussequenz enthält, von der Sau3A-(3446)-Stelle bis zur NruI-(6316)-Stelle, deren Fragment BssHII(4106)-BstEII(5186) deletiert wurde. Dieses Fragment wurde in die SalI-Stelle des Plasmids pCE kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pCO2 (4), das den linken Teil des Ad5-Adenovirus bis zur HinfI-Stelle (382), eine multiple Klonierungsstelle und das Sau3A (3446)-NruI(6316)-Fragment des Ad5-Adenovirus enthält, dessen BssHII(4106)-BstEII(5286)-Fragment deletiert wurde.
Beispiel 3 – Konstruletion eines rekombinanten Adenovirus, der eine Deletion im Gen E1 trägt
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines defektiven rekombinanten Adenovirus, der eine Deletion in der E1-Region trägt, die von Nukleotid 382 bis Nukleotid 3446 reicht. Dieser Adenovirus ist besonders vorteilhaft, da er eine größere Deletion im Gen E1 enthält, was eine größere Klonierungskapazität und vor allem geringere Rekombinationsrisiken bietet.
Dieser rekombinante Adenovirus wurde durch Rekombination in vivo erhalten, durch Cotransfektion in die Zellen 293, in Gegenwart von Calciumphosphat, der DNA des ADRSVβgal-Virus, verdaut mit ClaI, und des Plasmid pCO1, verdaut mit XmnI. Die Zellen wurden dann geerntet, durch drei Gefrier-Auftau-Zyklen in ihrem Überstand aufgebrochen, und dann 10 Minuten lang bei 4000 U/Min. zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand wurde dann auf einer frischen Zellkultur amplifiziert. Die Viren wurden dann von Plaques gereinigt und ihre DNA wurde gemäß dem Hirtverfahren (oben zitiert) analysiert. Dann wurden Virusstocks auf einem Cäsiumchloridgradienten hergestellt.
Beispiel 4 – Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus, der eine Deletion in den Genen E1 und IVa2 trägt
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines defektiven rekombinanten Adenovirus, der eine Deletion in der E1-Region trägt, die von Nukleotid 382 bis Nukleotid 3446 reicht, und eine Deletion in der IVa2-Region. Dieser Adenovirus ist besonders vorteilhaft, da er, im Vergleich mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Adenovirus eine Deletion im Gen IVa2 enthält, die eine größere Klonierungskapazität und vor allem geringere Risiken der Produktion viraler Proteine in vivo bietet.
A – Konstruktion des defektiven rekombinanten Adenovirus ΔE1-ΔVIa2 in Zelllinien, die die E1-Funktion (E1+) transkomplementieren.
Der rekombinante Adenovirus wurde gemäß den folgenden drei Protokollen hergestellt:

(a) Die AdRSVβgal-Virus-DNA, verdaut mit ClaI, und das Plasmid pCO2, verdaut mit XmnI, wurden in die Zellen E1+ (293 oder 293 E4) in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert, um die Rekombination in vivo zu ermöglichen.
(b) Die AdRSVβgal-Virus-DNA, verdaut mit ClaI und mit XcaI, und das Plasmid pCO2, verdaut mit XmnI, wurden in die Zellen E1+ (293 oder 293 E4) in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert, um die Rekombination in vivo zu ermöglichen.
(c) Die AdRSVβgal-Virus-DNA und das Plasmid pCO2, beide mit XcaI verdaut, werden zuerst in vitro ligiert und das resultierende Konstrukt wird dann in die Zellen E1+ (293 oder 293 E4) in Gegenwart von Calciumphosphat transfiziert.
(d) Die AdRSVβgal-Virus-DNA, verdaut mit ClaI, die Plasmid-pCO2-DNA, verdaut mit XmnI, und die DNA des Helfervirus pAC2 wurden in die Zellen E1+ (293 oder 293 E4) in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert.
(e) Die AdRSVβgal-Virus-DNA, verdaut mit Cla1, die Plasmid-pCO6-DNA, verdaut mit Xmn1, und die DNA des Helfervirus pAC2 wurden in die Zellen E1+ (293 oder 293 E4) in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert.

(Die Plasmide pAC2 und pCO6 werden in Beispiel 7 beschrieben.)
Die hergestellten Viren werden wie in Beispiel 3 amplifiziert und gereinigt.
B – Konstruktion eines Adenovirus ΔE1-ΔIVa2 in Zelllinien, die die IVa2-Funktion transkomplementieren.
In den Zellklonen, die die IVa2-Region des Ad5-Adenovirus exprimieren, konnte der Adenovirus ΔE1-ΔIVa2 gemäß den folgenden zwei Protokollen hergestellt werden:

(a) Die AdRSVβgal-Virus-DNA, verdaut mit Cla1, und die Plasmid-pCO2-DNA, verdaut mit Xmn1, wurden in die Zellen in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert.
(b) Die AdRSVβgal-Virus-DNA, verdaut mit Cla1, und die Plasmid-pCO6-DNA, verdaut mit Xmn1, wurden in die Zellen in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert.

Beispiel 5 – Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus, der eine Deletion in den Genen E1, E3 und IVa2 trägt
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines defektiven rekombinanten Adenovirus, der eine Deletion in der E1-Region, die von Nukleotid 382 bis Nukleotid 3446 reicht, eine Deletion in dem IVa2-Gen und eine Deletion in der E3-Region trägt. Dieser Adenovirus ist besonders vorteilhaft, da er, verglichen mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Adenovirus eine Deletion in der E3-Region enthält, was eine größere Klonierungskapazität bietet.
Der rekombinante Adenovirus wurde gemäß den folgenden drei Protokollen hergestellt:

(a) Die Add1324-Virus-DNA, verdaut mit ClaI, und das Plasmid pCO2, verdaut mit XmnI, wurden in die Zellen 293 in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert, um die Rekombination in vivo zu ermöglichen.
(b) Die Add1324-Virus-DNA, verdaut mit ClaI und mit XcaI, und das Plasmid pCO2, verdaut mit XmnI, wurden in die Zellen 293 in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert, um die Rekombination in vivo zu ermöglichen.
(c) Die Add1324-Virus-DNA und das Plasmid pCO2, beide mit XcaI verdaut, werden zuerst in vitro ligiert und das resultierende Konstrukt wird dann in die Zellen 293 in Gegenwart von Calciumphosphat transfiziert.

Die hergestellten Viren werden wie in Beispiel 3 amplifiziert und gereinigt.
Beispiel 6 – Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus, der eine Deletion in den Genen E1, E3, E4 und IVa2 trägt
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von defektiven rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung von deren Genom die Gene IVa2, E1, E3 und E4 deletiert sind. Dieser Adenovirus besitzt zuallererst eine große Kapazität, heterologe Gene einzubauen. Überdies sind diese Vektoren, aufgrund der Deletion der IVa2-Region und der E4-Region, sehr sicher. Letztere ist nämlich in die Regulierung der Expression später Gene, in das Processing später Prämessenger-RNAs, in die Extinktion der Expression der Proteine der Wirtszelle und in die Effizienz der Replikation der viralen DNA involviert. Diese Vektoren besitzen daher ein transkriptionales Hintergrundrauschen und eine sehr reduzierte Expression viraler Gene. Schließlich können diese Vektoren ganz besonders vorteilhaft mit sehr hohen Titern produziert werden.
Der rechte Teil eines viralen Genoms, das für die Regionen E3 und E4 deletiert ist (vgl. Kapitel B), oder nur für die Region E4, wie im Falle der Viren d1808, d11004, d11007 oder d11010, zum Beispiel beschrieben von G. Ketner (J. of Virology, 63 (1988) 631). Gemäß einer anderen Alternative kann der rechte Teil Deletionen in mehreren Regionen enthalten, zum Beispiel in den Regionen E3 und E4, wie jene, die in vitro konstruiert präsentiert wurden und in dem Virus, der wie folgt aus dem Plasmid pPY55 hergestellt wurde.
A/Konstruktion des Adenovirus, der in den Genen E1, E3 und E4 deletiert ist.
A.1 – Konstruktion des Plasmids pPY55.
a) Konstruktion des Plasmids pPY32.
Das AvrII-BcII-Fragment des Plasmids pFG144 [F. L. Graham et al. EMBO J. 8(1989) 2077–2085], das dem rechten Ende des Genoms des Ad5-Adenovirus entspricht, wurde zuerst zwischen den Stellen XbaI und BamHI des Vektors pIC19H, hergestellt aus einem dam--Kontext, kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pPY23. Ein interessantes Merkmal des Plasmids pPY23 ist, dass die aus der multiplen Klonierungsstelle des Vektors pIC19H erhaltene SalI-Stelle einmalig bleibt und dass sie neben dem rechten Ende des Genoms des Ad5-Adenovirus liegt. Das HaeIII-SalI-Fragment des Plasmids pPY23, das das rechte Ende des Genoms des Ad5-Adenovirus, ab der HaeIII-Stelle enthält, die an Position 35614 liegt, wurde dann zwischen den Stellen EvoRV Und XhoI des Vektors pIC20H kloniert, was das Plasmid pPY29 erzeugt. Ein interessantes Merkmal dieses Plasmids ist, dass die von der multiplen Klonierungsstelle des Vektors pIC20H erhaltenen Stellen XbaI und ClaI neben der EcoRV/HaeIII-Junction, die aus der Klonierung resultiert, liegen. Zudem modifiziert diese Junction den Nukleotidkontext, der direkt neben der ClaI-Stelle liegt, die nun in einen dam+-Kontext methylierbar geworden ist. Das XbaI(30470)-MaeII(32811)-Fragment des Genoms des Ad5-Adenovirus wurde dann zwischen den Stellen XbaI und ClaI des Plasmids pPY29, hergestellt aus einem dam--Kontext, kloniert, was das Plasmid pPY30 erzeugt. Das SstI-Fragment des Plasmids pPY30, das der Genomsequenz des Ad5-Adenovirus von der SstI-Stelle an Position 30556 bis zu dem rechten Ende entspricht, wurde schließlich zwischen den SstI- Stellen des Vektors pIC20H kloniert, was das Plasmid pPY31 erzeugt, von dem eine Restriktionskarte des Inserts, das zwischen den HindIII-Stellen liegt, in 5 dargestellt wird.
Das Plasmid pPY32 wurde nach der partiellen Verdauung des Plasmids pPY31 mit BglII erhalten, gefolgt von einer vollständigen Verdauung mit BamHI und dann einer erneuten Ligation. Das Plasmid pPY32 entspricht daher der Deletion des Genoms des Ad5-Adenovirus, das zwischen der BamHI-Stelle des Plasmids pPY31 angesiedelt ist und der BglII-Stelle, die an Position 30818 liegt. Eine Restriktionskarte des HindIII-Fragments des Plasmids pPY32 wird in 5 dargestellt. Ein Merkmal des Plasmids pPY32 ist, dass es einmalige SalI- und XbaI-Stellen besitzt.
b) Konstruktion des Plasmids pPY47.
Das BamHI (21562)-XbaI(28592-Fragment des Genoms des Ad5-Adenovirus wurde zuerst zwischen den Stellen BamHI und XbaI des Vektors p1C19H, hergestellt aus einem dam--Kontext, kloniert, was das Plasmid pPY17 erzeugt. Dieses Plasmid enthält daher ein HindIII(26328)-BglII(28133)-Fragment des Genoms des Ad5-Adenovirus, das zwischen den Stellen HindIII und BglII des Vektors pIC20R kloniert werden kann, um das Plasmid pPY34 zu erzeugen. Ein Merkmal dieses Plasmids ist, dass die von der multiplen Klonierungsstelle erhaltene BamHI-Stelle in unmittelbarer Nähe der HindIII(26238)-Stelle des Genoms von Ad5-Adenovirus liegt.
Das BamHI(21562)-HindIII(26238)-Fragment des Genoms des Ad5-Adenovirus, das aus dem Plasmid pPY17 erhalten wurde, wurde dann zwischen den Stellen BamHI und HindIII des Plasmids pPY34 kloniert, was das Plasmid pPY39 erzeugt. Das BamHI-XbaI-Fragment des Plasmid pPY39, hergestellt aus einem dam--Kontext, das den Teil des Genoms des Ad5-Adenovirus zwischen den Stellen BamHI(21562) und BglII(28133) enthält, wurde dann zwischen den Stellen BamHI und XbaI des Vektors pIC19H, hergestellt aus einem dam--Kontext, kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pPY47 mit dem interessanten Merkmal, dass die aus der multiplen Klonierungsstelle erhaltene SalI-Stelle in der Nähe der HindIII-Stelle liegt (6).
c) Konstruktion des Plasmids pPY55.
Das SalI-XbaI-Fragment des Plasmids pPY47, das aus einem dam--Kontext hergestellt ist und das den Teil des Genoms des Ad5-Adenovirus enthält, der von der BamHI(21562)-Stelle bis zur BglII(28133)-Stelle reicht, wurde zwischen den Stellen SalI und XbaI des Plasmids pPY32 kloniert, was das Plasmid pPY55 erzeugt. Dieses Plasmid kann direkt verwendet werden, um rekombinante Adenoviren zu produzieren, die mindestens für die E3-Region deletiert sind (Deletion zwischen den BglII-Stellen, die an den Positionen 28133 und 30818 des Genoms des Ad5-Adenovirus liegen) und für die gesamte E4-Region (Deletion zwischen den Stellen MaeII(32811) und HaeIII(35614)) des Genoms des Ad5-Adenovirus (6).
A.2. Konstruktion des Plasmids pE4Gal.
Hierfür wurde ein Plasmid, das die Joining-ITRs von Ad5, die Verpackungssequenz, das Gen E4 unter Kontrolle seines eigenen Promoters und als heterologes Gen, das Gen LacZ unter Kontrolle des LTR-Promoters des RSV-Virus trägt, konstruiert (7). Dieses Plasmid, pE2Gal genannt, wurde durch Klonierung und Ligation der folgenden Fragmente erhalten (vgl. 7):

– HindIII-SacII-Fragment, abgeleitet von Plasmid pFG144 (Graham et al., EMBO J.8 (1989) 2077). Dieses Fragment trägt die ITR-Sequenzen von Ad5 in "Head-to-Tail-Anordnung" und die Verpackungssequenz: HindIII(34920)-SacII(352)-Fragment;
– Fragment von Ad5 zwischen den Stellen SacII (liegt im Bereich des Basenpaares 3827) und PstI (liegt im Bereich des Basenpaares 4245);
– Fragment von pSP 72 (Promega) zwischen den Stellen PstI (bp 32) und SalI (bp 34);
– XhoI-XbaI-Fragment des Plasmids pAdLTR GalIX, beschrieben in Stratford-Perricaudet et al. (JCI 90(1992)626). Dieses Fragment trägt das Gen LacZ unter der Kontrolle der LTR des RSV-Virus;
– XbaI(bp 40)-NdeI(bp 2379)-Fragment des Plasmids pSP 72;
– NdeI (bp 31089)-HindIII (bp 34930) -Fragment in Ad5. Dieses Fragment, das im rechten Ende des Ad5-Genoms liegt, enthält die E4-Region unter Kontrolle seines eigenen Promoters. Es wurde an der NdeI(2379)-Stelle des Plasmids pSP 72 und der HindIII-Stelle des ersten Fragments kloniert.

Dieses Plasmid wurde durch Klonieren verschiedener Fragmente in die angegebenen Regionen des Plasmids pSP 72 erhalten. Es versteht sich, dass äquivalente Fragmente
A.3 Cotransfektion in die Zellen 293
Die Adenoviren werden durch Rekombination in vivo gemäß den folgenden Strategien erhalten:

(i) Die DNA des Ad-d1324-Virus (Thimmappaya et al., Zelle 31 (1982) 543) und das Plasmid pPY55, beide mit BamHI verdaut, werden zuerst in vitro ligiert und dann mit dem Plasmid pEAGal in die Zellen 293 cotransfiziert.
(ii) Die DNA des Ad-d1324-Virus, verdaut mit EcoRI, und das Plasmid pPY55, verdaut mit BamHI, werden mit dem Plasmid pE4Gal in die Zellen 293 cotransfiziert.
(iii) Die DNA des Ad5-Adenovirus und das Plasmid pPY55, beide mit BamHI verdaut, werden mit dem Plasmid pE4Gal in die Zellen 293 ligiert und dann cotransfiziert.
(ii) Die DNA des Ad5-Adenovirus, verdaut mit EcoRI, und das Plasmid pPY55, verdaut mit BamHI, werden mit dem pE4Gal in die Zellen 293 cotransfiziert.

Die Strategien (i) und (ii) machen es möglich, einen rekombinanten Adenovirus zu erzeugen, der für die Regionen E1, E3 und E4 deletiert ist; die Strategien (iii) und (iv) machen es möglich, einen rekombinanten Adenovirus zu erzeugen, der für die Regionen E3 und E4 deletiert ist. Überdies ist es auch möglich, eine Zelllinie zu verwenden, die abgeleitet ist von einer Linie, die die E1-Region exprimiert, zum Beispiel die Linie 293, und die auch mindestens die offenen Leserahmen ORF6 und ORF6/7 der Ad5-Adenovirus-E4-Region exprimiert (vgl. Fr 93 08596). Die Verwendung solcher Linien ermöglicht es, die Verwendung des pE4Gal zu vermeiden.
B/Konstruktion des Adenovirus der in den Genen IVa2, E1, E3 und E4 deletiert ist.
Dieser Adenovirus wurde durch Rekombination des Plasmids pCO2, nach der Cotransfektion in die Zellen 293 (Beispiel 2), und des rechten Teils eines Adenovirus, der mindestens für die E4-Region deletiert ist, und zum Beispiel der Adenovirus, der nach der Verwendung des Plasmid pPY55 erhalten wurde (vgl. Kapitel A) erhalten.
Nach der Cotransfektion mit Calciumphosphat wurden die Zellen geerntet, durch drei Gefrier-Auftau-Zyklen in ihrem Überstand aufgebrochen und dann 10 Minuten lang bei 4000 U/Min. zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand wurde dann auf einer frischen Zellkultur amplifiziert. Die Viren wurden dann von Plaques gereinigt und ihre DNA wurde gemäß dem Hirtverfahren (oben zitiert) analysiert. Dann wurden Virusstocks auf einem Cäsiumchloridgradienten hergestellt.
Beispiel 7 – Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus, der eine Deletion in den Genen E1, E4, IVa2 trägt
A – Konstruktion des Plasmids pCO6 (8).
A.1 – Konstruktion des Plasmids pPY38.
Das Mun1-Nru1-Fragment des Plasmid pCO1, das die Sequenzen des Ad5-Adenovirusgenoms enthält, die von den Basen 3924 bis zu 6316 reichen und vor allem das Gen IVa2 (Basen 4094 bis 5719), wurde zwischen den Stellen Mun1 und Nru1 des kommerziellen Vektors pSL1180 kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pPY38.
A.2 – Konstruktion des Plasmids pPY39.
Die folgende Nukleotidsequenz und ihr komplementärer Strang wurden künstlich durch herkömmliche molekularbiologische Techniken synthetisiert:
5'- CCT TAG CCC GGG CTA AGG CAT G -3' (SEQ-ID-Nr. 1)
Jeder der Stränge hat eine Sph1-Restriktionsstelle an seinem 3'-Ende. Diese Sequenz wurde in die Sph1-Stelle des Plasmids pGY38 kloniert: Sie führt einen Stoppcodon in den kodierenden Teil des Gens IVa2, an der Sph1-Stelle, die den Basen 5141 des Ad5-Adenovirus entspricht, ein. Dies erzeugt das Plasmid pPY39. In diesem Plasmid wird das so modifizierte Gen IVa2 inaktiviert: Es kodiert ein inaktives Protein, das den ersten 102 Aminosäuren des Wildtyp-IVa2-Protein entspricht.
A.3 – Konstruktion des Plasmids pCO6.
Das Mun1-Mru1-Fragment des Plasmids pGY39 wurde zwischen den Stellen Mun1 und Nru1 des Plasmids pCO1 kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pCO6 (8), das den linken Teil des Ad5-Adenovirus bis zur Hinf1-Stelle (382), eine multiple Klonierungsstelle, das Sau3A(3446)-Sph1(5141)-Fragment des Ad5-Adenovirus, das Oligonukleotid, dass einen Stoppcodon in die kodierende Sequenz des IVa2-Gens einbringt, und das Sph1(5141)-Nru1(6316)-Fragment des Ad5-Adenovirus enthält.
B – Konstruktion des Plasmids pAC2 (9).
B.1 – Konstruktion des Plasmids pSPITR
Die folgenden Fragmente wurden kloniert:

– Das Hind3(34930)-Sac2(357)-Fragment, abgeleitet von dem Plasmid pFG144 (Graham et al., EMBO J.8, 1989, 2027), wobei dieses Fragment die ITR-Sequenzen des Ad5-Adenovirus in „Head-to-Tail-Anordnung" und die Verpackungssequenz trägt,
– das Ad5-Adenovirus-Fragment zwischen den Stellen Sac2 (liegt im Bereich der Base 3827 in Ad50 und Pst1 (liegt im Bereich der Base 4245)

Dann wurde das Plasmid pSPITR durch Ligation dieser Fragmente zwischen den Stellen Hind3 und Pst1 des kommerziellen Plasmids pSP72 erhalten.
B.2 – Konstruktion des Plasmids pAC2.
Das Dra1-Nru1-Fragment des Plasmids pCO1, das die Sequenzen des Ad5-Adenovirusgenoms enthält, die von den Basen 4029 bis zu 6316 reichen und vor allem das Gen IVa2 und dessen Promoter, wurde in die Stelle EcoRV des Vektors pIC20H (Referenz J. L. March et al. (1984) Gene, 32, 481–485) kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pAC1. Das Bgl2-BamH1-Fragment des Plasmids pAC1 wurde in die BamH1-Stelle des Plasmids pSPITR kloniert, was das Plasmid pAC2 erzeugt (9).
C – Konstruktion des Plasmids pACS (10).
C.1 – Konstruktion des Plasmids pAC3.
Das EcoR1-Xba1-Fragment des kommerziellen Plasmids pMEP4 (Invitrogen) wurde zwischen den Stellen EcoR1 und Xba1 des Plasmids pAC1 ligiert. Dies erzeugt das Plasmid pAC3 mit dem Merkmal ist, dass es die ECNA1-OriP-Sequenzen und das Gen IVa2 enthält.
C.2 – Konstruktion des Plasmids pAC5.
Das Sal1-Xho1-Fragment des kommerziellen Plasmids pMSCV wurde in die Sal1-Stelle des Vektors pIC20H kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pAC41, das das Neo-Gen enthält. Das Xba1-Nru1-Fragment des Plasmids pAC3 wurde zwischen den Stellen Xba1 und Nrul des Plasmids pAC4 kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pAC5 (10) mit dem wichtigen Merkmal, dass es das Gen Neo und das Gen IVa2 unter Kontrolle seines eigenen Promoters besitzt. Zudem kann dieses Plasmid sich in eukaryotischen Zellen replizieren, weil es die EBNA1/OriP-Sequenzen trägt.
D – Konstruktion des Plasmids pGY37-TK-IVa2 (11).
D.1 – Konstruktion des Plasmids pGY32.
Die folgende Nukleotidsequenz und ihr komplementärer Strang wurden künstlich durch herkömmliche molekularbiologische Techniken synthetisiert:
5'- TCG ACG GAT CCC TTA AGG TTG ACG CCG CCA CCA TGG AAA CCA GAG GGC GAA GAC CGG CAG C -3' (SEQ-ID-Nr. 2)
Sie trägt eine Restriktionsstelle für Sal1 an ihrem 5'-Ende und eine Restriktionsstelle für Eco47III an ihrem 3'-Ende. Diese Sequenz wurde in das Plasmid pAC1 zwischen der Sal1-Stelle und der Eco47III-Stelle des Anfangs des IVa2-Gens insertiert, was der Base 5411 der Ad5-Adenovirussequenz entspricht. Dies erzeugt das Plasmid pGY32 mit dem wichtigen Merkmal, dass es eine multiple Klonierungsstelle (BamH1, Af12, Hinc2) nach stromaufwärts eines Kazak-Consensus vor dem ATG des Gens IVa2 besitzt. Zudem wurde in dieser Konstruktion das Intron des Gens IVa2 supprimiert.
D.2 – Konstruktion des Plasmids pGY33-TK.
Das BamH1(-110)-Hinc2(+35)-Fragment des TK-Promoters des Plasmids pX4B (B. Wasylyk et al., N.A.R. (19870, 15, 13, 5490) und eine multiple Klonierungsstelle, eingerahmt von den Sal1- und BamH1-Stellen, wurden ligiert und dann zwischen den Sal1- und Hinc2-Stellen des Plasmids PGY32 kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pGY33-TK, dessen interessantes Merkmal ist, dass es das Gen IVa2 ohne Intron unter Kontrolle des TK-Promoters trägt.
D.3 – Konstruktion des Plasmids pGY34.
Die folgenden Fragmente wurden hergestellt und dann ligiert:

– Die Xba1-Pvu1-Fragmente des kommerziellen Plasmids pMEP4 (5,5 kg); dieses Fragment enthält die EBNA1/OriP-Sequenzen und das 5'-Ende des Ampicillinresistenzgens,
– das Pvu1-AlwN1-Fragment des kommerziellen Plasmids pMEP4 (0,8 kb); dieses Fragment enthält das 3'-Ende des Ampicillinresistenzgens und einen Teil des Replikationsstartpunkts,
– die Fragmente Xba1 und AlwN1 des Plasmids pIC20H (0,8 kb); dieses Fragment enthält das Ende des Replikationsstartpunkts.

Dies erzeugt das Plasmid pGY34, das die EBNA1/OriP-Sequenzen enthält.
D.4 – Konstruktion des Plasmids pGY36.
Das BamH1-Fragment des kommerziellen Plasmids pUT614 (Cayla) wurde in die BamH1-Stelle des Vektors pIC20H kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pAC41, das das Neo-Gen enthält. Das Xba1-EcoRV-Fragment des Plasmids pPY9 wurde zwischen den Stellen Xba1 und Nru1 des Vektors pIC20R kloniert, was das Plasmid pGY35 erzeugt. Das Xba1-Fragment des Plasmids pGY35, hergestellt in einem dam--Kontext, wurde dann in die Xba1-Stelle des Plasmids pGY34 kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pGY36.
D.5 – Konstruktion des Plasmids pGY37-TK-IVa2 (11).
Das Bg12-Sap1-Fragment des Plasmids pGY33-TK wurde zwischen den Stellen Bg12 und Sap1 des Plasmids pGY36 kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pGY37-TK-IVa2 (11) mit dem wichtigen Merkmal, dass es das Gen Zeo und das Gen IVa2 besitzt, ohne Intron, unter der Kontrolle des TK-Promoters. Zudem kann sich dieses Plasmid in eukaryotischen Zellen replizieren, weil es die EBNA1/OriP-Sequenzen trägt.
E – Konstruktion des Plasmids GY37-CMV-IVa2 (12).
E.1 – Konstruktion des Plasmids GY33-CMV.
Das Bgl2-Afl2-Fragment des kommerziellen Plasmids pCI (Promega) wurde zwischen den Stellen BamH1 und Af12 des Plasmid PGY32 kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pGY33-CMV mit dem interessanten Merkmal, dass es das Gen IVa2 ohne Intron unter Kontrolle des CMV-Promoters trägt.
E.2 – Konstruktion des Plasmids pGY37-CMV-IVa2 (12).
Das Bg12-Sap1-Fragment des Plasmids pGY33-CMV wurde zwischen den Stellen Bg12 und Sap1 des Plasmids pGY36 kloniert. Dies erzeugt das Plasmid pGY37-CMV-IVa2 (12) mit dem wichtigen Merkmal, dass es das Gen Zeo und das Gen IVa2 trägt, ohne Intron, unter Kontrolle des TK-Promoters. Zudem kann sich dieses Plasmid in eukaryotischen Zellen replizieren, weil es die EBNA1/OriP-Sequenzen trägt.
F – Konstruktion der Zellklone, die die IVa2-Region des Ad5-Adenovirus exprimieren.
Verschiedene Typen von Zelllinien, die die IVa2-Funktion transkomplementieren, wurden in den E1⁺-Zellen (Zellen 293 oder 293 E4) konstruiert.

(a) Das Plasmid pAC5 wurde in die Zellen 293 in Gegenwart von Calciumphosphat transfiziert, die Zellklone, die das replikative Plasmid pAC5 tragen, wurden in Gegenwart von Geneticin (Sigma, 400 μg/ml) ausgewählt.
(b) Das Plasmid pGY37-TK-IVa2 wurde in Gegenwart von Calciumphosphat in die Zellen transfiziert, die Zellklone, die das replikative Plasmid pGY37-TK-IVa2 tragen, wurden in Gegenwart von Phleomycin (Cayla, 15 μg/ml für die Zellen 293 und 30 μg/ml für die Zellen 293 E4) ausgewählt.
(c) Das Plasmid pGY37-CMV-IVa2 wurde in Gegenwart von Calciumphosphat in die Zellen transfiziert, die Zellklone, die das replikative Plasmid pGY37-CMV-IVa2 tragen, wurden in Gegenwart von Phleomycin (Cayla, 15 μg/ml für die Zellen 293 und 30 μg/ml für die Zellen 293 E4) selektiert.

Genauer gesagt wurden in jeder dieser drei Zellen, Zellen in Schalen mit einem Durchmesser von 5 cm durch 1 bis 5 μg des Plasmids in Gegenwart von Calciumphosphat transfiziert. Nach der Transfektion der Zellen wurden diese gewaschen und dann wurde das Kulturmedium (MEM, Sigma), angereichert mit fötalem Kälberserum (7% Endwert), zugefügt und die Zellen wurden 24 Stunden lang inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen in Gegenwart von Geneticin oder Phleomycin selektiert. Das Geneticin oder das Phleomycin wird alle drei Tage ausgetauscht und die selektierbaren Klone erscheinen nach etwa drei Wochen. Wenn alle nicht transfizierten Zellen gestorben sind, teilen sich nur die transfizierten Zellen und erzeugen Zellklone. Wenn die Zellklone ausreichend groß sind, um mit bloßem Auge sichtbar zu sein, werden sie individuell in die Vertiefungen einer "24-Slot"-Kulturplatte übertragen. Jeder Klon wird dann progressiv amplifiziert, in der Gegenwart von Geneticin oder Phleomycin, zuerst in den Vertiefungen einer "12-Slot", und dann einer "6-Slot"-Kulturplatte, damit sie dann in den Zellkulturschalen amplifiziert werden.
G – Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus, der eine Deletion in den Genen E1-IVa2-E4 trägt.
G.1 – Konstruktion eines Adenovirus ΔE1-ΔIVa2-ΔE4 durch Cotransfektion eines Helfervirus, der das Gen IVa2 trägt.
Zum Beispiel war es möglich, den Adenovirus ΔE1-ΔIVa2-ΔE4 gemäß den folgenden zwei Protokollen herzustellen:

(a) Die DNA eines ΔE1-ΔE4-Virus, verdaut mit Cla1 (zum Beispiel AdRSBβgal-dl1004, AdRSBβgal-d1007 oder AdRSVβgal-dl11014, beschrieben in "Efficient dual transcomplementation of Adenovirus E1 and E4 regions from a 293-derived cell line expressing a minimal E4 functional unit" by P, YEH et al., J. Virology, im Druck), die Plasmid-pCO2-DNA, verdaut mit Xmn1, und die Helfervirus-pAC2-DNA wurden in 293 E4-Zellen in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert.
(b) Die DNA eines ΔE1-ΔE4-Virus, verdaut mit Cla1, die Plasmid-pCO6-DNA, verdaut mit Xmn1, und die Helfervirus-pAC2-DNA wurden in die 293 E4-Zellen in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert.

G.2 – Konstruktion eines Adenovirus ΔE1-ΔIVa2-ΔE4 in Zelllinien, die die IVa2 und E4-Funktionen transkomplementieren.
In den Zellklonen, die die IVa2- und E4-Regionen des Ad5-Adenovirus exprimieren und gegen Phleomycin resistent sind, konnte der Adenovirus ΔE1-ΔIVa2-ΔE4 gemäß den folgenden zwei Protokollen hergestellt werden:

(a) Die DNA eines ΔE1-ΔE4-Virus, verdaut mit Cla1, und die Plasmid-pCO2-DNA, verdaut mit Xmn1, wurden in die Zellen in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert.
(b) Die DNA eines ΔE1-ΔE4-Virus, verdaut mit Cla1, und die Plasmid-pCO6-DNA, verdaut mit Xmn1, wurden in die Zellen in Gegenwart von Calciumphosphat cotransfiziert.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Defektiver rekombinanter Adenovirus, dadurch gekennzeichnet, dass er die ITRs und eine Verpackungsregion umfasst, und dass mindestens das Gen IVa2 inaktiviert ist.
Rekombinanter Adenovirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen IVa2 durch Mutation und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen inaktiviert ist.
Rekombinanter Adenovirus nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen IVa2 durch partielle Deletion inaktiviert ist.
Rekombinanter Adenovirus nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen IVa2 durch Deletion eines Fragmentes inaktiviert ist, welches von Nukleotid 4106 bis Nukleotid 5186 reicht.
Rekombinanter Adenovirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine heterologe Nukleinsäuresequenz umfasst.
Defektiver rekombinanter Adenovirus, dadurch gekennzeichnet, dass er die ITRs und eine Verpackungsregion umfasst, und dass er eine Deletion der vollständigen Gene E1 und IVa2 oder von Teilen dieser trägt.
Defektiver rekombinanter Adenovirus, dadurch gekennzeichnet, dass er die ITRs und eine Verpackungsregion umfasst, und dass er eine Deletion im Bereich des Gens E1 trägt, welche von Nukleotid 382 bis Nukleotid 3446 reicht sowie eine Deletion im Bereich des Gens IVa2, welche von Nukleotid 4106 bis Nukleotid 5186 reicht.
Defektiver rekombinanter Adenovirus, dadurch gekennzeichnet, dass er die ITRs und eine Verpackungsregion umfasst, und dass er eine Deletion der vollständigen Gene E4 und IVa2 oder von Teilen dieser trägt.
Defektiver rekombinanter Adenovirus, dadurch gekennzeichnet, dass er die ITRs und eine Verpackungsregion umfasst, und dass er eine Deletion der vollständigen Gene E1, IVa2 und E3 oder von Teilen dieser trägt.
Defektiver rekombinanter Adenovirus, dadurch gekennzeichnet, dass er die ITRs und eine Verpackungsregion umfasst, und dass er eine Deletion der vollständigen Gene E1, IVa2 und E4 oder von Teilen dieser trägt.
Defektiver rekombinanter Adenovirus, dadurch gekennzeichnet, dass er die ITRs und eine Verpackungsregion umfasst, und dass er eine Deletion der vollständige Gene E1, IVa2, E3 und E4 oder von Teilen dieser trägt.
Defektiver rekombinanter Adenovirus, dadurch gekennzeichnet, dass er die ITRs und eine Verpackungsregion umfasst, und dass er eine Deletion der vollständigen Gene E1, IVa2, E3, L5 und E4 oder von Teilen dieser trägt.
Adenovirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er menschlichen, tierischen oder gemischten Ursprungs ist.
Adenovirus nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Adenoviren menschlichen Ursprungs ausgewählt sind aus denen, die in Gruppe C klassifiziert sind, vorzugsweise aus den Adenoviren des Typs 2 oder 5 (Ad2 oder Ad5).
Adenovirus nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Adenoviren tierischen Ursprungs ausgewählt sind aus Adenoviren von Hund, Rind, Maus, Schaf, Schwein, Vogel und Affe.
Adenovirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er ferner einen Teil des Gens E3 umfasst, welcher für das Protein gp19K kodiert, unter Kontrolle eines heterologen Promotors.
Adenovirus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleinsäuresequenz ein therapeutisches Gen und/oder ein Gen umfasst, welches für antigene Peptide kodiert.
Adenovirus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleinsäuresequenz ebenfalls eine transkriptionelle Promotorregion umfasst, welche in der infizierten Zelle, dem infizierten Organ und/oder Organismus funktionsfähig ist.
Adenovirus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleinsäuresequenz ferner eine sekretorische Sequenz umfasst.
Defektiver rekombinanter Adenovirus, dadurch gekennzeichnet, dass er die ITRs und eine Verpackungsregion umfasst, und dass er eine Deletion trägt, die von Nukleotid 382 bis Nukleotid 3446 reicht.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen defektiven rekombinanten Adenovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 20 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, die einen für eine injizierbare Formulierung geeigneten pharmazeutischen Träger umfasst.